Khảo sát ảnh hưởng của thời gian cấy đến sự thụ tinh và quá trình phát triển của phôi in vitro trên chuột nhắt trắng

KHAÛO SAÙT AÛNH HÖÔÛNG CUÛA THÔØI GIAN CAÁY ÑEÁN SÖÏ THUÏ TINH VAØ QUAÙ TRÌNH PHAÙT TRIEÅN CUÛA PHOÂI IN VITRO TREÂN CHUOÄT NHAÉT TRAÉNG Mai Coâng Minh Taâm 2 Ngaøy nay, khi nhaéc ñeán lónh vöïc “Thuï tinh trong oáng nghieäm” chuùng ta ñeàu nghó ñeán nhöõng thaønh töïu to lôùn maø noù ñem laïi. ÔÛû nöôùc ta, vieäc öùng duïng “Thuï tinh trong oáng nghieäm” trong Y hoïc nhaèm giaûi quyeát vaán ñeà voâ sinh ñaõ coù nhöõng thaønh coâng röïc rôõ, vieäc beänh vieän phuï saûn Töø Duõ ñoùn chaøo ñöùa beù thuï tinh trong oáng nghieäm thöù 1000. Nhö vaäy, coù theå thaáy thuï tinh trong oáng nghieäm laø moät ngaønh khoa hoïc coù nhieàu tieàm naêng, trong ñoù quan troïng hôn heát noù laø moät phöông thöùc dieäu kyø nhaèm khaéc phuïc hieän töôïng baát thuï cuûa con ngöôøi noùi rieâng cuõng nhö ñoäng vaät noùi chung. Tuy nhieân ñeå ñaït ñöôïc nhöõng thaønh coâng to lôùn aáy, vieäc ñaàu tö nghieân cöùu nhöõng quy trình môùi cuõng nhö vieäc tìm toøi saùng taïo caûi tieán quy trình cuõ nhaèm ñöa ra moät quy trình hôïp lyù mang tính thöïc tieãn cao thích hôïp vôùi ñieàu kieän nöôùc ta laø voâ cuøng caáp thieát. Ngaøy nay ñoái töôïng ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát trong lónh vöïc naøy ñoù laø chuoät nhaét traéng bôûi vaán ñeà ñaïo ñöùc trong sinh hoïc khoâng cho pheùp chuùng ta nghieân cöùu treân con ngöôøi. Trong böôùc ñaàu tieáp caän vôùi quy trình thuï tinh trong oáng nghieäm ôû chuoät nhaét traéng, chuùng toâi ñaõ gaëp khoâng ít khoù nhaên do ñieàu kieän cuûa chuùng ta coøn nhieàu haïn cheá. Nhöng thoâng qua ñoù, chuùng toâi daàn hoaøn thieän thao taùc cuûa mình nhaèm phuø hôïp vôùi ñieàu kieän hieän coù. Vaø thoâng qua ñoù, chuùng toâi nhaän thaáy raèng: “Neáu nhö chuùng ta gia taêng thôøi gian caáy tröùng thì chuùng ta seõ giaûm thieåu thôøi gian hôïp töû toàn taïi trong moâi tröôøng ngoaøi, hôn nöõa caùc chi phí toán keùm veà moâi tröôøng nuoâi caáy, ñóa petri nuoâi caáy vaø caùc thaønh phaàn khaùc seõ ñöôïc giaûm thieåu. Ngoaøi ra, vieäc xaùc ñònh chính xaùc nhöõng phoâi ñaõ thuï tinh (phoâi 2 teá baøo) seõ deã daøng hôn.” Trong gaàn 3 thaùng thöïc hieän luaän vaên toát nghieäp taïi Phoøng thí nghieäm thuï tinh trong oáng nghieäm Beänh vieän Phuï saûn Töø Duõ, chuùng toâi ñaõ thöïc hieän ñeà taøi naøy vaø ñaõ thieát laäp nhöõng thí nghieäm thuï tinh trong oáng nghieäm theo 2 höôùng : ƒ Caùc thí nghieäm coù thôøi gian caáy theo quy trình chuaån. ƒ Caùc thí nghieäm coù thôøi gian caáy daøi hôn, tieän lôïi hôn cho thao taùc. Muïc ñích chính cuûa caùc thí nghieäm treân laø nhaèm khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian caáy tröùng leân quaù trình thuï tinh vaø söï phaùt trieån cuûa phoâi trong giai phaân chia sôùm. Tuy nhieân, nhöõng nghieân cöùu nhö treân ôû nöôùc ta coøn quaù môùi meû vaø ñieàu kieän thöïc hieän coøn haïn cheá do ñoù vôùi taàm voùc khieâm toán cuûa ñeà taøi cuøng vôùi quyõ thôøi gian ít oûi, chuùng toâi mong raèng ñeà taøi naøy seõ ñem laïi moät caùch nhìn ñuùng ñaén cho quy trình thuï tinh trong oáng nghieäm ôû ñieàu kieän nöôùc ta hieän nay. Mai Coâng Minh Taâm 3 Phaàn 2 : VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP I. Vaät lieäu : 1) Ñoái töôïng nghieân cöùu : Trong thí nghieäm naøy, chuùng toâi söû duïng chuoät nhaét traéng (Mus musculus var albino) coù troïng löôïng khoaûng 20 – 30 g goàm chuoät caùi vaø chuoät ñöïc tröôûng thaønh veà maët sinh duïc (khoaûng 2 – 3 thaùng tuoåi). Nguoàn chuoät do vieän Pasteur Thaønh phoá Hoà Chí Minh cung caáp. 2) Duïng cuï hoaù chaát vaø thieát bò: 2.1) Duïng cuï : 2.1.1) Duïng cuï giaûi phaãu : ƒ Giaáy loùt. ƒ Keùo thaúng , keùo cong ƒ Pinch thaúng. 2.1.2) Duïng cuï taùch vaø thu nhaän teá baøo : ƒ OÁng tuyùp 5ml ƒ OÁng tuyùp 14 ml ƒ OÁng tieâm 1ml ƒ Kim tieâm 26G ƒ Ñóa petri nhöïa (ñöôøng kính 35 mm) ƒ Ñóa petri nhöïa (ñöôøng kính 60 mm) ƒ Pipette Pasteur voâ truøng. ƒ Duïng cuï huùt, röûa phoâi 2.1.3) Duïng cuï ñeám teá baøo : ƒ Lame, lamelle ƒ Phoøng ñeám Neubauer 2.1.4) Nhöõng duïng cuï khaùc : ƒ Ñeøn coàn. ƒ Tip 10 – 100 µl ƒ Micropipette 10 – 100 µl . Mai Coâng Minh Taâm 4 ƒ Goùi Medipack duøng ñeå ñoùng goùi duïng cuï phaãu thuaät tröôùc khi haáp voâ truøng. 2.2) Hoaù chaát : 2.2.1) Hoaù chaát khöû truøng: ƒ Coàn 700 . 2.2.2) Hormon kích thích tröùng chín vaø ruïng: PMSG : - Daïng ñoâng khoâ. - Baûo quaûn : 250C, traùnh aùnh saùng. - Coâng duïng : kích thích nang tröùng phaùt trieån. - Pha cheá : stock 1000UI + 10 ml nöôùc caát 2 laàn - Tieâm 10 UI/ 1 con chuoät. Pregnyl : - Daïng ñoâng khoâ. - Baûo quaûn 2 – 15oC , traùnh aùnh saùng. - Coâng duïng : kích thích tröùng chín vaø ruïng. - Pha cheá : stock 1500UI + 15 ml nöôùc caát 2 laàn. - Tieâm 10 UI/ 1 con chuoät. 2.2.3) Moâi tröôøng thu nhaän oáng daãn tröùng vaø maøo tinh : Moâi tröôøng GameteTM Vitrolife : - daïng dung dòch. - baûo quaûn 2 – 8oC , - traùnh aùnh saùng Thaønh phaàn chính : ¾ Muoái ¾ Lactate ¾ Pyruvate ¾ Human serum albumin_HSA ¾ Nöôùc Mili Q 2.2.4) Moâi tröôøng thuï tinh vaø nuoâi phoâi : Moâi tröôøng IVFTM – 20 Vitrolife : ƒ daïng dung dòch ƒ baûo quaûn 2 – 80C , traùnh aùnh saùng Mai Coâng Minh Taâm 5 Thaønh phaàn chính : ¾ Muoái ¾ Lactate ¾ Pyruvate ¾ Human serum albumin _ HSA ¾ Nöôùc Mili Q. 2.2.5) Daàu phuû moâi tröôøng : Daàu khoaùng do phoøng thí nghieäm thuï tinh trong oáng nghieäm Beänh vieän phuï saûn Töø Duõ cung caáp. - tyû troïng 0.83 – 0.86 ôû 20oC - khöû truøng daàu baèng phöông phaùp loïc baèng milipore filter. II. Phöông phaùp thuï tinh trong oáng nghieäm: ™ Caùc phöông phaùp ñöôïc thöïc hieän nhö sau : 1) OÅn ñònh ñieàu kieän soáng cuûa chuoät khoaûng 2 – 3 ngaøy tröôùc khi laøm thí nghieäm. Chuoät nhaét traéng ñöôïc nuoâi oån ñònh trong chuoàng baèng thuyû tinh coù theå tích 25cm ° 25 cm ° 12 cm taïi phoøng nuoâi chuoät thí nghieäm – Khoa Hieám muoän beänh vieän Phuï saûn Töø Duõ. Chuoät ñöïc vaø chuoät caùi ñöôïc nuoâi rieâng. Moät chuoàng coù khoaûng 3 con. Chuoät ñöôïc oån ñònh chu kyø saùng toái chu kyø saùng 7 giôø ñeán 19 giôø, chu kyø toái töø 19 giôø ñeán 7 giôø saùng hoâm sau. Thöùc aên duøng ñeå nuoâi chuoät laø caùm vieân chuyeân bieät cho chuoät cuûa vieän Pasteur, cuøng vôùi giaù, rau muoáng, thoùc maàm. Caùch cho chuoät aên nhö sau : ƒ Saùng : cho chuoät aên caùm vieân. ƒ Chieàu : cho chuoät aên thoùc maàm hoaëc giaù hay thænh thoaûng cho chuoät aên rau muoáng. Nöôùc uoáng ñöôïc laáy töø nguoàn nöôùc loïc daân duïng. Chuù yù : Thöùc aên rau caàn phaûi röûa saïch tröôùc khi cho chuoät aên. Khoâng neân cho chuoät aên quaù nhieàu caùm vieân trong moät böõa, ñieàu naøy seõ laøm cho chuoät bò beùo phì gaây khoù khaên cho thao taùc sau naøy. Mai Coâng Minh Taâm 6 2) Gaây ñoäng duïc ôû chuoät caùi : sau thôøi gian oån ñònh, ta tieâm chuoät caùi hormon gaây ñoäng duïc. Phaùc ñoà tieâm thuoác cho chuoät nhö sau : P h ö ô n g phaùp tieâm thuoác : • Baét chuoät. • Giöõ chuoät • Tieâm 10 UI baèng oáng tieâm 1ml, kim tieâm 26G. Tuaân thuû theo caùc nguyeân taéc khi tieâm thuoác nhö sau : ƒ Khoâng ñeå chuoät coù theå quay ñaàu vaø caén vaøo tay ngöôøi chích. ƒ Traùnh tieâm vaøo cô hoaønh hay baøng quang. ƒ Thuoác sau khi tieâm khoâng ñöôïc chaûy ra ngoaøi. ƒ Choã tieâm khoâng bò chaûy maùu . ƒ Lôùp da khoâng bò phoàng leân . 3) Quy trình thu nhaän giao töû : 3.1 Chuaån bò duïng cuï vaø moâi tröôøng thao taùc tröôùc ngaøy thao taùc ( D-1): ƒ Toaøn boä duïng cuï giaûi phaåu chuoät ñeàu ñöôïc ñoùng goùi laïi caån thaän vaø ñem haáp khöû truøng baèng autoclave ôû 121oC khoaûng 30 phuùt tröôùc khi söû duïng. ƒ Chuaån bò moät ñóa röûa (R) : duøng ñeå röûa tröùng sau khi thu vaø laøm nôi ñeå tröùng chôø tröôùc khi thuï tinh. Trong ñoù, 3 gioït ñaàu (1,2,3) chöùa khoaûng 80 µl moâi tröôøng Gamete vaø moät gioït coøn laïi chöùa 80 µl moâi tröôøng IVF. Sau ñoù, phuû ngaäp daàu khoaùng ñóa röûa naøy vaø uû trong tuû aám ôû 370C, 5% CO2 . ƒ Chuaån bò 4 oáng tuyùp loaïi 5ml trong ñoù : Ngaøy thöïc hieän Chuoät duøng ñeå thu phoâi Ngaøy - 3 (D-3) Tieâm 10 IU PMSG cho chuoät caùi Ngaøy -1 (D-1) (46 – 48h sau khi tieâm PMSG) Tieâm 10 IU Pregnyl. Mai Coâng Minh Taâm 7 ƒ C h u a ån bò 2 oáng tuyùp loaïi 14 ml chöùa khoaûng 0,3 – 0,5 ml moâi tröôøng IVF duøng ñeå xöû lyù tinh truøng baèng phöông phaùp Swim-up. Chuù yù : caùc oáng tuyùp ñeàu ñöôïc ghi teân caån thaän. Nuùt ñöôïc ñoùng ôû naác 1 ñeå moâi tröôøng trong tuyùp ñöôïc caân baèng vôùi khoâng khí vaø nhieät ñoä trong tuû nuoâi caáy. ƒ Chuaån bò moät ñóa röûa tinh truøng (loaïi ñöôøng kính 60mm) : ta chia laøm 4 phaàn baèng nhau, moãi phaàn ta taïo ñöôïc 3 gioït moâi tröôøng IVF (khoaûng 80 µl moät gioït) sau ñoù phuû daàu khoaùng. 3.2 Thao taùc taïo gioït moâi tröôøng: ƒ Duøng buùt veõ chia ñeàu ñóa petri laøm 4 phaàn ñeàu nhau . ƒ Ñaùnh soá töøng khoaûng (töø 1 ñeán 4) ƒ Ghi chuù thaät cuï theå treân ñóa cuøng vôùi ngaøy taïo gioït . ƒ Gaén pipette Pasteur vaøo oáng tieâm coù ñaàu silicon, sau ñoù huùt moâi tröôøng roài nhoû vaøo töøng khoaûng, moãi khoaûng moät gioït (moãi gioït khoaûng 80 µl). ƒ Sau ñoù phuû daàu khoaùng cho ngaäp caùc gioït moâi tröôøng . Taát caû moâi tröôøng ñöôïc ñaët vaøo trong tuû aám 370C , 5% CO2 / 4-6h tröôùc khi söû duïng. Rieâng ñóa röûa (R) ñöôïc ñeå qua ñeâm. Teân oáng tuyùp Moâi tröôøng Theå tích Muïc ñích söû duïng SP1 Gamete 2 ml Thu maøo tinh vaø röûa saïch maùu, môõ. SP2 IVF 1 ml Thu tinh truøng OV1 Gamete 2 ml Thu oáng daãn tröùng vaø röûa saïch maùu, môõ. OV2 Gamete 2 ml Thu tröùng 1 2 3 4 80 µl IVF 80 µl Gamete 80 µl Gamete Hình 16 : Chuaån bò ñóa röûa tröùng. Mai Coâng Minh Taâm 8 Hình 17 : Thao taùc taïo gioït moâi tröôøng vaø chuyeån phoâi vaøo gioït moâi tröôøng. 3.3 Nhöõng chuaån bò tröôùc khi thao taùc vaøo ngaøy D0 : Goïi ngaøy D0 laø ngaøy tröùng ñöôïc thuï tinh. Tröôùc tieân ta chuaån bò moät ñóa nuoâi phoâi (D1) : trình töï chuaån bò nhö treân, moâi tröôøng laø moâi tröôøng IVF. Ñóa naøy ñöôïc duøng ñeå nuoâi phoâi vaøo khoaûng 4giôø sau khi caáy. Chuaån bò saün caùc duïng cuï caàn thieát : o OÁng tieâm coù ñaàu silicon coù gaén saün pipet Pasteur o 2 oáng tieâm 1ml coù gaén kim 26G o 2 ñóa pertri voâ truøng . o Moät boä duïng cuï phaåu thuaät vaø giaáy thaám loùt cho chuoät khi phaåu thuaät. o Moät bao raùc ñeå boû xaùc chuoät. Chuù yù : Khi thu tinh truøng ta chuaån bò 1 boä nhö treân vaø khi thu tröùng cuõng vaäy. 3.4 Thu nhaän tinh truøng : 3.4.1 Giaûi phaãu chuoät ñöïc vaø thu maøo tinh : Mai Coâng Minh Taâm 9 - Gieát chuoät ñoät ngoät baèng caùch keùo giaõn ñoát soáng coå. - Moå oå buïng cuûa chuoät ñöïc. - Keùo tinh hoaøn vaø maøo tinh ra khoûi oå buïng. Neáu nhö chuoät ñöïc quaù maäp, khi moå oå buïng ra ta seõ thaáy ñöôïc 2 moâ môõ noái lieàn vôùi tinh hoaøn cuûa chuoät ñöïc. Keùo hai moâ môõ naøy leân ta seõ thaáy ñöôïc 2 tinh hoaøn. Duøng pinch thaúng keùo tieáp tinh hoaøn leân ta seõ thaáy ñöôïc maøo tinh. Nhö ñaõ trình baøy ôû treân, maøo tinh coù hình daáu chaám hoûi. Duøng keùo thaúng thu laáy maøo tinh. Thao taùc naøy phaûi kheùo vaø thaät caån thaän neáu khoâng ta seõ thu maøo tinh cuøng vôùi nhöõng moâ môõ bao quanh. Ñieàu naøy seõ gaây baát lôïi cho thao taùc sau naøy. - Chuyeån maøo tinh hoaøn vaøo oáng tuyùp SP1. 3.4.2 Thu nhaän tinh truøng vaø xaùc ñònh maät ñoä tinh truøng : - Chuyeån toaøn boä moâi tröôøng chöùa maøo tinh trong oáng SP1 vaøo moät ñóa petri voâ truøng ñaõ chuaån bò tröôùc. - Duøng 2 oáng tieâm ñaõ chuaån bò tröôùc röûa saïch maùu vaø loaïi boû môõ baùm treân maøo tinh. - Chuyeån toaøn boä moâi tröôøng trong oáng tuyùp SP2 vaøo ñóa petri ñaõ chuaån bò tröôùc. - Chuyeån maøo tinh naøy sang ñóa treân. Duøng 2 oáng tieâm ñaåy tinh truøng ra khoûi maøo tinh hoaøn. Ñeå thu ñöôïc löôïng tinh truøng trieät ñeå trong maøo tinh, ta coù theå duøng ñaàu oáng tieâm treân taïo moät vaøi veát caét treân maøo tinh roài aán nheï vaøo maøo tinh ñeå tinh truøng thoaùt ra deã daøng. Cöù theá ta seõ thu ñöôïc töøng khoái tinh truøng traøo ra töø nhöõng veát caét. - Duøng oáng tieâm coù ñaàu silicon ñaõ gaén saün pipet pasteur thu taát caû moâi tröôøng chöùa tinh truøng vaøo moät oáng tuyùp môùi. Tieáp theo ta troän ñeàu moâi tröôøng chöùa tinh truøng baèng caùch huùt nhaû nhieàu laàn moâi tröôøng naøy. Chuù yù thao taùc thaät nheï nhaøng neáu khoâng löïc cô hoïc khi huùt ñaåy seõ laøm cheát tinh truøng chuoät. Sau ñoù, trích moät ít moâi tröôøng ñeå xaùc ñònh maät ñoä tinh truøng baèng phöông phaùp phoøng ñeám Neubauer. 3.4.3 Xöû lyù tinh truøng vaø xaùc ñònh maät ñoä tinh truøng sau xöû lyù: Mai Coâng Minh Taâm 10 - Sau khi xaùc ñònh maät ñoä tinh truøng luùc ban ñaàu. Ta xöû lyù tinh truøng baèng phöông phaùp Swim – up. - Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp naøy ñöôïc trình baøy ôû phaàn toång quan taøi lieäu. Caùch tieán haønh : - Duøng oáng tieâm ñaõ duøng ôû treân huùt troän moâi tröôøng chöùa tinh moät laàn nöõa. - Chia ñoâi moâi tröôøng naøy. - Chuyeån töøng phaàn moâi tröôøng chöùa tinh truøng (khoaûng 0,5 ml) ñaët nheï nhaøng beân döôùi moâi tröôøng IVF trong oáng tuyùp 14 ml ñaõ chuaån bò saün. - Luùc naøy ta thaáy raát roõ 2 phaàn moâi tröôøng : moät phaàn trong phía treân vaø phaàn ñuïc chöùa tinh truøng ôû döôùi. - Duøng buùt loâng vaïch nheï ñaùnh daáu maët phaân caùch cuûa 2 moâi tröôøng. - Ñaët nheï nhaøng caùc oáng tuyùp vaøo moät coác nhöïa saïch ñeå taïo goùc nghieâng töông ñöông moät goùc 450 . - Ñaët coác naøy nheï nhaøng vaøo tuû aám. UÛ ôû 370C, 5% CO2 . - Thôøi gian Swim-up thöôøng laø töø 30 – 45 phuùt. - Sau thôøi gian naøy, thaät nheï nhaøng thu lôùp moâi tröôøng ôû treân. Chuù yù : ta neân söû duïng moät pipet pasteur môùi vaø chæ chaïm ñaàu pipet vaøo thaønh oáng tuyùp roài thu phaàn moâi tröôøng phía treân vaïch ñaùnh daáu moät chuùt ñeå traùnh vieäc thu nhaàm nhöõng tinh truøng cheát ôû phía döôùi. Xaùc ñònh maät doä tinh truøng : Ñeám maät ñoä tinh truøng baèng phoøng ñeám Neubauer. Ta caàn xaùc ñònh : ƒ Maät ñoä tinh truøng. ƒ Phaàn traêm tinh truøng di ñoäng. ƒ Ghi nhaän veà chaát löôïng tinh truøng. 3.4.4 Taïo gioït caáy vaø hoaït hoaù tinh truøng : Taïo caùc gioït caáy tuyø vaøo theå tích tinh truøng thu ñöôïc. Sau ñoù, phuû moät nöûa daàu khoaùng vaøo ñóa caáy vaø uû 370C, 5% CO2. 3.5 Thu nhaän tröùng : 3.5.1 Giaûi phaãu chuoät caùi vaø thu oáng daãn tröùng: ƒ Gieát chuoät ñoät ngoät baèng caùch keùo giaõn ñoát soáng coå. Mai Coâng Minh Taâm 11 ƒ Moå oå buïng cuûa chuoät caùi. ƒ Ñaåy noäi quan sang moät beân ñeå thaáy roõ nhaùnh töû cung. ƒ Keùo töû cung, oáng daãn tröùng, buoàng tröùng, ñeäm môõ ra khoûi xoang buïng. ƒ Taùch maøng ngoaøi töû cung. ƒ Duøng ñaàu keùo taùch môõ khoûi oáng daãn tröùng vaø moät phaàn töû cung gaàn oáng daãn tröùng. ƒ Taùch oáng daãn tröùng baèng caùch caét ngang phaàn thaét giöõa oáng daãn tröùng vaø buoàng tröùng. ƒ Chuyeån oáng daãn tröùng vaøo oáng tuyùp OV1. 3.5.2 Thu nhaän tröùng : ƒ Chuyeån toaøn boä moâi tröôøng thu oáng daãn tröùng vaøo 1 ñóa petri ñaõ chuaån bò saün. ƒ Röûa saïch maùu vaø môõ. ƒ Chuyeån caùc oáng daãn tröùng sang moät ñóa thöù 2 coù chöùa moâi tröôøng töø tuyùp OV2. ƒ Xeù ñoaïn boùng phình to cuûa oáng daãn tröùng. 3.5.3 Röûa tröùng tröôùc khi thuï tinh: ƒ Thu tröùng. ƒ Tieán haønh röûa töøng cuïm tröùng treân töøng gioït moâi tröôøng cuûa ñóa röûa. ƒ Cho tröùng chôø ôû gioït thöù 4 ôû 370C, 5% CO2 . 4 Quy trình thuï tinh trong oáng nghieäm : ƒ Ñaùnh giaù tröùng tröôùc khi thuï tinh ƒ Chuaån bò saün saøng ñóa caáy D0 : sau 1 giôø töø ta baét ñaàu taïo gioït caáy, ta phuû tieáp daàu khoaùng cho ngaäp caùc gioït tinh truøng. ƒ Caáy tröùng vaøo töøng gioït tinh truøng. 5 Röûa tröùng sau khi caáy vaø Chuyeån tröùng vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy : ƒ Thao taùc keùo oáng: (xem hình ôû phaàn phuï luïc) ƒ Röûa tröùng treân ñóa röûa tinh truøng ñaõ chuaån bò vaøo ngaøy D-1 ƒ Chuyeån tröùng vaøo ñóa nuoâi. 6 Kieåm tra söï thuï tinh ngaøy hoâm sau (D1) vaø chuaån bò ñóa nuoâi D3 7 Phaùc ñoà thöïc hieän : Mai Coâng Minh Taâm 12 Ngaøy thöïc hieän Thôøi gian thöïc hieän Noäi dung thöïc hieän D-3 Tieâm PMSG D-1 48 giôø sau khi tieâm PMSG Tieâm Pregnyl 12 giôø sau khi tieâm Pregnyl Thu vaø xöû lyù tinh truøng 13,5 giôø sau khi tieâm Pregnyl Taïo gioït caáy 13 giôø 50 phuùt sau khi tieâm Pregnyl Thu tröùng, röûa tröùng. 14 giôø 20 phuùt sau khi tieâm Pregnyl Caáy tröùng vaøo gioït caáy D0 4-6 giôø sau khi caáy Röûa tröùng vaø chuyeån tröùng vaøo ñóa nuoâi (D-1) D1 24 giôø sau khi caáy Quan saùt keát quaû thuï tinh Chuaån bò ñóa nuoâi ( D3) ** Chuù yù : chu kyø chuyeån phoâi laø 48 giôø. III. Caùch boá trí caùc thí nghieäm: Toaøn boä 20 thí nghieäm ñöôïc boá trí nhö sau : ƒ 12 thí nghieäm ñaàu : muïc ñích chính laø luyeän taäp caùc thao taùc vaø qua ñoù nhaän ñònh moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình thuï tinh. Trong ñoù, 3 5 thí nghieäm ñaàu : chuùng toâi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát löôïng tröùng (cuï theå laø thôøi gian tröùng chôø laâu trong gioït moâi tröôøng) ñeán hieäu quaû thuï tinh,. Nhö ñaõ trình baøy ôû treân, vieäc tröùng chôø laâu seõ laø cho tröùng seõ rôi vaøo tình traïng tröùng quaù chín (post-matured). Caùch tieán haønh nhö sau : chuùng toâi tieán haønh thu nhaän tröùng trong thôøi gian chôø tinh truøng Swim-up vaø cho tröùng chôø theâm khoaûng thôøi gian nöõa ñeå caùc tinh truøng gaàn nhö ñaõ ñöôïc hoaït hoaù xong, thôøi chôø toång coäng laø 1 giôø 30 phuùt. Mai Coâng Minh Taâm 13 3 7 thí nghieäm sau : chuùng toâi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát löôïng tinh truøng ñeán hieäu quaû thuï tinh vaø caùch thöïc hieän nhö quy trình ñöôïc trình baøy ôû phaàn phöông phaùp. ƒ 8 thí nghieäm sau, chuùng toâi chia laøm 2 loâ baèng caùch taùch ñoâi soá cuïm tröùng (OCCs - Oocyte cumulus complexes) moät caùch ngaãu nhieân, cuï theå nhö sau : - Loâ ñoái chöùng (loâ a) : chuùng toâi quy ñònh thôøi gian caáy laø töø 4 giôø. ÔÛ loâ naøy, sau 4 giôø caáy ta chuyeån toaøn boä soá tröùng (coù theå laø tröùng ñaõ thuï tinh vaø cuõng coù theå laø tröùng chöa thuï tinh) sang ñóa nuoâi D1. - Loâ thöû nghieäm (loâ b) : chuùng toâi quy ñònh thôøi gian caáy laø qua ñeâm. Saùng ngaøy hoâm sau chuùng toâi tieán haønh chuyeån toaøn boä soá phoâi 2 teá baøo sang ñóa nuoâi D1 . Maät ñoä phoâi khi nuoâi caáy laø 10 phoâi treân 1 gioït 80 µl moâi tröôøng IVF. ƒ Sau ñoù, chuùng toâi tieán haønh ghi nhaän soá löôïng caùc phoâi phaùt trieån vaø ñaûm baûo cho caû 2 loâ coù cuøng 1 ñieàu kieän nuoâi caáy. Mai Coâng Minh Taâm 14 KEÁT QUAÛ VAØ BIEÄN LUAÄN I. Keát quaû thu nhaän : Trong thôøi gian 3 thaùng (4/2004 ñeán 6/2004) thöïc hieän khoaù luaän naøy taïi Phoøng thí nghieäm thuï tinh trong oáng nghieäm beänh vieän Phuï saûn Töø Duõ, chuùng toâi ñaõ thöïc hieän ñöôïc toång coäng ñöôïc 20 thí nghieäm. Trong ñoù, 12 thí nghieäm ñaàu chuùng toâi nhaän ñònh laïi moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình thuï tinh vaø ôû 8 thí nghieäm cuoái, chuùng toâi chia thaønh 2 loâ ñeå khaûo saùt muïc tieâu ñaõ ñeà ra. Sau ñaây laø keát quaû chi tieát : 1. Caùc thí nghieäm nhaän ñònh aûnh höôûng cuûa chaát löôïng tinh truøng vaø chaát löôïng tröùng ñeán quaù trình thuï tinh : Coù theå noùi, coù raát nhieàu yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình thuï tinh. Nhöõng yeáu toá coù theå keå ñeán nhö : chaát löôïng tröùng, chaát löôïng tinh truøng, thôøi gian caáy, nhieät ñoä,…. Qua 12 thí nghieäm ñaàu, nhö ñaõ trình baøy ôû phaàn vaät lieäu phöông phaùp: ƒ 5 thí nghieäm ñaàu khaûo saùt aûnh höôûng cuûa vieäc ñeå tröùng chôø laâu (khoaûng 1,5 giôø) ñeán hieäu quaû thuï tinh vaø söï phaùt trieån cuûa phoâi. ƒ 7 thí nghieäm sau khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát löôïng tinh truøng ñeán hieäu quaû thuï tinh vaø söï phaùt trieån cuûa phoâi. Tuy nhieân, trong quaù trình ghi nhaän soá lieäu, chuùng toâi nhaän thaáy 5 thí nghieäm ôû treân cuõng coù chaát löôïng tinh truøng raát keùm neân keát quaû khaûo saùt chaát löôïng tinh truøng chuùng toâi söû duïng toaøn boä soá lieäu cuûa 12 loâ thí nghieäm naøy. ƒ Caùc keát quaû ñöôïc thu nhaän vaø ñöôïc xöû lyù baèng phaàn meàm Microsoft Excel. Mai Coâng Minh Taâm 15 Caùc keát quaû chuùng toâi thu nhaän ñöôïc nhö sau : Baûng 1 : Baûng keát quaû chung cuûa 12 thí nghieäm khaûo saùt ban ñaàu. Vôùi caùc keát quaû treân chuùng toâi nhaän thaáy: AÛnh höôûng cuûa chaát löôïng tinh truøng leân hieäu quaû thuï tinh vaø söï phaùt trieån cuûa phoâi : Chaát löôïng tinh truøng thu ñöôïc cuûa 12 thí nghieäm ñaàu tieân khoâng cao. Ñieàu naøy cuõng raát deã hieåu, khi tieáp caän vôùi phöông phaùp thuï tinh trong oáng nghieäm thì vieäc ñaàu tieân laø phaûi thaønh thaïo khaâu xöû lyù tinh truøng. Do ñoù, khi tieáp xuùc vôùi nhöõng thao taùc xöû lyù tinh truøng thì ta khoâng traùnh khoûi vieäc laøm cho tinh truøng cheát hay maát khaû naêng hoaït ñoäng. Ngoaøi ra, nhöõng nguyeân nhaân khaùc coøn ôû nguoàn chuoät khoâng ñaûm baûo, vieäc chaêm soùc chuoät ñöïc khoâng toái öu neân vieäc saûn xuaát tinh cuûa chuoät gaëp vaán ñeà truïc traëc. Hôn nöõa, trong quaù trình thu tinh truøng chuùng toâi coøn gaëp phaûi tröôøng hôïp chuoät quaù maäp khoâng coù tinh truøng hoaëc cho löôïng raát ít. Sau ñaây laø moät soá keát quaû veà chaát löôïng tinh truøng thu nhaän ñöôïc : TN Soá tröùng Soá tröùng 1 teá baøo (%) Phoâi 2 teá baøo (%) Phoâi 4 & 8 teá baøo (%) Morulae (%) Blastocyst (%) 1 6 6 (100%) 1 (17%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 2 10 10 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 3 42 40 (95%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 4 41 40 (98%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 5 30 30 (100%) 7 (23%) 2 (29%) 0 (0%) 0 (0%) 6 40 40 (100%) 9 (23%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 7 56 56 (100%) 12 (21%) 2 (17%) 0 (0%) 0 (0%) 8 30 30 (100%) 8 (27%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 9 40 40 (100%) 10 (25%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 10 80 80 (100%) 11 (14%) 9 (82%) 0 (0%) 0 (0%) 11 25 25 (100%) 13 (52%) 6 (46%) 0 (0%) 0 (0%) 12 36 36 (100%) 12 (33%) 3 (25%) 0 (0%) 0 (0%) Mai Coâng Minh Taâm 16 Baûng 2 : Chaát löôïng tinh truøng cuûa 12 thí nghieäm ñaàu tieân Baûng 3 : Baûng keát quaû tính toaùn maät ñoä tinh truøng soáng vaø cheát cuûa maãu tinh truøng sau xöû lyù. TN SOÁ CON CHUOÄT ÑÖÏC MAÄT ÑOÄ BAN ÑAÀU (trieäu/ml) % DI ÑOÄNG Thôøi gian swim-up (phuùt) MAÄT ÑOÄ SAU XÖÛ LYÙ (trieäu/ml) % DI ÑOÄNG 1 2 4.5 60 45 2 40 2 2 5 50 45 1.5 50 3 3 6 50 45 1.5 50 4 3 5 40 45 1.5 50 5 3 9 50 45 1.5 50 6 3 8 60 45 2 50 7 3 10 60 45 3 50 8 3 8 30 45 4 50 9 3 8 30 45 4 50 10 2 8 50 45 2 60 11 2 6 30 45 2.5 60 12 3 8 60 45 2.5 60 TN Maät ñoä tinh truøng sau xöû lyù (106 tinhtruøng/ml) Tinh truøng di ñoäng (%) Maät ñoä tinh truøng soáng (106 tinhtruøng/ml) Maät ñoä tinh truøng cheát (106 tinh truøng/ml) 1 2 40 0.8 1.2 2 1.5 50 0.75 0.75 3 1.5 50 0.75 0.75 4 1.5 50 0.75 0.75 5 1.5 50 0.75 0.75 6 2 50 1 1 7 3 50 1.5 1.5 8 4 50 2 2 9 4 50 2 2 10 2 60 1.2 0.8 11 2.5 60 1.5 1 12 2.5 60 1.5 1 Mai Coâng Minh Taâm 17 Nhaän xeùt : Chaát löôïng tinh truøng cuûa caùc thí nghieäm treân cho thaáy: ƒ Sau khi xöû lyù baèng phöông phaùp swim-up, maät ñoä tinh truøng cuõng nhö % tinh truøng di ñoäng khoâng toái öu ñeå thuï tinh trong oáng nghieäm. Cuï theå laø maät ñoä tinh truøng cao nhaát laø 4 trieäu tinh truøng/ml (% tinh truøng di ñoäng laø 50%) vaø maät ñoä tinh truøng thaáp nhaát laø 1,5 trieäu (vôùi % tinh truøng di ñoäng cuõng laø 50%.) ƒ Thôøi gian xöû lyù ñeàu laø 45 phuùt, thôøi gian toái ña khi xöû lyù tinh truøng baèng phöông phaùp swim-up. ƒ Hôn nöõa, sau khi xöû lyù chuùng toâi thaáy tyû leä tinh truøng keùm di ñoäng chieám phaàn lôùn coù trong maãu. Keát quaû thuï tinh vaø söï phaùt trieån cuûa phoâi : ƒ Tyû leä thuï tinh khoâng cao di ñoäng töø 0% ñeán 52%, coù 3 tröôøng hôïp khoâng cho keát quaû thuï tinh. Tyû leä thuï tinh trung bình laø 19% (83/433). ƒ Tyû leä phoâi phaùt trieån ôû giai ñoaïn 4-8 teá baøo 0% ñeán 82% trong ñoù coù 3 tröôøng hôïp phoâi khoâng phaùt trieån tieáp tuïc. Tyû leä phoâi phaùt trieån tieáp tuïc ôû giai ñoaïn naøy thaáp 27% (22/83). ƒ Khoâng coù phoâi naøo phaùt trieån tieáp tuïc ñeán giai ñoaïn Morula vaø Blastocyst. AÛnh höôûng cuûa vieäc ñeå tröùng chôø trong thôøi gian laâu ñeán hieäu quaû thuï tinh vaø söï phaùt trieån cuûa phoâi : Trong tieán trình 5 thí nghieäm ñaàu tieân, chuùng toâi tieán haønh thu nhaän tröùng sôùm (trong luùc chôø tinh truøng Swim-up) vaø ñeå cho tröùng (chôø trong gioït moâi tröôøng) do ñoù thôøi gian tröùng chôø trong moâi tröôøng laø khaù laâu khoaûng 1 giôø 30 phuùt. Trong thôøi gian naøy chuùng toâi quan saùt thaáy caùc khoái cumulus daàn daàn raõ ra, luùc naøy caùc tröùng ñang coù hieän töôïng “quaù chín” (post-matured). Hieän töôïng naøy coù theå seõ gaây baát lôïi cho quaù trình thuï tinh sau naøy. Keát quaû cho thaáy : (Xem theâm keát quaû 5 thí nghieäm ñaàu tieân ôû baûng keát quaû soá 1/ trang 56) ƒ Tyû leä thuï tinh : 6% (8/126) trong ñoù coù 3 tröôøng hôïp khoâng cho keát quaû thuï tinh. Mai Coâng Minh Taâm 18 ƒ Ngoaøi ra, coù theå thaáy 5 tröôøng hôïp treân coøn bò taùc ñoäng bôûi chaát löôïng tinh truøng. Vaø coù theå thaáy, tyû leä thuï tinh cuûa 5 tröôøng hôïp naøy thaáp hôn tyû leä thuï tinh trong tröôøng hôïp chaát löôïng tinh truøng keùm (6% so vôùi 19%). ƒ Tyû leä phaùt trieån leân ñeân phoâi 4-8 teá baøo laø 25% (2/8) vaø khoâng coù phoâi naøo phaùt trieån ñeán phoâi Morulae. 2. Thí nghieäm khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian caáy ñeán quaù trình thuï tinh vaø söï phaùt trieån cuûa phoâi trong ñieàu kieän in vitro: Thí nghieäm naøy ñöôïc thöïc hieän ôû 8 thí nghieäm cuoái trong toång soá 20 thí nghieäm chuùng toâi thöïc hieän. Cuï theå caùc thí nghieäm naøy ñöôïc boá trí nhö sau : ƒ Loâ ñoái chöùng (loâ a) : loâ naøy ñöôïc quy ñònh thôøi gian caáy laø 4 giôø. ƒ Loâ thöû nghieäm (loâ b) : loâ naøy ñöôïc quy ñònh thôøi gian caáy laø qua ñeâm. Sau ñaây laø moät soá keát quaû thu nhaän ñöôïc cuûa thí nghieäm naøy : TN SOÁ CON CHUOÄT ÑÖÏC MAÄT ÑOÄ BAN ÑAÀU (trieäu/ml) % DI ÑOÄNG Thôøi gian Swim-up (phuùt) MAÄT ÑOÄ SAU XÖÛ LYÙ (trieäu/ml) % DI ÑOÄNG 13 3 6 60 40 1.5 70 14 3 10 70 40 4 70 15 3 8 60 40 4 80 16 3 10 60 40 2 80 17 3 10 60 40 2.5 80 18 2 7 70 40 2 80 19 3 10 80 40 2 85 20 3 9 70 40 2.5 80 Baûng 4 : Chaát löôïng tinh truøng ôû loâ thöû nghieäm vaø loâ ñoái chöùng. Mai Coâng Minh Taâm 19 TN Nhoùm TN Toång soá tröùng Soá löôïng tröùng Tröùng thuï tinh (%) Phoâi 2 teá baøo (%) Phoâi 4 &8 teá baøo (%) Morulae (%) Blastocyst (%) Ñoái chöùng 20 20 (100%) 10 (50%) 5 (50%) 2 (20%) 1 (10%) 13 Thöû nghieäm 35 15 15 (100%) 8 (53%) 1 (13%) 0 (0%) 0 (0%) Ñoái chöùng 22 22 (100%) 14 (64%) 7 (50%) 3 (21%) 2 (14%) 14 Thöû nghieäm 39 17 17 (100%) 12(71%) 1 (8%) 0 (0%) 0 (0%) Ñoái chöùng 20 20 (100%) 8 (40%) 5 (63%) 2 (25%) 1 (13%) 15 Thöû nghieäm 40 20 20 (100%) 12 (60%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) Ñoái chöùng 20 20 (100%) 9 (45%) 5 (56%) 2 (22%) 1 (11%) 16 Thöû nghieäm 42 22 22 (100%) 10 (45%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) Ñoái chöùng 18 18 (100%) 11 (61%) 7 (64%) 2 (18%) 2 (18%) 17 Thöû nghieäm 40 22 22 (100%) 8 (36%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) Ñoái chöùng 24 24 (100%) 20 (83%) 6 (30%) 2 (10%) 2 (10%) 18 Thöû nghieäm 36 12 12 (100%) 10 (83%) 3 (30%) 1 (10%) 0 (0%) Ñoái chöùng 30 30 (100%) 15 (50%) 5 (33%) 2 (13%) 1 (7%) 19 Thöû nghieäm 39 9 9 (100%) 6 (67%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) Ñoái chöùng 23 23 (100%) 20 (87%) 3 (15%) 1 (5%) 1 (5%) 20 Thöû nghieäm 37 14 14 (100%) 10 (71%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) Baûng 5 : Baûng keát quaû chung ñaùnh giaù aûnh höôûng cuûa thôøi gian caáy ñeán quaù trình thuï tinh vaø söï phaùt trieån cuûa phoâi. Mai Coâng Minh Taâm 20 Nhaän xeùt : Chaát löôïng tröùng vaø tinh truøng thu nhaän ñöôïc : ƒ Chaát löôïng tröùng thu ñöôïc laø raát toát, caùc cuïm tröùng ñöôïc haïn cheá toái ña thôøi gian chôø. ƒ Chaát löôïng tinh truøng ôû caùc loâ naøy thu ñöôïc raát toát. Vieäc xöû lyù tinh truøng baèng phöông phaùp Swim-up ñöôïc ñieàu chænh laø 40 phuùt. Vôùi thôøi gian treân, chuùng toâi nhaän thaáy löôïng tinh truøng thu ñöôïc laø raát toát. ƒ Chaát löôïng tinh truøng ñaït tieâu chuaån ñeå thuï tinh trong oáng nghieäm. Vôùi maät ñoä thaáp nhaát laø 1.5 trieäu tinh truøng/ml (70% laø tinh truøng di ñoäng) vaø cao nhaát laø 4 trieäu tinh truøng/ml(80% tinh truøng di ñoäng). Keát quaû cho thaáy : (xem baûng 5 / trang 60) ƒ ÔÛ 8 loâ thí nghieäm treân, chuùng toâi thu nhaän töø 24 chuoät caùi ñöôïc toång coäng 308 tröùng (Trung bình 1 thí nghieäm chuùng toâi söû duïng 3 con chuoät caùi). ƒ Hôn nöõa, khi thu tröùng chuùng toâi chia ngaãu nhieân caùc khoái cumulus thu ñöôïc vaøo ñóa caáy cuûa 2 loâ treân. Töø baûng soá 5 ta coù caùc keát quaû sau: Loâ thí nghieäm Tyû leä thuï tinh Tyû leä phoâi 4-8 Tyû leä Morulae Tyû leä Blastocyst Ñoái chöùng 60% (107/177) 40% (43/107) 15% (16/107) 10% (11/107) Thöû nghieäm 58% (76/131) 5% (5/76) 1% (1/76) 0% ( 0/76) Baûng 6 : Baûng toång keát khi quy ñònh thôøi gian caáy. Chuù yù : tyû leä thuï tinh ñöôïc tính baèng coâng thöùc : Tyû leä thuï tinh (%) = C A°100% Tyû leä phaùt trieån cuûa phoâi ôû caùc giai ñoaïn (%) = %100× A B Trong ñoù , C : toång soá tröùng chuyeån sang ñóa nuoâi caáy. B : toång soá phoâi ôû caùc giai ñoaïn tieáp theo (phoâi 4 &8 teá baøo hay Morulae,…) Mai Coâng Minh Taâm 21 A : toång soá phoâi 2 teá baøo. Nhaän xeùt : ƒ Tyû leä thuï tinh trung bình cuûa 2 loâ thí nghieäm treân laø nhö nhau (60% vaø 58%). ƒ Tyû leä phaùt trieån cuûa phoâi caû hai loâ ñeàu giaûm daàn. Nhöng tyû leä naøy giaûm ñoät ngoät ôû loâ thöû nghieäm (58% xuoáng coøn 5%). ƒ Ngoaøi ra, ôû loâ thöû nghieäm, tyû leä phoâi phaùt trieån ñeán giai ñoaïn phoâi nang laø 0%. Treân loâ ñoái chöùng thì tyû leä naøy laø 10%. ƒ Hôn nöõa, coù theå thaáy tyû leä phoâi phaùt trieån ñeán giai ñoaïn 4-8 teá baøo ôû loâ ñoáâi chöùng laø 40% coøn ôû loâ thöû nghieäm tyû leä naøy thaáp hôn raát nhieàu (5%). Ñeå deã daøng nhaän thaáy, ta coù : Error! Not a valid link. Hình 25 : Ñoà thò so saùnh tyû leä thuï tinh vaø tyû leä phaùt trieån cuûa phoâi ôû loâ a vaø loâ b. II. Bieän luaän : 1) Taïi sao caùc thí nghieäm naøy laïi choïn ñoái töôïng chuoät nhaét traéng ? Hieän nay, ñoái töôïng thoâng duïng nhaát ñeå nghieân cöùu taïi caùc phoøng thí nghieäm laø chuoät nhaét traéng vaø heo. Tuy nhieân chuoät vaãn ñöôïc xem nhö laø löïa choïn toát hôn do : ƒ Chuoät laø ñoäng vaät nhoû coù ñoä töông ñoàng vôùi con ngöôøi raát cao. ƒ Vieäc thao taùc treân chuoät raát deã daøng. ƒ Chu kyø sinh saûn ngaén. ƒ Vieäc tìm nguoàn cung caáp raát deã daøng. ƒ Ñieàu kieän chaêm soùc chuoät töông ñoái ñôn giaûn. ƒ Vieäc thu nhaän giao töû raát tieän lôïi vaø deã daøng. 2) Taïi sao laïi choïn moâi tröôøng IVFTM – 20 (Vitrolife AB – Sweden) vöøa laøm moâi tröôøng thuï tinh vaø vöøa laøm moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi ? Trong quy trình chuaån, 2 moâi tröôøng thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå thuï tinh vaø nuoâi caáy laø : moâi tröôøng Whittingham T6 (thuï tinh) vaø moâi tröôøng M16 (nuoâi caáy phoâi) – theo taøi lieäu naêm 1993, moâi tröôøng HTF (thuï tinh) vaø moâi tröôøng KSOMAA (nuoâi caáy phoâi) – theo taøi lieäu naêm 2003. Mai Coâng Minh Taâm 22 Tuy nhieân hieän nay, vieäc söû duïng caùc moâi tröôøng treân ñeàu phaûi thoâng qua quaù trình pha cheá. Hôn nöõa, vieäc pha cheá ñoøi hoûi phaûi ñoä chính raát cao, ñieàu kieän phaûi voâ truøng vaø raát toán keùm. Do ñoù, chieán löôïc hôïp lyù hôn laø söû duïng nhöõng moâi tröôøng ñaõ ñöôïc pha saün ôû daïng dung dòch coù treân thò tröôøng ÔÛ ñaây, chuùng toâi söû duïng moâi tröôøng IVFTM – 20. Moâi tröôøng naøy coù saün vaø ñöôïc khoa Hieám muoän beänh vieän cung caáp ñeå hoã trôï cho nghieân cöùu. Coù theå thaáy, ñaây laø loaïi moâi tröôøng coù tính naêng vöøa duøng ñeå laøm moâi tröôøng thuï tinh vöøa duøng ñeå laøm moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi. Tuy raèng ñaây laø loaïi chuyeân duïng ñeå nuoâi caáy phoâi ngöôøi nhöng tröôùc ñoù moâi tröôøng naøy ñaõ ñöôïc kieåm ñònh thoâng qua vieäc nuoâi caáy phoâi chuoät vôùi tyû leä phoâi thoaùt nang laø ≥80% neân vieäc söû duïng moâi tröôøng treân laø coù theå chaáp nhaän ñöôïc. 3) Ñaùnh giaù keát quaû thöïc hieän : 3.1 Quaù trình thöïc hieän caùc thí nghieäm, coù caàn phaûi tuaân thuû thôøi gian moät caùch nghieâm khaéc khoâng? Coù. Ñieàu naøy laø tuyeät ñoái do khi thao taùc trong caùc thí nghieäm thuï tinh trong oáng nghieäm nhöõng thao taùc ñoøi hoûi khoâng chæ thaät chính xaùc maø coøn ñoøi hoûi phaûi thaät ñuùng thôøi gian quy ñònh ñaõ ñeà ra. Maëc duø vaäy trong quy trình luoân coù moät khoaûng thôøi gian thaät nhoû ñeå caùc thao taùc linh ñoäng hôn nhöng vieäc giaûm thieåu nhöõng thao taùc thöøa seõ giuùp cho caùc thí nghieäm gaët haùi ñöôïc nhöõng keát quaû thaät toát vaø thaät chính xaùc. Khi caùc thao taùc trôû neân thaønh thuïc vaø chính xaùc thì söï lo aâu veà thôøi gian seõ daàn khoâng laø vaán ñeà raéc roái nöõa. 3.2 Taïi sao laïi choïn thu nhaän tinh truøng tröôùc maø khoâng choïn thu tröùng tröôùc? Nhieàu nghieân cöùu hieän nay cho raèng vieäc thu nhaän tröùng tröôùc seõ gaëp raát nhieàu trôû ngaïi nhö : ƒ Tröùng quaù non (chöa tröôûng thaønh) ƒ Tröùng chôø trong gioït moâi tröôøng quaù laâu seõ gaëp raát nhieàu ñieàu kieän baát lôïi sau naøy. ƒ Tröùng ôû ñieàu kieän in vivo thöôøng seõ toát hôn khi tröùng trong ñieàu kieän in vitro. Do khi ôû ñieàu kieän in vitro tröùng seõ deã tieáp xuùc vôùi nhöõng ñieàu kieän baát lôïi. Mai Coâng Minh Taâm 23 Do ñoù, vieäc thu nhaän vaø xöû lyù tinh truøng ñöôïc thöïc hieän tröôùc trong thôøi gian hôïp lyù seõ giuùp giaûm thieåu nhöõng taùc ñoäng baát lôïi cuûa moâi tröôøng leân tröùng. Hôn nöõa, ñieàu kieän töï nhieân luùc naøo cuõng laø ñieàu kieän toái öu. 3.3 Sau khi xöû lyù baèng phöông phaùp Swim-up, chaát löôïng tinh truøng, % tinh truøng di ñoäng seõ aûnh höôûng nhö theá naøo ñeán chaát löôïng thuï tinh ? Nhaän thaáy, sau khi xöû lyù baèng phöông phaùp Swim-up neáu nhö thao taùc toát thì maät ñoä tinh truøng vaø % tinh truøng di ñoäng cao ( %70≥ ) seõ taïo neân nhöõng öu theá cho quaù trình thuï tinh. Coøn ngöôïc laïi, neáu löôïng tinh truøng cheát thu ñöôïc quaù nhieàu, keát quaû thuï tinh seõ giaûm ñi so vôùi nhöõng thí nghieäm coù chaát löôïng tinh truøng toát. Cuï theå laø trong 12 thí nghieäm ñaàu, % tinh truøng di ñoäng khaù thaáp do ñoù tyû leä tinh truøng cheát trong gioït caáy khaù cao neân tyû leä thuï tinh trung bình cuûa 12 thí nghieäm naøy thaáp hôn nhieàu so vôùi loâ ñoái chöùng cuûa 8 thí nghieäm sau cuøng : 19% (% tinh truøng di ñoäng %60≤ ) so vôùi 60% (% tinh truøng di ñoäng %70≥ ). Ñieàu naøy coù theå nhaän ñònh nhö sau : trong 12 thí nghieäm ban ñaàu ña soá caùc thí nghieäm ñeàu coù tyû leä tinh truøng cheát ≥ tyû leä tinh truøng soáng sau khi xöû lyù. Hôn nöõa, caùc tinh truøng di ñoäng raát keùm, haàu heát chuùng ñeàu di ñoäng taïi choã. Chính ñieàu naøy ñaõ gaây ra nhöõng baát lôïi cho quaù trình thuï tinh daãn ñeán tyû leä thuï tinh cuûa caùc tröôøng hôïp naøy thaáp hôn nhieàu so vôùi loâ ñoái chöùng vaø loâ thöû nghieäm cuûa 8 thí nghieäm sau cuøng . Ngoaøi ra, caùc phoâi thu ñöôïc töø 12 thí nghieäm ban ñaàu ñeàu phaùt trieån raát keùm. Tyû leä phoâi phaùt trieån ñeán giai ñoaïn sau chæ laø 27%. Hôn nöõa, trong quaù trình quan saùt nhöõng phoâi naøy chuùng toâi nhaän thaáy chaát löôïng caùc phoâi treân raát keùm (moät soá phoâi baøo trong phoâi thöôøng bò thaùi hoaù). 3.4 Taïi sao soá löôïng tröùng thu nhaän chöa cao? Thoâng qua 20 thí nghieäm, toång soá löôïng tröùng thu ñöôïc töø 56 chuoät caùi laø 739 tröùng. Vaäy trung bình ta thu ñöôïc : 13 tröùng/1 con. Soá löôïng tröùng trung bình thu ñöôïc cao hôn moät ít so vôùi soá tröùng ruïng trong moät chu kyø ñoäng duïc bình thöôøng cuûa chuoät nhaét traéng khi khoâng coù taùc ñoäng cuûa kích duïc toá ngoaïi sinh : 8 -12 tröùng/1 con. Ñieàu naøy coù theå hieåu nhö sau : Mai Coâng Minh Taâm 24 ƒ Nguoàn chuoät chuùng ta söû duïng chöa oån ñònh. Do ñoù coù chuoät ñaùp öùng thuoác toát vaø coù chuoät ñaùp öùng vôùi thuoác keùm daãn ñeán soá löôïng tröùng thu ñöôïc khoâng ñoàng ñeàu ôû caùc thí nghieäm. ƒ Ngoaøi ra, coøn moät soá yeáu toá khaùc nhö : caùch baûo quaûn thuoác chöa toát, thao taùc chích thuoác cho chuoät chöa chuaån daãn ñeán soá löôïng tröùng thu ñöôïc chöa cao. 3.5 Chaát löôïng tröùng coù aûnh höôûng gì ñeán keát quaû thuï tinh khoâng ? Coù. Ñieàu naøy laø ñieàu hieån nhieân. Khi chaát löôïng tröùng khoâng ñaûm baûo nhö tröùng quaù non hay tröùng quaù giaø thì chaát löôïng tröùng seõ khoâng toái öu ñeå thuï tinh cuõng nhö giuùp cho phoâi phaùt trieån moät caùch bình thöôøng. Khi tröùng quaù non, caùc thaønh phaàn trong teá baøo chaát cuûa tröùng vaø DNA trong nhaân thöôøng chöa chuaån bò cho quaù trình thuï tinh vaø söï phaùt trieån cuûa phoâi sau naøy. Coøn khi tröùng quaù giaø, maøng trong suoát cuûa tröùng seõ trôû neân cöùng chaéc (hardened) do ñoù tinh truøng seõ khoâng theå thöïc hieän quaù trình thuï tinh vaø tröùng thöôøng ñi vaøo chu trình cheát cuûa teá baøo (cell apoptosis). Trong 12 thí nghieäm ñaàu tieân, thí nghieäm thöù 1 ñeán thí nghieäm thöù 5 cho thaáy tyû leä thuï tinh raát thaáp (6%) vaø caùc phoâi ôû caùc giai ñoaïn sau phaùt trieån raát keùm. Hôn nöõa, chuùng khoâng theå phaùt trieån ñeán giai ñoaïn Morulae. Keát quaû cuûa 5 thí nghieäm naøy ñaõ cho thaáy vieäc thu nhaän tröùng quaù sôùm cuøng vôùi vieäc ñeå tröùng chôø trong moâi tröôøng khaù laâu coäng vôùi chaát löôïng tinh truøng keùm neân keát quaû thuï tinh laø raát thaáp. Ñieàu naøy ñuùng nhö nhaän ñònh ban ñaàu cuûa chuùng toâi. Ngoaøi ra, trong luùc ghi nhaän keát quaû chuùng toâi coøn nhaän thaáy coù moät soá phoâi töï hoaït hoaù do hieän töôïng trinh saûn (Parthenogenetic). Soá löôïng caùc phoâi naøy khoâng nhieàu vaø caùc phoâi naøy thöôøng döøng laïi toái ña ôû giai ñoaïn 8 teá baøo. 3.6 Ñaùnh giaù veà keát quaû toång keát töø caùc thí nghieäm khaûo saùt thôøi gian caáy: Coù theå thaáy, töø 12 thí nghieäm ñaàu chuùng toâi nhaän ñònh raèng :” Lieäu löôïng tinh truøng cheát trong gioït caáy nhieàu nhö vaäy vaø thôøi gian caáy coù aûnh höôûng gì ñeán keát quaû thuï tinh cuõng nhö söï phaùt trieån cuûa phoâi khoâng ?” Thí nghieäm treân laø moät thí nghieäm song song cho ta keát quaû thaät thuù vò ñoù laø tyû leä thuï tinh cuûa 2 loâ a vaø b ñeàu nhö nhau nhöng tyû leä phaùt trieån cuûa phoâi ôû loâ b giaûm ñi ñaùng keå. Vieäc quy ñònh thôøi gian caáy laø qua ñeâm seõ cho ta nhöõng dieàu kieän toát ñeå tieát Mai Coâng Minh Taâm 25 kieäm chi phí khi laøm thí nghieäm veà thuï tinh trong oáng nghieäm tuy nhieân keát quaû chuùng toâi ñaït ñöôïc cho thaáy hieäu quaû cuûa phöông phaùp naøy raát thaáp. Töø keát quaû naøy, ta nhaän thaáy thôøi gian caáy ñaõ khoâng aûnh höôûng gì ñeán keát quaû thuï tinh tuy nhieân noù laïi coù aûnh höôûng ñeán söï phaùt trieån cuûa caùc phoâi sau naøy. Nhìn vaøo ñoà thò bieåu dieãn (trang 52) cho thaáy tyû leä phoâi phaùt trieån ñeán giai ñoaïn Morulae cuûa loâ a cao hôn nhieàu so vôùi loâ b (15% so vôùi 1%) vaø tyû leä phoâi phaùt trieån leân giai ñoaïn Blastocyst cuûa loâ a laø 10% coøn loâ b thì khoâng coù moät phoâi naøo phaùt trieån tôùi giai ñoaïn Blastocyst. Söï taùc ñoäng cuûa thôøi gian caáy leân söï phaùt trieån cuûa phoâi in vitro laø raát roõ reät, coù theå laø khi ta keùo daøi thôøi gian caáy quaù laâu thì moâi tröôøng caáy laø moâi tröôøng coù maät ñoä tinh truøng daøy ñaëc seõ khoâng laø moâi tröôøng toái öu cho phoâi phaùt trieån. Do ñoù, phoâi seõ bò nhöõng taùc ñoäng xaáu töø moâi tröôøng naøy laøm aûnh höôûng ñeán chaát löôïng phoâi vaø laøm giaûm söùc soáng cuûa phoâi ôû caùc giai ñoaïn tieáp theo. Do ñoù, vieäc quy ñònh moät thôøi gian caáy thích hôïp laø raát quan troïng, thoâng thöôøng ôû chuoät thôøi gian caáy thöôøng laø 4 - 6 giôø. Thôøi gian naøy seõ laø toái öu cho vieäc giaûm thieåu caùc ñoäc chaát trong tinh truøng laøm aûnh höôûng ñeán söï phaùt trieån cuûa phoâi. Ngoaøi ra, keát quaû thuï tinh cuõng nhö tyû leä phaùt trieån cuûa phoâi ôû caùc loâ a vaø b laø khoâng cao. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích nhö sau : ƒ Tyû leä thuï tinh khoâng cao( tyû leä thuï tinh bình thöôøng laø %80≥ ). Ñieàu naøy laø do moâi tröôøng IVFTM – 20 laø moâi tröôøng thuï tinh chuyeân bieät cho ngöôøi hôn nöõa vieäc kích thích buoàng tröùng khoâng ñaït keát quaû cao neân soá löôïng tröùng chín treân toång soá tröùng coù theå khoâng ñöôïc toái öu. ƒ Tyû leä phaùt trieån cuûa phoâi thaáp laø do soá löôïng phoâi bò “block” khaù lôùn. Do ñoù, vieäc söû duïng moâi tröôøng nuoâi caáy thích hôïp giuùp caùc phoâi vöôït qua hieän töôïng “block” laø raát caàn thieát. Hieän nay, vieäc söû duïng moâi tröôøng KSOMAA ñang ñöôïc caùc phoøng thí nghieäm veà nuoâi caáy phoâi söû duïng raát roäng raõi do moâi tröôøng naøy coù theå giuùp cho hôn 93% caùc phoâi 2 teá baøo vöôït qua giai ñoaïn “block” vaø hôn 50% caùc phoâi naøy thoaùt nang. Maët khaùc, tyû leä phoâi bò “block” ôû 12 thí nghieäm ban ñaàu cuõng khaù cao khoaûng 73% trong khi ñoù ôû loâ ñoái chöùng tyû leä naøy laø 60%. Ñieàu naøy coøn chöùng toû theâm ñöôïc Mai Coâng Minh Taâm 26 laø chuûng chuoät cuûa chuùng ta söû duïng coù tyû leä “block” khaù cao khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng IVFTM – 20. Hôn nöõa, chuùng toâi tieán haønh chuyeån caùc phoâi 2 teá baøo bò “block” sang caùc gioït moâi tröôøng môùi thì nhaän thaáy raèng haàu heát caùc phoâi chæ phaùt trieån tieáp ñeán nhöõng phoâi 3 teá baøo thì ngöng phaùt trieån.