Enzyme cố định và các ứng dụng

lsuberimidate … phản ứng với nhóm amine, hoặc một số chất phản ứng với nhóm carboxyl (-COOH) nhóm thiol (-SH), trong đó glutaraldehyde được dùng phổ biến nhất. Hình 3: Tạo liên kết chéo giữa các phân tử E Hạn chế của phương pháp này: trong quá trình tạo liên kết chéo giữa các phân tử E, có thể phá hỏng cấu trúc của E, làm giảm hoạt động của nó. Vì vậy, cần lựa chọn điều kiện phản ứng, chất tham gia tạo liên kết chéo sao cho hoạt độ của E bị giảm ít nhất. Để tăng độ bền của chế phẩm, có thể sử dụng thêm protein không có xúc tác như albumin huyết thanh bò. Nói chung phương pháp tạo liên kết chéo ít được sử dụng vì không đáp ứng được yêu cầu của nhiều quá trình kỹ thuật trong sản xuất. 2.6. Phương pháp gắn E vào chất mang rắn bằng liên kết cộng hóa trị Vào những năm 1953, Grubhofer và Schleith đã tạo được các chế phẩm không tan của một số E như carboxypeptidase, diastase, pepsin, và ribonuclease bằng cách tạo liên kết cộng hóa trị giữa E với polyaminostyrene đã được diazot hóa. Có thể nói, thành công này đã mở đầu cho việc sử dụng E trong thực tế. Hình 4: Gắn E vào chất mang bằng liên kết cộng hóa trị Ưu điểm : Có thể tạo ra các chế phẩm có độ bền cao, có thể sử dụng trong nhiều quá trình sản xuất quy mô lớn, trong hệ thống dòng chảy. Trong một số trường hợp, các monomer cũng làm giảm hoạt độ E Do E gắn trên bề mặt chất mang nên dễ tiếp xúc với cơ chất. Hạn chế: Cấu trúc của E có thể bị thay đổi một phần trong quá trình gắn với chất mang, làm giảm hoạt độ xúc tác. Do liên kết giữa E với chất mang, có thể làm giảm sự di chuyển tự do của E, và từ đó cũng làm giảm hoạt động của nó. Việc tìm được các điều kiện thích hợp cho quá trình sản xuất chế phẩm không tan theo phương pháp này cũng có nhiều khó khăn. Những đặc tính cần có của các chất mang : Bề mặt của chất mang phải tương thích với E Phải có các nhóm có khả năng phản ứng với các nhóm chức của protein, nhưng không phản ứng với các nhóm chức của trung tâm hoạt động. Có dung tích kết hợp cao Chất mang phải có tính “trơ” đối với các thành phần phản ứng Chất mang phải bền chặt trong điều kiện quá trình phản ứng liên tục kéo dài Độ bền của chế phẩm còn tùy thuộc tính chất hóa lý của chất mang và phương pháp gắn E. Các nguyên liệu thường dùng làm chất mang Chất mang vô cơ: thủy tinh, aluminum oxide, gồm (ceramic) Các polymer tổng hợp Các polymer của saccharide và dẫn xuất của chúng: agarose, dextran, chitin, cellulose; hay một số protein như collagen, gelatin, albumin. Các chất này có bề mặt phân tử ưa nước, lại có nhiều nhóm hydroxyl, có thể tạo thành liên kết cộng hóa trị với E. Cầu nối giữa E và chất mang Do hạn chế của chất mang khi gắn trực tiếp với E có thể làm ảnh hưởng xấu đến hoạt động của E, một phần do chất mang có thể cản trở bề mặt không gian tiếp xúc giữa E và cơ chất. Vì vậy người ta thường dùng spacer có vai trò như là cầu nối giữa E và chất mang, làm cho E có thể hoạt động trong phạm vi môi trường rộng hơn, dễ tiếp xúc với cơ chất hơn. Khoảng cách giữa E và chất mang cũng có vai trò quan trọng, khi có spacer, khoảng cách giữa E và chất mang là khoảng 1nm. Phải chọn được spacer có chiều dài thích hợp, để vừa đảm bảo độ linh động của E và cũng không quá dài. Ngoài chiều dài, để thực hiện có kết quả phương pháp này còn cần lưu ý đến kiểu liên kết giữa E và chất mang, trình tự kết hợp (spacer kết hợp với E trước rồi mới kết hợp với chất mang hay ngược lại) Phương pháp gắn E vào chất mang bằng liên kết cộng hóa trị: trong nhiều trường hợp thường tiến hành qua 2 giai đoạn chính: Xử lý, hoạt hóa chất mang trước khi gắn E Gắn E vào chất mang đã được hoạt hóa Một số phương pháp dùng để hoạt hóa chất mang như: dùng cyanogens bromide, diazot hóa, azide acid, các chất ngưng tụ… Các ví dụ Cyanogens bromide (BrCN) được sử dụng phổ biến để hoạt hóa các chất mang Có nhiều nhóm hydroxyl như các polysaccharide, các hạt thủy tinh, gồm…sơ đồ phản ứng được trình bày trên hình  Phương pháp alkyl hóa các nhóm trên chất mang Làm cho nó dễ dàng phản ứng với các nhóm amino, nhóm hydroxyl phenolic, nhóm sulfhydryl của phân tử E. Các dẫn xuất halogen của acetyl cellulose, dẫn xuất triazinyl của cellulose hay các chất trao đổi ion khác được dùng trong phương pháp này. Tạo cầu disulphide giữa E và chất mang Đối với các E có nhóm sulfydryl không có vai trò quan trọng đối với hoạt động xúc tác của E, có thể dùng chất mang có nhóm sulfydryl để tạo cầu disulphide với E. Phản ứng này có tính thuận nghịch, có thể dễ dàng tách E khỏi chất mang (nếu hoạt động của nó bị giảm), để tái tạo chế phẩm, chỉ cần thêm chất khử vào. Dùng các hóa chất ngưng tụ Ví dụ, sử dụng carbodiimide làm yếu tố ngưng tụ để tạo thành liên kết peptid giữa các nhóm carboxyl hoặc nhóm amino của chất mang, với các nhóm amino và các nhóm carboxyl của E. Phương pháp này được sử dụng đối với chất mang cellulose. Tạo liên kết peptide bằng phương pháp azide acid Phương pháp này dùng trong hóa tổng hợp peptid. Ví dụ dùng chất mang là CM-cellulose, phản ứng tiến hành như sau: Phương pháp diazot hóa Phương pháp này được sử dụng đối với các chất mang có các nhóm amino thơm, nhóm amin của nó được diazot hóa bằng acid nitrous, tạo thành dẫn xuất diazonium. Dẫn xuất này phản ứng với E tạo E không tan. Ví dụ dùng chất mang là 4-aminobenxyl cellulose, phản ứng tiến hành như hình. Cố định E trên bột thủy tinh bằng liên kết cộng hóa trị Chất mang bột thủy tinh có nhiều ưu điểm như chịu được các điều kiện khắc nghiệt, có cấu trúc bền vững, vì vậy rất thuận tiện trong công nghiệp. Hạn chế chính của chất mang này là có tính “trơ” về hóa học. Vì vậy để có thể sử dụng chúng một cách có hiệu quả, cần gắn thêm các nhóm phản ứng vào bề mặt của nó. Có thể trình bày tóm tắt quá trình gắn E vào bề mặt bột thủy tinh không có lỗ. Chuẩn bị bột thủy tinh, hạt có đường kính khoảng 1mm, quá trình gắn E được thực hiện qua 5 bước chính như sau : Hoạt hóa bề mặt thủy tinh bằng phản ứng với silane để đưa nhóm amin vào. Phản ứng tiếp với p-nitrobenzoylchloride, nhóm nitro của vòng thơm sẽ được chuyển hóa bằng các phản ứng khác. Khử nhóm nitro thành nhóm amino Cho tác dụng với acid nitrous, nhóm amino chuyển thành cation diazonium Nhóm diazonium sẽ kết hợp với gốc tyrosine trong phân tử E. Cố định E vào polyamide bằng liên kết cộng hóa trị Nylon là polyamide kỹ thuật quan trọng nhất, là polymer mạch dài được tạo thành do phản ứng ngưng tụ với lượng tương đương của acid adipic và hexanediamine n HOOC-(CH2)4-COOH + n H2N-(CH2)6-NH2 [-NH-CO-(CH2)4-CO-NH-(CH2)6-]n Ưu điểm của nylon là bền dưới tác dụng của vi sinh vật, và cũng có tính ưa nước ở mức độ nhất định. Vì vậy, có thể sử dụng nylon để bọc E, nhưng khó tạo được liên kết cộng hóa trị giữa E và nylon vì nó chỉ có hai nhóm ở hai đầu phân tử là có thể phản ứng với E. Để tăng số nhóm có khả năng kết hợp với E, cần thủy phân một số liên kết amide trong polymer để tạo thành các nhóm amino và carboxyl tự do có thể kết hợp với E. Cố định E vào các nhóm amin sau khi thủy phân một phần polyamide, quá trình này gồm có 4 bước Xử lý polymer để làm tăng diện tích bề mặt và tăng khả năng tiếp xúc với nước Cắt đứt một số liên kết amide Hoạt hóa các nhóm amin hoặc nhóm caborxyl tự do Gắn E vào polyamide đã được hoạt hóa Những điều cần lưu ý khi thực hiện việc cố định E Khi lựa chọn phương pháp và thử nghiệm cố định E cần lưu ý các điều sau đây: E phải ổn đinh trong điều kiện xảy ra phản ứng: quan trọng nhất là hoạt lực E và độ bền của nó theo thời gian phản ứng, điều này quyết định hiệu suất phản ứng, hiệu suất tổng thu hồi và hiệu quả của toàn bộ quá trình (giá thành, giá trị khoa học và thực tiễn, giá trị kinh tế - xã hội) Nếu có thể được thì các hợp chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang (giữa chất mang và E) sẽ chủ yếu tương tác với những nhóm chức năng nằm ngoài trung tâm hoạt động của E. Nếu điều kiện này không thực hiện được hoàn toàn thì chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang phải có kích thước lớn không cho phép nó xâm nhập, ảnh hưởng đến trung tâm hoạt động của E. Trung tâm hoạt động của E phải luôn được bảo vệ bằng các phương pháp khác nhau. Ví dụ như E với trung tâm hoạt động có nhóm – SH thì cần xử lý sơ bộ bằng glutation hay systein và chỉ tái hoạt hóa E sau khi đã gắn nó vào chất mang. Hoặc có thể che chắn tâm hoạt động bằng cách bổ sung vào hỗn hợp phản ứng cơ chất đã được bão hòa bởi E (nồng độ cao nhất mà E có thể thực hiện được phản ứng xúc tác) Khi rửa thiết bị phản ứng để phụ hồi E, không được làm ảnh hưởng xấu đến hoạt tính của E đã được gắn vào chất mang. Khi lựa chọn chất mang cần phải để ý đến phản ứng E sẽ diễn ra cụ thể, sao cho không làm ảnh hưởng thậm chí hủy hoại chất mang và sản phẩm phản ứng không được ức chế hoạt động của E. Ví dụ không thể gắn E cellulose vào chính chất mang là cellulose và các dẫn xuất của nó cũng không thể tiến hành phản ứng thủy phân cellulose trên chính chất mang này. Cần lưu ý đến độ bền của chất mang (bền cơ học, thủy lực học, bền nhiệt, bền gel) nhất là khi phản ứng trong các cột công suất lớn. Phân tích chế phẩm E không tan Khi cố định E trên chất mang, cũng như trong quá trình bảo quản và sử dụng chế phẩm, để biết có bao nhiêu, còn bao nhiêu E trên chất mang, hoạt động của nó biến đổi ra sao cần xác định: Protein Hoạt độ của chế phẩm 3.1. Xác định protein Có nhiều phương pháp khác nhau nhưng nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp sử dụng acid bicinchoninic (BCA) cho kết quả tốt hơn cả. Nguyên tắc Các ion Cu2+ bị protein khử đến Cu1+ trong môi trường kiềm, Cu1+ kết hợp với 2 phân tử BCA tạo thành phức màu đỏ tía. Phản ứng có độ nhạy cao hơn phản ứng biuret nhiều lần: độ nhạy của phản ứng biuret là 0.1- 0.8 mg trong phương pháp BCA có độ nhạy < 10g, và cũng không quá nhạy đối với các detergent ở nồng độ cao. Cách thực hiện Lấy một mẫu E không tan có khối lượng xác định cho vào 1ml dung dịch thuốc thử C và giữ ở 370C, lắc nhẹ, trước khi so màu cần loại bỏ phần không tan. Xác định hoạt độ của E không tan Phương pháp quang học Cách thực hiện: Lấy một lượng xác định E không tan, cho vào bình phản ứng cùng với dung dịch đệm, cơ chất, cofactor, giữ ở nhiệt độ xác định, hỗn hợp phải khuấy liên tục. Để đo vận tốc phản ứng, nếu chất mang E đủ nặng, dễ lắng, có thể dừng ngay phản ứng, gạn lấy phần trong, đo độ hấp thụ quang học, sau khi đo phải cho dung dịch vào lại bình phản ứng để giữ cho thể tích hỗn hợp phản ứng không thay đổi. Trường hợp chất mang không dễ lắng, có thể lọc hay ly tâm, nhưng phải làm thật nhanh, sau khi đo phải cho cả dịch trong và cặn trở lại bình phản ứng. Như vậy sẽ nhận được giá trị ở các thời gian khác nhau. Để tính toán tốt hơn cả là tính trên khối lượng khô, hoặc bề mặt tiếp xúc của chế phẩm. Để đo liên tục phản ứng E có thể dùng thiết bị chuyên dụng: hỗn hợp phản ứng được bơm liên tục vào bình phản ứng trong vòng tuần hoàn khép kín, dịch sau khi đi qua cuvette để đo mật độ quang học. Hình 5: Bình phản ứng E để đo vận tốc phản ứng E không tan Ưu và nhược điểm của E không tan 4.1. Ưu điểm E không hoà tan có đầy đủ tính chất của một E, tuy ở dạng không hoà tan mà vẫn giữ được hoạt động xúc tác, ưu điểm nổi bật của E không hoà tan so với khi ở dạng hoà tan là: Có thể sử dụng lặp lại nhiều lần một lượng E xác định (60 – 70 lần), nên làm giảm đáng kể giá thành chế phẩm E, và có thể sử dụng liên tục trong các hệ thống dòng chảy. pH thích hợp của các E này khác nhau, vẫn có thể tìm được điều kiện để các E hoạt động tốt. Không trộn lẫn với các phẩm vật khác của phản ứng và dễ dàng tách ra khỏi hỗn hợp phản ứng, do đó có thể ngừng phản ứng ở bất kì giai đoạn nào. E không tan có độ bền đối với các yếu tố hóa lý (nhiệt độ, pH, áp suất…) cao hơn khi ở dạng hoà tan. Ví dụ: cố định protease làm tăng độ bền nhiệt gấp chục nghìn lần. Sau khi được cố định không những độ bền với nhiệt của E tăng lên mà phạm vi nhiệt độ tối thích của E cũng được mở rộng. Nhiệt độ cao làm cho E bị biến tính, cấu trúc bậc ba của E bị phá vỡ và E bị mất hoạt tính. Khi E được cố định nhờ nhiều liên kết gắn với chất mang quá trình biến tính sẽ bị ngăn cản, làm cho E chịu được nhiệt độ cao. Trong một số trường hợp đối với các E thủy phân protein, ví dụ papain và trypsin, sự cố định làm ngăn cản một phần hoặc hoàn toàn hiện tượng tự phân. Điều này có ý nghĩa thực tế vì nó giúp làm tăng thời gian làm việc của E. Có thể thực hiện chuỗi phản ứng bằng cách gắn nhiều E lên một chất mang nhằm giúp giảm chi phí, đẩy nhanh quá trình. Ví dụ : A E1 B E2 C E3 D Thiết lập mô hình để nghiên cứu các E liên kết với màng trong hệ thống sống, nghiên cứu ảnh hưởng của vi môi trường lipid đối với hoạt động của các enzyne trong màng, giúp chúng ta mô hình hóa hệ thống sống. 4.2. Nhược điểm Khi E được cố định trên chất mang, hoạt động của nó bị giới hạn trong một vi môi trường nhất định. Tính chất của E không hoà tan còn phụ thuộc vào phương pháp cố định và bản chất của chất mang. Mỗi loại E có chất mang phù hợp Phải có thiết bị dùng để cố định E có hiệu suất cao Hoạt độ riêng thấp hơn ở dạng hoà tan Hằng số Km biểu kiến có thể thay đổi do ảnh hưởng trường tĩnh điện của chất mang Độ bền của E không tan có thể không thay đổi, tăng hoặc giảm tùy thuộc vào khuynh hướng ảnh hưởng của vi môi trường pH thích hợp của mỗi E có thể thay đổi, nhất là các chất mang có điện tích ỨNG DỤNG CỦA E CỐ ĐỊNH Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, E và các chế phẩm của nó ngày càng được sản xuất nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, da giày, dệt may, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Cho tới nay, người ta đã biết được khoảng 3.000 E. Tất cả các E đều được gọi tên và được xếp vào “Hệ thống phân loại” gồm 6 lớp (class), trong các lớp có các lớp phụ (subclass), nhóm (section). Hằng năm, lượng E được sản xuất trên thế giới vào khoảng trên 300.000 tấn, với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Phần lớn, E được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại E đơn cấu tử, xác tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là E thủy phân, dùng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Thấy được vai trò quan trọng của E - chất xúc tác quan trọng trong các phản ứng hóa học ở mọi cơ thể sống. Ở Việt Nam, vấn đề về nghiên cứu E học cũng đã được quan tâm, thu hút sự quan tâm của nhiều nhà sinh hóa, sinh học thực nghiệm cũng như các nhà khoa học trong lĩnh vực khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch E, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu về cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của E, khả năng ứng dụng vào đời sống của E và các sinh phẩm từ nó. Các E thường được sử dụng trong dung dịch, sau đó không thu hồi được, mà việc chiết tách chúng rất tốn kém làm giá thành cao. Chính vì khắc phục nhược điểm của E hòa tan, có thể sử dụng lặp lại nhiều lần (60 đến 70 lần) nên E cố định mang lại hiệu quả cao khi sản xuất ở quy mô công nghiệp, tiết kiệm chi phí sản xuất. Đặc biệt, khi dùng các E cố định thì sản phẩm không bị lẫn E nên tinh sạch hơn và đỡ tốn kém hơn. Vì thế, khai thác ưu điểm này, E cố định được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phẩm, y dược, xử lý chất thải… 1. Trong công nghiệp 1.1. Sản xuất sirop giàu fructose E cố định glucoisomerase Ứng dụng công nghệ sử dụng E chuyển hóa này đã mang lại nhiều ích lợi đáng kể, đặc biệt là ở các nước có nguồn nguyên liệu tinh bột dồi dào. Một trog những ví dụ điển hình về ứng dụng các E cố định với quy mô lớn trong công nghiệp là sản xuất chất ngọt từ bột. Mỹ đã sản xuất hơn 8 triệu tấn sirop giàu fructose. Chất bột dưới tác dụng của α – amylase biến thành dextrin, chất này nhờ glucoamylase thủy giải đến tận cùng tạo glucose có độ ngọt thấp hơn đường thường là saccharose hay sucrose. Glucose được biến thành fructose nhờ glucoseisomera tạo ra sirop glucose – fructose ngọt hơn đường saccharose. Phản ứng do glucoseisomerase thực hiện là thuận nghịch. Quá trình được thể hiện như sau: α- --z Việc sử dụng enzyme không tan để sản xuất sirop giàu fructose đã được ứng dụng trong sản xuất dịch fructose nồng độ cao từ bột ngô (HFCS), mỗi năm khoảng 5 triệu tấn. Khi sử dụng glucoamylase và glucoisomerase không tan trong hệ thống phản ứng liên tục, giá thành của enzyme chỉ chiếm 0,28% giá thành sản phẩm cuối cùng. Giá thành sản phẩm sản xuất theo phương pháp này chỉ bằng 1/10 khi sử dụng enzyme ở dạng tự nhiên. Khoảng năm 1970, ở Mỹ dùng 6 loại chế phẩm glucoisomerase gắn với chất mang khác nhau, theo các phương pháp khác nhau, đến năm 2002, ở Mỹ chỉ dùng 4 loại chế phẩm không tan của enzyme này tách ra từ Streptomyces. Hai chế phẩm ở dạng hạt, cố định bằng tương tác tĩnh điện với chất mang tích điện (DEAE - cellulose và chất mang làm từ silic dioxyde), hai chế phẩm khác là chế phẩm không tan của tế bào Streptomyces cố định bằng liên kết chéo đồng hóa trị nhờ glutaraldehyde. Để tăng tỷ lệ fructose lên gấp 1.7 lần đường ăn, các glucoisomerase cố định được sử dụng trong bioreactor. Dung dịch glucose khi qua bioreactor chứa glucoisomerase sẽ biến thành fructose rồi thoát ra ngoài để được thu hồi, nhờ vậy dịch sirop glucose – fructose từ bột giàu fructose chứa đến 42% fructose, 50% glucose và 8% các đường khác. Dịch sirop này có thể được xử lý bằng nhiều cách khác nhau để tạo thành một số sản phẩm có hàm lượng fructose khác nhau: 55%, 70%, 90% hoặc tinh thể fructose. Từ những kết quả trên cho thấy enzyme cố định thể hiện rõ vai trò ưu việt của nó. Hình 6: Bioreactor sử dụng E hoặc tế bào cố định [3] Một số chế phẩm thương mại sử dụng E glucoseisomerase được liệt kê trong bảng sau: [4] Các enyme glucoisomera thường được sử dụng ở dạng E cố định liên kết với cầu nối glutaraldehyde, trong một số chế phẩm cobal và magiesium làm tăng hoạt tính. E glucoisomerase được tách chiết từ xạ khuẩn Actinomyces, khi bảo quản cần tránh O2. Trong quá trình chuyển gluco thàng fructo vẫn còn 1 lượng ít glucose, cần tiến hành hồi lưu để thu sản phẩm tinh sạch. E cố định invertase Với các nước ở vùng nhiệt đới như Ấn Độ, lượng mía trồng rất phong phú, các sirop fructose cao có thể thu được từ một quá trình đơn giản hơn đó là thủy phân sucrose nhờ E invertase. So với sucrose đường nghịch hoạt tính và độ hòa tan cao hơn. Trong lịch sử, invertase có lẽ là E đầu tiên được cố định, nghiên cứu và ứng dụng. Một số lượng lớn các hệ thống invertase cố định đã được nghiên cứu và cấp bằng sáng chế. Việc sử dụng các tế bào nấm men nguyên vẹn để thu E invertase đã được chứng minh bởi D'Souza và Nadkarni vào năm 1978. Một nghiên cứu có hệ thống đã được tiến hành trong phòng thí nghiệm để tạo ra đường nghịch (invert sugar) bằng cách sử dụng E cố định invertase hay sinh khối của các tế bào nấm men 17-19, 38, 45, 55, 68, 69, 71, 98. Những nghiên cứu toàn diện thực hiện trên các khía cạnh khác nhau về việc sử dụng tế bào nấm men nguyên vẹn để cố định E đã thu được nhiều kết quả đáng kể trong công nghiệp sản xuất đường nghịch (Glucose và Fructose). Hiện nay, xu hướng trong công nghiệp là sản xuất chất ngọt theo phương pháp dùng các E cố định này, vì ít tiêu tốn năng lượng hơn và không phụ thuộc mùa vụ như đường làm từ mía vì sản xuất đường mía phải quy hoạch vùng nguyên liệu cho nhà máy, đến mùa thu hoạch phải tốn nhiều năng lượng chế biến, chặt và chuyên chở khối lượng lớn, ép mía, nấu cô đặc, kết tinh, li tâm và thu đường, chỉ khoảng 10% như vậy sản lượng là rất thấp. Ngoài ra, còn được ứng dụng trong công nghệ giải khát do giảm lượng đường gần 2 lần, dẫn đến giảm chi phí nguyên liệu để từ đó giảm giá thành các sản phẩm như pepsi, cocacola... Sử dụng trong chế biến thức ăn cho người ăn kiêng, do fructose không gây bệnh đường và không gây sâu răng, giúp giả quyết nhu vầu cần thiết của người bị bệnh tiểu đường. 1.2. Sản xuất sữa phi lactose Lactose là một disaccharic có công thức cấu tạo galacto – O – gluco được gọi là đường sữa loại đường có này có độ ngọt thấp (bằng 30% với đường saccharic ở cũng nồng độ), độ hòa tan kém gây nên hiện tượng sạn đường trong sữa. Một bộ phận người sử dụng không có khả năng tiêu hóa hấp thụ được sữa này. Như ta biết, những người lớn tuổi thường được khuyến khích nên uống sữa vì cơ thể họ không có E phân hủy lactose trong sữa. Mặc khác đường sữa hầu như được thải cùng với sữa, nếu đem chế biến các sản phẩm sữa chua, phomat sẽ gây ô nhiễm môi trường. Như vậy nếu thủy phân lactose thành 2 monosaccharic cấu thành nó sẽ mang lại hiệu quả lớn hơn, nâng cao chất lượng sữa, lọai bỏ hiện tượng sạn sữa, nâng cao độ tiêu hóa và các monosac sẽ được vi sinh vật sử dụng khi lên men sữa. b-galactosidase E cố định trong công nghiệp sữa phi lactose, thường sử dụng b-galactosidase. Sự có mặt của b-galactose trong sữa đã khắc phục được vấn đề này một cách đơn giản. Chính vì vậy, những người “tiêu hóa khó” với lactose hoàn toàn có thể yên tâm khi sử dụng những chế phẩm sữa được bổ sung E thủy phân lactose. Điều này có ý nghĩa rất lớn đối với một đất nước như Ấn Độ - nơi có số người không dung nạp được lactose rất lớn. Lactose thủy phân còn tăng cường vị ngọt, tính hòa tan của đường. Và từ đó, mở ra trong tương lai nhiều tiềm năng phát triển đa dạng hơn các chế phẩm từ sữa. Chất thủy phân lactose có thể được sử dụng như là một thành phần của sữa, đồ uống có pha các chế phẩm sữa, các chất liệu thức ăn, hoặc có thể được lên men để sản xuất ethanol và rượu. Như vậy, ta đã chuyển một phụ gia rẻ tiền vào những thực phẩm dinh dưỡng cao, chất lượng tốt Các chuyên gia ngành sữa tại Anh và xứ Wales, đã thiết lập E cố định b-galactosidase tại nhà máy ở Bắc xứ Wales để sản xuất lactose-hydrolysed. Các b-galactosidase được chiết xuất từ nấm, sau đó được ứng dụng và sản suất theo quy mô công nghiệp. Lactase Bên cạnh việc sản xuất E cố định b-galactosidase, người ta còn cố định E lactase cho cùng hiệu quả trên. Dưới tác dụng của E lactase của ruột non thì Với các bệnh nhân về đường tiêu hóa hay trẻ em suy dinh dưỡng, kém ăn, do hệ E lactase kém, hoạt động yếu nên việc sản xuất loại sữa lactose đã được thủy phân sẽ giúp dễ tiêu hóa hơn. E latase được sinh tổng hợp từ 1 số loài nấm mốc và nấm men. Hãng SNAM progetti (Ý) sử dụng bioreactor dung tích 10l chứa 4 kg latase cố định trong sợi acetat celluloza. Trước hết sữa được tiệt trùng cực nhanh ( 42 oC, 3s), làm lạnh nhanh đến 4 – 7oC rồi cho chảy qua bioreactor với vận tốc 7lít/phút. Sản phẩm sữa bảo quản tốt trong 3 đến 4 tháng ở 4oC. Hiện nay hãng sản xuất hàng ngày 10 tấn sữa phi tactose. Các công ty đầu tiên thương mại hydrolyse - lactose trong sữa bởi E cố định lactase đã được Centrale del Latte của Milan (Italia) sử dụng công nghệ snamprogetti. Quá trình này sử dụng một lactase trong sợi tổng hợp. Hãng Corning Glass từ năm 1978 sử dụng E latase liên kết đồng hóa trị với silicagel để xử lý dịch trong sữa với công suất 30 tấn / ngày. Một số chế phẩm thương mại sử dụng E latase được liệt kê trong bảng sau:[5] 1.3. Dùng E cố định trong việc biến đổi aminoacid Trong quá trình tổng hợp hóa học hay lên men để sản xuất các acid amin, nhược điểm lớn là cho ra các sản phẩm raxemic, tức là hỗn hợp của 2 dạng đồng phân quang học D, L. Trong đó chỉ có dạng L mới có hoạt tính sinh học cao, có ý nghĩa trong khoa học hóa sinh. Nếu sử dụng phương pháp hóa học hay kết hợp với sinh tổng hợp bằng cách lên men hai pha sẽ rất tốn kém, không khả thi. Từ năm 1969 hãng Tanabe Seizaku của Nhật Bản đã sử dụng E cố định amino acylase, là loại E đồng phân hóa chuyển acid amin từ dạng D sang dạng L.Từ đó chuyển hóa hoàn toàn hỗn hợp D, L acid amin. Quá trình thực hiện qua các bước sau: Bước 1: hỗn hợp D, L – amino acid được xử lý acetyl anhydride thành D, L - acyl aminoacid. Bước 2: D, L - acyl amino acid dưới tác động đặc hiệu của L – amino acid acylase cố đinhj cắt nhóm acyl tạo L – amino acid có độ hòa tan khác với D – acyl amino acid. Bước 3: tách L – amino acid khỏi D – acyl amino acid. Bước 4 : D – acyl amino acid có thể được triền quang hóa rồi tái sử dụng Trong đó ezyme amino acylase được cố định trên DEAE Sephadex bằng liên kết ion trong thời gian bán hủy là 65 ngày ở 50oC. E sau khi gắn vào chất mang có hoạt tình 50 – 60% hoạt tính E tự do. Chế phẩm E cố định được nhồi vào bioreactor. Sau 65 ngày làm việc sẽ được tái sinh với dịch E mới, cứ như vậy sau 8 năm mới phải thay chất mới, tiết kiệm được một lượng lớn chi phí và công sức trong sản xuất. Hình 7: Sơ đồ công nghệ sản xuất L axit amin của hãng TANABE SEIZAKY [6] E aspartase chuyển dạng L – aspartic L – aspartic acid được sử dụng rộng rãi trong các loại thuốc và như là một phụ gia thực phẩm. Là cơ chất trung gian của rất nhiều quá trình chuyển hóa sinh tổng hợp các acid amin khác rất quan trọng trong dinh dưỡng động vật và chế biến thực phẩm như sản xuất acid L – valin, tổng hợp acid α – xetoglutaric là tiền chất để chuyển hóa thành acid L – glutamic. Cơ chế hóa sinh của sự tạo thành acid aspartic là quá trình tạo liên kết đồng hóa trị giữa NH3 với acid fumaric bởi E aspartase theo phương trình sau: Các E đã được cố định bằng cách sử dụng toàn bộ tế bào E.coli. Đây được coi là ứng dụng công nghiệp đầu tiên của tế bào vi khuẩn cố định. Quá trình ban đầu được cố định trên gel polyacrylamit sau này được thay thế bằng gel carageenan. Từ năm 1973, hãng TANABE SEIZAKY đã sử dụng tế bào có chứa E aspatase và cố định nó trong gel polyacrylamit với bán chu kỳ hoạt động là 120 ngày ở 37oC. Sau quá trình ứng dụng với cột bioreactor dung tích 1m3 trên đã sản xuất được 1700 kg acid L – aspartic / ngày với chi phí bằng < 60% so với công nghệ cũ (chuyển hóa bằng phương pháp hóa học). E thermolysin sản xuất aspartame L – aspartic acid là thành phần gốc của aspartame, được phát hiện vào năm 1969, có độ ngọt gấp 200 lần đường ăn, được tạo thành từ phenylalanime và aspartate, nhưng α – aspatame có vị ngọt, còn β – aspartame lại có vị đắng. Người ta đã sử dụng thermolysin trong môi trường nước, E này xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide, nhưng nếu bảo vệ nhóm amin của L - aspartame và khóa nhóm carboxyl của Phe, nó sẽ xúc tác cho phản ứng ngược, tức là tổng hợp liên kết peptide, tạo thành aspartame ở dạng muối kết tinh, D - phenyalanine methyl ester còn lại trong dung dịch, racemic hóa thành dạng L và được tái sử dụng như trên. Aspartame được sử dụng như chất đường cho người ăn kiêng. Sản xuất acid L – malic bằng E fumarase hydratase cố định Acid malic được sử dụng để thay thế acid citric trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Hiện nay, đây là một thì trường rộng lớn, giàu tiềm năng, mang lại lợi ích kinh tế lớn. Vì vậy việc sản xuất acid L – malic thay acid citric bằng cách sử dụng E cố định ngày càng được quan tâm hơn. Dưới tác dụng của E fumarase, acid fumaric được chuyển hóa thành acid malic. Ở Nhật Bản, các công ty như Tanabe Seiyaku và Kyowa Hakko đã sử dụng E fumarase cố định để sản xuất acid malic. Nguồn E được lấy từ các vi khuẩn B.flavus và được cố định trong gel polyacrylamde hay trong sợi triacetat celluloza. 2. Ứng dụng trong y học Ứng dụng trong phân tích chất Cố định E Glucose-oxidase Một ứng dụng khác của E cố định trong lĩnh vực y học là thực hiện định lượng đường máu (Glucose) hiệu quả hơn. Nồng độ glucose bình thường trong máu người khoẻ mạnh, lúc đói là: 4,4 – 6,1 mmol/l (0.8-1.1g/l). Trước kia, định lượng đường máu theo phương pháp Folin - Wu là phương pháp định lượng không đặc hiệu dựa vào tính khử của đường cho nên khi trong máu bệnh nhân có các chất khử khác (ví dụ vitamin C) nó sẽ tạo nên kết quả cao hơn nồng độ đường thực có. Hiện nay, định lượng đường máu đặc hiệu là phương pháp enzym - màu. Đó là phương pháp định lượng đường máu dựa trên phản ứng xúc tác của gluco-oxidase: oxy hóa glucose thành acid gluconic và peroxidhydrogen (H2O2). H2O2 tác dụng với 4 - aminoantipyrine và phenol dưới xúc tác của peroxidase (POD) tạo thành chất có màu hồng là quinoneimine và nước. Đo mật độ quang của đỏ quinoneimine ở bước sóng 500nm sẽ tính được kết quả đường máu. CHO-(CHOH)4 - CH2OH + O2 , E gluco oxydase COOH –( CHOH )4–CH2OH Gluco oxydase được gắn lên điện cực platin, khi đo nhúng điện cực vào dung dịch rồi đo kết quả phản ứng. Bằng phường pháp enzym, kết quả đường máu chính xác hơn, không phụ thuộc vào các chất khử. E cố định sử dụng trong biosensor (cảm biến sinh học) Hình 8: Hệ thống biosensor [7] Các E cố định được sử dụng trong biosensor để chẩn đoán và mục đích khác. Một biosensor được cấu tạo từ 1 thụ thể sinh học và 1 hệ thống chuyển tiếp. thụ thể sinh học (bioreceptor) là phân tử sinh học nhận biết được nhân tố đích, sự nhận biết đó được nhân tố chuyển tiếp biến thành tín hiệu có thể đo được. Tính độc đáo của biosensor là hai thành phần trên được kết hợp thành một đầu dò duy nhất. Sự kết hợp này giúp đo được nhân tố đích cần phân tích mà không cần các chất phản ứng. Điều này thuận lợi so với việc xét nghiệm qua nhiều bước và mỗi bước phải sử dụng một chất phản ứng đối với mẫu. Ezyme là biosenssor nhờ khả năng nhận biết đặc hiệu, các bioreceptor gồm kháng thể, nucleic acid và các protein thụ thể. Sự nhận biết này thông qua tương tác yếu giữa nhóm trên bề mặt trình diện E và ở các phân tử khác không phải E. Cách đo đơn giản và nhanh là thuận lợi chính của biosensor sử dụng E cố định, và có thể cho ra kết quả định tính và định lượng. GDH của B.cereus được sử dụng vàp mục đích này vì nó có tính đặc hiệu cao, chỉ oxy hóa D – gluco. Phản ứng xảy ra như sau : Lượng NADH tạo thành được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm, từ đó định lượng gluco trong máu. Như việc nghiên cứu sử dụng E acetylcholin esterase được cố định để ứng dụng tạo biosensor nhạy cảm, có khả năng phát hiện ra thuốc trừ sâu OP (organophosphate), parauxon. Trong khoảng 0.4 – 2 ppm với thời gian phân tích là 15 phút cũng đã có những kết quả khả quan. [8] E cố định trong công nghiệp kháng sinh a. Penicillin Penicillin G [9] APA [10] E penicillin amydase cố định đóng vai trò thiết yếu trong quá trình sản xuất penicillin bán tổng hợp. Penicillin là một nhóm chất có tính kháng sinh, có cấu tạo chung gốc R là gốc acyl thì ta có penicillin G và là loại phổ biến nhất hiện nay. E penicillin amydase xúc tác thủy phân penicillin G để tạo thành nhóm 6 – aminopenicillanic (6 – APA và acid phenyl acetid. Bằng cách loại bỏ chuỗi bên của penicillin G tự nhiên thu được lượng lớn trong quá trình lên men, sau đó gắn nhánh mới vào lõi 6 – aminopenicillanic acid. Vậy dung dịch penicillin G đi qua bioreactor chứa penicillin acylase cố định và sản phẩm đầu ra là 6 – aminopenicillanic acid kết tủa ở pH 4,2 – 4,3 và được thu nhận. Năm 2000, E.Katchalski – Katzir và D.M.Kraemer đã dùng chất mang là Eupegit C, là một polymer dạng hạt, có các nhóm chức epoxide hoạt động để gắn penicillin G amydase bằng liên kết cộng hóa trị. Chế phẩm E không tan này có thể dùng lặp lại 600 lần, phản ứng được thực hiện trên quy mô công nghiệp ở nhiệt độ 30 – 40oC và pH 7.5 – 8.0. Tỷ lệ chuyển hóa trong điều kiện này rất tốt, đạt 98%. E nội bào được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn E.coli, B.facecalic. Với môi trường casein thủy phân, cao ngô, glucose... làm chất cảm ứng. Chất mang ở đây có thể là gel polyacrylamid, sephadex, dextran… 6 – APA được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dược phẩm để sản xuất các loại kháng sinh họ penicillin. Hiện nay toàn bộ 6 – APA của thế giới đều được sản xuất bằng phương pháp sử dụng E penicillin amydase cố định. b. Bacitracin Bacitracin là một hỗn hợp polypetide, có ở tế bào Bacillus.spp. Trong sản xuất công nghiệp, ezyme được cố định trong màng gel polyacrylamide để sản xuất kháng sinh bacitracin. Ngoài ra bacitracin có thể kết hợp với các loại kháng sinh khác, sử dụng như thuốc mỡ dùng để điều trị các bệnh nhiễm trùng da mắt, phòng chống các bệnh nhiễm trùng vết thương. c. Tylosin và nikkomycin Tylosin [11] Tylosin và nikkomycin có thể được sản xuất bởi tế bào sống của Streptomycin spp, được cố định bằng canxium algenat. Tylosin được sử dụng trong thú y để điều trị các bệnh nhiễm trùng gây ra do vi khuẩn kháng thuốc, bệnh viêm kết tràng ở động vật… Ngoài ra còn được sử dụng như chất hoạt hóa tăng trưởng. Nikkomycin là kháng sinh có khả năng ức chế sinh tổng hợp chitin ở vách tế bào bằng cách ức chế cạnh tranh chitin symthase, tác dụng quan trọng trong các điều trị nhiễm trùng. [12] Sản xuất prednisolone điều trị thấp khớp Sử dụng 2 E không tan là steroid 11β – monooxygenase và - dehydrogenase. Hai E này xúc tác cho quá trình chuyển hóa 11- deoxycortisol, một tiền chất tương đối rẻ, thành prednisolone, có tác dụng điều trị cao. Thành phần của thận nhân tạo Trong thận nhân tạo có các E không tan như urease, glutamate dehydrogenase, alcoholdehydrogenase. Quá trình được thực hiện như sau: urea trong máu của bệnh nhân được đưa vào thận nhân tạo nhờ thẩm tích, urease phân giải urea thành CO2 và NH4+, loại NH4+ bằng nhựa trao đổi ion hay glutamate dehydrogenase phối hợp với alcoholdehydrogenase để quay vòng CoE trước khi dịch được đưa trở lại vào máu. Từ đó để urea và các chất thải khác khỏi cơ thể của người bị bệnh thận. Ngoài ra trong y học E cố định còn dùng để làm các nội quan giả như bàng quan, niêm mạc... Sử dụng E ở dạng vi tiêm (micro capsul) để đưa E vào chữa trị bệnh thiếu E nhưng không gây nên các phản ứng phụ. Nghiên cứu cấu trúc phân tử E, cấu tạo màng tế bào, mô hình hóa hệ thống enzyme trong tế bào. Một số ứng dụng khác như vi tiểu cầu chứa catalase đã có thể thay thế một cách có hiệu qủa số catalase bị thiếu sốt trong cơ, đưa vi tiểu cầu có gắn E L - asparaginase vào cơ thể có khả năng ức chế sự phát triển của một số u ác tính vì sự phát triển các u này phụ thuộc vào sự có mặt của L - asparagin. 3. Xử lý chất thải Các chất độc hại trong môi trường thường là các chất hữu cơ có vòng thơm như các hợp chất phenol, các amin vòng hoặc các chất hữu cơ phosoho. Các E cố định xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử thuộc lớp Oxidoreductase và các E xúc tác phản ứng thủy phân thuộc lớp Hydrolase có vai trò tích cực trong việc phá hủy hay loại bỏ các phức chất trên, mang hiệu quả tích cực trong việc xử lý môi trường. Với ý nghĩa đối với công nghệ môi trường, trong lớp Oxidoreductase có thể kể đến các E peroxidase, các E này có ý nghĩa quan trọng. Các loại E này có khả năng phân giải chất độc và gắn lên chất mang, sau đó được đưa lên tháp xử lý, cho dung dịch cần xử lý chạy qua, dung dịch sau xử lý là những chất độc hại được loại bỏ. Tháp xử lý nước thải có E cố định được sử dụng với 1 lượng lớn nước thải. Tháp liên hoàn được ứng dụng nhiều trong công nghiệp này. Hình 9: Một số bình phản ứng E [13] A: Bình là một thùng chứa có cánh khuấy B: Bình phản ứng có 2 lớp màng lọc ở trên và ơ dưới C: Bình phản ứng có dạng có các cột dùng trong sắc ký cột Hình 10: Mô hình xử lý nước thải E thuộc lớp Oxidoreductase E catalase xúc tác phản ứng đặc hiệu phân huỷ H2O2. Ngoài ra, catalase còn có thể phân hủy formaldehyde, formic acid và alcohol. Các chất nêu trên là những chất độc hại với môi trường, được thải ra trong nước thải của các nhà máy chế biến sữa, pho mát hoặc các nhà máy dệt, sợi. Catalase vi khuẩn có tác dụng tích cực trong việc phá hủy chúng. Trong các E peroxidase nêu trên, catalase, peroxidase và manganese peroxidase được nghiên cứu nhiều phục vụ cho việc phát hiện một số ion kim loại độc cho môi trường như: Hg+2, Pb+2, Cd+2 , Cr+6, Mn+2. Peroxidase củ cải ngựa (Horseradish peroxidase-HRP) HRP là một trong những E được nghiên cứu nhiều nhất có liên quan tới phương pháp xử lý rác thải bằng E. HRP có thể xúc tác phản ứng oxy hoá một phổ rộng các hợp chất thơm độc bao gồm phenol, biphenol, aniline, benzidine và các hợp chất thơm dị vòng như hydroxyquinoline và arylamine carcinogen như benzidine và naphthylamine. Sản phẩm phản ứng được polyme hoá thông qua quá trình không có E xúc tác dẫn tới hình thành các chất kết tủa có thể dễ dàng loại bỏ khỏi nước hoặc nước thải nhờ quá trình lắng đọng hoặc lọc. HRP đặc biệt phù hợp với xử lý nước thải bởi nó giữ nguyên hoạt tính ở phạm vi rộng pH và nhiệt độ. HRP có khả năng làm kết tủa nhiều chất thải khó loại bỏ cùng với nhiều hợp chất dễ loại bỏ hơn bằng cách hình thành các polimer phức tạp có tính chất tương tự như các sản phẩm polimer của các hợp chất dễ loại bỏ. Một hệ quả của đặc tính này đối với các loại nước thải nguy hiểm đã được chứng tỏ khi người ta thấy rằng các chất biphenyl được polichloride hoá có thể bị loại bỏ khỏi dung dịch khi kết tủa với phenol. Các kim loại nặng như arsenic, đồng, cadmi, chì, crom và một số kim loại khác, đều là những chất ô nhiễm nguy hiểm tìm thấy trong một số dòng nước thải công nghiệp và mỏ khai thác cũng như các chất thải rắn, bùn thải của thành. E Cyanide hydratase xử lý chất thải xyanua Cyanide hydratase hoặc formamide hydro - lyase là một E có khả năng chuyển hoá cyanide trong nước thải công nghiệp thành amoniac và formate. Cyanide hydratase được phân lập từ một vài loại nấm và được tạo ra từ nấm khi nồng độ xyanua thấp. Khi được cố định, tính bền của Cyanide hydratase tăng lên nhiều và E từ Gloeocercospora sprrghi bền vững hơn từ Stemphylium loti. Cyanide hydratase từ nấm thích hợp để xử lý các chất thải công nghiệp chứa xyanua. Một số vi khuẩn Gram - (-) như Alcaligenes denitrificans cũng tiết ra cyanidase có ái lực độ bền cao và có khả năng loại xyanua ở nồng độ rất thấp, ví dụ như < 0.02 mg dm-3 CN. Sau này, khi công nghệ sinh học phát triển, người ta đã tách được gen cyanidase từ Pseudomonas stutzeri AK61 Pseudomonas pseudoalcaligenes. Hoạt tính của cyanidase không bị ảnh hưởng bởi các ion thông thường có mặt trong nước thải (ví dụ như Fe2+, Zn2+ và Ni2+), hay bởi các chất hữu cơ như acatat, formamide, acetamide và acetonitrile. pH tối ưu trong khoảng 7.8 - 8.3 và mất hoạt tính hoàn toàn, không phục hồi khi pH cao hơn 8.3. Tóm lại, việc sử dụng E trong xử lý phế thải có một tương lai đầy hứa hẹn. Đây là một trong những hướng nghiên cứu ứng dụng để sử dụng có hiệu quả E trong công nghệ xử lý phế thải sinh hoạt ở nước ta hiện nay. Cố định E urease Urease là một loại enzym thuỷ phân urea hình thành NH3 và CO2, được ứng dụng rất nhiều trong Y học và Công nghiệp thực phẩm để định lượng ure trong các mẫu bệnh phẩm và nước chấm nhất là trong điều trị bệnh nhân thận (máy lọc thân nhân tạo). NH2 – CO – NH2 urease NH3 + CO2 Trong tự nhiên, kim loại nặng có mặt ở khắp mọi nơi. Chúng có độc tính cao, vì vậy gây ra một ảnh hưởng nghiêm trọng đối với môi trường. Do đó, cần phải xác định chúng ở mức độ vết một cách nhanh chóng. Urease là một metalloenzym có ion nickel (Ni2+) ở trung tâm xúc tác. Khi ion nickel ở trung tâm xúc tác bị thay thế bởi ion kim loại nặng khác thì hoạt tính xúc tác của urease bị thay đổi, do đó có thể xác định được hàm lượng kim loại nặng. Vì vậy, urease được gắn cố định ở dạng vi túi (micro - capul) dùng trong ứng dụng xác định hàm lượng kim loại nặng trong môi trường. Trước đây, đã có rất nhiều nghiên cứu về enzym urease đã đưa ra nhiều phương pháp tinh sạch và cố định urease. Ở nước ta, cũng đã có một số nghiên cứu cố định enzym urease từ đậu nành nhưng cũng chưa đưa được quy trình hiệu quả và chưa được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm urease. Ngành y học và thực phẩm ở nước ta hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease từ nước ngoài với giá thành rất cao. 4. Một số ứng dụng tiềm năng Ứng dụng trong hóa học Bằng việc tìm ra các nguồn vi sinh vật có khả năng chịu nhiệt cao tạo ra những loại E bền với nhiệt, cảm ứng cao với pH và những thay đổi khác của môi trường, E và sinh phẩm của nó ngày càng được ứng dụng nhiều trong hóa học. Trong nghiên cứu cấu trúc hóa học, người ta sử dụng protease để nghiên cứu cấu trúc của protein, dùng endonuclease để nghiên cứu cấu trúc nucleic acid. Đồng thời, E cũng được dùng làm thuốc thử trong hóa phân tích. Sử dụng chất mang gắn phức E xúc tác cho phản ứng nhiều bước. Ví dụ như trong tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid, sản xuất hormone… cũng bằng cách tạo phức, người ta gắn vi sinh vật để sử dụng trong công nghệ xử lý nước thải, sản xuẩt alcohol, amino acid. Một ứng dụng nổi bậc của E trong hóa học là sử dụng E trong công nghệ giặt tẩy. Với những tính năng vượt trội của mình, E giúp tăng hiệu quả việc giặt tẩy, tiết kiệm nước, giảm thời gian giặt nhờ khả năng phân hủy vết bẩn nhanh chóng, giảm năng lượng tiêu thụ do có thể giặt ở nhiệt độ thấp, làm giảm ảnh hưởng đối với môi trường do E là chất có thể phân hủy sinh học, làm mới vải, tăng độ trắng và tăng khả năng chống bẩn bám trở lại. Hiện nay, các loại E được sử dụng phổ biến trong sản phẩm tẩy rửa là protease, lipase, xenlulase, amylase…sản phẩm chất tẩy rửa thường có một hỗn hợp dạng cokatil giữa 2 hoặc 3 loại E trên, nhưng có những sản phẩm có cả 4 loại. E nguyên liệu được cung cấp dưới dạng bột, dạng viên nang, lỏng sệt, lỏng. Trong thành phẩm bột giặt chỉ có 0,2 - 2% hạt enzym, trong mỗi hạt chỉ có 2 - 5% protein enzym. Do đó, trong thành phẩm bột giặt chỉ có 0,004 - 1% protein enzym. Trong sản phẩm bột giặt, enzym chiếm 0,2 - 2,0% khối lượng và chiếm 5 - 10% giá thành nguyên liệu. Chất giặt tẩy chứa E là ví dụ điển hình cho sự kết hợp của hóa học và sinh học, mà kết quả là bột giặt có chứa E đang được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới với những tính năng vượt trội giúp tiết kiệm năng lượng và góp phần giảm ô nhiễm môi trường. Glucoamylase gắn đồng hóa trị với polystyrol được dùng để xác định tự động glucose, điện cực urease cố định dùng để xác định tự động urea trên dòng liên tục, điện cực alcoholoxydoreductase cố định dùng để xác định methanol, ethanol trong dung dịch nước. [14] Kỹ thuật cố định không chỉ dùng cho các chế phẩm E mà có thể dùng cho các tế bào vi sinh vật nguyên vẹn. Để cố định các tế bào vi sinh vật người ta thường dùng gel polyacrylamide, cellulose, caraganine và các vật liệu khác. Trong nhiều trường hợp hoạt tính E của các tế bào cố định cao hơn nhiều so với các E tự do nên các tế bào cố định có thể thực hiện được các quá trình sinh hóa tinh vi và phức tạp. Ví dụ các tế bào Rhisobium lupini của nốt sần cây lupin vàng giữ được rất lâu hoạt tính cố định đạm của chúng. Ứng dụng trong nông nghiệp Enzym được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp nhưng chủ yếu được sử dụng nhiều trong chăn nuôi. Những điều tra nghiên cứu đầu tiên về ứng dụng của E trong dinh dưỡng động vật đã được thực hiện vào thập niên 1920. Tuy nhiên, đến thập niên 1950, ngành công nghiệp sản xuất E mới thực sự khởi động. Trong giai đoạn này các chế phẩm E thô được sản xuất và được ứng dụng rộng rãi trong khẩu phần thức ăn cho gia súc, đặc biệt được sử dụng trong khẩu phần cho heo và gia cầm. Việc sử dụng E phục phụ cho chăn nuôi bắt đầu từ Liên Xô chủ yếu là các chế phẩm E thô (chưa tinh sạch hoặc tinh sạch khoảng 3 – 10 lần) từ vi sinh vật với tên khác nhau như: amilorizin, glucoavanmorin, có chứa đến năm E thủy phân khác nhau (amylase, dextrinase, maltase, glucoamylase và protease). Các chế phẩm enzym thường được sử dụng để chuẩn bị thức ăn cho lợn, động vật có sừng và chim. Trong thức ăn của động vật có nhiều chất không thể hấp thụ được như là cellulose, hemicellulose, pectin mặc dù trong hệ tiêu hóa của động vật có các E phân hủy thức ăn nhưng vẫn không đủ để phân giải hết, vì vậy người ta sử dụng các E không tan để bổ sung thiếu E tiêu hóa nội nguồn trong cơ thể gia súc, gia cầm, giảm sự phát sinh của bệnh đường tiêu hóa, thúc đẩy sự hấp thu tiêu hóa đối với các chất dinh dưỡng như protein, tinh bột… phân giải chất xơ trong thức ăn chăn nuôi, giúp các chất dinh dưỡng và E tiêu hóa trong tế bào tiếp xúc hiệu quả, nâng cao sự hấp thu tiêu hóa đối với các chất dinh dưỡng.Thúc đẩy gia súc gia cầm sinh sản, tăng trọng hàng ngày rõ ràng, nâng cao tỷ lệ đẻ trứng và lượng sữa đạt 4-10%. Ví dụ như thêm chế phẩm subtilase vào khẩu phần ăn của lợn làm tăng trọng cao hơn đối chứng 15 - 20%. Việc sử dụng enzym trong chăn nuôi còn đem lại nhiều lợi ích. E sẽ tạo thêm nhiều khả năng sáng tạo để cho ra các công thức thức ăn mới, mở rộng phạm vi sử dụng các thực liệu nhằm khai thác tiềm năng di truyền của các giống vật nuôi cũng như những hạn chế về sinh lý của chúng trong các giai đoạn tuổi khác nhau. Cải thiện chất lượng sữa, trứng và thịt, giảm cholesterol, cải thiện màu trứng vàng, tăng độ dày trứng vỏ, nâng tỷ lệ thịt nạc, nâng cao sức kháng bệnh gia súc gia cầm, giảm phản ứng vụ sóc chịu nổi, giảm tỷ lệ chết. Cải thiện môi trường chăn nuôi, không độc hại, không có thuốc sót lại, hạn chế mùi hôi thối của phân bón động vật, hạn chế mùi amoniac của chuồng nuôi, cải thiện môi trường chăn nuôi, là sự lựa chọn tốt nhất cho thay thế kháng sinh, sản xuất thực phẩm xanh. Ngoài ra người ta còn sử dụng E như là một nguyên liệu tự nhiên nhằm thay thế kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng trong khẩu phần, ít sử dụng thuốc thú y…Với sự hỗ trợ về di truyền của các giống cây trồng (chủ yếu là bắp, đậu nành) nhằm nghiên cứu chọn tạo, sản xuất ra các nguyên liệu thức ăn có E phân hủy phytate và chất xơ... Cùng với các tiến bộ kỹ thuật trong dinh dưỡng thì sự chuyên biệt hóa ngày càng cao của các khẩu phần thức ăn đã làm cho chúng ngày càng trở nên đơn giản hơn với những thực liệu truyền thống như bắp, đậu nành, cám gạo, cám mì...Ví dụ như protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp E dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm. Ngày nay người ta còn sử dụng chế phẩm enzym vào việc nuôi hải sản. Một ví dụ điển hình là Trạm thuỷ sản huyện Cao Lãnh đã triển khai thực hiện mô hình nuôi tôm càng xanh bằng chế phẩm sinh học E - plus nhằm hạn chế ô nhiễm môi trường, giảm rủi ro trong quá trình nuôi. Sau khi tiến hành cải tạo ao đúng qui trình kỹ thuật và kiểm tra các chỉ tiêu môi trường nước nhất là pH phải từ 6,5 – 7 mới tiến hành thả con giống. Do con giống mới thả có kích cỡ nhỏ, lượng thức ăn sử dụng ít, lượng phân thải ra ít nên môi trường không bị ảnh hưởng. Khi tôm nuôi được 1,5 tháng thì tiến hành xử lý E - plus và Zeolite như sau: - Liều lượng sử dụng E - plus: 5 lít/10.000m3 nước/ 3 ngày 1 lần. - Liều lượng sử dụng Zeolite: 14 kg/10.000 m3 nước/ 1 tuần 1 lần. Sử dụng Zeolite để hấp thụ khí độc do E - plus phân huỷ các chất hữu cơ và mùn bã đáy ao gây ra. Trong giai đoạn tôm tăng trưởng và phát triển, thường xuyên kiểm tra, quan sát các diễn biến của môi trường nước ao nuôi vào buổi sáng và buổi chiều để điều chỉnh lượng E - plus cho phù hợp. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu môi trường trước và sau khi xử lý E - plus đều dao động trong mức cho phép: pH: 6.0 – 7.0, NH3/NH4: 0.0 mg/l, NO2: 0.0 mg/l, O2: 3 – 6 mg/l. Kết quả khi sử dụng chế phẩm sinh học cho ao nuôi ở gia đình thì trong suốt quá trình nuôi không có hiện tượng nổi đầu, tôm ít bị đen mang cũng như đóng rong, tôm phát triển nhanh, kích cỡ tôm lớn nhiều. [16] Có thể sử dụng các loại chế phẩm E khác nhau để chuyển hóa các phế liệu, đặc biệt là các phế liệu nông nghiệp cải tạo đất phục vụ nông nghiệp.Công nghệ này khá phổ biến ở nhiều quốc gia. Ở nước ta việc dùng E vi sinh vật góp phần trong sản xuất phân hữu cơ đang được khai thác để thay thế cho phân hóa học. Ví dụ, chế phẩm E mới ra đời phục vụ nông nghiệp E2001 có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất, tăng năng suất cây trồng. Nói tóm lại, trong các lĩnh vực này, E đã có nhiều tiềm năng trong ứng dụng vì vậy việc sử dụng E cố định trong các lĩnh vực này sẽ mang lại sản phẩm nhiều hơn, tốt hơn và nhanh hơn, là một lĩnh vực sẽ mang lại giá trị kinh tế lớn. Tuy nhiên vì chưa có những ứng dụng thật sự cụ thể cũng như những ứng dụng đã đi vào sản xuất E cố định trong các lĩnh vực này, nên nhóm chỉ xếp nó vào ứng dụng tiềm năng của E cố định. KẾT LUẬN Tóm lại, việc nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm E ngày càng được chú trọng ở các lĩnh vực khác nhau. Trong 20 năm cuối thế kỷ XX và các năm đầu của thế kỷ XXI các E khác nhau đã được ứng dụng. Ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các E trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột (Viện công nghiệp thực phẩm, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội…). Việc nghiên cứu các E phục vụ nông nghiệp, công nghiệp cũng được quan tâm và có các kết quả đáng khích lệ. Ví dụ, chế phẩm E mới ra đời phục vụ nông nghiệp E2001 có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất, tăng năng suất cây trồng. Đã có các nghiên cứu ứng dụng protease trong sản xuất rượu bia, rút ngắn thời kỳ lên men cũng như sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng công nghệ E protease. E amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose ở quy mô công nghiệp. Những thành tựu trong nghiên cứu E cố định, chế tạo các E - biosensor đã làm tăng hiệu quả và mở rộng phạm vi ứng dụng của E trong thực tế ở quy mô ngày càng lớn. Ngày nay ta biết rõ rằng phần lớn E nội bào hoạt động trong môi trường tương tự như gel hoặc chúng được “gói” trong màng ti thể lục lạp hoặc các quan tử khác. Vì vậy các E cố định có thể là mô hình tốt để nghiên cứu hoạt động của E. Hi vọng trong tương lai không xa, việc nghiên cứu ứng dụng E cố đinh ngày càng rộng rãi và quy mô hơn trong các lĩnh vực khác nhau. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Thị Thanh Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2007. Công Nghệ Sinh Học, tập 3, Enzyme Và ứng Dụng, trang 143. NXB giáo dục. [2] Phạm Thị Thanh Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2007. Công Nghệ Sinh Học, tập 3, Enzyme Và ứng Dụng, trang 145. NXB giáo dục. [3] HYPERLINK ""  [4]  HYPERLINK ""  [5]  HYPERLINK ""  [6] Trần Xuân Ngạch, Công Nghệ Enzyme, trang 50. [7] Phạm Thành Hổ, 2008. Nhập Môn Công Nghệ Sinh Học, trang 124. NXB giáo dục. [8] HYPERLINK ""  [9]  HYPERLINK ""  [10]  HYPERLINK ""  [11]  HYPERLINK ""  [12] ( HYPERLINK ""  [13] Phạm Thị Thanh Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2007. Công Nghệ Sinh Học, tập 3, Enzyme Và ứng Dụng, ,trang 168. NXB giáo dục. [14] Mai Xuân Hương, Enzyme Và Xúc Tác Sinh Học. Đại học Đà Lạt. [15] Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2007. Công Nghệ Sinh Học ,tập 3, Enzym Và ứng Dụng, trang 130-131. NXB giáo dục. [16]  HYPERLINK ""  ĐÁNH GIÁ CỦA GIẢNG VIÊN