Đồ án Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC

.................................................................................. - 16 - 1.3.2. Cơ sở lý thuyết .............................................................................. - 17 - 1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC ............................................ - 17 - 1.3.3.1. Hệ thống bơm .............................................................................. - 17 - 1.3.3.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi ......................... - 17 - 1.3.3.3. Hệ tiêm mẫu ................................................................................ - 17 - 1.3.3.4. Cột sắc ký lỏng HPLC ................................................................. - 18 - 1.3.3.5. Detector trong HPLC .................................................................. - 18 - 1.3.3.6. Thiết bị hiển thị kết quả ............................................................... - 18 - - 5 - 1.3.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký .............................. - 19 - 1.3.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký ..................... - 21 - 1.3.5.1. Lựa chọn cột (pha tĩnh) [12], [18] ............................................... - 21 - 1.3.5.2. Lựa chọn pha động cho HPLC [12], [18] .................................... - 22 - 1.3.5.3. Chọn đệm pH ............................................................................... - 23 - 1.3.5.4. Tốc độ dòng ................................................................................ - 23 - 1.3.6. Cách đánh giá pic ......................................................................... - 23 - 1.3.7. Ứng dụng của HPLC .................................................................... - 24 - 1.3.7.1. Định tính và thử độ tinh khiết: ..................................................... - 24 - 1.3.7.2. Sắc ký điều chế: .......................................................................... - 24 - 1.3.7.1. Định lượng: ................................................................................ - 24 - PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .......................................... - 26 - 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM ... - 26 - 2.1.1. Nguyên vật liệu : ........................................................................... - 26 - 2.1.1.1. Nguyên liệu và hoá chất: ............................................................. - 26 - 2.1.1.2. Dụng cụ: ...................................................................................... - 26 - 2.1.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ........................................ - 26 - 2.1.2.1. Phương pháp nghiên cứu ............................................................. - 26 - 2.1.2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................... - 27 - 2.2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .................................................... - 28 - 2.2.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC ............................................................................... - 28 - 2.2.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký ....................................... - 28 - 2.2.1.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc kí: .......................................... - 28 - a. Khảo sát chọn bước sóng thích hợp ...................................................... - 28 - Hình 1: Phổ hấp thụ của dung dịch tobramycin 0,02% ............................. - 29 - b. Lựa chọn cột:........................................................................................ - 29 - c. Lựa chọn đệm: ...................................................................................... - 29 - d. Lựa chọn pha động: .............................................................................. - 30 - e. Lựa chọn tốc độ dòng ........................................................................... - 30 - đ. Điều kiện sắc ký lựa chọn ..................................................................... - 31 - 2.2.2. Qui trình định lượng .................................................................... - 31 - 2.2.2.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống ........................................... - 32 - 2.2.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng ............................................. - 32 - 2.2.2.3. Điều kiện sắc ký .......................................................................... - 33 - 2.2.2.4. Tính kết quả ................................................................................. - 33 - 2.2.3. Định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp mới xây dựng ........................................................................................................ - 34 - 2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng .............................................. - 35 - 2.2.4.1. Tính tuyến tính .......................................................................... - 35 - - 6 - 2.2.4.2. Tính chính xác ........................................................................... - 37 - 2.2.4.3. Tính đúng ................................................................................... - 37 - Bảng 6: Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp ............................. - 38 - 2.2.4.4. Tính đặc hiệu ............................................................................. - 39 - 2.3. BÀN LUẬN VÀ KẾT QUẢ ............................................................. - 40 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................... - 43 - 3.1 KẾT LUẬN ....................................................................................... - 43 - 3.2 ĐỀ XUẤT .......................................................................................... - 43 - - 7 - PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN 1.1.1. Công thức cấu tạo C18H37N5O9 PTL: 467.5 Tên khoa học: 4-O-(3-Amino-deoxy-α-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-O-(2,6- diamino-2,3,6-trideoxy-α-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [21]. 1.1.2. Tính chất lý hóa Bột màu trắng hoặc trắng ngà. Dễ tan trong nước, rất khó tan trong ethanol, thực tế không tan trong cloroform và ether. Góc quay cực riêng [α]D20 : +1380 đến +1480[7] 1.1.3. Nguồn gốc Chiết xuất từ môi trường nuôi cấy Streptomyces tenebrarius, có thể bán tổng hợp từ kanamycin B [7]. 1.1.4. Dược động học Tobramycin hầu như không hấp thu qua đường tiêu hoá nhưng hấp thu tốt qua đường tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch. Thuốc ít liên kết với protein huyết - 8 - tương. Do phân tử phân cực mạnh nên khó đi vào các mô kể cả não. Thuốc đạt nồng độ cao trong vỏ thận. Khi sử dụng cho phụ nữ mang thai, thuốc tích lũy trong thai gây độc cho cả mẹ và con. Tobramycin đào thải chủ yếu qua thận nên phải giảm liều khi suy thận, thường dựa vào creatinin huyết thanh để tránh độc tính. Hiện nay, tobramycin được dùng với chế độ một liều cao và duy nhất trong ngày. Cách dùng này cho thấy hiệu quả điều trị cao hơn và ít độc tính hơn so với dùng liều nhỏ và nhiều lần trong ngày như trước đây. Đối với các ca nặng (nhiễm Pseu. aeruginosa ở người giảm neutrophile và các ca suy thận) cần khoảng cách liều dài hơn 24 giờ. Thời gian bán thải của tobramycin: 2 - 5 giờ [6] 1.1.5. Tác dụng và cơ chế tác dụng Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr (+) hiếu khí. Thuốc không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuẩn yếm khí. Tobramycin rất giống gentamycin về tính chất sinh học và độc tính: chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận. Điểm quan trọng nhất của tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn các chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh hơn cả gentamycin. Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu phân 30S của ribosom [2], [11]. 1.1.6. Chỉ định Được chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gr (-). - 9 - Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng, hoặc trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng toàn thân do Pseudomonas sp. gây ra, tobramycin có thể dùng phối hợp với một kháng sinh nhóm beta-lactam. Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha - Streptococcus gây ra, có thể dùng tobramycin phối hợp với ampicilin hoặc benzylpenicilin nhưng phải tiêm riêng rẽ. [2] 1.1.7. Chống chỉ định Người có tiền sử dị ứng với các kháng sinh loại aminoglycosid, người nghe kém và người có bệnh thận. [2] 1.1.8. Dạng bào chế và liều lượng Tobramycin sulphat: Dung dịch tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch 40 mg/ml (người lớn), 10 mg/ml (trẻ em). Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ. Lọ 5 ml 0,3 % để nhỏ mắt. Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 %. Dạng thuốc hít qua đường miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm P. aeruginosa đường hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa. [11] 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN 1.2.1. Định lượng tobramycin bằng phương pháp vi sinh 1.2.1.1. Phương pháp 1 [15] - Chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis CMCC(B)63501. - Dung dịch đệm phosphat pH 7,8 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 5,59 g Kali dihydrophosphat : 0,41 g - Môi trường định lượng: Pepton : 5,0 g Cao thịt : 3,0 g Dikali hydrophosphat : 3,0 g Thạch : 15,0 - 20,0 g - 10 - Nước cất : 1000 ml pH sau khi tiệt trùng : 7,8 ± 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử sau đó tiến hành thử và tính kết quả theo [15] 1.2.1.2. Phương pháp 2 [3] - Chủng vi khuẩn: Bacillus pumilus NCTC 8241. - Dung dịch đệm phosphat pH 8,0 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 16,75 g Kali dihydrophosphat : 0,523g - Môi trường định lượng: Cao men bia : 3,0 g Pepton : 6,0 g Casein pancreatic : 4,0 g Glucose : 1,0 g Cao thịt : 1,5 g Thạch : 15,0 g Nước cất : 100 ml pH sau khi tiệt trùng : 8,2 ± 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử Cân chính xác khoảng 25,0 mg tobramycin hòa tan trong dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml; 20 IU/ml và 40 IU/ml. - Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phương pháp hoạt lực kháng sinh - DĐVN III. 1.2.1.3. Phương pháp 3:[14], [20] - Xác định hoạt lực kháng sinh của tobramycin bằng phương pháp vi sinh vật theo BP 2000 hay JP14 - 11 - - Chủng vi khuẩn : Bacillus subtilis ATCC 6633 - Môi trường nuôi cấy : Môi trường đặc - Dung dịch chuẩn Cân chính xác một lượng tobramycin chuẩn, tương đương khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25 ml và đó chính là dung dịch chuẩn gốc. Giữ dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 5οC đến 15οC và sử dụng trong vòng 30 ngày. Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để được các dung dịch có nồng độ 8µg/ml và 2µg/ml (theo hiệu lực). - Dung dich thử: Cân chính xác một lượng tobramycin, tương đương khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25ml. Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để được các dung dịch có nồng độ 8µg/ml và 2µg/ml (theo hiệu lực). 1.2.2. Định lượng tobramycin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 1.2.2.1. Phương pháp 1: [4] Cân một lượng tobramycin sulfat tương ứng với khoảng 0,3 g tobramycin nguyên liệu , cho vào bình định mức có dung tích 100 ml, bổ sung nước cất 2 lần vừa đủ đến vạch, trộn đều. Lấy 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức có dung tích 20 ml, thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,01N, 2 ml dung dịch KMnO4. Dung dịch vừa pha đem đun cách thuỷ ở 400C trong 60 phút. Song song tiến hành điều chế dung dịch chuẩn bằng cách dùng chất đối chiếu tobramycin. Mẫu trắng tiến hành như mẫu thử nhưng không có tobramycin. Sau khi đun cách thuỷ ở 400C, thời gian 60 phút, đem đo mật độ quang của các dung dịch này ở bước sóng 425 nm, cuvet dày 1cm. 1.2.2.2. Phương pháp 2: [19] - 12 - Dựa trên cơ sở tạo ra sản phẩm mầu xanh với 3-methyl-2 benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid và FeCl3. Sản phẩm có độ hấp thụ lớn nhất ở 645 nm. Định luật Lambert-Beer được áp dụng trong khoảng nồng độ từ 50-500 mUI/ml. 1.2.3 Định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC 1.2.2.1 Phương pháp 1 [14] - Cột styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8µm). - Nhiệt độ cột: 55 0C. - Pha động: Hỗn hợp pha trong 1l nước đã loại CO2 gồm: 52 g natri sulfat khan; 1,5 g natri octansulfonat; 3 ml tetrahydrofuran và 50 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2 M đã được chỉnh pH về 3,0 bằng acid phosphoric. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Dung dịch thêm vào sau cột: Dung dịch natri hydroxyd 2% pha trong nước đã loại CO2. Tốc độ 0,3 ml/phút. - Detector: Detector ampe kế hoặc các thiết bị tương tự. - Thể tích tiêm: 20 µl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 0,1 mg/ml. 1.2.2.2 Phương pháp 2 [20], [23] - Cột RP 18 (3,9 mm x 30 cm). - Pha động: Hòa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan trong khoảng 800 ml nước, thêm vào dung dịch này 20 ml dung dịch acid sulfuric 1N, sau đó pha loãng bằng acetonitril tới 2000 ml, lắc đều. - Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dịch 2,4dinitrofluorobenzen 1% trong ethanol 96%. - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút. - Detector UV: 365 nm. - 13 - - Thể tích tiêm: 20 µl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,22 mg/ml trong dung dịch acid sulfuric 0,004 N. - Các dung dịch chuẩn và thử được tạo dẫn xuất với các thuốc thử 2,4- dinitrofluorobenzen và tris (hydroxymethyl) aminomethan trước khi tiêm sắc ký. 1.2.2.3 Phương pháp 3 [15] - Cột Purospher STARRP-18e (4 x 55 mm, 3 µm, Merck). - Pha động: Acetonitril - nước (50:50). - Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút. - Detector UV: 230 nm. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 5 µg/ml trong nước. - Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được tạo dẫn xuất với dung dịch thuốc thử 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ở 700C. 1.2.2.4 Phương pháp 4 [16] - Cột Xterra RP - 18 (2,1 x 250 mm, 5 µm). - Nhiệt độ cột: 30 0C. - Pha động A: Thêm 0,7 ml dung dịch amoni hydroxyd 28 - 30 % vào 1 lít nước Milli - Q. Sử dụng dung dịch natri hydroxyd 2,5 N để chỉnh pH pha động A đến 11,0. - Pha động B: Acetonitril. - Tiến hành sắc ký theo chương trình gradient dung môi như sau: Thời gian (phút) Pha động A (%) Pha động B (%) 0 100 0 10 0 100 - 14 - - Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút. - Detector: Khối phổ. - Thể tích tiêm: 4µl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,35 mg/ml trong dung dịch NaCl 0,9 %. 1.2.2.5 Phương pháp 5 [15] - Cột Ultrasphera RP 8 (4,6 x 250 mm, 5µm). - Pha động: Acetonitril - đệm phosphat 0,05 M pH 3,5 [62:38] - Tốc độ dòng: 2,5 ml/phút. - Thuốc thử tạo dẫn chất: Acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic. - Detector UV: 340 nm. - Thể tích tiêm: 20 µl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,02 mg/ml trong đệm phosphat pH 7,4. - Dung dịch chuẩn và thử được tạo dẫn xuất với thuốc thử acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic ở 70 0C. 1.2.2.6. Phương pháp 6 [5] - Cột : RP -18 brava ODS (150 x 4,6 mm,5µm) - Detector huỳnh quang : Ex/Em= 338 nm/ 455 nm - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Tốc độ thuốc thử: 0,7ml/phút - Thể tích tiêm: 20 µm - Pha động: Hoà tan 17,75 g natri sulfat khan ; 3,05g natri pentansulfonat và 1ml acid acetic băng trong 1000 ml nước, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm. - Thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột: Hoà tan 0,5g o-phthalaldehyd trong 100 ml methanol, thêm 1,0 ml 2-mercaptoethanol, lắc 3 phút. Thêm 1,5 ml - 15 - dung dịch polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 ml dung dịch đệm borat pH 10,4 lắc đều. - Dung dịch đệm borat pH 10,4: Hoà tan 24,64 g acid boric trong 900 ml nước. Điều chỉnh pH đến 10,4 bằng dung dịch NaOH 40%, thêm nước tới vừa đủ 1000 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm (pha theo BP 2005). 1.2.2.7. Phương pháp 7 [9]  Dung dịch thử Cân chính xác khoảng 20,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 20,0 ml. Hòa tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch. Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 20,0 ml. Thêm 0,5 ml thuốc thử X, đem đun cách thủy ở 80 0C trong 60 phút. Thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.  Dung dịch chuẩn (đối chiếu) Tiến hành tương tự như dung dịch thử nhưng thay tobramycin nguyên liệu bằng tobramycin chuẩn (đối chiếu). - Cột sắc ký Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5µm). - Detector UV : ở = 215 nm. - Pha động: Methanol : Đệm phosphat 0,01 M pH 3 = 20 : 80 - Thể tích tiêm: 10 µl. - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút. - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm. * Nhận xét: Qua các phương pháp định lượng nêu trên, chúng tôi nhận thấy: - Định lượng bằng phương pháp vi sinh: Rẻ, đơn giản, không cần trang thiết bị phức tạp nhưng có nhược điểm lớn là mất nhiều thời gian và kém dặc hiệu do sự có mặt của các chất kháng vi sinh vật khác, tính chính xác không cao. - 16 - - Định lượng bằng phương pháp đo độ hấp thụ UV-VIS: Có độ chính xác cao, tiến hành đơn giản, không yêu cầu máy móc quá phức tạp, hoá chất thông dụng và có thể áp dụng định lượng ở các cơ sở kiểm nghiệm trong cả nước. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là: Tính đặc hiệu chưa cao (sự có mặt của chất khác có khả năng hấp thụ tử ngoại khả kiến như benzalkonium clorid, một chất bảo quản hay dùng, sẽ ảnh hưởng kết quả định lượng), hoặc phải dùng thuốc thử nhập ngoại để tạo dẫn chất. - Định lượng bằng phương pháp HPLC :  Ưu điểm: Nói chung có tính đặc hiệu cao, tách riêng được hoạt chất.  Nhược điểm: Tiến hành phức tạp, đòi hỏi có trang thiết bị và thuốc thử đắt tiền vì detector UV thường không dùng được mà thường phải tạo dẫn chất. Phương pháp HPLC pha đảo với detector UV rất hay sử dụng để phân tích các hợp chất phân cực và hấp thụ UV. Nhưng với các hợp chất hấp thụ UV yếu như tobramycin thì thường phải tạo dẫn chất, hoặc phải sử dụng detector loại đặc biệt đắt tiền. Vì vậy, với các trang thiết bị sẵn có ở phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng một quy trình định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn, không sử dụng thuốc thử tạo dẫn xuất như các phương pháp hiện nay với hi vọng có thể đưa vào sử dụng trong công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lượng các sản phẩm chứa tobramycin. 1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 1.3.1. Nguyên tắc Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh - 17 - (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in [8]. 1.3.2. Cơ sở lý thuyết Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc đồ [8], [11]. 1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau: 1.3.3.1. Hệ thống bơm Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 - 400 bar) 1.3.3.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm ) và đuổi khí hòa tan. 1.3.3.3. Hệ tiêm mẫu Để đưa mẫu phân tích vào cột. - 18 - Có nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động. Mẫu thử (dạng lỏng hay dạng rắn) đều phải hoà tan trong dung môi thích hợp rồi lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi tiêm. 1.3.3.4. Cột sắc ký lỏng HPLC Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được với áp suất cao đến vài trăm bar. - Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh có đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 µm). - Đường kính cột: 4 hoặc 4,6 mm. Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu ta sử dụng đúng cách. Nếu sử dụng không đúng cách tuổi thọ của cột sẽ giảm. Ví dụ dung môi có tính chất acid mạnh hoặc base mạnh hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay nguyên liệu bẩn thì tuổi thọ của cột sẽ bị giảm. 1.3.3.5. Detector trong HPLC Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp thụ UV - VIS. Nguyên lý hoạt động của detector UV - VIS dựa trên nguyên lý hoạt động của phương pháp đo quang phổ hấp thụ. Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa. 1.3.3.6. Thiết bị hiển thị kết quả Có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi các tín hiệu dưới dạng pic [8], [14]. Sơ đồ khối hệ thống HPLC được tổng quát ở hình 1.1 Cột Binh chứa pha động Bơm Detector Bộ phận tự ghi Van tiêm mẫu - 19 - Hình 1.1: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC 1.3.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký Hình 1.2: Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ với các thông số: * tR (Thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất phân tích được bơm vào cột cho đến khi được phát hiện ở nồng độ cựu đại của nó. * t0 (Thời gian chết): thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký. * tR ’ (Thời gian lưu thực): tR’ = tR - t0 * W0.5 : Độ rộng của pic ở nửa chiều cao. * Wb : Độ rộng ở đáy pic. t t Wb2 0.5-2W 0.5-1W b1W R2 R2t' t'R1 R1t o - 20 - Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi. 1.3.4.1. Hệ số dung lượng k’ [8],[14] Nếu k' nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau. Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1 < k' < 8 1.3.4.2. Độ chọn lọc α (selectivity - factor) α= tt tt 'k 'k 01R 02R 1 2 − − = (k2' > k1' ) [8], [14] α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2. 1.3.4.3. Độ phân giải (resolution) Đặc trưng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo công thức: =R ( ) ( )               α −α = + − = + − + 'k1 'k ww tt ww tt B B A2/1B2/1 A,RB,R AB A,RB,R 1 4 N18,12 [8], [14] Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5 1.3.4.4. Hệ số bất đối AF Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức: a2 AF w 20/1= [8], [14] Trong đó: W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. Trong phép định lượng, yêu cầu: 0,9 ≤ AF ≤ 2 [1], [18], [22]. 1 t t t tt t 't 'k 0 R 0 0R 0 R −= − == - 21 - 1.3.4.5. Số đĩa lý thuyết N Đặc trưng cho hiệu lực cột. N = 16       w t B R 2 hay N=5,54       w t B2/1 R 2 [8], [12], [22] Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng công thức: =H N L 1.3.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 1.3.5.1. Lựa chọn cột (pha tĩnh) [12], [18] Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều thành phần. Nó là một chất rắn xốp có kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3 - 10 µm, diện tích bề mặt riêng từ 50 - 500 m2/g. Yêu cầu pha tĩnh trong HPLC:  Phải trơ và bền vững trong môi trường HPLC.  Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định.  Tính chất bề mặt ổn định.  Cân bằng động học của sự tách diễn ra nhanh và lặp lại tốt.  Cỡ hạt phải đồng nhất. Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên nền mạch carbon. Trong sắc ký hấp phụ, pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu điểm và sử dụng nhiều nhất. Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan: | 0 CH3 | |  Si  0  Si  R | | - 22 - 0 CH3 | * R là nhóm phân cực (ưa nước): nhóm hydroxyl (-0H) hoặc các alkylamin (-CH2NH2), alkylnitril (-CH2CN). Loại này sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực. * R là các nhóm ít phân cực: các nhóm octyl, octadecyl, phenyl được chế bằng cách alkyl hóa các nhóm OH trên bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl - R của mạch carbon (C2, C8, C18) hay các gốc carbon vòng (phenyl). Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion. 1.3.5.2. Lựa chọn pha động cho HPLC [12], [18] Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp. Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định. Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, hiệu lực tách của cột, độ phân giải RS , độ rộng của pic sắc ký ... Chính vì vậy việc lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng. Yêu cầu của pha động:  Phải trơ với pha tĩnh.  Hòa tan được chất cần phân tích.  Bền vững theo thời gian.  Có độ tinh khiết cao.  Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.  Phù hợp với detector.  Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường. - 23 - Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực (kỵ nước) như: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform... Các pha động này thường được bão hoà. Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực như: nước, methanol, acetonitril... hay hỗn hợp của chúng. Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ. Bốn yếu tố chính cần chú ý khi lựa chọn pha động:  Bản chất của dung môi để chạy pha động.  Thành phần của các chất trong pha động.  pH của pha động.  Tốc độ dòng của pha động. 1.3.5.3. Chọn đệm pH Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính acid hay base thường phải thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký [12], [18]. 1.3.5.4. Tốc độ dòng Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp thì một yếu tố cần lựa chọn để quá trình tách tốt hơn là tốc độ dòng [12], [18]. 1.3.6. Cách đánh giá pic * Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tương ứng với tổng lượng chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy tích phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số 1,3 %). Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đường nền và cả pic có đường nền bị trôi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuối của pic được nhận ra chính xác và cho và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao. - 24 - * Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic (khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ. Phương pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số k' là hằng định. 1.3.7. Ứng dụng của HPLC Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có ba ứng dụng chính: 1.3.7.1. Định tính và thử độ tinh khiết: Thời gian lưu của chất thử trên sắc đồ phải tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ. 1.3.7.2. Sắc ký điều chế: Qua qúa trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa giải được hứng riêng rồi cho bốc hơi dung môi thu lấy chất. 1.3.7.1. Định lượng: Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất. Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong HPLC:  Phương pháp chuẩn ngoại (external standard method) Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó đem so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ mẫu thử với pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ.  Phương pháp chuẩn nội (internal standard method) Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và - 25 - mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai gọi là chất chuẩn nội.  Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic (area normalisation) + Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc đồ. Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện, và tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector như nhau. + Áp dụng: Ít dùng để định lượng, chỉ dùng trong xác định hàm lượng tạp chất khi coi đáp ứng của các chất là như nhau. [12], [18]. - 26 - PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.1.1. Nguyên vật liệu : 2.1.1.1. Nguyên liệu và hoá chất: - Nguyên liệu: Tobramycin của công ty CPDP Hà Tây. - Chất đối chiếu: Tobramycin của viện kiểm nghiệm trung ương, hàm lượng 94,96%. - KH2PO4 (PA) - H3PO4 (PA) - Methanol dùng cho HPLC (Meck) - Nước cất tinh khiết 2 lần - Một vài hoá chất khác 2.1.1.2. Dụng cụ: - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX - detector UV Diode array - PDA 100 - Máy quang phổ UV- VIS Lambda EZ210 - Máy siêu âm SONOREX - Cân phân tích Mettler AB 204 có độ chính xác 0,1mg - Máy lọc chân không Satorius - Bình định mức các loại - Cốc có mỏ - Pipet chính xác, pipet thường - Lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 µm 2.1.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.1.2.1. Phương pháp nghiên cứu - Tham khảo các phương pháp định lượng tobramycin đã công bố. - Tham khảo các phương pháp định lượng tobramycin bằng HPLC. - 27 - - Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất hoá lý của tobramycin cũng như điều kiện thực nghiệm của nước ta hiện nay để xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng tobramycin bằng HPLC. 2.1.2.2. Nội dung nghiên cứu  Nghiên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng phương pháp: Chọn cột, pha động, bước sóng phát hiện và tốc độ dòng, thể tích tiêm thích hợp để định lượng.  Xây dựng, đánh giá phương pháp định lượng tobramycin nguyên liệu. - Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký - Đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ tobramycin và diện tích pic trên sắc ký đồ - Đánh giá tính chính xác của phương pháp - Đánh giá tính đúng của phương pháp - Đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp  Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả - Giá trị trung bình: ∑ = = n 1i ixn 1 x (2.1) - Độ lệch chuẩn: ( ) 1n x S n 1i 2 ix − − = ∑ = (2.2) - Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): 100 x S s x ×= (2.3) - Sai số chuẩn: n S sx = (2.4) - Sai số tương đối: ( ) 100 x % st x)1n( ××=ε −α (2.5) - Khoảng tin cậy x ± tαSx (2.6) - 28 - 2.2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.2.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC 2.2.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký Chọn phương pháp sắc ký: Tobramycin sulfat là chất hữu cơ phân cực, tan nhiều trong nước. Vì vậy, để phân tích và định lượng tốt, chúng tôi chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo. Chọn cột sắc ký: Trong phương pháp định lượng HPLC pha đảo, cột sắc ký thông dụng là Nucleosil C8, C18, ... Với điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm chúng tôi sử dụng cột Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5 µm). Chọn pha động: Trong phương pháp HPLC pha đảo, pha động thông dụng nhất là acetonitril, methanol, nước hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với nước. Do tobramycin sulfat tan nhiều trong nước, để rút ngắn thời gian lưu thích hợp của chất cần phân tích, pha động cần phải có nước, để chuyển tobramycin sang hết dạng ion cần sử dụng đệm pH acid. Chọn bước sóng: cấu trúc tobramycin có 5 nhóm amin (-NH2), tuy nhiên khả năng hấp thụ UV của tobramycin không cao vì vậy bước sóng nghiên cứu dự kiến là bước sóng thấp. 2.2.1.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc kí: a. Khảo sát chọn bước sóng thích hợp Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện ra tobramycin, chúng tôi tiến hành quét phổ UV dung dịch tobramycin 0,2 mg/ml trên máy quang phổ UV- VIS Lambda EZ210. Tiến hành: Cân chính xác khoảng 20 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 100,0 ml, thêm nước vừa đủ đến vạch lắc đều. Quét phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch này. Kết quả ghi ở hình 1. - 29 - 200 250 300 nm T ob ra 0,02% 0.0 0.5 Abs Hình 1: Phổ hấp thụ của dung dịch tobramycin 0,02% Nhận xét: Từ phổ hấp thụ của dung dịch tobramycin chúng tôi thấy: Cực đại hấp thụ của dung dịch chất này khoảng 194 nm. Để giảm ảnh hưởng của dung môi và tạp chất nhưng vẫn đảm bảo định lượng được tobramycin chúng tôi chọn bước sóng đo là 195 nm. b. Lựa chọn cột: Sử dụng cột Nucleosil C18 (250x4 mm), cỡ hạt 5 µm sẵn có ở bộ môn Hoá dược, trường đại học Dược Hà Nội. c. Lựa chọn đệm: Chúng tôi tiến hành khảo sát pha động là dung dịch đệm phosphat 0,01M ở các pH khác nhau, kết quả cho thấy:  Với pH=3,5 thì hệ số bất đối của pic tobramycin là 2,95  Với pH=3,0 thì hệ số bất đối của pic tobramycin là 1,53  Với pH=2,5 thì hệ số bất đối của pic tobramycin là 1,49 Nhận xét: - 30 - Khi pH giảm, hệ số bất đối giảm, pic tobramycin tách tốt cân xứng hơn. Tuy nhiên, dễ thấy là hệ số bất đối của pic tobramycin tại pH 3,0 và pH 2,5 khác biệt không đáng kể. Trong khi đó, nếu sử dụng tại pH 2,5 sẽ làm giảm tuổi thọ của cột do đó chúng tôi đã lựa chọn đệm phosphat 0,01 M, pH 3,0 để khảo sát tiếp. d. Lựa chọn pha động: Để chọn được hệ pha động phù hợp chúng tôi đã tiến hành khảo sát trong cùng điều kiện sắc kí: Tốc độ dòng 1,0 ml/phút, nồng độ chất chuẩn tobramycin là 3,0 mg/ml, thể tích tiêm 20µl trên các hệ pha động với thành phần gồm acetonitril và đệm phosphat pH 3,0 với các tỉ lệ khác nhau. Theo dõi sự thay đổi hệ số bất đối của các pic tobramycin, kết quả thu được ghi ở bảng 1: Bảng 1: Giá trị hệ số bất đối của các pic tobramycin khi khảo sát lựa chọn pha động Acetonitril Đệm pH 3,0 Hệ số bất đối 20 80 2,43 10 90 2,02 5 95 1,75 0 100 1,52 Nhận xét: Với pha động là 100% đệm phosphat 0,01 M pH 3,0 cho pic gọn, khá cân xứng, hệ số bất đối thấp nhất. Kết luận: Pha động được chọn để nghiên cứu định lượng tobramycin là 100% đệm phosphat 0,01 M pH 3,0. e. Lựa chọn tốc độ dòng - 31 - Tiến hành sắc kí với điều kiện đã chọn trên nhưng với tốc độ dòng thay đổi 1,0 ml/phút; 0,8 ml/phút: 0,6 ml/phút. Kết quả như sau:  Với tốc độ dòng 0,6 ml/phút thời gian lưu của tobramycin là 2,95 phút  Với tốc độ dòng 0,8 ml/phút thời gian lưu của tobramycin là 2,32 phút  Với tốc độ dòng 1,0 ml/phút thời gian lưu của tobramycin là 1,86 phút Nhận xét: Với tốc độ dòng 1,0 ml/phút thời gian lưu quá ngắn nên chất cần tách bị rửa giải ở thời gian gần với thời gian chết, tách không tốt. Với tốc độ dòng 0,8 ml/phút pic của tobramycin và pic tạp bị chồng phủ nhau một phần, hiệu lực tách kém. Với tốc độ dòng 0,6 ml/phút kết quả tách tốt, pic cân đối, thời gian phân tích tR= 2,95 phút là thời gian chạy sắc ký phù hợp. Kết luận: Chọn tốc độ dòng là 0,6 ml/phút để nghiên cứu định lượng tobramycin. đ. Điều kiện sắc ký lựa chọn Từ các kết quả khảo sát, chúng tôi đã xây dựng một quy trình sắc kí có khả năng phân tích tốt tobramycin trong nguyên liệu như sau: - Cột Nucleosil C18 (250x4,6 mm, 5µm). - Pha động: Đệm phosphat 0,01M pH 3 - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút. - Thể tích tiêm: 30 µl. - Detector UV: Bước sóng đo 195 nm. - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng. 2.2.2. Qui trình định lượng - 32 - 2.2.2.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu cho vào bình định mức 10,0ml. Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, dùng dịch lọc tiêm sắc ký. Tiêm 5 lần mẫu đối chiếu vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn ở trên. Ghi kết quả: thời gian lưu, diện tích và hệ số bất đối của pic tobramycin. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được trình bày như bảng 2. Bảng 2: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống STT Pic của tobramycin Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU) Hệ số bất đối (AF) 1 2,94 12,2985 1,52 2 2,95 12,3001 1,53 3 2,96 12,2805 1,51 4 2,96 12,2230 1,52 5 2,96 12,1916 1,52 RSD(%) 0,30 0,40 Nhận xét: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy:  Độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) của thời gian lưu và diện tích pic trong các phép thử là 0,30 và 0,40 đều nhỏ hơn 2%.  Các giá trị của hệ số bất đối giao động từ 1,51 đến 1,53 Kết luận: Hệ thống HPLC mà chúng tôi sử dụng là thích hợp để định lượng tobramycin trong nguyên liệu. 2.2.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng - 33 - a. Dung dịch thử Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 10,0 ml. Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm b. Dung dịch chuẩn (đối chiếu) Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu, cho vào bình định mức 10,0 ml. Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. c. Mẫu trắng: Nước cất 2 lần, lọc qua màng lọc 0,45 µm, siêu âm đuổi khí 15 phút d. Pha động: Dung dịch đệm phosphat 0,01 M, pH 3,0. Cách pha: Hoà tan 0,68g KH2PO4 trong nước và pha loãng bằng nước vừa đủ 500 ml. Điều chỉnh về pH 3,0 bằng H3PO4 đặc. Lọc qua màng lọc 0,45µm, siêu âm đuổi khí 15 phút. 2.2.2.3. Điều kiện sắc ký - Cột Nucleosil C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) - Pha động: Đệm phosphat 0,01 M pH 3,0. - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Thể tích tiêm: 30 µl - Detector UV 195 nm - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng 2.2.2.4. Tính kết quả Ghi diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng. Tính hàm lượng % tobramycin có trong mẫu thử theo công thức sau: - 34 - %X = P mA mA tc ct × × × Trong đó: At, Ac là diện tích pic tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn mt, mc là lượng cân tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn (mg) P là hàm lượng % ghi trên nhãn của tobramycin chuẩn 2.2.3. Định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp mới xây dựng Chuẩn bị và cho hệ thống HPLC chạy ổn định với pha động trong 30 phút. Tiêm lần lượt 30 µl mỗi dung dịch đã chuẩn bị vào hệ thống sắc ký. Tiến hành định lượng 5 mẫu thử và 1 mẫu chuẩn tobramycin theo các điều kiện đã chọn. Ghi các giá trị diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng. Kết quả định lượng được trình bày ở bảng 3. Bảng 3 : Kết quả định lượng tobramycin nguyên liệu Khối lượng cân (mg) Diện tích pic(mAU.min) Hàm lượng % 29,6 11,9207 90,97 29,7 11,9585 90,95 29,9 11,9165 90,02 30,1 11,9975 90,03 30,3 12,0954 90,17 m( chuẩn) =29,0 12,1916 94,96 Số liệu thống kê: Giá trị trung bình 90, 43X = Độ lệch chuẩn : S = 0,46 Độ lệch chuẩn tương đối : RSD = 0,51% Sai số chuẩn : Sx= 0,21 ( 1) 0,5962n xX t Sα −∆ = × = Khoảng tin cậy = 90,43 ± 0,59 Kết luận: - 35 - Kết quả trình bày ở bảng trên cho thấy nguyên liệu tobramycin đem định lượng có hàm lượng là: 90,43% ± 0,59 % 2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng Chúng tôi tiến hành đánh giá phương pháp định lượng tobramycin nguyên liệu bằng HPLC mới xây dựng dựa vào các chỉ tiêu sau - Đánh giá tính tuyến tính - Đánh giá tính chính xác - Đánh giá tính đúng - Đánh giá tính đặc hiệu 2.2.4.1. Tính tuyến tính Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic của dẫn chất tobramycin (tính theo lượng tobramycin đưa vào) trên chất chuẩn tobramycin. Cách pha: Cân chính xác khoảng 375 mg tobramycin chuẩn cho vào bình định mức 50,0 ml. Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch. Dung dịch thu được có nồng độ 7,5 mg/ml. Tiến hành pha loãng theo bảng 4 để thu được các dung dịch có nồng độ lần lượt là 2,4; 2,7; 3,0; 3,3; 3,6 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45µm. Bảng 4 : Cách pha các dung dịch để khảo sát khoảng tuyến tính Tiêm lần lượt 30 µl các dung dịch đã chuẩn bị vào hệ thống sắc ký. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi các gía trị diện tích pic đo được Bình 1 2 3 4 5 Tobramycin (mg) 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 Nước cất vừa đủ (ml) 25 25 25 25 25 Nồng độ (mg/ml) 2,4 2,7 3,0 3,3 3,6 - 36 - ứng với các nồng độ của các dung dịch trên. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được trình bày ở bảng 5. Bảng 5 : Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Từ các kết quả thu được ở bảng trên chúng tôi thiết lập mối tương quan giữa diện tích pic thu được trên sắc ký đồ và nồng độ của dung dịch (tính theo lượng tobramycin đưa vào). Phương trình hồi quy biểu thị mối tương quan này là: y= 3,9878 x + 0,039 với hệ số tương quan r= 0,9999 Độ lệch chuẩn y_intercept: Sb= 0,064 Khoảng tin cậy 95% của y_intercept: 0,039 ± 0,204 hay -0,165 ≤ y_intercept ≤ 0,243 chứa gốc toạ độ. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của tobramycin được ghi ở hình 2. Nồng độ (mg/ml) 2,4 2,7 3,0 3,3 3,6 Diện tích pic (mAU.min) 9,6023 10.7959 12,0322 13,1989 14,3825 Tính tuyến tính y = 3.9878x + 0.039 R2 = 0.9999 0 4 8 12 16 0 1 2 3 4 Nồng độ (mg/ml) Di ện tíc h pi c (m AU * m in ) - 37 - Hình 2 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của tobramycin Từ kết quả thu được ở hình 2 cho thấy:  Tất cả các giá trị thu được nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả 2 phía của đường hồi quy.  Hệ số tương quan r= 0,9999.  Khoảng tin cậy của y_intercept chứa gốc toạ độ. Nhận xét: Phương pháp tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát từ 2,4 đến 3,6 mg/ml (tính theo lượng tobramycin đưa vào) hay tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80 % đến 120% nồng độ làm việc. 2.2.4.2. Tính chính xác Nguyên tắc: Tính chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của 5 phép thử song song. Cách tiến hành và kết quả được trình bày như phần 2.2.3 Kết quả thử độ chính xác của phương pháp cho thấy trong các điều kiện sắc ký đã chọn độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả rất nhỏ (RSD = 0,51% << 2%). Như vậy phương pháp là chính xác. 2.2.4.3. Tính đúng Nguyên tắc: Đánh giá tính đúng của phương pháp được tiến hành trên việc khảo sát khả năng tìm lại của phương pháp. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ định lượng. Khối lượng cân như bảng 6. Tiến hành định lượng các mẫu này theo điều kiện đã chọn, mỗi mẫu định lượng 3 lần, lấy kết quả trung bình. Tính hàm lượng % của tobramycin có trong mẫu thử dựa trên chuẩn đã biết hàm lượng, từ đó tính % tìm lại của mẫu thử. - 38 - Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp được trình bày ở bảng 6 Mẫu đối chiếu: m = 29,0 mg; Sc = 12,1916 (mAU.min) Bảng 6: Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp Đồ thị biểu diễn phương trình hồi qui tuyến tính về mối tương quan giữa lượng cân và lượng hoạt chất tìm lại được ghi ở hình 3. Hình 3: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi qui tuyến tính về mối tương quan giữa lượng cân và lượng hoạt chất tìm lại - Qua phân tích ta có: Phần trăm tìm lại = 99,71% (khoảng tin cậy 98,43 – 100,99) X mcân(mg) mthực(mg) Diện tích pic trung bình (mAU.min) Khối lượng tìm lại trung bình (mg) % tìm lại = 23,2 22,0 9,7089 21,9 99,55 30,2 28,7 12,6349 28,5 99,30 35,8 34,6 15,1176 34,1 100,29 %100 m m chovao timlai × Tính đúng y = 0.9686x + 0.6252 R2 = 0.9999 0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 Khối lượng TB cho vào (mg) Kh ố i l ư ợ ng TB tìm lạ i (m g) - 39 - Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = 0,52% (<< 2%) - Phương trình hồi quy tuyến tính về mối tương quan giữa lượng cân và lượng hoạt chất tìm lại: Phương trình: y = 0,9686x + 0,6252 Độ lệch chuẩn của a: Sa = 0,01 Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,298 - Với độ tin cậy 95% ta có: Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 0,127 hay : 0,840 < a < 1,095 (a chứa 1=> không có sai số hệ thống tỷ lệ) Khoảng tin cậy của y_intercept: b± 3,786 hay : -3,16 ≤ y_intercept ≤ 4,393 (y chứa gốc tọa độ => không có sai số hằng định). Kết luận: Qua các kết quả trên ta thấy phương pháp đúng trong khoảng khảo sát 2.2.4.4. Tính đặc hiệu Để khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp chúng tôi tiến hành như sau: Chuẩn bị mẫu trắng (nước cất hai lần) và mẫu thử. Tiến hành sắc ký mẫu trắng và mẫu thử theo quy trình đã chọn Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu thử được trình bày như ở hình 4 và 5 - 40 - Hình 4:Sắc kí đồ mẫu trắng Hình 5: Sắc kí đồ mẫu thử Nhận xét: Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu cho một pic chính với tR=2,96 phút, cân đối. Trên sắc ký đồ mẫu trắng, trong khoảng thời gian lưu của pic tạo bởi tobramycin không có pic nào xuất hiện. Vậy phương pháp định lượng tobramycin trong nguyên liệu được xây dựng có tính đặc hiệu 2.3. BÀN LUẬN VÀ KẾT QUẢ - 41 - Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại, đang từng bước được đưa vào phòng kiểm nghiệm vào trung tâm kiểm nghiệm ở Việt Nam. Ưu điểm chung của phương pháp này là có sự ổn định, độ chọn lọc, tính chính xác cao và cách tiến hành đơn giản, nhanh chóng có thể định tính, định lượng đồng thời nhiều hoạt chất mà không cần phân tách trước khi đo. Đối với tobramycin, ở Việt Nam, thường dùng phương pháp vi sinh để định lượng. Trong dược điển Mỹ, Anh dùng phương pháp HPLC, song phải tạo dẫn chất với thuốc thử nhập ngoại đắt tiền. Vì vậy chúng tôi đã nghiên cứu và xây dựng một phương pháp HPLC mới để định lượng tobramycin với hóa chất dễ kiếm, rẻ tiền, có thể áp dụng dễ dàng trong các phòng kiểm nghiệm trong nước. Quy trình định lượng như sau:  Điều kiện sắc ký - Cột Nucleosil C18 (250x4,6 mm; 5µm) sẵn có ở bộ môn Hoá dược, trường Đại học Dược Hà Nội. - Pha động: Đệm phosphat 0,01M pH 3,0. - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Thể tích tiêm: 30 µl - Detector UV 195 nm - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng  Dung dịch thử Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 10,0ml. Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm  Dung dịch chuẩn (đối chiếu) - 42 - Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu cho vào bình định mức 10,0ml. Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.  Mẫu trắng: Nước cất 2 lần, lọc qua màng lọc 0,45 µm, siêu âm đuổi khí 15 phút  Tính kết quả: Hàm lượng % tobramycin trong nguyên liệu được tính theo công thức: %X = P mA mA tc ct × × × At , Ac: Diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn mt , mc: Khối lượng cân của mẫu thử và mẫu chuẩn (mg). P : Là hàm lượng % ghi trên nhãn của tobramycin chuẩn. Từ kết quả thực nghiệm và xử lý số liệu thống kê cho thấy, phương pháp mới xây dựng là chính xác (RSD = 0,51%), đúng, tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát và đặc hiệu. Vì vậy, có thể áp dụng phương pháp này để định lượng tobramycin nguyên liệu. Do thời gian có hạn, chúng tôi chưa tiếp tục nghiên cứu áp dụng phương pháp này để định lượng tobramycin trong các chế phẩm. - 43 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 3.1 KẾT LUẬN Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp chúng tôi đã thu được một số kết quả: 1. Xây dựng được một phương pháp định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp. Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp đáp ứng đầy đủ các chỉ tiêu của một phương pháp định lượng (tính đặc hiệu, tính chính xác, tính đúng và tính tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát). 2. Xác định được hàm lượng của tobramycin trong nguyên liệu. 3. Học được cách tìm tài liệu, làm thực nghiệm và trình bày văn bản một cách khoa học về một vấn đề nghiên cứu. Tìm hiểu phương pháp HPLC, làm quen và sử dụng được máy HPLC để định lượng một sản phẩm; biết cách đánh giá một phương pháp định lượng. 3.2 ĐỀ XUẤT 1. Có thể áp dụng phương pháp này tại các cơ sở kiểm tra chất lượng trong cả nước để xác định về mặt hàm lượng tobramycin trong nguyên liệu. 2. Tiếp tục nghiên cứu, khảo sát để áp dụng định lượng tobramycin trong các thành phẩm như thuốc nhỏ mắt, thuốc tiêm ... - 44 -