Hoàn thiện kỹ thuật trung hòa vi lượng trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1
Bước đầu ứng dụng kĩ thuật MN trong điều tra huyết
thanh học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1
8. Có16/311 (5,14%)mẫu dương tính. Có 3 trường hợp tiếp xúc
với bệnh nhân, 13 người tiếp xúc với gia cầm. Phần lớn các
trường hợp có hiệu giá KT trung hòa thấp (20-80). Các mẫu
huyết thanh của người trên 60 tuổi có thểcho kết quảMN và HI
không chính xác. Nếu loại bỏcác trườ
33 trang |
Chia sẻ: lvcdongnoi | Lượt xem: 2847 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Hoàn thiện kỹ thuật trung hòa vi lượng trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
LOGO
Luận văn thạc sĩ khoa học
Chuyên ngành: Hoá sinh học
Mã số: 1.05.10
Đại học Quốc gia Hà Nội
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
LOGO
Hoàn thiện kỹ thuật trung hòa vi lượng trong
nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học
trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Vân Trang
Học viên: Nguyễn Hoà Bình
Đại học Quốc gia Hà Nội
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Nội dung
Tổng quan tài liệu1
Vật liệu và phương pháp2
Kết quả và bàn luận3
Kết luận và kiến nghị4
Lời cảm ơn5
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Tình hình dịch cúm gia cầm H5N1 trên thế giới
11/2007
2005
2003
1997
2004
2006
- 60 quốc gia đã
có dịch bùng phát
- 207/337 người
chết/người nhiễm
virus
-200 triệu gia cầm
bị chết và tiêu huỷ
- 10 tỷ USD thiệt
hại về kinh tế
Tình hình dịch cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam
11/2007
2005
2004
2006
- 61/64 tỉnh đã có
dịch bùng phát
- 46/100 người
chết/người nhiễm
virus
- 50 triệu gia cầm
bị chết và tiêu huỷ
2003
Virus cúm gia cầm H5N1
Lớp lipit kép
NA (Neuraminidase)
HA (Hemaglutinin)
M2 (Kênh ion)
M1 (protein nền)
NS1 (protein không cấu
trúc, xâm nhiễm tế bào)
NP (protein nucleocapsit)
PB1, PB2, PA (phức hợp
polymeraza)
NS2
Phân loại: - Thuộc họ Orthomyxoviridae, chi cúm A;
Lây truyền: - Gia cầmÆGia cầm; - Gia cầmÆĐộng vật có vú;
- Gia cầmÆNgười; (NgườiÆNgười)
Sự xâm nhập và sao chép của virus
Lắp ghép và phóng thích
Tổng hợp các thành phần
Xâm nhập và “cởi áo”
Hấp phụ
Chu kì xâm nhập
và sao chép
Cơ chế hình thành chủng mới
Thay đổi lớn KN
(Antigenic Shift): Khi
hai (nhiều) chủng virus
với các đoạn RNA
khác nhau cùng xâm
nhiễm vào một tế bào
chủ, chúng có thể trao
đổi các đoạn gen với
nhau, tạo ra chủng
virus mới có kháng
nguyên thay đổi.
Thay đổi nhỏ KN
(Antigenic Drift): Sự
thay đổi kháng nguyên
do đột biến ngẫu nhiên
như thêm, mất, chèn
điểm hoặc đoạn xảy ra
ở gen mã hoá cho
protein của virut đặc
biệt là HA và NA.
Các phương pháp chẩn đoán virus
1
Chẩn đoán trực tiếp:
-Phản ứng HA
-Phản ứng HI
-Kính hiển vi điện tử
-RT-PCR
-Multiplex RT-PCR
-Real-time PCR
2
Chẩn đoán gián tiếp:
-Phân lập từ trứng
-Phân lập từ tế bào
3
PP huyết thanh học:
- NA và NAI
- Phản ứng HI
- Western Blot
- Serial radial
hemalysis
- Trung hoà virus
(Trung hoà vi lượng)
Trung hoà virus Trung hoà vi lượng
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Dòng tế bào: Tế bào thận chó (MDCK)
KN & KT:
- KN virus A/Vietnam/Ck/6/03 H5N1;
- KT chuột kháng NP virus cúm A và cộng hợp
Phiếu điều tra thông tin cá nhân
Hoàn
thiện kỹ
thuật
trung hòa
vi lượng
Chủng virus: NIBRG-14
Huyết thanh: - Người tiếp xúc với bệnh nhân
- Người tiếp xúc với gia cầm
Điều tra
huyết
thanh học
Huyết thanh: - Chứng âm của người
- Chứng dương của gà và cừu
Hoàn thiện kỹ thuật MN
- Chuẩn bị virus
+ Xác định % trypsin
+ Xác định tỉ lệ pha loãng
virus gốc ÆMOI
-Hoàn thiện kĩ thuật MN
+ Xác định mật độ tế bào
+ Xác định thời gian gây
nhiễm
+ Xác định TCID50
+ Xác định ảnh hưởng của
trypsin
+ Xác định tính ổn định, độ
đặc hiệu và độ nhạy (so sánh
với HI)
Virus đối
chứng (VC)
Tế bào đối
chứng (CC)
Mẫu huyết thanh
Pha
loãng
Bỏ 50 μl
Bắt đầu 1/10 10µl mẫu + 90µl DMEM + 1% BSA
Số mẫu
Virus đối
chứng (VC)
Tế bào đối
chứng (CC)
Huyết thanh
Pha loãng
Bỏ 50 μl
Thêm 100µl virus
Bỏ 50 μl
Tính ngưỡng hiệu giá (X)
X =
- OD ≤ X Æ có KT trung
hòa
- OD > X Æ không có KT
trung hòa
Điều tra huyết thanh học trên người tiếp xúc với
virus cúm gia cầm H5N1
¾ Thu nhận, xử lý, bảo quản mẫu huyết thanh
¾ Thực hiện phản ứng trung hoà vi lượng
¾ Xử lý thông tin về người tiếp xúc (thu thập từ phiếu
điều tra bằng phần mềm Epi Info 6.0 và được xử lý
bằng chương trình thống kê SPSS 15.0.)
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xác định nồng độ trypsin-TPCK và MOI sử dụng trong gây nhiễm
Nồng độ
trypsin
Hiệu giá HA
Pha loãng virus
10-3
Pha loãng virus
10-4
1μg/ml 20-40 < 10
2μg/ml 20 40
5μg/ml 160 - 320 10 - 320
Nồng độ trypsin-TPCK cho hiệu quả cao nhất là: 5μg/ml
Virus gốc được pha loãng với các tỉ lệ 10-3; 10-4. Như vậy, MOI của virus sử
dụng cho phản ứng MN là từ 2x10-3 tới 4x10-3
Xác định mật độ tế bào MDCK thích hợp
Thí nghiệm với tế bào MDCK ở các mật độ khác nhau: 1,5 x 105; 2,0 x 105
và 2,5 x 105 tế bào/ml.
Mật độ 1,5x105 tế bào/ml Mật độ 2,0x105 tế bào/ml Mật độ 2,5x105 tế bào/ml
Mật độ tế bào thích hợp nhất cho phản ứng MN 2,0x105 tế bào/ml
Hiệu ứng huỷ hoại tế bào do virus
CPE 30%
độ khuếch đại 10x
CPE 60%;
độ khuếch đại 10x
TB không nhiễm
virus;
độ khuếch đại 10x
CPE 90%;
độ khuếch đại 10x
Xác định thời gian gây nhiễm virus vào tế bào
Tiến hành thí nghiệm với các khoảng thời gian: 18 tiếng; 20 tiếng
và 22 tiếng trong điều kiện không có và có trypsin-TPCK (0,5
µg/ml).
Kết quả thu được:
+ Ở điều kiện không có mặt của trypsin, thời gian gây nhiễm virus
vào tế bào thích hợp nhất là 22 tiếng,
+ Trong điều kiện có mặt của trypsin-TPCK, ở nồng độ 0,5 µg/ml
với thời gian gây nhiễm 18 tiếng sẽ cho kết quả tốt nhất.
Xác định TCID50 của virus dùng cho phản ứng MN
Ngưỡng dương tính =
AvgCC(OD) + 3SD(OD).
Khoảng cách =
TCID50 = 10-5,5 + 0,25
TCID50 của chủng virus
sử dụng cho phản ứng MN
là 10-5,75 /100ml
10-2 10-
2,5
10-
3,5
10-4 10-
4,5
10-5 10-
5,5
10-6 10-
6,5
10-3 Đối chứng
Thêm
146µl
virus pha
loãng ban
đầu
(1/100)
Chỉ có môi
trường
(không có
virus)
Bỏ đi
46µl
So sánh kết quả phản ứng MN ở điều kiện có và không có mặt
của trypsin-TPCK
Mã huyết thanh Hiệu giá HI Hiệu giá MN không cótrypsin
Hiệu giá MN có
trypsin
Mẫu 1 <10 14* 80
Mẫu 2 <10 10 80
Mẫu 3 10 10 40
Mẫu 4 20 20 160
Mẫu 5 20 160 320
Mẫu 6 20 20 80
Mẫu 7 20 <10 40
Mẫu 8 20 28* 40
Mẫu 9 28* <10 40
Mẫu 10 28* <10 80
Mẫu 11 28* <10 80
HT người (-) <10 <10 Không ổn định**
HT gà (+) 640 1280 1280
HT cừu (+) 640 2560 2560
Đánh giá độ ổn định của phản ứng MN
Lần TN
HT Gà (+) HT Cừu (+) HT Người (-)
Hiệu giá Log(hiệu giá) Hiệu giá
Log(hiệu
giá) Hiệu giá
I 640 2.806 1280 3.107 < 10
II 640 2.806 640/1280 2.957 < 10
III 640/1280 2.957 1280/2560 3.258 < 10
IV 1280 3.107 2560 3.408 < 10
V 1280 3.107 2560 3.408 < 10
VI 1280 3.107 2560 3.408 < 10
Độ lệch
chuẩn 0, 147 (5%) 0,190 (5%)
Phản ứng MN thiết lập được có độ ổn định trong giới hạn cho phép
Đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng MN
HI (-)
HI (+)
MN (-) MN(+)
287
8
20
40 x x x
28
57 57
80 80
160
28x3
x
x
x
160
Æ Phản ứng MN thiết lập được có độ đặc hiệu cao
Æ Phản ứng MN có độ nhạy không cao hơn phản ứng HI
Thông tin dịch tễ các mẫu MN dương tính
Ứng dụng kĩ thuật MN trong điều tra huyết thanh học
Phát hiện được 16/311 mẫu dương tính, có 3 mẫu của người
tiếp xúc với bệnh nhân. Mẫu số 3 của một người nhà bệnh
nhân có hiệu giá cao cả HI và MN, hai trường hợp còn lại là
của nhân viên y tế tham gia chăm sóc bệnh nhân.
13/16 mẫu dương tính là của người tiếp xúc với gia cầm, chủ
yếu ở nhóm chăn nuôi gia cầm, hiệu giá MN của nhóm này
không cao với 8/13 mẫu có hiệu giá MN bằng 20.
4/8 mẫu huyết thanh dương tính với HI, âm tính với MN là
của người trên 60 tuổi, kết quả của các mẫu này có thể không
chính xác, cần được khẳng định lại bằng các kĩ thuật khác.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
A. Hoàn thiện kĩ thuật MN
1. Nồng độ trypsin-TPCK thích hợp cho gây nhiễm là 5μg/ml.
2. Tỉ lệ pha loãng từ virus gốc là 10-3 tới 10-4. MOI trong gây nhiễm
virus vaccine H5N1 vào tế bào: 2x10-3 tới 4x10-3.
3. Mật độ tế bào thích hợp cho phản ứng MN: 2,0x105 tế bào/ml.
4. Thời gian gây nhiễm virus ở điều kiện không có trypsin là 22 tiếng.
5. Virus H5N1 sử dụng có TCID50: 10-5,75/100ml.
6. Đã thiết lập và hoàn thiện kĩ thuật MN với độ ổn định và độ đặc hiệu
cao sử dụng trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp
xúc với virus cúm gia cầm H5N1.
7. Có 98% số mẫu (đã loại bỏ những người trên 60 tuổi) cho kết quả
tương đồng với kết quả của HI.
KẾT LUẬN
B. Bước đầu ứng dụng kĩ thuật MN trong điều tra huyết
thanh học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1
8. Có 16/311 (5,14%) mẫu dương tính. Có 3 trường hợp tiếp xúc
với bệnh nhân, 13 người tiếp xúc với gia cầm. Phần lớn các
trường hợp có hiệu giá KT trung hòa thấp (20-80). Các mẫu
huyết thanh của người trên 60 tuổi có thể cho kết quảMN và HI
không chính xác. Nếu loại bỏ các trường hợp này thì tỉ lệ tương
đồng giữa hai kĩ thuật này đạt 98%.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu, xác định những điều kiện tốt nhất nhằm làm
tăng độ nhạy, giúp hoàn thiện hơn nữa phản ứng MN.
2. Tiến hành phản ứng MN với các chủng virus cúm khác như
H1N1, H3N2, chủng H5N1 có độc lực.
3. Thực hiện phản ứng trên một số lượng mẫu lớn hơn để khẳng định
chắc chắn hơn nữa hiệu quả và độ tin cậy của phản ứng MN.
4. Xác định các dòng tế bào khác có khả năng thay thế cho tế bào
MDCK sử dụng trong phản ứng MN.
5. Tiến hành phản ứng MN với toàn bộ số mẫu thu được và phân tích
hiệu giá MN trên người tiếp xúc với gia cầm và người tiếp xúc với
bệnh nhân.
Lời cảm ơn
1. TS. Nguyễn Vân Trang - người trực tiếp hướng dẫn tận tình và tạo
mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu.
2. PGS. TS. Nguyễn Văn Mùi, PGS. TS. Vũ Tân Trào, đã có định
hướng quan trọng và những lời khuyên bổ ích
3. Chị Đỗ Quỳnh Nga đã giúp đỡ tôi về kĩ thuật trong nghiên cứu.
4. Các thầy cô trong Bộ môn Hoá sinh và Khoa Sinh học, ĐHKHTN
đã cho tôi niềm đam mê khoa học cùng những kiến thức cơ bản.
5. PGS. TS. Đinh Duy Kháng, TS. Nguyễn Tiến Dũng, TS. Mason
(AFRIMS) đã cung cấp virus và hướng dẫn kĩ thuật
6. Lãnh đạo cùng các đồng nghiệp tại công ty Ageless.
7. Các tổ chức SIDA, AFRIMS và NIH đã cấp kinh phí và hoá chất
cho nghiên cứu.
LOGO
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- Hoàn thiện kỹ thuật trung hòa vi lượng trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1.pdf