Đồ án So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III

ẩn và thử: 32 µg/ml * Tiến hành: 9 Lần lượt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin trong dung dịch thử, chuẩn và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng berberin cĩ trong chế phẩm.  Phương pháp 3: [16] * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột Hypersil C18 ( 5 µm, 25 cm x 4,6 mm) - Pha động: Acid phosphoric 0,04 mol/l – acetonitril ( 58: 42). - Tốc độ dịng: 1ml/phút. - Detector UV ở bước sĩng 349 nm. * Tiến hành: Tương tự như 2 phương pháp HPLC đã trình bày ở trên. 1.3. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP HPLC 1.3.1. Nguyên tắc Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hĩa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luơn tiếp xúc nhưng khơng hịa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung mơi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung mơi pha động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in. [8] 1.3.2. Cơ sở lý thuyết Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với 10 một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung mơi mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta cĩ sắc đồ. [8], [11] 1.3.3. Các thơng số đặc trưng của quá trình sắc ký: Kết quả của quá trình sắc kí được detector phát hiện, phĩng đại và ghi thành sắc ký đồ( hình 1): Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thơng số đặc trưng Trong đĩ : to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách tR (thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào cột cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích. tR’ (thời gian lưu thực ) = tR- to. W0,5: Độ rộng pic ở nửa chiều cao Wb: Độ rộng đáy pic. 1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’ [8] t t Wb2 0.5-2W 0.5-1W b1W R2 R2t' t'R1 R1t o 1 t t t tt t 't 'k 0 R 0 0R 0 R −= − == 11 Nếu k' nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng cĩ giá trị khác nhau. 1.3.2.2 Độ chọn lọc α (selectivity - factor) α= tt tt 'k 'k 01R 02R 1 2 − − = (k2' > k1' ) [4], [8] α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2. 1.3.2.3. Độ phân giải (resolution) Đặc trưng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo cơng thức: =R ( ) ( )               α −α = + − = + − + 'k1 'k ww tt ww tt B B A2/1B2/1 A,RB,R AB A,RB,R 1 4 N18,12 [4], [8] Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5 1.3.2.4. Hệ số bất đối AF Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nĩ được tính theo cơng thức: a2 AF w 20/1= [4], [8] Trong đĩ: W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic a: khoảng cách từ đường vuơng gĩc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. Khi AF nằm trong khoảng 0,5-2,5 thì phép định lượng được chấp nhận, nếu AF càng tăng lên thì hiện tượng kéo đuơi càng rõ. Hiện tượng đỉnh kéo đuơi (tailing peak) cĩ thể là do tương tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh hoặc cột sắc ký bẩn. Đỉnh kéo tuyến trước (fronting peak) cĩ thể do lượng mẫu đưa vào quá lớn so với năng lực cột [7]. 1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N Đặc trưng cho hiệu lực cột. 12 N = 16       w t B R 2 hay N=5,54       w t B2/1 R 2 [4], [8] Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng cơng thức: =H N L 1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8] Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau: a/Hệ thống bơm Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 - 400 bar) a/ Bình chứa dung mơi và hệ thống xử lý dung mơi Bình chứa dung mơi thường bằng thủy tinh hoặc thép khơng gỉ. Dung mơi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm ) và đuổi khí hịa tan. c/ Hệ tiêm mẫu Để đưa mẫu phân tích vào cột. Cĩ nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động. Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng cĩ thể được tiêm ngay sau khi lọc loại tạp qua màng lọc 0,45 µm, cịn mẫu rắn cần hịa tan trong 1 dung mơi thích hợp. d/ Cột sắc ký lỏng HPLC Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hĩa chất, chịu được với áp suất cao đến vài trăm bar. - Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh cĩ đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 µm). - Đường kính cột: 4 hoặc 4,6 mm. 13 e/ Detector trong HPLC Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp thụ UV - VIS. Ngồi ra cịn cĩ detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hĩa. f/ Thiết bị hiển thị kết quả Cĩ nhiều loại nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín hiệu đo dưới dạng pic. Sơ đồ khối hệ thống HPLC được tổng quát ở hình 2 Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC 1.3.5. Cách đánh giá pic[7] * Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tương ứng với tổng lượng chất đĩ. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy tích phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số 1,3 %). Phương pháp này cĩ thể dùng cho các pic khơng bị trơi đường nền và cả pic cĩ đường nền bị trơi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu Cột Binh chứa pha động Bơm Detector Bộ phận tự ghi Van tiêm mẫu 14 điểm cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao. * Đánh giá chiều cao pic: Khi pic cĩ dạng khơng đổi thì chiều cao pic (khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích pic và nĩ cũng cĩ thể dùng để đánh giá phổ. Phương pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số k' là hằng định. * Với pic cĩ đường nền bị nhiễu hoặc bị hẹp thì việc xác định chiều cao pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic. 1.4.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS 1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6] 1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc cĩ bước sĩng ở và cường độ Io qua dung dịch đồng nhất cĩ nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là l. Khi đi qua dung dịch ,một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần cịn lại (I) thì đi qua dung dịch . Mối quan hệ giữa I và Io được thể hiện bằng định luật Lambert-Beer. I = Io × 10 -ồCl Với ồ là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này khơng phụ thuộc vào nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bước sĩng của ánh sáng chiếu vào dung dịch. 1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert – beer + Chùm tia sáng phải đơn sắc + Dung dịch phải lỗng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp) + Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang). + Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền duới tác dụng của ánh sáng (UV-VIS). 1.4.1.3. Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer 15 + Sự sai lệch do máy:(do bộ phận đơn sắc ,bộ phận khuếch đại kém) như do tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém. + Sai lệch do hố học: - Do sự phân ly (ion hố): thường gặp khi pha lỗng dung dịch, phân tử chất tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân ly khơng như nhau. - Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại cĩ độ hấp thụ khác dạng đơn phân tử. + Do phản ứng các chất lạ: - Chất lạ cĩ thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phịng hiện tượng này xảy ra, người ta dùng mẫu trắng cĩ thành phần như dung dịch, chỉ thiếu chất cần định lượng. - Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng cĩ thể ảnh hưởng tới kết quả định lượng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng ″tạo màu″, phải chú ý tới điều kiện phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng. 1.4.1.4. Một số đại lượng thơng dụng[ a/ Độ truyền qua (T-Transmittance): Độ truyền qua (hay cịn gọi là độ thấu quang) đặc trưng cho độ trong suốt (về mặt quang học) của dung dịch, được định nghĩa: T = 0 tI I = 10-ồCl Thường T tính ra phần trăm (%). Một chất cĩ T=1(hay100%), nghĩa là hồn tồn khơng cĩ hấp thụ ánh sáng, người ta nĩi chất đĩ hồn tồn trong suốt. b/ Độ hấp thụ (A-Absorbance): Độ hấp thụ (hay cịn gọi là mật độ quang) được định nghĩa : A = lg 1 T = ồ.C.l 16 Đối với một chất xác định (cĩ ồ xác định), thường đo trên một loại cốc đo (cĩ bề dày thơng thường là l=1 cm), như vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch: A=K.C (K=ồ.l) c/ Hệ số hâp thụ phần trăm ( 11%cmE ): Theo cơng thức A =ồ.C.l, nếu l=1 cm, C=1% thì : A = ồ = 11% cmE Vậy 11% cmE chính là độ hấp thụ của dung dịch cĩ nồng độ 1%, dùng cốc đo cĩ bề dày 1cm. Với một chất tan xác định, tại một ở xác định, 11% cmE là một hằng số. d/ Hệ số hấp thụ phân tử (ồỡ): Hệ số hấp thụ phân tử, hay cịn gọi là hệ số tắt mol là độ hấp thụ của dung dịch cĩ nồng độ 1M/l, dùng cốc đo cĩ bề dày1cm. Cũng như 11% cmE , với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác định (ở, dung mơi, nhiệt độ,...) ồỡ là một hằng số. Giữa 11% cmE và ồỡ cĩ mối liên hệ ồỡ = 1 1% 10 cmE × M ở đây M là phân tử gam của chất tan. 1.4.2. Một số kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV- VIS.[2],[4],[8] 1.4.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp: Đo độ hấp thụ của dung dịch, tính nồng độ C của dung dịch dựa vào giá trị 11% cmE biết trước (tra cứu). A = 11% cmE .C.l → C = 1 1% cm A E (với l =1 cm) 17 Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bước sĩng (ở) và mật độ quang A bằng cách:  Dùng đèn thuỷ ngân, đèn D2 (cho một vạch sáng cĩ bước sĩng xác định).  Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.  Dùng một kính lọc Holmium (cĩ các giá trị ởmax xác định cho trong tài liệu )để kiểm tra lại máy.  Dùng dung dịch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiết quang phổ pha thành dung dịch cĩ nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị ởmax và tìm Amax . 1.4.2.2. Phương pháp so sánh Đo độ hấp thụ Ax, Ac của dung dịch thử cĩ nồng độ Cx (chưa biết) và của dung dịch chuẩn cĩ nồng độ Ac (đã biết). Ta cĩ: x c A A = xC cC → Cx = x c A A x Cc Chú ý: nồng độ của dung dịch thử Cx và của dung dịch chuẩn Cc khơng được chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết quả càng chính xác. Ngồi ra cịn cĩ các kỹ thuật định lượng khác như: phương pháp đường chuẩn, phương pháp thêm đường chuẩn, phương pháp chuẩn độ đo quang, phương pháp định lượng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ . 18 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu, hố chất, thuốc thử: 2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu: . Berberin clorid: Chất chuẩn hàm lượng 83,3% do Viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp . Berberin clorid dạng nguyên liệu do bộ mơn Hố Dược cung cấp . Palmatin: do viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp 2.1.1.2. Hố chất, thuốc thử: . Muối potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric (H3PO4) . Heptane sodium sulfonate, triethylamine . Acetonitril dùng cho HPLC (Merk) . Nước cất 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ mơn Hĩa vơ cơ trường đại học Dược Hà Nội) dùng cho máy HPLC . Một vài hĩa chất khác 2.1.1.3. Thiết bị: + Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX- Detector UV Diode array- PDA 100 + Cân phân tích AY 220 , Max = 220 g, độ chính xác 0,1 mg + Máy đo pH JENWAY của Anh + Máy cất nước 2 lần + Máy lắc siêu âm EBRO ARMATUREN của Đức 19 + Máy lọc hút chân khơng Satorius + Bình định mức các loại: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml ... + Cốc cĩ mỏ: các loại 100; 200; 500 + Pipet chính xác, pipet thường, đũa thủy tinh. + Bơm tiêm, lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 µm... 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu: . Phân tích mẫu thử bằng phương pháp HPLC và phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV- VIS . Đánh giá độ chính xác, tính đúng, tính tuyến tính, tính đặc hiệu của hai phương pháp trên . So sánh 2 phương pháp trên 2.1.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu:  Nghiên cứu trên lý thuyết và tài liệu tham khảo để lựa chọn phương pháp phân tích  Bằng thực nghiệm, dựa vào kết quả thu được, xử lý thống kê và rút ra kết luận  Phương pháp sử dụng trong thực nghiệm: HPLC, Đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 2.1.2.3.Phương pháp xử lý số liệu thống kê: . Dữ liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê - sử dụng cơng cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft Excel . Một số đặc trưng thống kê được sử dụng: - Giá trị trung bình: ∑ = = n 1i ixn 1 x - Độ lệch chuẩn: ( ) 1n x S n 1i 2 ix − − = ∑ = 20 - Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): RSD% = S x × 100 - Sai số chuẩn : n S sx = - Sai số tương đối: ( ) 100 x % st x)1n( ××=ε −α - Khoảng tin cậy: µ = x ± tαSx Trong đĩ : xi là kết quả xác định lần thứ i ; n là số lần xác định + Tiêu chuẩn Fischer để đánh giá độ chính xác hay độ lặp lại của 2 phương pháp thí nghiệm khác nhau : Ftn = 2 1 2 2 S S ; trong đĩ S1 > S2 Ftn>Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác nhau cĩ ý nghĩa thống kê  Ftn>Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác nhau cĩ ý nghĩa thống kê  Ftn<Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê  Flt tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n – 1 + Test T để so sánh giá trị trung bình kết quả định lượng của hai phương pháp khác nhau : T = 1 2 1 2 1 1p n n X X S + − ( 1 2X X> ) với pS = ( ) ( )2 21 1 2 2 1 2 1 1 2 n S n S n n − + − + − 21  T < 1 2 2/2n ntα + − : giá trị trung bình kết quả định lượng của hai phương pháp khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê  T > 1 2 2/2n ntα + − : giá trị trung bình kết quả định lượng của hai phương pháp khác nhau cĩ ý nghĩa thống kê  1 2 2/2 n ntα + − tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n1+n2-2 2.2. Kết quả thực nghiệm : 2.2.1. Định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III * Cách tiến hành : + Dung dịch thử : Cân 0,200 g chế phẩm và hồ tan trong 200 ml nước bằng cách đun nĩng. Sau đĩ làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml. Lấy 10 ml dung dịch này pha lỗng với nước đến 100 ml (C = 20 µ g/ml) + Dung dịch chuẩn được pha tương tự dung dịch thử , dùng chất đối chiếu berberin clorid + Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện tại bước sĩng cực đại 421 nm với mẫu trắng là nước cất, cốc đo dày 1 cm. * Cách tính kết quả : * Do cĩ sẵn berberin, mặt khác dự định áp dụng phương pháp này cho cả berberin trong các dạng bào chế nên chúng tơi thay kali dicromat bằng berberin chuẩn. 22 Theo phương pháp so sánh, hàm lượng phần trăm được tính theo cơng thức : C% = t c c t mA mA × × × C Trong đĩ : C% : Hàm lượng % Berberin clorid cĩ trong mẫu thử. C : Hàm lượng % Berberin clorid cĩ trong mẫu chuẩn At : Độ hấp thụ của dung dịch thử. Ac : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn. mt : Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid trong bột nguyên liệu đã cân để pha dung dịch thử. mc : Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid chuẩn đã cân để pha dung dịch chuẩn. Tiến hành định lượng 5 mẫu. Kết quả ghi trong bảng 1 . Bảng1 : Kết quả định lượng Beberin clorid trong nguyên liệu STT Khối lượng cân(g) Độ hấp thụ(A) C% 1 0,1971 0,269 86,50 2 0,2010 0,272 85,76 3 0,2062 0,280 86,06 4 0,2090 0,285 86,42 5 0,2030 0,277 86,48 Chuẩn 0,2001 0,263 83,30 23 Theo kết quả ở bảng 1, ta cĩ:  Giá trị trung bình: X = 86,24%  Độ lệch chuẩn : S = 0,324  Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%): ∆X(%) = 0,40  Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = 0,37% Kết luận: Hàm lượng Beberin clorid trong bột nguyên liệu là 86,24% ± 0,40%. 2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III 2.2.2.1./Tính chính xác : Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của các phép thử song song. Cách tiến hành và kết quả được trình bày như trong phần 2.2.1.1 Kết quả thử độ chính xác của phương pháp cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả (RSD = 0,37% < 2%). Như vậy phương pháp là chính xác 2.2.2.2 Tính tuyến tính: Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ trên chất chuẩn Berberin. Cân 5 mẫu chất chuẩn Berberin clorid cĩ khối lượng từ 0,1600g→ 0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định lượng) Cách tiến hành tương tự 2.2.1 Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch 24 STT 1 2 3 4 5 C (mg/ml) 0,0161 0,0180 0,0202 0,0220 0,0240 A 0,215 0,239 0,262 0,286 0,315 Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch - Phương trình hồi quy biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch là: y = 12,5 x + 0,013; - Hệ số tương quan: 0,998 - Độ lệch chuẩn của y_ intercept: Sb = 0,009 - Với độ tin cậy 95% ta cĩ khoảng tin cậy của y_intercept: b ±3,182Sb = 0,013 ± 0,029 hay - 0,016 ≤ y_intercept ≤ 0,042 Từ kết quả trên cho thấy hệ số tương quan của đường hồi quy vượt quá 0,99…Tất cả các giá trị nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả hai phía của đường hồi quy. Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. Vậy phương pháp là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ làm việc. y = 12.5x + 0.013 R = 0.998 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 § é h Êp t h ơ A C(mg/ml) 25 2.2.2.3. Độ đúng: . Cân 3 mẫu chất đối chiếu Beberin clorid ( hàm lượng 83,3%) với khối lượng từ 0,1600g → 0,2400g (tại các điểm 80, 100, 120% so với lượng cân dùng khi định lượng) . Tiến hành tương tự 2.2.1. Mỗi mẫu đo 3 lần, lấy kết quả trung bình . Tính tốn kết quả khảo sát độ đúng dựa vào độ hấp thụ của mẫu chuẩn là 0,263 ứng với khối lượng cân 0,2001g Kết quả thu được ghi ở bảng 3 Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS STT Khối lượng cân (g) Lượng hoạt chất cĩ thực a (g) Độ hấp thụ trung bình (A) Lượng tìm lại trung bình b (g) Phần trăm tìm lại (b/a.100%) 1 0,1605 0,1337 0,208 0,1322 98,88 2 0,2020 0,1683 0,267 0,1696 100,77 3 0,2362 0,1967 0,313 0,1984 100,86 Từ kết quả bảng 3 ta cĩ: - Trung bình % tìm lại: 100,17% - Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban đầu và lượng hoạt chất tìm lại là: y = 1,052x – 0,008 - Hệ số tương quan: r = 0,999 26 - Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,003 - Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,019 - Với độ tin cậy 95% ta cĩ: Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 3,182Sa = 1,052 ± 0,060 hay 0,992 < a < 1,112 Khoảng tin cậy của y_intercept: b ± 3,182Sb = - 0,008 ± 0,009 hay - 0,017 < y_intercept < 0,001 Hình 7: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối tương quan giữa lượng hoạt chất tìm lại và lượng hoạt chất cĩ thực Kết luận: - Khơng cĩ sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. - Khơng cĩ sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy độ dốc chứa 1. - Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,17% nghĩa là nằm trong khoảng từ 98% đến 102%. Như vậy, phương pháp đưa ra là đúng trong khoảng khảo sát. 2.2.2.4. Tính đặc hiệu: Như trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhưng trong điều kiện thí nghiệm khơng cĩ chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tơi chỉ tiến hành xác định sự ảnh hưởng của tạp chất Palmatin đối với phương pháp định lượng y = 1.052x - 0.008 R = 0.999 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 L ỵ n g t ×m l ¹i ( g ) Lỵng ho¹t chÊt cã thùc (g) 27 Tiến hành: + Cân 0,200 g chất chuẩn berberin clorid và hịa tan trong 200 ml nước bằng cách đun nĩng. Sau đĩ làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml, thu được dunhg dịch berberin chuẩn 0,2 mg/ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào 4 bình định mức 100 ml. + Pha dung dịch Palmatin 10%, 5% và 2,5% so với nồng độ của berberin clorid đem đo . Cân 0,02 g Palmatin chuẩn và hịa tan trong 20 ml nước bằng cách đun nĩng. Sau đĩ làm lạnh và thêm nước đến 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dung dịch palmatin chuẩn 0,02 mg/ml . Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,02 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, ta được dung dịch palmatin 0,01 mg/ml. . Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,01 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dugn dịch palmatin 0,005 mg/ml. . Lần lượt thêm 10 ml dung dịch palmatin 0,02; 0,01; 0,005 mg/ml vào 3 bình định mức 100 ml đã chứa berberin clorid chuẩn trên và thêm nước vừa đủ tới vạch. Một bình định mức 100 ml khơng thêm palmatin và thêm nước tới vạch. Đem đo độ hấp thụ quang của dung dịch 4 bình này tại bước sĩng 421 nm Bảng 4: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới độ hấp thụ quang của berberin clorid Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4 Berberin clorid 0,2 mg/ml (ml) 10 10 10 10 Palmatin 0,02 mg/ml (ml) 10 Palmatin 0,01 mg/ml (ml) 10 28 Palmatin 0,005 mg/ml (ml) 10 Độ hấp thụ A 0,263 0,282 0,271 0.266 Nhận xét: Từ kết quả bảng trên, ta thấy độ hấp thụ quang của dung dịch tăng theo sự tăng của nồng độ dung dịch palmatin. Khi thêm 2,5% palmatin, hàm lượng berberin trong bột nguyên liệu định lượng theo phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS của DĐVN III tăng 1,14%. Nếu cĩ 2% palmatin như trong giới hạn về palmatin mà DĐVN III yêu cầu thì kết quả định lượng tăng 0,91% Vậy phương pháp khơng cĩ tính đặc hiệu. 2.2.3. Định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): Điều kiện sắc ký để định lượng Berberin clorid nguyên liệu - Cột sắc ký: hạt nhồi silicagel được octadecylsilan hĩa - Detector UV: 263 nm - Pha động: đệm phosphate [ hỗn hợp KH2PO4 0,05M và heptan Na sulfonate(1:1) chứa 0,2% triethylamin, điều chỉnh pH=3,0 bằng H3PO4] – acetonitril (60:40). - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phịng thí nghiệm - Thể tích tiêm: 20ỡl - Tốc độ dịng: 1,5 ml/phút * Tiến hành: + Dung dịch thử: Cân 0,04 g berberin clorid hịa tan trong nước nĩng, cho vào bình định mức 100 ml.Sau đĩ làm lạnh và thêm nước tới vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 ỡm, bỏ 8 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 2 ml dịch lọc trên cho vào bình định mức 25 ml , thêm nước tới vạch. 29 + Dung dịch chuẩn : pha tương tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu berberin clorid + Tiêm lần lượt 10 ỡl dung dịch chuẩn và các dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, chạy sắc ký theo các điều kiện đã lựa chọn. Dựa vào diện tích hoặc chiều cao pic trên sắc đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử, nồng độ của dung dịch chuẩn, tính hàm lượng (%) Berberin clorid cĩ trong mẫu thử theo cơng thức sau: HL% = 83,30t c c t S m S m × × × Trong đĩ: tS : Diện tích pic mẫu thử cS : Diện tích pic mẫu chuẩn ( cS = 12,2646) cm : Khối lượng cân mẫu chuẩn (0,0405 g) X : Khối lượng cân mẫu thử 83,30: Hàm lượng thực của mẫu chuẩn Bảng 5: Kết quả định lượng Berberin clorid nguyên liệu STT Khối lượng cân (g) Diện tích pic (mAU.min) Hàm lượng (%) 1 0,0407 12,6917 85,78 2 0,0402 12,6120 86,30 3 0,0398 12,4224 85,86 4 0,0405 12,7101 86,32 5 0,0400 12,5350 86,20 Chuẩn 0,0405 12,2646 83.30 Theo kết quả ở bảng 5, ta cĩ: 30 - Giá trị trung bình: X = 86,09 % - Độ lệch chuẩn: S = 0,254 - Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%): X (%) = 86,09% ± 0,315% - Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = 0,295 Vậy theo phương pháp định lượng trên, hàm lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu là: 86,09% ± 0,315% 2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): 2.2.4.1. Tính chính xác: Cách tiến hành và kết quả được trình bày như trong phần 2.2.3 Kết quả thử độ chính xác cho thấy độ lệch chuẩn của các kết quả RSD =0,295 % < 2%. Vậy phương pháp là chính xác. 2.2.4.2. Tính tuyến tính: Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic trên chất chuẩn Berberin. Cân 5 mẫu chất chuẩn Berberin clorid cĩ khối lượng từ 0,1600g→ 0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định lượng) Tiến hành tương tự 2.2.3 Kết quả thu được ở bảng 6 Bảng 6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch STT 1 2 3 4 5 C (ỡg/ml) 25,76 28,80 32,16 35,04 38,48 Diện tích pic (mAU.min) 9,7115 10,8580 12,1243 13,2081 14,5069 31 Hình 10: Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic vào nồng độ của dung dịch - Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch là:y = 0,377x + 0,002 - Hệ số tương quan: R = 0,9999 - Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,003 - Với độ tin cậy 95% ta cĩ khoảng tin cậy của y_intercept: b ± 3,182Sb = 0,002 ± 0,009 hay - 0,007 < y_intercept <0,011 Nhận xét: Hệ số tương quan của đường hồi quy vượt quá 0,99…Tất cả các giá trị đo được nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả hai phía của đường hồi quy. Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. Vậy phương pháp này là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ làm việc. 2.2.4.3. Tính đúng: . Cân 3 mẫu chất đối chiếu berberin clorid (hàm lượng 83,3%) với khối lượng từ 0,032g → 0,048g (tại các điểm 80%,100%,120% so với lượng cân dùng khi định lượng). . Mỗi mẫu chạy sắc ký 3 lần, lấy giá trị trung bình. Tiến hành tương tự 2.2.3 y = 0.377x + 0.002 R = 0,999 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 D iƯ n t Ýc h p ic ( m A U .m in ) C(µg/ml) 32 . Tính tốn kết quả khảo sát tính đúng dựa trên diện tích pic của mẫu chuẩn là 12,2646 mAU.min ứng với khối lượng cân 0,0405 g. Két quả thu được ghi ở bảng 7 Bảng 7: Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp HPLC STT Khối lượng cân(g) Lượng Beberin clorid cĩ thực a (g) Diện tích pic trung bình (mAU.min) Lượng tìm lại trung bình b (g) Phần trăm tìm lại %=b/a× 100% 1 0,0322 0,0268 9,8535 0,0270 100,75 2 0,0402 0,0335 12,1701 0,0334 99,70 3 0,0481 0,0401 14,5705 0,0400 99,75 Hình 11: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối tương quan giữa lượng hoạt chất cĩ thực và lượng tìm lại - Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban đầu và lượng hoạt chất tìm lại là: y = 0,997x + 0,001 - Hệ số tương quan: R = 0,999 - Trung bình % tìm lại :100,07% - Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,001 - Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,013 y = 0.977x + 0.001 R = 0.999 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 L ỵ n g t ×m l ¹i ( g ) Lỵng ho¹t chÊt cã thùc (g) 33 - Với độ tin cậy 95% ta cĩ: Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 3,182Sa hay 0,9560 < a <1,038 Khoảng tin cậy của y_intercept :b ± 3,182Sb hay -0,002 < y_intercept <0,004 Kết luận : - Khơng cĩ sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. - Khơng cĩ sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy của độ dốc chứa 1. - Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,07% nằm trong khoảng từ 98% đến 102%. Như vậy phương pháp là đúng trong khoảng khảo sát. 2.2.4.4. Tính đặc hiệu: Như trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhưng trong điều kiện thí nghiệm khơng cĩ chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tơi chỉ tiến hành xác định sự ảnh hưởng của tạp chất Palmatin đối với phương pháp định lượng Tiến hành: . Cân 0,04 g berberin clorid chuẩn hịa tan trong nước nĩng, cho vào bình định mức 100 ml.Sau đĩ làm lạnh và thêm nước tới vạch, thu được dung dịch Berberin clorid 0,4 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 ỡm, bỏ 8 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 2 ml dịch lọc trên cho vào 4 bình định mức 25 ml , thêm nước tới vạch. . Pha dung dịch palmatin chuẩn cĩ nồng độ 10%; 5%; 2,5% so với nồng độ berberin clorid đem chạy sắc ký. + Cân 0,04 g palmatin chuẩn hịa tan trong nước nĩng, cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước tới vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 ỡm, bỏ 8 ml 34 dịch lọc đầu. Lấy 5 ml dịch lọc này cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước tới vạch, thu được dung dịch palmatin 0,04mg/ml. + Lấy chính xác 25 ml dung dịch palmatin 0,04 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước tới vạch., thu được dung dịch palmatin 0,02 mg/ml. + Lấy chính xác 25 ml dung dịch palmatin 0,02 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước tới vạch, thu được dung dịch palmatin 0,01 mg/ml. . Lần lượt thêm 2 ml dung dịch palmatin 0,04; 0,02; 0,01 mg/ml vào 3 bình định mức 25 ml trên, thêm nước vừa đủ tới vạch. Bình định mức 25ml khơng thêm palmatin được thêm nước vừa đủ tới vạch. . Chạy sắc ký dung dịch 4 bình này. Kết quả thu được ghi trong bảng 8 Bảng 8: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới diện tích pic của Berberin clorid Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4 Berberin clorid 0,4 mg/ml 2 2 2 2 Palmatin 0,04 mg/ml 2 Palmatin 0,02 mg/ml 2 Palmatin 0,01 mg/ml 2 Diện tích pic (mAU.min) 12,2650 12,3011 12,3229 12,2530 35 Hình 12: Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 13: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Hình 14: Sắc ký đồ mẫu chuẩn cĩ thêm Palmatin Nhận xét: Diện tích pic hầu như khơng thay đổi khi cĩ mặt tới 10% palmatin. Vậy phương pháp cĩ tính đặc hiệu khi cĩ mặt của tạp chất này. 2.2.5. So sánh hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc 2005 và đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III: 2.2.5.1. So sánh kết quả độ chính xác của hai phương pháp định lượng: 0.7 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 13.4 -5.0 35.0 KLLien #83 [modified by Adminis trator] BERBERIN T H10,4 UV_VIS_1 mAU min 1 - 4.653 2 - 7.420 WVL:263 nmAz 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1 -0.10 1.0 ] UV_VIS_1 mAU min WVL:263 nm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1 -5.0 35.0 BERBERIN CH UV_VIS_1 mAU min 1 - 7.353 WVL:263 nm 36 Các tính tốn được thực hiện trên các kết quả thu được khi định lượng Berberin clorid nguyên liệu do bộ mơn Hĩa Dược trường Đại Học Dược Hà Nội cung cấp. Tĩm tắt kết quả thu được khi định lượng nguyên liệu Berberin clorid bằng hai phương pháp ở bảng 9 Bảng 9: Tĩm tắt các kết quả thực nghiệm thu được khi định lượng nguyên liệu Berberin clorid Phương pháp Hàm lượng trung bình (%) Phương sai (S2) Độ lêch chuẩn (S) Số lần thí nghiệm HPLC 86,09 0,0645 0,254 5 Đo quang UV-VIS 86,24 0,1050 0,324 5 Dùng chuẩn F (Fisher): Ftn = S12/S22 (S1>S2) Ftn = 0,1050/0,0645 = 1,3 S1: độ lệch chuẩn của phương pháp đo quang UV-VIS S2: độ lệch chuẩn của phương pháp HPLC Flt ( ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K1 = 5 - 1 = 4; K2 = 5 - 1 = 4) là: 6,39 Như vậy Ftn<Flt do đĩ độ lặp lại của 2 phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê. 2.2.3.2. So sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp định lượng : Do độ lặp lại của 2 phương pháp định lượng khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê nên để so sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp định lượng, ta dùng Test T. 37 T = 1 2 1 2 1 1p n n X X S + − với pS = ( ) ( )2 21 1 2 2 1 2 1 1 2 n S n S n n − + − + − T phân phối Student với n1 + n2 – 2 bậc tự do ở mức tin cậy 95% hay ỏ =0,05, ta cĩ: ( )1 2 2 8/2 0,025n nt tα + − = =2,306 pS = 4.0,0645 4.0,1050 5 5 2 + + − = 0,291 Do đĩ Tqs = 86,24 86,09 1 10,291 5 5 − + = 0,815 Như vậy 0,815 < 2,306 nên với mức ý nghĩa 0,05 giá trị trung bình hàm lượng Berberin trong nguyên liệu của hai phương pháp định lượng khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê. 2.2.3.2. Đánh giá ưu nhược điểm của hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III  Phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): + Ưu điểm: . Phương pháp cĩ tính đặc hiệu khi cĩ mặt tạp chất palmatin + Nhược điểm: . Yêu cầu phải cĩ các hĩa chất dung mơi tinh khiết dùng cho HPLC . Chi phí cao khi phải chạy pha động cĩ acetonitril và đặc biệt là hĩa chất heptan natri sulfonat rất đắt tiền . Quá trình chuẩn bị chạy sắc ký và chạy đường nền tốn thời gian  Phương pháp đo quang phổ UV-VIS theo DĐVN III: + Ưu điểm: . Khơng tốn hĩa chất dung mơi 38 . Thời gian phân tích nhanh chĩng, chỉ cần 5-10 phút cĩ thể cho biết ngay kết quả . Kỹ thuật thao tác đơn giản, máy mĩc dễ tìm, gọn nhẹ + Nhược điểm: Phương pháp khơng cĩ tính đặc hiệu (palmatin ảnh hưởng tới kết quả định lượng) 2.3. BÀN LUẬN: Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại, đang từng bước được đưa vào phịng kiểm nghiệm và trung tâm kiểm nghiệm ở Việt Nam. Phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) cho biết hàm lượng Berberin trong nguyên liệu là 86,09% ± 0,315%; phương pháp chính xác với RSD = 0,295% < 2%, tuyến tính trong khoảng 80%-120% nồng độ định lượng và đúng trong khoảng khảo sát. Ưu điểm của phương pháp này là cĩ tính đặc hiệu khi cĩ mặt tạp chất palmatin trong nguyên liệu Berberin. Tuy nhiên phương pháp này lại rất tốn kém khi phải dùng những dung mơi và hĩa chất đắt tiền như: natri heptan sulfonat, acetonitril… Hàm lượng Berberin trong nguyên liệu khi định lượng bằng phương pháp đo quang phổ UV-VIS theo DĐVN III là 86,24% ± 0,40%; phương pháp chính xác với RSD = 0,37% < 2%, tuyến tính trong khoảng 80%-120% nồng độ định lượng và đúng trong khoảng khảo sát nhưng khơng đặc hiệu ( tạp chất palmatin ảnh hưởng tới kết quả định lượng). Tuy nhiên. DĐVN III cĩ quy định giới hạn tạp chất palmatin khơng quá 2% [6]. Theo kết quả ở mục 2.2.2.4 thì nếu palmatin cĩ mặt 2%, kết quả định lượng tăng 0,91%. Nên với berberin nguyên liệu thõa mãn yêu cầu về giới hạn tạp chất palmatin thì sự cĩ mặt của palmatin khơng ảnh hưởng lớn đến kết quả định lượng. 39 Ngồi ra, khi so sánh kết quả của hai phương pháp định lượng ta thấy độ chính xác và giá trị trung bình khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê. Như vậy, nếu khơng yêu cầu độ chính xác cao, cĩ thể dùng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III để định lượng berberin nguyên liệu (đạt yêu cầu về giới hạn tạp chất palmatin khơng quá 2%) vì phương pháp này khơng tốn kém, tiến hành nhanh, thao tác đơn giản, dễ thực hiện. Với thành phẩm do khơng quy định hàm lượng palmatin và những tạp khác cũng cĩ thể hấp thụ UV nên để cĩ kết quả định lượng chính xác thì nên dùng phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005). KẾT LUẬN * Kết luận Trong quá trình thực hiện khĩa luận tốt nghiệp, chúng tơi đã thu được một số kết quả: + Xác định được hàm lượng của berberin trong nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ UV-VIS ( theo DĐVN III) và bằng phương pháp HPLC( theo dược điển Trung Quốc 2005). Kết quả cho thấy cả hai phương pháp đều đáp ứng các chỉ tiêu : độ chính xác, độ đúng, tính tuyến tính. Nhưng chúng khác nhau về tính đặc hiệu: phương pháp HPLC với sự cĩ mặt palmatin khơng ảnh hưởng tới kết quả định lượng, trong khi đĩ palmatin ảnh hưởng tới kết quả định lượng trong phương pháp đo quang phổ UV-VIS + Hiểu được cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, một phương pháp phân tích hiện đại cĩ nhiều ứng dụng trong kiểm nghiệm thuốc, biết sử dụng thành thạo các thao tác cơ bản của máy HPLC. + Học được cách tìm tài liệu, làm thực nghiệm và trình bày văn bản một cách khoa học về một vấn đề nghiên cứu; 40 + Tìm hiểu phương pháp HPLC, làm quen và sử dụng thành thạo được máy HPLC để định lượng một sản phẩm; biết cách đánh giá một phương pháp định lượng. * Đề xuất: Do điều kiện thời gian và hĩa chất cĩ hạn nên chúng tơi chỉ mới tiến hành định lượng Berberin clorid nguyên liệu. Tuy nhiên từ kết quả thu được trong khĩa luận, chúng tơi cĩ những đề xuất sau: + Áp dụng phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc(2005) để định lượng Berberin clorid trong một số chế phẩm thuốc nhỏ mắt + Nghiên cứu, khảo sát điều kiện định lượng berberin bằng HPLC khơng phải dùng Natri heptan sulfonat để áp dụng định lượng ở các cơ sở kiểm nghiệm trong nước. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng việt 1. Bộ mơn Dược liệu (1998), Bài giảng dược liệu, Trường ĐH Dược Hà Nội, tập 2, tr. 89- 91. 2. Bộ mơn Hĩa Phân tích (2006), Hĩa phân tích, Trường ĐH Dược Hà Nội, tập 2, tr. 41- 62. 3. Bộ mơn Hĩa Phân tích (2002), Hĩa phân tích, Trường ĐH Dược Hà Nội, tập 1, tr. 27- 44. 4. Bộ mơn Hĩa Phân tích (2004), Kiểm nghiệm thuốc, Trường ĐH Dược Hà Nội, tr. 68- 79,83-98. 5. Bộ Y tế (1994), Dược điển Việt Nam II, Nhà xuất bản Y học, tập 3, tr.71- 74. 6. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tr.33- 35, 178- 179 phụ lục 3 (PL- 75, 76). 7. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, Nhà xuất bản y học thành phố Hồ Chí Minh, tr.138,148-149. 8. Phạm Gia Huệ, Trần Tử An (1998), Hĩa phân tích tập 2, Đại học dựợc Hà Nội, tr.55-98. 9. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Xuất bản lần thứ VIII- Nhà xuất bản Y học, tr.195. 10. Từ Văn Mạc (1995), Phân tích hĩa lý, NXB khoa học và kỹ thuật Hà Nội, tr.313-319. 11. DS. Phạm Thiệp- DS.Vũ Ngọc Thúy( tái bản lần thứ 13), Thuốc biệt dược và cách sử dụng, Nhà xuất bản Y học, tr.106. II. Tiếng Anh 12. Martindal 34 (2005), volume II, p.1659. 42 13. Pharmacopoeia of the people′s republic of China (2005), volum III, p.94- 96. 14. The Korean Pharmacopoeia, 8th edition (2002), p.81-82. 15. The Japanese Pharmacopoeia fifteenth edition (2006), p.351- 352. 16. Wang, S. D; Song, B.S . (2000), Determination of berberin in decoted liquid from Shensu granules with water by reversed- phase liquid chromatography, Sepu, p. 261- 262. III. Trang web 17. Cây thuốc quý (2007), berberin, www. cây thuốc quý. Info.vn. 18. Wikipedia (2007), berberin, . 43 ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 2 PHẦN I. TỔNG QUAN ................................................................................ 3 1.1. VÀI NÉT VỀ BERBERIN: ................................................................ 3 1.1.1. Cấu trúc: ............................................................................................. 3 Cấu trúc của isoquinolin ............................................................................... 3 Cơng thức cấu tạo: ....................................................................................... 3 1.1.2. Nguồn gốc: ........................................................................................... 3 1.1.3. Tính chất ............................................................................................. 4 1.5. Tác dụng dược lý: .................................................................................. 4 1.1.6. Chống chỉ định: [17] ........................................................................... 5 1.1.7. Dạng thuốc và hàm lượng: [11] .......................................................... 5 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN: .................. 5 1.2.1. Phương pháp thể tích: [5], [13] .......................................................... 5 1.2.2. Phương pháp đo UV-VIS ................................................................... 5 1.2.3. Phương pháp cân [5] .......................................................................... 6 1.2.4. Phương pháp HPLC ........................................................................... 7 1.3. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP HPLC ............................................... 9 1.3.1. Nguyên tắc ........................................................................................... 9 1.3.2. Cơ sở lý thuyết .................................................................................... 9 1.3.3. Các thơng số đặc trưng của quá trình sắc ký: ................................. 10 Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thơng số đặc trưng ............................ 10 1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’ ......................................................................... 10 1.3.2.2 Độ chọn lọc α (selectivity - factor) ................................................... 11 α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2. ...... 11 1.3.2.3. Độ phân giải (resolution) ................................................................ 11 =R ( ) ( )               α −α = + − = + − + 'k1 'k ww tt ww tt B B A2/1B2/1 A,RB,R AB A,RB,R 1 4 N18,12 [4], [8] ...................... 11 Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5 .................................................... 11 1.3.2.4. Hệ số bất đối AF .............................................................................. 11 Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nĩ được tính theo cơng thức: ......... 11 Trong đĩ:...................................................................................................... 11 1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N ............................................................................. 11 N = 16       w t B R 2 hay N=5,54       w t B2/1 R 2 [4], [8] .................................... 12 1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8] ..................................... 12 a/Hệ thống bơm ........................................................................................... 12 a/ Bình chứa dung mơi và hệ thống xử lý dung mơi ................................... 12 c/ Hệ tiêm mẫu ............................................................................................ 12 44 d/ Cột sắc ký lỏng HPLC ............................................................................. 12 e/ Detector trong HPLC ............................................................................... 13 Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC ........................................... 13 1.3.5. Cách đánh giá pic[7] ......................................................................... 13 1.4.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS 14 1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6] ............................................................. 14 1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer ................................................................. 14 1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert – beer ............................... 14 1.4.1.3. Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer ....................................... 14 1.4.1.4. Một số đại lượng thơng dụng[ ........................................................ 15 1.4.2. Một số kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV- VIS.[2],[4],[8] .............................................................................................. 16 1.4.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp: ....................................................... 16 1.4.2.2. Phương pháp so sánh ..................................................................... 17 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .............................................. 18 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................... 18 2.1.1. Nguyên liệu, hố chất, thuốc thử: .................................................... 18 2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu: ................................................................... 18 2.1.1.2. Hố chất, thuốc thử: ...................................................................... 18 2.1.1.3. Thiết bị: .......................................................................................... 18 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu: ................................................................ 19 2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu: ...................................................................... 19 2.1.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu: ........................... 19 2.1.2.3.Phương pháp xử lý số liệu thống kê: ............................................. 19 2.2. Kết quả thực nghiệm : ......................................................................... 21 2.2.1. Định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ........................................... 21 Bảng1 : Kết quả định lượng Beberin clorid trong nguyên liệu................ 22 2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ....... 23 2.2.2.1./Tính chính xác : ............................................................................. 23 Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của các phép thử song song. ............................................... 23 2.2.2.2 Tính tuyến tính: ............................................................................... 23 Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch ............ 23 Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào ................... 24 2.2.2.3. Độ đúng: ......................................................................................... 25 2.2.2.4. Tính đặc hiệu:................................................................................. 26 Bảng 4: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới ... 27 45 2.2.3. Định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): .................................................................................... 28 HL% = 83,30t c c t S m S m × × × .................................................................................. 29 Bảng 5: Kết quả định lượng Berberin clorid nguyên liệu ........................ 29 2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): ..................................... 30 2.2.4.1. Tính chính xác: .............................................................................. 30 2.2.4.2. Tính tuyến tính: .............................................................................. 30 Bảng 6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch .............. 30 2.2.4.3. Tính đúng: ...................................................................................... 31 Bảng 7: Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp HPLC ................ 32 2.2.4.4. Tính đặc hiệu:................................................................................. 33 Hình 12: Sắc ký đồ mẫu trắng .................................................................... 35 Hình 13: Sắc ký đồ mẫu chuẩn ................................................................... 35 Hình 14: Sắc ký đồ mẫu chuẩn cĩ thêm Palmatin ...................................... 35 2.2.5. So sánh hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc 2005 và đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III: ................................. 35 2.2.5.1. So sánh kết quả độ chính xác của hai phương pháp định lượng: 35 2.2.3.2. So sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp định lượng : ......................................................................................................... 36 2.2.3.2. Đánh giá ưu nhược điểm của hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ..... 37 . Khơng tốn hĩa chất dung mơi ..................................................................... 37 . Kỹ thuật thao tác đơn giản, máy mĩc dễ tìm, gọn nhẹ ................................ 38 2.3. BÀN LUẬN: ......................................................................................... 38 KẾT LUẬN ................................................................................................. 39 * Kết luận .................................................................................................... 39 * Đề xuất: .................................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 41 I. Tiếng việt ................................................................................................. 41 II. Tiếng Anh .............................................................................................. 41 III. Trang web ............................................................................................ 42