Enzym xylanase trong công nghệ thực phẩm

se. - Khi sử dụng các nguồn nitơ tối ưu này ta nhận thấy dịch canh trường bị acid hoá đến pH = 2,5-3,0 và có sự tích luỹ enzyme pectinase tốt hơn. Nói chung, tỉ lệ thích hợp nhất đối với C/N khi tổng hợp pectinase trong khoảng 7/1 – 13/1. Nguồn nito (0.15% tính theo nito) Lactose 2% + Pectin 2%Khối lượng sợi nấm khô(gam)Hđ P đvị/10mlHđ PEHđ PMGHđ PGĐơn vị/g(NH4)2HPO4 NaNO3 NH4NO3 Pepton Dịch thuỷ phân casein (NH4)2HPO4 NaNO3 NH4NO3 Pepton Dịch thuỷ phân casein1,200 0,890 0,850 1,500 1,5501820,7 880,6 810,9 1620,0 1350,00,491 0,197 0,163 0,418 0,3400,560 0,310 0,278 0,410 0,4500,885 0,560 9,560 0,750 0,800Saccharose 2% + pectin 2%1,150 0,920 0,890 1,300 1,450820,2 590,4 94,8 750,7 7,0030,163 0,083 Vết 0,160 0,1200,420 0,280 0,060 0,340 0,3700,580 0,520 0,320 0,500 0,530 Bảng 3 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ 2.1.2.3 Ảnh hưởng của các yếu tố khác Ngoài nguồn C, N, các nguyên tố vô cơ cũng có ảnh hưởng quan trọng đến sự tạo thành phức hệ enzyme này. Trong số đó P là cấu tử vô cơ cần thiết của môi trường. Hàm lượng P trong môi trường phải là 8-10%. Khi sử dụng nguồn N của phốtphát diamon thì nhu cầu về P của nấm mốc hoàn toàn được thỏa mãn. Các yếu tố khác như pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đều ảnh hưởng đến sự tạo ra enzyme pectinase. 2.1.3 Môi trường lên men giống Nấm mốc Asp.niger được giữ giống trên môi trường Czapek. Chuẩn bị bột cà rốt: cà rốt xay nhuyễn, sấy ở nhiệt độ 60oC cho đến khi độ ẩm cà rốt đạt 4% (nguồn pectin – chất cảm ứng) Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase gồm: Cám gạo 65,5% Trấu 21,5% Bột cà rốt 11% (NH4)2SO4 2% Độ ẩm 55%. 2.2 Sơ đồ công nghệ Nguyên liệu Trộn Làm ẩm Thanh trùng bằng nhiệt Làm nguội, làm tơi Gieo giống vi sinh vật Nuôi cấy giống Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy Thu nhận phế phẩm enzyme thô Chế phẩm enzyme thô đem đi sử dụng Chế phẩm enzyme thô đem tinh chế Nghiền mịn Trích ly Lọc Bã Kết tủa enzyme Thu nhận kết tủa Sấy kết tủa Tinh chế kết tủa Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết Enzyme kết tinh Thuyết minh quy trình : + Nguyên liệu được trộn với nhau. + Làm ẩm : có ý nghĩa quan trọng trong điều kiện sản xuất lớn, hàm ẩm tối ưu của môi trường cám là 58-60%. Khi nuôi cấy trong điều kiện tiệt trùng nghiêm ngặt thì đạt hoạt độ enzyme cao nhất khi làm ẩm 65-68%. Tuy nhiên nếu môi trường quá ẩm thì sẽ bị dính bết ( khi hấp thanh trùng, làm tơi, khi nuôi cấy ), dễ bị nhiễm vi sinh vật tạp ( bị lên men rượu, lên men giấm…) Để làm ẩm có thể dùng nước trộn với nguyên liệu rồi thanh trùng hoặc làm ẩm sơ bộ rồi thanh trùng sau đó dùng nước vô trùng ( nước ngưng tụ, nước đun sôi để nguội ) để điều chỉnh lại độ ẩm của khối nguyên liệu. Cách sau có thể rút ngắn thời gian làm nguội, khống chế được độ ẩm chính xác hơn nhưng đòi hỏi phải thanh trùng ở nhiệt độ và áp suất cao hơn. + Thanh trùng bằng hơi nhiệt : Làm cho môi trường được tinh khiết hơn về phương diện vi sinh vật và làm cho chín ( biến hình ) môi trường ( tinh bột, protein ). Thông thường người ta thanh trùng bằng hơi nước trực tiếp ở nhiệt độ 120-1300C trong 2-3 giờ. + Làm nguội và làm tơi môi trường để gieo giống : Khối môi trường vừa hấp xong còn nóng và dính bết. Vì vậy phải làm nguội và làm tơi để thuận tiện cho việc gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi cấy. Yêu cầu thời gian này phải ngắn để hạn chế nhiễm khuẩn từ bên ngoài. Nhiệt độ yêu cầu đạt được để gieo giống là 35-390C. + Nuôi cấy nấm mốc : Nhằm đủ lượng bào tử giống cho toàn bộ môi trường nuôi cấy. Quy trình công nghệ thực hiện tương tự như trong sản xuất lớn nhưng phải thực hiện các điều kiện kỹ thuật đặc biệt và khắt khe hơn như : nguyên liệu phải tốt, giàu chất dinh dưỡng hơn, điều kiện nuôi cấy khống chế nghiêm ngặt hơn, thời gian nuôi cấy dài hơn ( gần gấp đôi ) để nấm mốc hình thành nhiều bào tử và đều. + Tiến hành quá trình nuôi cấy Sau khi gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi ( mành hay khay đục lỗ ) rồi chuyển vào phòng nuôi có điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm tương đối của không khí () cũng như mức độ thông khí. Quá trình nuôi cấy nấm mốc kéo dài 33-48 giờ/mẻ được trải qua 3 giai đoạn : - Giai đoạn 1 : Từ khi nôi cấy nấm mốc giống đến giờ nuôi cấy thứ 10-12. Xảy ra sự trương nở bào tử và xuất hiện cuống nấm. Để đảm bảo sự nảy mầm nhanh và hạn chế nhiễm tạp, cần giữ độ ẩm nguyên liệu 55-60%, = 96-100%, T= 30-320C. - Giai đoạn 2 : Kéo dài trong 10-18 giờ. Nấm mốc phát triển mạnh, lan khắp bề mặt và trong toàn khối môi trường ( khuẩn ti ăn sâu vào cơ chất) dẫn đến hiện tượng kết bánh. Quá trình hô hấp và tỏa nhiệt mạnh làm môi trường bị khô xốp, tăng hàm lượng CO2, nhiệt độ phòng nuôi tăng lên 38-400C. Để khống chế nhiệt độ thích hợp 28-300C cần thông gió ( quạt ) và bão hòa ẩm không khí phòng nuôi. - Giai đoạn 3 : Kéo dài trong 10-20 giờ và đặc trưng nhất vì tạo ra enzyme nhiều nhất. Cường độ trao đổi chất giảm đi chút ít, nhiệt tỏa ra ít hơn nên tốc độ bốc hơi nước của môi trường nuôi cấy cũng giảm theo. Quá trình nuôi cấy được chấm dứt khi mấm mốc đạt độ già chín sinh lý và bắt đầu tạo thành bào tử. + Thu nhận chế phẩm enzyme thô Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme pectinase, chế phẩm này được gọi là enzyme thô ( vì ngoài thành phần enzyme ra còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước trong môi trường). Để đảm bảo chế phẩm enzyme pectinase không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp. Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phẩm thô không cần phải quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta cần phải tiến hành làm sạch enzyme. Để sản xuất enzyme tinh khiết người ta phải tiến hành như sau: - Toàn bộ khối lượng enzyme thô pectinase được đem đi nghiền nhỏ. Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát ra khỏi tế bào. Phần lớn enzyme pectinase ngoại bào khi được tổng hợp và thoát ra khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi ta nghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi thành phần này dễ dàng hơn. - Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường hợp này được dùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thuỷ tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật - Trích ly: Sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme pectinase. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan.Cứ một phần chế phẩm enzyme thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc(chú ý cần loại bỏ các thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn ). Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô vì trong đó chứa nước và các chất hòa tan khác từ khối lượng môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi vật chất này - Quá trình kết tủa enzyme pectinase : * Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây kết tủa. Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây kết tủa khác. * Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzyme thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme. Khi đổ chất làm kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính. * Trong quá trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sunfat amon với liều lượng như sau: Cứ một phần dung dịch enzyme thô người ta cho 2 đến 2.5 lần cồn hoặc sulfat amon. Khi cho chất kết tủa vào dung dịch enzyme thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường là 4-7oC) theo thời gian các enzyme sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa dạng paste ( độ ẩm lớn hơn 70%W), ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme pectinase cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt W = 5-8%. Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme pectinase ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa 1 số enzyme ta quan tâm. 2.3 Quy trình tách chiết và làm sạch 2.3.1 Giới thiệu chung : Các dạng chế phẩm enzyme: + Chế phẩm thô - Chế phẩm thô từ canh trường lỏng. - Chế phẩm thô từ canh trường bề mặt + Chế phẩm kỹ thuật Là chế phẩm được tinh chế sơ bộ, trong đó một số protein và enzyme tạp đã được tách ra. Trong chế phẩm kỹ thuật thường chứa một vài enzyme chủ yếu. + Chế phẩm tinh khiết Là chế phẩm trong đó chỉ chứa một loại enzyme nhất định với hàm lượng cao Thường tinh sạch enzyme từ các chế phẩm enzyme thô. Chế phẩm thô thường chứa những thành phần cơ bản sau: Nước chiếm khối lượng lớn nhất. Protein không có hoạt tính sinh học. Các tạp chất từ tế bào ( nếu là nguồn động vật, thực vật ), từ môi trường nuôi cấy (nếu là nguồn VSV) Enzyme (hay protein có hoạt tính sinh học cao). Quá trình tinh sạch enzyme là quá trình loại bỏ ba phần đầu, chỉ nhận sản phẩm cuối là enzyme mong muốn (trong đó phần lớn enzyme tạp đã được loại bỏ). Việc loại ba thành phần đầu không thể cùng thực hiện trong một giai đoạn mà phải thực hiện qua nhiều giai đoạn khác nhau, ở mỗi giai đoạn, ta sẽ loại bỏ được một phần không phải là enzyme mong muốn ra khỏi hỗn hợp, khối lượng chế phẩm sẽ giảm theo.  Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme Các kỹ thuật tinh sạch thường đưa lại những kết quả quan trọng sau: + Khối lượng chế phẩm enzyme được giảm dần qua từng bước tinh sạch + Tăng hoạt tính enzyme có ý nghĩa quan trọng trong quá trình sử dụng sau này. + Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm. + Tạo những chế phẩm tinh khiết nhằm mục đích nghiên cứu hoặc ứng dụng trong y học… Tóm tắt các giai đoạn tinh sạch : Các giai đoạn Phương pháp sử dụngPhá vỡ tế bàoCơ học, vật lý, hóa học, sinh họcChiết tách enzymeNước, acid, kiềm loãng, dung dịch đệm, dung mô hữu cơTách các phần tử không hòa tanLy tâm, lọcLoại các thành phần không phải protein: Chất có phân tử lượng thấp Nucleic acid LipidThẩm tích, lọc gel, siêu lọc Sử dụng nuclease, protease Dung môi hữu cơTách phân đọan protein và enzyme: Kết tủa Phân tích trong hệ dung dịch hai pha. Gây biến tính hỗn hợp protein Sắc ký Ly tâm Điện di Kết tủa bằng điện Kết tinhMuối dung môi hữu cơ, các hợp chất sinh học đặc hiệu. Sử dụng các dung dịch polimer tan trong nước Sử dụng acid, kiềm, nhiệt độ. Hấp thụ, trao đổi ion, ái lực, lọc gel. Trong gradient nồng độ gel polyacrylamide Trên cột hoặc gel bản mỏng. Bằng muối hoặc bằng dung môi hữu cơ Cô đặcSiêu lọc, đông khô, cô chân không -Siêu lọc -Thẩm tích -Siêu ly tâm Sắc ký trao đổi ion -Sắc ký lọc gel Sắc ký đẳng điện Điện di trên “gel” polyacrylamit Khối lượng phân tử Điện tích ENZYME Vị trí liên kết đặc hiệu Tính hòa tan Tính ổn định Tác động của acid Tác động của nhiệt hoặc kiềm -Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính Sắc ký ái lực Phân ly thể lỏng-lỏng -Kết tủa bằng dung môi hữu cơ -Kết tủa đẳng điện Hình3: Các kỹ thuật tách và tinh chế enzyme theo các đặc tính của chúng 2.3.2 Phưong pháp kết tủa: 2.3.2.1 Giới thiệu chung về phương pháp: Phương pháp kết tủa chỉ hiệu quả khi hàm lượng protein trong dung dịch lớn hơn 100mg/mL. Thông thường đây chỉ là giai đoạn đầu của quá trình tinh sạch: Kết tủa đẳng điện Một protein hay một protein enzyme thường hòa tan ít nhất ở điểm đẳng điện (pI) vì ở pI các phân tử protein enzyme có tổng điện tích bằng 0, tức là không có lực đẩy tỉnh điện, nên các phân tử protein enzyme sẽ kết hợp với nhau tạo ra kết tủa. Vì vậy ta có thể kết tủa đẳng điện enzyme quan tâm cũng như các enzyme, protein tạp khác. Sau đó lọc hay ly tâm để thu hoặc loại bỏ kết tủa. Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính (phương pháp diêm tích). Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme. Trong công nghiệp enzyme, người ta thường sử dụng muối amonium sulfate. Các thiết bị dùng trong quá trình kết tủa bằng muối này thường được chế tạo bằng thép không rỉ. Tuy nhiên, thép không rỉ cũng có nhiều loại, nhiều trường hợp thiết bị chế tạo từ thép không rỉ cũng bị ăn mòn bởi amonium sulfate. Vì vậy sau này thay amonium sulfate bằng sodium sulfate, muối này tuy không gây hư hỏng thiết bị, song chúng lại không có tính hòa tan tốt. Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể ở 35 – 400C, nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai dung dịch lại với nhau. Nồng độ tối ưu của muối dùng trong kết tủa enzyme sẽ được xác định trong những thí nghiệm cụ thể. Khoảng tối ưu của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng, khoảng 20 – 80%. Mỗi loại protein enzyme sẽ có một khoảng nồng độ muối mà protein enzyme đó kết tủa hoàn toàn, gọi là nồng độ muối tích. Khoảng nồng độ muối tích của các protein enzyme thường không giống nhau. Chúng ta có thể tinh chế enzyme nhờ kết tủa phân đoạn muối trung tính. Kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ. Dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ tăng lên. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý tới nhiệt độ nên bắt buộc ta khi tiến hành phải làm lạnh dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme, mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ, thường tiến hành ở nhiệt độ từ 3 – 100C. Tỉ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác đình bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch. Dung môi hữu cơ được dùng để kết tủa enzyme bao gồm: ethanol, isopropanol, aceton. Các loại dung môi này làm giảm hằng số điện môi của môi trường. Khi đó lực hút và lực đẩy tỷ lệ nghịch với hằng số điện môi. Do đó trong dung dịch toàn bộ các protein enzyme và toàn bộ các protein khác cũng như các tạp chất phân tử lớn khác đều bị kết tủa. Do sự giảm hằng số điện môi nên các phân tử tương tác với nhau tạo thành một tập hợp và sẽ lắng xuống. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiện tượng này bao gồm: nồng độ dung môi, nhiệt độ, phản ứng môi trường, lực ion của dung dịch và tính chất của enzyme. Thay đổi thành phần hóa học của môi trường để làm sạch enzyme. Khi thêm vào môi trường các chất đặc hiệu, người ta thu được kết tủa của một số phân tử VD: sử dụng một số muối kim loại (Mn2+) tác dụng với acid Nucleic sẽ làm dễ dàng cho việc tách các enzyme nội bào. Sử dụng chất trợ kết tủa enzyme. Đối với các enzyme ngoại bào, ở quy mô công nghiệp người ta có thể thêm vào các chất như kisegua, tinh bột, lactose, dextran sulfat.. để làm kết tủa ở dạng hạt, thường dùng các chất này khi có mặt rượu, natri sulffat, acid tanic. Kết tủa bằng các polyme co khối lượng phân tử cao. Các polyme như dextran, polyetylenglycol (PEG) được dùng với nhiều mục đích: chất làm bền, làm đặc, hoặc là chất kết tủa. các phân tử này rất háo nước nên sẽ làm mất nước của các phân tử sinh học dẫn tới làm thay đổi hằng số điện môi của môi trường xung quanh do đó mà ảnh hưởng tới các tương tác không gian của các nhóm háo nước của các phân tử protein dẫn tới việc kết tủa protein việc kết tủa protein phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ, pH, lực ion, nồng độ protein và khối lượng phân tử của chúng. 2.3.2.2 Kết tủa đối với pectinase: a) Từ canh trường bề mặt. VSV : Botryti8 cinerea, Penicillium expanrum, và Aspergilus aureus. - 30g mẫu của môi trường được tách với 300 ml nước cất, - Dùng HCl chỉnh pH 5-6. Enzyme được kết tủa bằng hai cách: Cách 1: thêm vào 5 lần thể tích dung dịch ethanol 95%. Cách 2: 70g (NH4)2SO4 /100 ml dịch chiết. VSV: Aspergilus awamori - Sử dụng rượu ethanol (72.5-75%) hoặc isopropanol (55-57%). Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết khoảng 90%, - Sử dụng muối ammonium sunfat sử dụng có độ bão hòa 0.79.Khi kết tủa bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. - Nhiệt độ kết tủa tối ưu đối với rượu là 2-5oC, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt. Sau đó ly tâm để tách kết tủa ra khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản. b) Từ canh trường bề sâu. - Thu dịch lọc canh trường - Phối trộn canh trường với ethanol theo tỉ lệ 4:1, với aceton theo tỉ lệ 2:1 và isopropanol theo tỉ lệ 1.3:1, hoặc với ammonium sunfat (50-80% trong muối kết). - Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu. - Khi độ bão hòa của (NH4)2SO4 bằng 0.5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp (đoạn này chiếm 0.25% trọng lượng khô), nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hòa 1.0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0.11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao. 2.3.3 Phương pháp thẩm tích: a) Nguyên lý Trong quá trình tinh sạch các enzyme, để loại bỏ các phân tử hòa tan nhỏ không mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme như là amoni sulfat sau kết tủa, dùng một muối để khử hấp thụ enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối tử cạnh tranh trong sắc ký ái lực,… người ta thường dùng phương pháp thẩm tích. Túi thẩm tích được cấu tạo bằng một màng bán thấm (thường bằng solephan). Túi thẩm tích có chứa dịch chiết enzyme, được đặt vào trong một dung dịch đệm không được chứa chất hòa tan cần loại bỏ. Chất hòa tan khuếch tán ra khỏi màng theo chiều Gradient nồng độ. ở trạng thái cân bằng thì nồng độ chất hòa tan bên trong túi và bên ngoài dịch dệm sẽ cân bằng nhau do đó phải dùng một thể tích lớn dung dịch đệm và thỉnh thoảng phải thay dung dịch mới. b) Ứng dụng của phương pháp thẩm tích trong tinh sạch pectinase. Chế phẩm pectinase sau khi được kết tủa bằng muối (NH4)2SO4 được cho vào túi thẩm tích; rồi đặt túi đó vào dung dịch có chứa polymer cacboxyl methyl cellulose, polyetylenglycol (PEG) là những polymer có tính háo nước  cô đặc dung dịch enzyme. 2.3.4 Kết tủa ái lực: Kết tủa ái lực là phương pháp phân tách dựa trên sự tạo phức giữa một phối tử ái lực với protein cần tách nằm trong dịch enzyme thô, sau đó phức này sẽ được kết tủa bằng cách thêm vào một tác nhân hợp lý. Alginate là copolymer của acid guluronic và acid mannuronic, tạo kết tủa với ion Ca2+, đuợc dùng để liên kết với pectinase trong quá trình tinh sạch (đi từ A.niger). Nếu xử lý alginate bằng vi sóng ở nhiệt độ 75oC sẽ làm tăng khả năng chọn lọc, chế phẩm enzyme thu được có tỷ lệ tinh sạch 20 lần và giữ được 83% hoạt tính. Chuẩn bị dung dịch alginate: Alginate được hòa tan vào đệm acetate 0.05M, pH 5.0 với tỉ lệ 2% (w/v). Dung dịch này được đem bảo quản ở 4oC và có thể được pha loãng khi sử dụng Kết tủa ái lực pectinase hai pha bằng alginate - Cho pectinase vào 0.4 ml dung dịch alginate, định mức thành 4ml bằng đệm acetate 0.05%, pH = 5.0. pH của hỗn hợp được chỉnh về 3.8 bằng acid acetic 3M vì đây là pH tối ưu để enzyme kết hợp với alginate. Ủ hỗn hợp ở 25oC trong 1h. Thêm vào 0.4 ml dung dịch CaCl2 1M tạo kết tủa tách kết tủa bằng máy ly tâm (tốc độ 10000 vòng/phút, trong 10 phút), rửa 3 lần bằng 4ml đệm acetate 0.05M, pH 5.0 có chứa CaCl2 0.1M. - Phức pectinase-alginate thu được đem hòa tan vào 6ml đệm acetate 0.05M, pH 5.0 có chứa NaCl 1M, đem ủ ở 4oC trong 18h. Sau đó, alginate sẽ bị kết tủa và được lấy ra khỏi hỗn hợp. Các muối (NaCl và CaCl2) sẽ đuợc tách bằng cách cho qua cột Sephadex Kết tủa ái lực pectinase ba pha bằng alginate Hòa tan dung dịch enzyme thô với alginate, 1% w/v (alginate đóng vai trò là phối tử liên kết ái lực). Sau khi hòa tan, alginate sẽ liên kết đặc hiệu với pectinase trong dung dịch. Tiếp theo, ta cho vào dung dịch t-butanol (tỉ lệ 1:2, v/v) và cho vào (NH4)2SO4 với tỉ lệ 30% (w/v). Khuấy trộn đều, các pha sẽ được tách ra, khi đó ta sẽ tách pha trung gian là pha có hòa tan phức alginate và pectinase. Rồi đem phức đó đi tách rửa với dung dịch NaCl 1M ở nhiệt độ 40C trong vòng 18 giờ ta sẽ thu được pectinase tinh khiết. Trong phương pháp này, khi sử dụng alginate được ester hóa làm phối tử ái lực có thể đạt được hiệu suất thu hồi 100% với tỷ lệ tinh sạch 4 lần. Nếu kết tủa ái lực bằng alginate 1% cho hiệu suất 52% và tỷ lệ tinh sạch là 10 lần. Mặt khác, sử dụng 0.5% alginate ester hóa cho tỷ lệ tinh sạch chỉ là 7 lần nhưng có thể thu hồi 75% hoạt tính. 2.3.5 Phương pháp sắc ký. 2.3.5.1 Giới thiệu chung Thuật ngữ sắc ký để chỉ các kỹ thuật phân tích và điều chế cho phép tách biệt các hợp chất khác nhau của một hổn hợp. Phép phân tích sắc ký này dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hòa tan đẵ được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn. Người ta thường chọn các chất có khả năng kết gắn được với các chất định phân tách làm pha tĩnh. Tương tác giữa chất hòa tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học. Dựa vào các kiểu liên kết người ta chia ra thành các kiểu sắc ký sau Sắc ký lọc gel: (sắc ký loại trừ phân tử) phân đoạn protein theo klg. Sắc ký trao đổi ion:liên kết ion. Sắc ký ái lực: liên kết kỵ nước Sắc ký hấp phụ: liên kết yếu như lk kỵ nước, lk Van der Waals 2.3.5.2 Sắc ký lọc gel Sắc ký lọc (sắc ký loại trừ không gian, loại trừ khuếch tán hay phương pháp loại trừ phân tử) cho phép phân đoạn một số hổn hợp protein theo khối lượng phân tử của chúng. Thực tế ngoài kích thước ra, hình dạng của phân tử cũng có ảnh hưởng. Tuy nhiên thông số này có thể bỏ qua nếu protein trong hổn hợp là hình cầu. Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong cột dùng để tách enzyme, các phân tử được tách ra dựa theo kích thước và hình dạng của chúng Pha tĩnh: các hạt gel xốp chứa đầy trong cột Khi cho dung dịch các protein chảy qua cột thì các phân tử lớn nhất của hổn hợp có đường kính lớn hơn lổ của pha tĩnh, không thể khuếch tán vào bên trong hạt nên bị loại trừ và chúng sẽ đi ra khỏi cột cùng với thể tích dịch rửa bằng thể tích giữa các hạt gel.(V0) Các phân tử bé, ngược lại, sẽ khuếch tán tối đa vào trong hạt gel và thể tích dịch rửa của chúng sẽ bằng tổng thể tích pha lỏng của cột.(V1) Còn các phân tử có kích thước trung gian sẽ khuếch tán hạn chế vào hạt, thể tích dịch rửa của chúng càng lớn khi quảng đường đi (của chúng) vào bên trong hạt càng dài thì kích thước của chúng càng nhỏ. Hãng và tên thương mạiLoại gelKhoảng phân đoạn (r)Biogel (Bio-Rad) Uetrogele (IBF, Serva) Fractogel (Merk) Sephadex (Pharmacia) Sephacryl (Pharmacia) Sepharose (Pharmacia) Glycophase (Plerce)Polycrylamide (P-type) Agarose (A-type) Agarose/polycrylamide Agarose Vinyl polymer (nhiều loại khác nhau) Dextran Sephacryl/bisacrylamide Agarose Agarose liên kết chéo 1,2 dihydroxypropyl-substituted 100-400000 1000-150 x 106 60000-1.3 x 10625000-20 x 106 100-5 x 106 50-60000 5000-10610000-40 x 106 10000-106 1000-350000  Phương pháp lọc gel thường được ứng dụng để tách các phân tử nhỏ như muối vô cơ và các phân tử nước thông qua cấu trúc mạng lưới của sephadex. Thường phương pháp này chỉ làm tăng độ cô đặc nhưng giảm hiệu suất thu hồi sản phẩm do các phân tử protein bị kẹt lại giữa các hạt gel. - 300 ml dịch thô enzyme thu được từ canh trường Penicillium viridicatum được gạn vào hai lần thể tích ethanol lạnh đông và bảo quản ở -20oC trong hai giờ. Kết tủa thu được bằng cách ly tâm (20000g/20 phút) hòa tan vào một lượng nhỏ thể tích tris-HCl (50nM, pH = 7.4) rồi cho đi qua cột sephadex G50 (3x100cm) với dung dịch đệm là 50mM HCl pH = 7.4. 2.3.5.3 Sắc ký trao đổi ion. a/ Nguyên tắc Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện của các phân tử protein. Phương pháp trao đổi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme trong quy mô công nghiệp Tính chất tích điện của phân tử protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị PH, từ đó người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation. Trong sắc ký trao đổi ion, việc gắn một protein enzyme vào nhựa trao đổi ion sẽ phụ thuộc vào trạng thái ion hóa của protein, cũng như trạng thái ion hóa của nhựa trao đổi, PH, lực ion và nhiệt độ. Các nhóm trao đổi ion : Hãng và tên thương mạiLoại chấtNhóm trao đổiAnionCation Cellex (Bio-Rad) Bio-Gel (Bio-Rad) Trisacryl (IBE-Serva) Fractogel (Merk) Sephadex (Pharmacia) Sepharose (Pharmacia) Sephacel (Pharmacia)Cellulose Agarose Polymer tổng hợp Polymer vinyl Dextran Agarose CelluloseDEAE; ECTEOLA; QAE; TEAE; DEAE DEAE DEAE DEAE QAE DEAE DEAECM phosphoryl CM CM CM; SP CM SP CM Quá trình phân tách trên bao gồm hai giai đoạn:  Hấp thụ thuận nghịch protein-enzyme cần tinh sạch (và các protein có điện tích gần giống nhau) vào nhựa trao đổi ion.  Khử hấp phụ các ion đã được hấp thụ  Bằng cách thay đổi PH của dịch rửa sẽ dẫn tới sự thay độ ion hóa và do đó thay đổi điện tích tổng của protein  Hoặc bằng cách tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh. Các protein –enzyme nào có ái lực với nhựa trao đổi ion yếu nhất sẽ bị đẩy ra trước tiên và ngược lại. Hình 4: Sắc ký trao đổi ion b/ Ứng dụng: - 30-40mL canh trường được cho qua cột DEAE-Sephacel (1.8 x 60.0 cm) cân bằng với 25mM dung dịch đệm tri-acatate, pH 6.5, chứa 1 mM EDTA (đệm B). - Protein nào không bám lên resin (nhựa trao đổi ion) sẽ bị rửa trôi với dung dịch đệm tương ứng. Những protein bám được sẽ bị rửa trôi dần bởi sự gia tăng dần nồng độ NaCl ở đệm B (20 và 300 mM) ở tốc độ dòng chảy 0.71 mL.phút-1 và 5 mL phần tử sẽ được thu nhận. - Những phần tử PIII và PIV thu được từ cột DEAE-Sephacel sẽ được tái sắc ký với một cột DEAE mới (1.6 x 26.5 cm) cân bằng với dung dịch đệm B và rửa trôi với 50 mM NaCl. Tốc độ dòng chảy của pha động Thông số vật lýExo-PG IIExo-PG IIIMr (Sự lọc gel – Gel sinh học P 100)63 kDa79 kDaNhiệt độ tối ưu50 oC50 oCpH tối ưu5.05.8Vmax2571 U/mg185 U/mg Chương 3 : Ứng dụng của enzyme pectinase 3.1 Tình hình ứng dụng enzyme trong công nghiệp trên thế Từ khi phát hiện ra enzyme và khả năng chuyển hóa của enzyme loài người đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng dùng enzyme trong công nghiệp. Số lượng enzyme phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzyme dùng vào trong công nghiệp ngày càng nhiều. Các enzyme quan trọng sử dụng rộng rãi trong công nghiệp đựợc trình bày trong bảng sau: SttLoại enzymeTỉ lệ ứng dụng 1 2 3 4Enzyme protease Trypsine Rennet Protease acid Protease trung tính Protease kiềm yếu Protease kiềm mạnh dùng trong chất tẩy rửa Carbohydrase Pectinase Isomerase Cellulase  - amylase  - amylase Lipase Các enzim khác sử dụng trong y học và trong phân tích59% 3% 10% 3% 12% 6% 25% 28% 3% 6% 1% 13% 13% 3% 10% Bảng 3: Mức độ ứng dụng của một số enzyme quan trọng trên thế giới Stt Loại enzyme Giá trị buôn bán enzyme ( triệu USD)1 2 3 4 5 6Carbohydrase Protease Lipase Pectinase Những loại enzyme đặc biệt Các laọi enzyme khác83,2 187,2 31,6 41,6 20,8 41,6Trong số các loại enzyme được sản xuất và ứng dụng trên thế giới , các nước châu Âu sản xuất và bán ra thị trường thế giới số lượng nhiều nhất Bảng 4: Thị trường enzyme châu Âu SttLĩnh vực công nghiệp và enzymeGiá trị buôn bán enzyme (triệu USD)SttLĩnh vực công nghiệp và enzymeGiá trị buôn bán enzyme (triệu USD)1 2 3 Chuyển hóa tinh bột Amylo glucosidase  - amylase Glucose isomerase Cellulase, hemicellulase Enzym naám sôïi Pullulanase  - amylase Công nghiệp sữa Rennet động vật Rennet vi sinh vật Lipase-esterase Lysozym Rượu, bia, nước giải khát Pectinase Papain  - glucanase Cellualse-hemicellulase  - amylase Amyloglucosidase Glucose oxidase140 55 40 20 5 3 1 1 110 75 20 8 6 46 10 8 4 3 – 4 2 – 3 1 – 2 0,5 4 5 6 7Cồn  - amylase Amyloglucosidase Pullulanase  - glucanase Cellulase-hemicellulase Công nghiệp bánh kẹo Amylase nấm sợi  - amylase Protease Cellulase-hemicellulase Thực phẩm hỗn hợp Invertase LipaseBromelin Glucose oxidase Thức ăn gia súc  - glucanase Cellualse-hemicellulase  - amylase Glucose oxidase Protease vi khuẩn32 15 10 – 12 1 – 2 1 – 2 1 – 2 15 8 2 3 – 4 1 – 2 8 3 – 4 2 – 3 < 1 < 0,5 < 0,5Riêng trong công nghệ thực phẩm, lượng enzyme được tiêu thụ nhiều nhất. Số lượng enzyme được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm chủ yếu ở các nước châu Mỹ và châu Âu Bảng 5: Thị trường enzyme trong công nghệ thực phẩm, thức ăn gia súc trên thế giới 3.2 Ứng dụng của enzyme pectinase Các chế phẩm ezyme pectinase thường được sử dụng trong sản xuất nước quả, sản xuất rượu vang , trích ly đông dược ( sắc thuốc ) và trong chăn nuôi. 3.2.1 Ứng dụng chế phẩm pectinase trong sản xuất nước quả Có các mặt hàng nước quả trong, nước quả đục, nước quả có thịt quả ,tất cả đều được sản xuất từ nước ép ( chiết rút của quả ). Do đó hiệu quả thu dịch quả phụ thuộc vào tính chất của nguyên liệu quả ( cấu tạo, độ chín, thành phần định tính, và định lượng của pectin trong quả, phương pháp ép, chiết rút ). - Khi chế biến nước quả trong thì chế phẩm pectinase phải có endo và exo của polygalacturonase . Enzyme pectinesterase và proteinase. Hai loại enzyme này đều làm giảm độ nhớt của dịch quả , còn PE góp phần vào tác dụng của enzyme này, còn protein thủy phân protein của vỏ tế bào thực vật làm cho dịch quả dễ thoát ra, cặn và bã dễ lắng hơn. Với các loại quả có nhiều protopectin như táo, lê, ổi thì chế phẩm không được có enzyme protopectinase vì nếu có sẽ phân hủy protopectin làm mềm hóa mô quả, tăng độ nhớt của dịch quả nên làm giảm hiệu suất lấy nước quả trong. Ngoài ra nước quả không được phép chứa các enzyme oxy hóa ( ascobatoxydase, polyphenoloxydase, peroxydase) làm hao tổn vitamin C và sẫm màu, biện pháp sử dụng nhiệt ( đun nóng ) sẽ vô hoạt hóa hệ enzyme này. - Để thu được nước quả với hiệu suất cao, người ta thường nghiền thịt quả , xử lý bằng chế phẩm ezyme pectinase, sau đó mới đem vắt, ly tâm hay ép. Chẳng hạn : Nếu xử lý táo nghiền bằng 0.03% chế phẩm pectinase ( 200 đơn vị hoạt độ) PMG ( gam ) sau 2-4 giờ sẽ tăng hiệu suất thu dịch quả 20-25%. Khi ép nho mà không sử dụng chế phẩm pectinase thì hiệu suất ép là 65%, nhưng nếu sau khi nghiền chà quả và xử lý bằng 0.2% chế phẩm pectinase trong 3 giờ ở 450C sẽ nâng cao hiệu suất ép lên 77-82%. Dùng pectinase còn có tác dụng làm trong do sự phá hủy hệ keo trong nước quả, vị của quả tốt hơn và ít bị đục trở lại. 3.2.2 Ứng dụng chế phẩm pectinase trong sản xuất rượu vang Rượu vang được sản xuất từ các loại quả ngọt ( quả có đường ) : nho, táo, dâu, chuối, dứa, mơ, mận, anh đào … bao gồm các giai đoạn chủ yếu : Điều chế dịch quả lên men Lên men dịch quả Xử lý và tràng trữ vang Chế phẩm pectinase dùng trong công nghệ vang để làm tăng hiệu suất thu dịch quả và để làm trong. Các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất rượu vang phải có những yêu cầu sau + Chế phẩm không được làm giảm chất lượng của vang, không được gây ảnh hưởng xấu đén hương vị và màu sắc của sản phẩm, nghĩa là chế phẩm phải được làm sạch tới mức tối đa khỏi các tạp chất có ảnh hưởng xấu đén chất lượng vang. + Chế phẩm được đưa vào dịch hay bã nghiền để tăng cường quá trình sơ chế quả, tăng nhanh và làm trong dịch, nâng cao tốc độ lọc, tăng hiệu suất chung và đặc biệt là hiệu suất của phần tự chảy có chất lượng cao. Để tăng nhanh và làm tốt quá trình làm trong dịch thì tương quan hoạt độ của các enzyme chính như endo - PMG là 55,0.102 đơn vị/ mg protein chứa trong phế phẩm, còn enzyme Cx là 57,5 đơn vị/mg protein chứa trong 1 lit dung dịch. Trong trường hợp này không cần có mặt PE. Nhưng nếu hoạt độ của endo – PMG ở trong chế phẩm là 31.102 đơn vị / mg protein thì có PE với hoạt độ 4,1 đơn vị / mg protein. Trong sản xuất vang nho giữa hàm lượng enzyme endo-PMG là 28,2.102 đơn vị / mg protein và Cx là 28,7 đơn vị/mg protein quá trình làm trong sẽ xảy ra nhanh hơn khi có hoạt độ endo-PMG là 25,4.102 đơn vị / mg protein và Cx là 55,0 đơn vị/mg protein + Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn định của vang, nghĩa là phải chứa enzyme proteinase với hoạt độ không thấp hơn 120 đơn vị / g theo globulin và 140 đơn vị / g theo anbumin. + Để tránh tổn thất màu của vang đỏ và tránh xuất hiện màu tối trong vang trắng thì hoạt độ enzyme oxy hóa trong chế phẩm không được vượt quá 0,1 đơn vị / mg axit ascorbic trong một phút trên một gam chế phẩm. + Chế phẩm pectinase dùng trong vang quả phải bảo toàn được hoạt độ trong điều kiện có chứa rượu ( 10-12% ) và phải tác dụng có hiệu quả trong điều kiện có độ pH nhất định. + Để xử lý dịch hoặc bã nghiền ở trạng thái dòng có thể dùng chế phẩm pectinase có hoạt độ cao ( 12000 đv/g ) hoặc dùng chế phẩm pectinase không tan. Chẳng hạn, trong sản xuất vang nho, khi sử dụng chế phẩm pectawamorin PM10x người ta thấy có thể tăng hiệu suất dịch tự chảy lên 32% . Trung bình thể tích của phần dịch có thể tăng được 10% còn hiệu suất chung của dịch tăng lên 1-2%. Hoặc khi ép bã nghiền nho trắng đã được xử lý bằng pectinol thì thấy quá trình ép tiến hành nhanh hơn. Hiệu suất dịch khi đó tăng lên 9.6%. Vậy dùng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng tốc độ làm trong và tốc độ lọc của dịch. Thời gian épThể tích dịch thu đượcKhông xử lýKhi có xử lý bằng enzim30 giây đầu 30 giây thứ 2 Phút thứ 2 Phút thứ 3 Phút thứ 4 Phút thứ 5 Phút thứ 6 Phút thứ 7 Phút thứ 8 Phút thứ 9 Phút thứ 10400 100 90 90 80 60 50 50 50 50 40 1060675 225 215 205 110 110 110 110 100 100 90 2050 Bảng6 : Tốc độ ép của bã nghiền nho khi sử dụng pectinol Khi sử dụng chế phẩm pectinase, các polyme của dịch như protein, pectin… sẽ thủy phân làm giảm độ nhớt do đó làm tăng tốc độ lọc. Trong 1 gìơ dịch thu được từ bã nghiền của nho có xử lý bằng chế phẩm pectinase sẽ qua lọc 7 lần nhanh hơn từ bã không được xử lý. A.A.Martakov đã chứng tỏ rằng khi xử lý bằng enzyme thì độ nhớt của dịch bị giảm đi ít hơn là khi xử lý dịch, vì lẽ khi đó protopectin của thành tế bào cũng bị phân giải. Khi dịch không được xử lý bằng enzyme thì trong quá trình lắng, các hạt vẫn đục lớn và nhỏ sẽ bị kết tủa xuống. Khi sử dụng enzyme thì các chất cao phân tử của dịch sẽ bị thủy phân từng phần, độ nhớt bị giảm, kết quả là tốc độ làm trong đều tăng. Sử dụng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng chất lượng của dịch quả và của vang. Trong quá trình xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase, thành phần hóa học của bã thay đổi rất đáng kể mà trước tiên là hàm lượng chất phenol. Người ta thấy rằng khi xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng hàm lượng catesin ở trong dịch. Khi đó quá trình trích ly sẽ vượt lên trước quá trình oxy hóa catesin ngay cả trong nhiệt độ tăng. Điều này rất quan trọng, vì các hợp chất phenol đặc biệt là catesin có các nhóm hydroxy ở vị trí octo thường có hoạt tính của vitamin P. Như vậy xử lý bằng bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng giá trị sinh học của dịch quả và vang. Không những vậy vang được pha chế từ dịch và bã nghiền có xử lý bã bằng chế phẩm pectinase sẽ chín nhanh hơn do đó cần chiết sớm hơn. Người ta cho thấy rằng chế phẩm thu được từ nấm mốc Botrylis cinerea gây ảnh hưởng rất tốt đến chất lượng của vang, vang có hương thơm mạnh và dịu do hàm lượng glyxerin và ester ở trong vang cao. 3.2.3 Ứng dụng chế phẩm pectinase trong trích ly các dựoc liệu đông y Các dược liệu có nguồn gốc thực vật thường là lá, hoa, quả, vỏ và thân cây, củ, rễ… pectin là một trong các thành phần phổ biến của mô thực vật. Tuy nhiên hàm lượng của chúng trong các dược liệu không giống nhau : loại chứa ít nhất 3.8%, loại chứa nhiều nhất 37.7%. Từ trước đến nay để thu nhận được các thành phần hoạt chất trong dược liệu để trị bệnh cấp thời ( ngay lúc đó ), để điều chế dạng cồn ( rượu ), thuốc ( uống và xoa bóp ), để điều chế dung dịch thuốc, viên nén, viên nang. Đặc biệt hiện nay để sản xuất thuốc tiêm và dịch chuyền từ chính các vị thuốc đông y, các thực phẩm chức năng, người ta dùng các phương pháp: chiết rút bằng nước nhiệt ( còn gọi là sắc thuốc – và đây là phương pháp phổ biến nhất ), bằng cồn ( ngâm rượu thuốc ), trích ly bằng dung môi thích hợp ( axeton, ete, nitơ lỏng, axeton lạnh ). Do có thành phần pectin nên quá trình sắc thuốc khó khăn, không trích ly được triệt để hoạt chất, dịch thuốc bị biến chất sau một thời gian ngắn. Để tiết kiệm công sức tránh phiền phức và tổn thất khi sắc thuốc theo đơn, người ta có thể dùng chế phẩm pectinase để phân giải mô thực vật để các hoạt chất được giải phóng ra dễ dàng và triệt để hơn khi sắc thuốc. Các chế phẩm pectinase dùng trong trích ly dược liệu đông y phải thỏa mãn những điều kiện tối thiểu sau : - Chế phẩm phải có độ tinh khiết rất cao để không mang theo những tạp chất có thể làm giảm phẩm chất của thuốc. - Chế phẩm phải có hoạt độ cao để chỉ cần sử dụng với một lượng tối thiểu. Sơ đồ quá trình trích ly dược liệu có sử dụng chế phẩm pectinase có thể như sau : Dược liệu  Làm nhỏ  Trộn enzyme  Thủy phân lần 1  Hãm chiết  Thủy phân lần 2  Nung nóng, làm nguội  Lọc  Cô đặc  Đóng chai Thanh trùng 3.2.3 Ứng dụng chế phẩm pectinase trong chăn nuôi Khẩu phần thức ăn của động vật thường có hàm lượng pectin, xenluloza và hemixenluloza cao. Thế nhưng động vật lại chỉ có khả năng tổng hợp rất hạn chế các enzyme cacbohydraza phân giải được tinh bột và disaccarit. Trong dịch tiêu hóa động vật không có enzyme phân ly liên kết glycozit do đó không thể thủy phân xenluloza và nó chuyển thành dạng đồng hóa được. Trong dịch tiêu hóa động vật cũng không có hemixenluloza để phân giải xilan, pectinase để phân giải pectin, liguinase để phân giải ligin và các hợp chất phức tạp khác. Như vậy là một nhóm gluxit rộng rãi sẽ được phân hóa bởi các enzyme của chính các động vật mà nhờ vào enzyme của vi sinh vật sống ở dạ cỏ và ruột già, để sử dụng hóa năng tàng trữ trong các polyme đó. Trung bình, khoảng 1/3 chất hữu cơ đi vào cùng với thức ăn không được đồng hóa bởi động vật. Để giúp động vật sử dụng triệt để thức ăn, người ta phải thải thêm vào khẩu phần ăn của chúng các chế phẩm enzyme nguồn vi sinh vật có hoạt độ pectinase cùng với xenlulose và hemixenlulose cao. Trong chăn nuôi người ta thường dùng các chế phẩm pectinaza BMx, pectaWamorin BM10x và Pectofoctidin BM10x. Khi sử dụng enzyme trong chăn nuôi, điều quan trọng là phải chọn được chế phẩm thích hợp. Chẳng hạn khi nuôi và vỗ béo lợn thì phải dùng chế phẩm phức hợp có tác dụng tối ưu trong môi trường trung tính axit yếu, có hoạt độ protease cao và amylase vừa phải. Khi nuôi gia cầm, kết quả tốt nhất là dùng phế phẩm vi khuẩn có hàm lượng cacbohydrase cao và hàm lượng protease kiềm tính cũng như axit tính vừa phải. Khi nuôi bê thì trong khẩu phần tốt nhất là thêm chế phẩm có hàm lượng cacbohydrase cao và hàm lượng protease, còn khi vỗ béo thì thêm phức hệ cacbohydrase có tác dụng tối ưu trong môi trường axit yếu. Trong chăn nuôi, điều quan trọng nữa là xác lập được liều lượng chế phẩm tối ưu. Thường khi sử dụng liều lượng lớn lại không có hiệu quả. 3.2.3.1 Ứng dụng chế phẩm pectinase trong khẩu phần động vật nhai lại Động vật nhai lại khác với động vật có vú khác ở chỗ có các vi sinh vật sống ở dạ cỏ tham gia tích cực vào việc tiêu hóa thức ăn. Ở đây có điều kiện tương đối ổn định, thuận lợi cho sự phát triển của các quần thể vi sinh vật khác nhau, trong đó có vi khuẩn mao trùng và nấm mốc. Vi khuẩn đóng vai trò chính trong các quá trình enzyme ở trong dạ cỏ ( tổng lượng vi khuẩn trong 1 gam các vật chứa trong dạ cỏ lên tới 108 – 1010 ). Do các phẩm chất của sự lên men vi khuẩn liên tục được tách ra nên không ngăn cản mà còn tạo điều kiện thuận lợi cho các enzyme vi sinh vật tác dụng. Do đó, thêm vào thức ăn các phế phẩm enzyme có hoạt độ pectinase và xenlulose cao có pH=6,0-7,0 sẽ làm tăng độ tiêu hóa của thức ăn. Năm 1972 ở nông trang “Zaria” thuộc tỉnh Bengoroxki đã thí nghiệm vỗ béo trâu bò non 12-13 tháng tuổi (trọng lượng 275kg) bằng bã củ cải có thêm chế phẩm Pectawmorin BMx với liều lượng 0.10%, 0.15%, 0.25% (so với chất khô của khẩu phần ) trong 140 ngày. Kết quả cho thấy liều lượng chế phẩm Pectawmorin tốt nhất là 0.15% TN1TN2TN3NhómĐối chứngTNĐối chứngTNĐối chứngTNTrọng lượng sống Ban đầu TN Sau TN Tăng trọng trung bình hàng ngày (g) % so với đối chứng Chi phí cho kg tăng trọng Đơn vị thức ăn % so với đối chứng Tăng trọng thêm trên 1 đầu súc vật (kg)  275 384 991 100 8.4 100 __ 275 401 1145 115.5 7.2 85.6 17.0 260 376 960 100 9.0 100 __ 261 391 1084 112.9 7.9 88.4 14.0 285 390 913 100 8.8 100 __ 285 105 1045 114 7.7 87.5 15.0Bảng 7 : Kết quả thí nghiệm vỗ béo trâu bò non 12-13 tháng tuổi trọng lượng 275kg ) bằng củ cải có thêm chế phẩm Pectawamorin BMx với liều lượng 0.10%, 0.15%, 0.25% N.V. Ezdakob và IU.E. Razmacin (1970) cũng đã nghiên cứu ứng dụng của chế phẩm Pectawamorin BM10x với liều lượng 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.05%, 0.03% để vỗ béo bê đực. Khẩu phần chính lúc ban đầu là bã, thức ăn tinh rơm và 1kg mật rĩ, tính ra trong đó chứa 6.51 đơn vị thức ăn, 685 gam protein tiêu hóa được , 35.3 gam canxi, 31 gam photpho. Khẩu phần được tính để thu được 800 gam tăng trọng trung bình hằng ngày. Chế phẩm enzyme Pectawmorin được cho vào cùng với thức ăn tinh 1lần/ngày. Thời gian thí nghiệm kéo dài 90 ngày. Các kết quả thí nghiệm được dẫn ra trong bảng dưới đây : Nhóm và liều lượng chế phẩmTrọng lượng sống (kg)Tăng trọng trung bình hằng ngày theo tháng vỗ béoSau thí nghiệmĐầu TNSau TNTháng thứ 4Tháng thứ 2Tháng thứ 3Tăng trọng trung bình hằng ngày (g)So với đối chứngg%g%g%Nhóm đối chứng I 0.005% II 0.01% III 0.015% IV 0.03% V 0.05%296 298 295 289 296 295363 871 376 367 368 362710 865 970 930 805 705100 121.8 136.6 130.9 113.3 99.4 760 820 920 890 810 750100 107.8 121.5 117.1 106.5 98.6760 740 800 790 770 800100 97.3 105.2 103.9 101.3 105.2744 800 895 870 306 751100 107 120.3 116.8 107.6 100.9Bảng 8: Kết quả thí nghiệm nghiên cứu hiệu quả sử dụng của chế phẩm Pectawmorin BM10x với liều lượng từ 0.005%, 0.01, 0.015%, 0.03% và 0.05% để vỗ béo bê đực Qua bảng trên cho thấy liều lượng chế phẩm Pectawmorin BMx tốt nhất là 0.01% so với trọng lượng chất khô của khẩu phần. Sự tăng trọng trung bình hằng ngày của bê đực so với nhóm đối chứng là 20.3% (P<0.05). Sự tăng trọng qua từng chặng ở nhóm này cũng cao hơn nhóm khác. Nghiên cứu ảnh hưởng của Pectawmorin BM16x đến độ tiêu hóa các chất dinh dưỡng của khẩu phần bã chứng tỏ rằng nó làm tăng độ tiêu hóa của protein lên tới 4.1% - 11%. Chế phẩm cũng làm tăng mức độ sử dụng nitơ lên tới 11%. Chỉ tiêuNông trường đường Lenin tỉnh Tuxki (20 đầu gia súc trong nhóm vỗ béo trong 115 ngày )Nông trường Zaria tỉnh Bengoroxki (116 gia súc vỗ béo trong 115 ngày )Nông trường Đavôn tỉnh Bengoroxki (31đầu gia súc vỗ béo trong 115 ngày ) Đối chứng TNĐối chứng TNĐối chứng TNTăng trọng trung bình hằng ngày g % so với đối chứng Chi phí cho 1kg tăng trọng Đơn vị thức ăn % so với đối chứng Độ calo của 1kg thịt kcal % so với đối chứng Cứ một đầu gia súc tăng trọng thêm (tính ra kg)783 100 8.6 100 1516 100 887 113.3 7.6 88.4 1945 128.3 12.0 913 100 8.8 100 2029 100 1043 114.2 7.7 87.5 2410 118.7 15.0 744 100 9.01 100 __ __895 120 7.53 83.2 __ __ 13.6Bảng 9: Hiệu quả sử dụng của chế phẩm Pectawmorin BM10x (0.01%) để vỗ béo gia súc non bằng bã 3.2.3.2 Ứng dụng pectinase trong chăn nuôi ngỗng Ngỗng có năng lực sinh trưởng rất cao, có thể sử dụng các thức ăn xanh, thức ăn mọng nước và thức ăn thô do đó làm hạ được giá thành sản xuất thịt. Vấn đề chính trong sản xuất thịt ngỗng là làm thế nào để rút ngắn được thời gian nuôi nhưng đông thời lại làm tăng trọng nhanh và giảm được chi phí thức ăn trên một đơn vị tăng trọng. Để đạt mục đích đó, người ta có thể dùng các chế phẩm Pectoclostridin BS3x Pectawamorin BM10x và pectawamorin BMx cho thêm vào khẩu phần thức ăn của ngỗng. Người ta đã thí nghiệm nuôi ngỗng bằng khẩu phần thức ăn có cho thêm chế phẩm Pectawamorin BMx và Pectawamorin BM10x. Khẩu phần gồm thức ăn trộn sẵn, khô dầu, nấm men, bột cá và các thức ăn khác đã được tính cân bằng về năng lượng, protein vitamin và các nguyên tố vi lượng. Ngỗng được chia làm 7 nhóm : - Nhóm I : Khẩu phần không có chế phẩm enzyme - Nhóm II : Khẩu phần thức ăn + 0.01% Pectawamorin BM10x - Nhóm III : Khẩu phần thức ăn + 0.02% Pectawamorin BM10x - Nhóm IV : Khẩu phần thức ăn + 0.03% Pectawamorin BM10x - Nhóm V : Khẩu phần thức ăn + 0.04% Pectawamorin BMx - Nhóm VI : Khẩu phần thức ăn + 0.08% Pectawamorin BMx - Nhóm VII : Khẩu phần thức ăn + 0.16% Pectawamorin BMx NhómTrọng lượng sống bình quânTăng trọng tuyệt đốigTăng lên so với đối chứngg% so với đối chứngI II III IV V VI VII3700 4180 4157 4180 4460 4367 4429_ + 480 + 457 + 480 + 764 + 663 + 7203600 4080 4057 4080 4364 4263 4320100 113.3 112.7 13.3 21.2 8.4 1.0 Bảng 10 : Trọng lượng bình quân và sự tăng trọng của ngỗng sau 70 ngày tuổi Qua bảng cho thấy trọng lượng của ngỗng ở các nhóm đều cao hơn ở nhóm đối chứng. Liều lượng chế phẩm Pectawamorin có hiệu quả hơn cả là 0.04% ( Nhóm V). Thêm Pectawamorin BM10x vào khẩu phần của ngỗng sẽ làm tăng chi phí lên 5.3- 6%. Kết quả sẽ kinh tế hơn khi đưa vào thức ăn trộn sẵn chế phẩm Pectawamorin BMx chưa tinh chế. Không những tăng trọng mà chất lượng của thịt ngỗng của nhóm thí nghiệm lại có hàm lượng protein và chất béo nhiều hơn. Do đó độ calo cũng lớn hơn. Chỉ tiêuNhómIIIIIIChất khô Protein Chất béo Tro Độ sinh trọng lượng (Kcal)35.12 17.5 19.6 0.96 258535.96 18.2 16.77 1.02 263038.7 18.5 19.02 1.01 2870 Bảng 11 : Thành phần hóa học của thịt ngỗng (%) 3.2.3.3 Ứng dụng pectinase trong thành phần thức ăn của gà mái đẻ Người ta cũng dùng các chế phẩm pectawamorin BM10x, petofoctidin BM10x, pectoclostridin bổ sung vào thành phần thức ăn của gà mái đẻ để tăng sản lượng của trứng gà. N.V/Ezdakov và.F.Kastin (1973 ) đã dùng 3 chế phẩm trên để bổ sung vào khẩu phần thức ăn của gà mái đẻ và so sánh hiệu quả tác dụng của những chế phẩm đó. 3.2.4 Ứng dụng pectinase trong lên men và sản xuất cà phê Trong quá trình lên men, lượng enzyme pectinase được tổng hợp khá nhiều. Các enzyme này tham gia phản ứng sau : Pectin + H2O  pexit pectic + CH3OH Enzyme pectinase được tạo thành nhờ vi khuẩn và nấm mốc. Trong đó lưu ý rằng các pectinase của vi khuẩn thường hoạt động ở pH cao hơn của nấm mốc ( Ở vi khuẩn pH 5-6 và ở nấm mốc pH 4-5 ). Các enzyme pectinase thường bị mất hoạt tính ở nhiệt độ 950C trong 20 phút. Chương 4 : Ứng dụng của enzyme pectinase trong sản xuất nước nho đỏ Để hiểu rõ hơn về ứng dụng của enzyme pectinase trong công nghiệp ta tìm hiểu về ứng dụng của nó trong công nghệ sản xuất nước quả ép, cụ thể là nước quả nho đỏ. 4.1. Tác dụng của enzyme pectinase Khi chế biến nước quả trong thì chế phẩm pectinase phải có endo và exo của polygalacturonase. Enzyme pectinesterase và proteinase. Hai loại enzyme này đều làm giảm độ nhớt của dịch quả, còn PE góp phần vào tác dụng của enzyme này, còn protein thủy phân protein của vỏ tế bào thực vật làm cho dịch quả dễ thoát ra, cặn và bã dễ lắng hơn. - Làm tăng hiệu suất chiết rút dịch quả - Làm trong dịch quả, làm giảm độ nhớt của dịch quả giúp quá trình lọc được tốt hơn. So sánh bổ sung enzyme pectinase và không bổ sung enzyme pectinasetrong quá trình sản xuất nước quả épBổ sung enzyme pectinaseKhông bổ sung enzyme pectinase- Hiệu suất thu dịch ép cao hơn ( tăng 14 – 30 % ) - Độ nhớt của dịch quả giảm mạnh. - Quá trình lọc tốt và nhanh hơn. - Tăng nhanh quá trình làm trong dịch quả.- Hiệu suất thấp hơn. - Độ nhớt dịch quả cao. - Quá trình lọc kém và lâu hơn. - Quá trình làm trong dịch quả mất nhiều thời gian 4.2 Quy trình sản xuất nước nho đỏ Nho Rửa sạch Gia nhiệt 85-900C Làm lạnh nhanh Bổ sung pectinase 0.03% Ép và lọc Dịch lọc Bổ sung pectinase 0.03% Lọc Đóng chai Thanh trùng Giải thích quy trình : - Nho : chọn loại nho có độ chín thích hợp - Rửa nho nhiều lần bằng nước sạch nhằm loại bỏ vi sinh vật và tạp chất. - Cho nho vào thùng và gia nhiệt , nhiệt độ được tăng lên 85 – 900C trong thiết bị gia nhiệt và thời gian từ 5 đến 20 phút tùy thuộc vào độ chín của nho. - Sau đó nho được làm lạnh nhanh và giữ nhiệt độ 45 – 50 0C trong 3 đến 4 giờ trong thùng kín. - Bổ sung pectinase với liều lượng 0.03% , mục đích để thủy phân các liên kết pectin trong tế bào để thu được dịch chiết nhiều hơn , làm tăng dịch chiết lên 15-30%. - Sau đó ta tiến hành ép rồi thu dịch lọc , dịch lọc được bổ sung thêm 0.03% pectinase ( mục đích để phân cắt các phân tử pectin , làm giảm độ nhớt của dung dịch và giúp cho quá trình lọc tốt hơn ). - Thời gian làm trong dịch quả có thể từ 4 – 6 giờ. - Nếu thời gian xử lý enzyme lâu quá thì nước nho sẽ thành nước nho trắng và không còn độ đục. - Sau đó nước quả được lọc và rót vào chai đem thanh trùng. Kết luận Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, những vấn đề liên quan đến công nghệ enzyme ngày càng được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn. Ứng dụng các chế phẩm enzyme càng được chú trọng ở các lĩnh vực khác nhau. Trong 20 năm cuối thể kỷ XX và các năm đầu thế kỷ XXI các enzyme khác nhau đã được ứng dụng ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzym trong chế biến nông sản, thực phẩm, thức ăn chăn nuôi gia súc, nhất là trong lĩnh vực sản xuất nước quả, bia, rượu… ( viện công nghiệp thực phẩm,Viện công nghệ sinh học –công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội…)Việc nghiên cứu các enzyme phục vụ nông nghiệp công nghiệp cũng đã được quan tâm và có kết quả đáng kể. Ví dụ, chế phẩm enzyme mới ra đời phục vụ nông nghiệp E 2001 có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất, tăng năng suất cây trồng. Đã có những nghiên cứu ứng dụng enzim pectinase trong sản xuất rượu vang nho và sản xuất nước quả ép rất thành công.