Đồ án Nghiên cứu xác định các loại axit amin trong một số loài nấm lớn ở khu vực Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆPTÊN ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC LOẠI AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM LỚN Ở KHU VỰC BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)”GVHD: Th.S Hoàng Văn TrungSVTH: Nguyễn Duy Trọng Hoàng Thị NgaLớp: 51K_CNTP Với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa đã góp phần tạo nên sự đa dạng của hệ nấm Việt Nam, đây là nguồn có giá trị tài nguyên rất to lớn. Hiện nay không chỉ ở Việt Nam mà trên thế giới đều công nhận giá trị khoa học các loài nấm, nấm được coi là một thực phẩm chức năng, có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con người, chúng là nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, nguồn dược phẩm quý.  Protein trong nấm có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với hầu hết các protein thực vật. Protein khi đi vào cơ thể được chuyển hóa thành các axit amin, trong đó có 9 axit amin thiết yếu. Axit amin là thành phần quan trọng thực hiện các chức năng đa dạng của cơ thể, là tiền thân của nhiều sinh chất quan trọng trong cơ thể sống. Vì vậy việc xác định axit amin trong nấm là rất cần thiết.MỞ ĐẦU1. Lí do chọn đề tài2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời các axit amin trong các loại nấm khác nhau, cung cấp số liệu về thành phần dinh dưỡng (axit amin) trong một số loại nấm được nghiên cứu.3. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu xác định các axit amin trên nấm tự nhiên được thu thập từ rừng Quốc gia Pù Mát, Phong Nha Kẻ Bàng thuộc vùng Bắc Trung Bộ. Trong những năm gần đây, HPLC được ứng dụng rộng rãi trong phân tích, đánh giá chất lượng thực phẩm như axit amin, vitamin, kháng sinh, phụ gia thực phẩm... Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi lựa chọn đề tài : “Nghiên cứu xác định hàm lượng các axit amin trong một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC”.NẤM436Các chất có hoạt tính sinh học caoThực phẩm giàu dinh dưỡngVitamin, khoáng chấtNgăn ngừa, điều trị bệnh251Dược phẩm, chống lão hóaTuần hoàn vật chất1.3. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao - HPLCChú thích: 1. Bình chứa dung môi pha động2. Bộ phận khử khí3. Bơm cao áp4. Bộ phận tiêm mẫu 5. Cột sắc ký 6. Đầu dò  7. Hệ thống máy tính 8. Máy in CNHHaHCOOHRCN+HHHaHRCOO_1.2. Axit aminBảng 1.1: Cấu trúc của 17 axit amin tiêu chuẩn Các mẫu Nấm Thượng hoàng, nấm PL1, nấm PL2, nấm PL3, nấm PL4 được thu thập từ các rừng Quốc Gia Pù Mát và rừng Phong Nha Kẻ Bàng vào 8-2013. Sau khi đưa về phòng thí nghiệm được làm khô và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Hình 2.1: Mẫu nấm PL1 Hình 2.2: mẫu nấm PL2Hình 2.3: mẫu nấm PL3Chương 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM2.1. Thu thập mẫu nấm Hình 2.4: Mẫu nấm PL4 Hình 2.5: Mẫu nấm Thượng hoàng 2.6: Mẫu nấm Linh Chi2.2 Quy trình phân tíchTTTime (min)A %B %Flow (ml/min)1010000,521801000,5318,101000,5418,501000,8523,901000,862401000,572510000,5- Cột sắc ký: cột C18 150 x 4,6mm, kích thước hạt 5μm.- Nhiệt độ cột: 450C. Tốc độ dòng: 0,5ml/phút. Pha động: Pha động A: Hỗn hợp dung môi nước và tetrahydrofuran Pha động B: Hỗn hợp dung môi nước, axetonitril và methanol theo gradient:2.3. Điều kiện chạy máy Chương trình bơm mẫu:3.1. Khảo sát các điều kiện thủy phân mẫu3.1.1. Khảo sát nồng độ axit HCl Để chọn nồng độ axit HCl phù hợp cho sự thủy phân mẫu chúng tôi khảo sát một dãy mẫu thực (mẫu nấm Thượng hoàng) cùng với chuẩn axit amin 25pmol được thêm vào và thủy phân trong môi trường HCl ở các nồng độ : 3M; 4M; 5M; 6M; 6,5M ; 7M. Ở nhiệt độ thủy phân 1250C trong thời gian 24h Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNBảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi axit amin Từ đồ thị cho thấy khi nồng độ axit HCl 6M ở các axit amin đều cho hiệu suất thu hồi cao nhất. Từ nồng độ 6-6,5M thì hiệu suất thu hồi ổn định và các hiệu suất thu được lớn hơn 90%. Từ kết quả này chúng tôi chọn nồng độ axit HCl 6M làm môi trường thủy phân mẫu cho các nghiên cứu tiếp theo.Hình 3.1: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl3.3.2. Khảo sát thời gian thủy phân mẫu Để chọn thời gian phù hợp cho sự thủy phân các axit amin, chúng tôi chuẩn bị mẫu nấm Thượng hoàng và mẫu nấm Thượng hoàng thêm chuẩn 25pmol tiến hành thủy phân trong môi trường HCl 6M, nhiệt độ 1250C và thủy phân tại các mốc thời gian khác nhau : 20h, 22h, 24h, 26h.Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi Kết quả ở hình 3.2 cho thấy khi thời gian thủy phân lớn hơn 22h hiệu suất thu hồi bắt đầu ổn định. Thời gian từ 24h-26h cho hiệu suất thu hồi tốt nhất, ở 24h cho hiệu suất rất lớn (> 95%). Vậy nên chúng tôi chọn 24h là thời gian thủy phân mẫu phân tích.Hình 3.2: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào thời gian thủy phân3.2. Xây dựng phương trình đường chuẩnĐể tiến hành xây dựng đường chuẩn chúng tôi chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ: 10pmol, 25pmol, 100pmol để xác định khoảng tuyến tính của các axit amin. Kết quả đo được như sau:Bảng 3.3: Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ (pmol/ )của axit aminHình 3.4: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn các axit amin ở nồng độ 25pmolHình 3.5: Sắc đồ chạy hỗn hợp chuẩn các axit amin ở nồng độ 100pmolHình 3.3: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn các axit amin ở nồng độ 10pmol Hình 3.6: Đường chuẩn định lượng Met Hình 3.7: Đường chuẩn định lượng Thr Hình 3.7: Đường chuẩn định lượng Tyr Hình 3.8: Đường chuẩn định lượng Ile y = 82,72156x + 131,60838 y = 87,61079x + 68,49580 R2 = 0,9998 R2 = 0,9999Hình 3.8: Đường chuẩn định lượng Ser Hình 3.9: Đường chuẩn định lượng Ile y = 81,82352x + 83.06823R2 = 0,99989 y = 103.81416x + 38.54980R2 =0,99988y = 81,82352x + 83.06823R2 = 0,999893.2. Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)Bảng 3.4: Giá trị LOD và LOQ của axit AsparticTiến hành đo lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ chuẩn ta có bảng giá trị LOD và LOQ của Aspartic như sau:Nồng độ chuẩn(pmol)Nồng độ đo đượcSDSD(tb)LODPmolLOQPmolLần 1Lần 2Lần 31012,2975712,2081512,217380,040150,032740,00190,00632524,0809724,1046824,061210,0177710099,0461499,1161899,141430,04030Bảng 3.5: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp3.5. Độ thu hồi của phương pháp Dựa vào việc thêm chuẩn vào mẫu thực cùng với làm mẫu thực không thêm chuẩn song song chúng tôi tiến hành tính độ thu hồi như sau : Hiệu suất thu hồi Tiến hành thí nghiệm trên nấm Thượng hoàng, nấm Thượng hoàng thêm chuẩn 25pmol, thực hiện phân tích 5 lần lặp lại và lấy kết quả trung bình. Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.6.Bảng 3.6: Hiệu suất thu hồi của axit amin trong nấm Thượng HoàngHình 3.11: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân nấm Thượng hoàng thêm chuẩnHình 3.10: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm Thượng hoàng Bảng 3.7: Hàm lượng axit amin trong nấm Thượng hoàng3.6. Xác định hàm lượng các axit amin trong các mẫu nấmBảng 3.8: Hàm lượng (μg/g) axit amin trong các mẫu nấm Bảng 3.9: Hàm lượng (μg/g) axit amin trong các mẫu nấm Bảng 3.10: Hàm lượng (μg/g) axit amin trong các mẫu nấm theo phương pháp xử lí mẫu khác nhauTTAxit aminNấm PL1HL- ĐKNấm PL1HL- CKNấm PL1HL- TNấm PL2HL- TNấm PL2 HL-CKThượng Hoàng HL- T Nấm PL3 HL- T  Nấm PL4 HL-CK1Thr114,34KPH24,04KPH00002Val 01647,3402019,582582,301997,92401,83Met 300,80217,27107,05369,65418,02128,03106,10234,194Ile 160,42198,670232,34286,230KPH05Leu1219,181433,88464,262318,083120,5462,752544,21251,186Phe 135,111555,73481,562389,192987,1498,792543,51233,37Lys 667,68627,64201,09861,041091,0319,69751,481011,48His 1817,901688,69783,282587,223407,91246,92770,82055,3Tổng axit amin thiết yếu4415,437369,222061,2810777,113893,12656,1610713,98187,29Asp1386,881203,08296,172285,562818,5749,182860,21202,910GluKPHKPHKPHKPHKPHKPHKPHKPH11SerKPHKPHKPHKPHKPHKPHKPHKPH12Gly KPHKPHKPHKPHKPHKPHKPHKPH13Cys – ss – Cys4951,883601,552701,14531,365943,43059,71439,65905,814Ala KPH0KPH0000015Arg________16Tyr614,84608,27294,29364,36921,29279,65272,961033,817Pro4988,893460,91536,15020,94633,53519,93852,85634,6Tổng axit amin không thiết yếu11942,498873,84827,6612202,1814316,77608,438425,5613777,1Tổng16357,9216243,028888,9422979,2828209,810264,619139,421964,3EAA/TAA26,99%45,37%29,92%46,90%49,25%25,88%55,98%37,28%Hình 3.12: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL1Hình 3.13: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL2Hình 3.14: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL3Hình 3.15: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL4Hình 3.16: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm Linh chi1. Khảo sát tối ưu hóa một số điều kiện trong quy trình thủy phân xử lý mẫu xác định hàm lượng axit amin trong nấm: + Thời gian thủy phân mẫu tối ưu là 24h + Nồng độ HCl thủy phân tối ưu là 6M2. Đã xây dựng được phương trình đường chuẩn của các axit amin và xác định được khoảng nồng độ nghiên cứu nằm trong khoảng tuyến tính.3. Xác định được giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ của phương pháp là rất nhỏ: LOD từ 0,0006 - 0,006 pmol, LOQ từ 0,002 - 0,0153pmol.4. Quy trình phân tích đưa ra đã được đánh giá bằng đường chuẩn, độ thu hồi. Độ thu hồi với các loại axit amin nằm trong khoảng 85,6 – 133,8% trong vùng đường chuẩn tuyến tính.KẾT LUẬN5. Xác định được hàm lượng axit amin thủy phân trong 7 mẫu nấm tự nhiên, cụ thể:KẾT LUẬN Từ các kết quả thu được chúng tôi thấy phương pháp phân tích hàm lượng axit amin trong các mẫu nấm với độ tin cậy cao và đề nghị được áp dụng phương pháp phân tích axit amin này cho nhiều đối tượng thực phẩm khác nhau. Thanks for your attention!