Khảo sát các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L và Hydrocotyle vulgaris L

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC BỘ MÔN HÓA 
Tên đề tài: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA HỌC 2004 – 2008 KHẢO SÁT CÁC HỢP CHẤT HỌ FLAVONOID TRONG CÂY RAU MÁ LÁ SEN Hydrocotyle bonariensis L. và Hydrocotyle vulgaris L. Cán bộ hướng dẫn: ThS. TÔN NỮ LIÊN HƯƠNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN GIÁP - 2041719 NGUYỄN NGỌC THỂ - 2041778 Lớp: Cử nhân Hóa – K.30 Cần Thơ 06/2008 LỜI CẢM ƠN  Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Tôn Nữ Liên Hương, giảng viên bộ môn Hóa Học – Khoa Khoa Học – Trường Đại Học Cần Thơ và là giáo viên hướng dẫn đề tài luận văn, đã cho chúng em ý tưởng, động lực và sự giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian chúng em thực hiện đề tài luận văn. Xin cảm ơn các Thầy Cô trong hội đồng bảo vệ đã có những nhận xét quý báu cho các kết quả. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả các Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng em trong những năm học vừa qua; cung cấp, hỗ trợ các phương tiện để chúng em có thể thực hiện đề tài luận văn. Xin gửi lời cảm ơn đến Cô Lê Thu Trang, Cô Lê Thị Ngọc Điệp, nhân viên phòng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ, phòng thí nghiệm Hóa Phân Tích đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Xin cảm ơn các bạn sinh viên đã cùng chúng tôi thực hiện đề tài. Cảm ơn gia đình, bạn bè những người đã động viên, hỗ trợ chúng em hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn! NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1. Cán bộ hướng dẫn: ThS. Tôn Nữ Liên Hương 2. Tên đề tài: “Khảo sát các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. và Hydrocotyle vulgaris L.” 3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Giáp MSSV: 2041719 Nguyễn Ngọc Thể MSSV: 2041778 4. Lớp: Cử Nhân Hóa Học - Khoá 30 5. Nội dung nhận xét: a. Hình thức: .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... b. Nội dung: .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... c. Những vấn đề còn hạn chế: .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... d. Kết luận, đề nghị và điểm: .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... Cần Thơ, ngày ..... tháng .... năm 2008 Cán bộ hướng dẫn NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1. Cán bộ phản biện: .......................................................................................... .......................................................................................... 2. Tên đề tài: Khảo sát các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. và Hydrocotyle vulgaris L. 3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Giáp MSSV: 2041719 Nguyễn Ngọc Thể MSSV: 2041778 4. Lớp: Cử Nhân Hóa Học - Khoá 30 5. Nội dung nhận xét: a. Hình thức: .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... b. Nội dung: .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... c. Những vấn đề còn hạn chế: .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... d. Kết luận, đề nghị và điểm: .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... Cần Thơ, ngày ..... tháng .... năm 2008 LỜI MỞ ĐẦU  Rau Má là một loại cây quen thuộc đối với nhiều nước trên thế giới nhất là ở Việt Nam. Cây mọc tự nhiên khắp nơi từ vùng hải đảo ven biển đến vùng núi. Nhiều công trình đã chứng minh Rau Má có tác dụng phòng ngừa và điều trị được nhiều loại bệnh khác nhau. Ngày nay đã có nhiều nghiên cứu về khả năng sản xuất, sử dụng Rau Má và các thành phần trích ly từ Rau Má, trong đó flavonoid được biết như là một nhóm sắc tố tự nhiên phân bố rộng rãi trong các loài thực vật, có vai trò rất lớn trong việc tạo ra màu sắc của nhiều loại hoa quả và có nhiều tác dụng sinh học đặc biệt quan trọng. Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật và công nghệ, các biệt dược đi từ nguồn tổng hợp có tác dụng ức chế miễn dịch hiện đang được sử dụng rộng rãi và ngày càng nhiều, tuy nhiên chúng đều đắt tiền và có nhiều tác dụng phụ gây nguy hiểm. Vì vậy xu hướng hiện nay là tìm các hoạt chất thiên nhiên từ nguồn gốc thảo mộc có tác dụng như thuốc tổng hợp nhưng ít độc hơn và dễ dung nạp, nhất là ở người cao tuổi và người có bệnh mạn tính. Chính vì vậy nhóm sắc tố tự nhiên flavonoid là một trong những nhóm sắc tố không kém phần thu hút sự chú ý quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu. Hiện nay đã có đề tài nghiên cứu về khả năng sản xuất flavonoid từ nhiều loại cây cỏ, tuy nhiên Rau Má Lá Sen là nguồn nguyên liệu mới khảo sát và định danh ở nước ta trong thời gian ngắn gần đây và chưa được nghiên cứu về hóa học. Vì vậy mở rộng việc nghiên cứu trên các nguồn nguyên liệu mới, là cần thiết. Đây cũng chính là lý do mà chúng em chọn đề tài “Khảo sát các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. và Hydrocotyle vulgaris L.” với đề tài này chúng em mong muốn góp phần vào việc khảo sát sự có mặt và hàm lượng của các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen. PHẦN TÓM LƯỢT  Với đề tài “Khảo sát các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. và Hydrocotyle vulgaris L.”, luận văn sẽ tiến hành ly trích tạo các cao thô từ lá và thân cây Hydrocotyle bonariensis và cây Hydrocotyle vulgaris theo 2 phương pháp: phương pháp trích lỏng – lỏng và phương pháp trích rắn – lỏng. Sau đó định tính sự có mặt của flavonoid trong các mẫu cao thô này. Đồng thời tiến hành điều chế flavonoid thô từ cao methanol tổng của cây Hydrocotyle bonariensis và cây Hydrocotyle vulgaris và cô lập flavonoid tự nhiên từ cao flavonoid thô bằng sắc ký cột. Nội dung của đề tài được tóm lượt như sau:  Phần 1: Tổng quan.  Phần 2: Thực nghiệm và kết quả.  Phần 3: Kết luận và kiến nghị. MỤC LỤC  LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................i LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................i PHẦN TÓM LƯỢT ............................................................................................ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii MỤC LỤC BẢNG ............................................................................................. vi MỤC LỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ .................................................................vii MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT ....................................................................................ix PHẦN 1 ..............................................................................................................1 TỔNG QUAN .....................................................................................................1 CHƯƠNG 1 ........................................................................................................2 GIỚI THIỆU CHUNG ........................................................................................2 1.1. Giới thiệu chung về cây Rau Má ............................................................... 2 1.1.1. Tên gọi ............................................................................................... 2 1.1.2. Sinh thái học của cây Rau Má ...........................................................2 1.1.3. Phân bố ............................................................................................. 3 1.1.4. Thành phần hóa học...........................................................................3 1.2. Sơ lược về cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. và Hydrocotyle vulgaris L. ...................................................................................5 1.2.1. Cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. ............................... 5 1.2.1.1. Tên gọi........................................................................................5 1.2.1.2. Phân loại .....................................................................................5 1.2.1.3. Sinh thái học ...............................................................................5 1.2.1.4. Thành phần hóa học ....................................................................6 1.2.2. Rau Má Lá Sen Hydrocotyle vulgaris L. ...........................................6 1.2.2.1. Tên gọi........................................................................................6 1.2.2.2. Sinh thái học ...............................................................................7 1.2.2.3. Thành phần hóa học ....................................................................7 1.3. Công dụng của cây Rau Má .....................................................................9 1.4. Giới thiệu chung về flavonoid ..................................................................9 1.4.1. Định nghĩa.........................................................................................9 1.4.2. Phân loại.......................................................................................... 10 1.4.2.1. Phân loại dựa vào cấu trúc hóa học ........................................... 10 1.4.2.1.1. PCO.................................................................................... 10 1.4.2.1.2. Quercetin ............................................................................ 11 1.4.2.1.3. Biflavonoid của họ chanh (cam, quít, chanh,…) ................. 11 1.4.2.1.4. Polyphenol của trà (chè) xanh............................................. 11 1.4.2.2. Phân loại dựa theo màu sắc ....................................................... 11 1.4.2.2.1. Anthocyanin ....................................................................... 11 1.4.2.2.2. Anthoxathin và flavone....................................................... 12 1.4.2.2.3. Catechin và leucoanthocyanin ............................................ 13 1.4.3. Một số cấu trúc phân tử thuộc nhóm sắc tố flavonoid ...................... 13 1.4.4. Tác dụng sinh học của nhóm sắc tố flavonoid .................................. 15 CHƯƠNG 2: MỘT SỐ QUI TRÌNH TRÍCH FLAVONOID Ở VIỆT NAM ................................................................................................... 16 2.1. Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ................................................................. 16 2.1.1. Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng dung dịch acetat chì ................ 16 2.1.2. Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau .................................................................................................. 17 2.2. Trích rutin từ hoa Hòe ........................................................................... 18 2.3. Trích polyphenol từ trà (có hỗ trợ bằng vi sóng) ................................... 19 CHƯƠNG 3: MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TRÍCH TÁCH HỢP CHẤT RA KHỎI CÂY ............................................................................ 22 3.1 Phương pháp trích lỏng – lỏng ............................................................... 22 3.2. Phương pháp trích rắn – lỏng ................................................................ 23 3.2.1. Phương pháp trích ngâm dầm .......................................................... 23 3.2.2. Phương pháp trích bằng máy Soxhlet .............................................. 23 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ....................................................... 24 CHƯƠNG 1 : VỊ TRÍ, THỜI GIAN, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................... 25 1.1. Địa điểm - thời gian tiến hành ................................................................ 25 1.2. Phương tiện nghiên cứu ......................................................................... 25 1.2.1. Dụng cụ ........................................................................................... 25 1.2.2. Hóa chất .......................................................................................... 26 1.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 26 CHƯƠNG 2: ĐIỀU CHẾ VÀ ĐỊNH TÍNH CÁC MẪU CAO ........................... 27 2.1. Lựa chọn và chuẩn bị nguyên liệu ......................................................... 27 2.2. Điều chế cao .......................................................................................... 27 2.2.1. Điều chế cao methanol tổng và cao nước (trích bằng phương pháp ngâm dầm) ................................................................................................. 27 2.2.1.1. Điều chế cao methanol tổng ...................................................... 28 2.2.1.2. Điều chế cao nước..................................................................... 29 2.2.2. Điều chế cao theo phương pháp trích lỏng – lỏng ............................ 30 2.2.2.1. Sơ đồ điều chế cao .................................................................... 30 2.2.2.2. Điều chế cao petroleum ether .................................................... 31 2.2.2.3. Điều chế cao chloroform ........................................................... 32 2.2.2.4. Điều chế cao ethyl acetate ......................................................... 33 2.2.2.5. Điều chế cao buthanol ............................................................... 34 2.2.3. Điều chế cao theo phương pháp trích rắn – lỏng (trích Soxhlet) ....... 36 2.2.3.1. Sơ đồ điều chế cao .................................................................... 36 2.2.3.2. Điều chế cao ............................................................................. 36 2.3. Định tính sự có mặt của flavonoid trong các mẫu cao ........................... 39 2.3.1. Định tính sự có mặt của flavonoid bằng thuốc thử Shibata và dung dịch HCl đậm đặc....................................................................................... 39 2.3.2. Định tính sự có mặt của flavonoid bằng 3 loại thuốc thử: thuốc thử Stiasny, chì acetate bão hoà và dung dịch FeCl3 bão hoà ........................... 40 CHƯƠNG 3: ĐIỀU CHẾ FLAVONOID THÔ .................................................. 43 3.1. Trích flavonoid thô bằng dung dịch acetate chì ...................................... 43 3.2. Trích flavonoid thô bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau ....... 45 3.3. Kết luận ................................................................................................. 46 3.4. Định tính flavonoid thô .......................................................................... 46 CHƯƠNG 4: SẮC KÝ CỘT CAO FLAVONOID THÔ CỦA CÂY RAU MÁ LÁ SEN HYDROCOTYLE BONARIENSIS....................................................... 48 4.1. Chuẩn bị nguyên liệu ............................................................................. 48 4.2. Sắc ký cột cao flavonoid thô .................................................................. 48 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 54 MỤC LỤC BẢNG  Bảng 1: Thành phần hóa học của cây Rau Má....................................................... 3 Bảng 2: Các hợp chất hóa học trong cây Rau Má .................................................. 4 Bảng 3: Một số nhóm flavonoid quen thuộc trong cuộc sống hằng ngày ............... 9 Bảng 4: Một số cấu trúc phân tử thuộc nhóm flavonoid ...................................... 14 Bảng 5: Các dụng cụ thí nghiệm ......................................................................... 25 Bảng 6: Hóa chất sử dụng ................................................................................... 26 Bảng 7: Tóm tắt thu suất điều chế cao methanol tổng và cao nước...................... 30 Bảng 8: Thu suất điều chế các mẫu cao bằng phương pháp trích lỏng – lỏng ...... 35 Bảng 9: Thu suất điều chế các mẫu cao bằng phương pháp trích rắn – lỏng (trích Shoxhlet) .................................................................................. 38 Bảng 10: Kết quả định tính flavonoid trong các cao của cây Hydrocotyle bonariensis ............................................................................... 40 Bảng 11: Kết quả định tính flavonoid trong các cao của cây Hydrocotyle vulgaris.................................................................................... 40 Bảng 12: Kết quả định tính flavonoid trong các cao của cây Hydrocotyle bonariensis ............................................................................... 42 Bảng 13: Kết quả định tính flavonoid trong các cao của cây Hydrocotyle vulgaris..................................................................................... 42 Bảng 14: Thu suất điều chế flavonoid thô bằng dung dịch acetate chì................ 44 Bảng 15: Thu suất điều chế flavonoid thô bằng chu trình kiềm ......................... 46 Bảng 16: Kết quả định tính flavonoid thô .......................................................... 47 Bảng 17: Kết quả của quá trình sắc ký cột .......................................................... 49 MỤC LỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ  Hình 1: Cây Rau Má............................................................................................. 2 Hình 2: Cây Hydrocotyle bonariensis ................................................................... 5 Hình 3: Hoa Hydrocoytyle bonariensis ................................................................. 5 Hình 4: Cây Hydrocotyle vulgaris ........................................................................ 6 Hình 5: Hoa Hydrocotyle vulgaris ........................................................................ 6 Hình 6: Sắc ký bản mỏng cao Me tổng của cây Hydrocotyle bonariensis ........... 29 Hình 7: Sắc ký bản mỏng cao Me tổng của cây Hydrocotyle vulgaris ................. 29 Hình 8: Sắc ký bản mỏng cao nước của cây Hydrocotyle bonariensis................. 30 Hình 9: Sắc ký bản mỏng cao nước của cây Hydrocotyle vulgaris ...................... 30 Hình 10: Sắc ký bản mỏng cao PE của cây Hydrocotyle bonariensis .................. 32 Hình 11: Sắc ký bản mỏng cao PE của cây Hydrocotyle vulgaris ....................... 32 Hình 12: Sắc ký bản mỏng cao C của cây Hydrocotyle bonariensis .................... 33 Hình 13: Sắc ký bản mỏng cao C của cây Hydrocotyle vulgaris ......................... 33 Hình 14: Sắc ký bản mỏng cao Ea của cây Hydrocotyle bonariensis .................. 34 Hình 15: Sắc ký bản mỏng cao Ea của cây Hydrocotyle vulgaris........................ 34 Hình 16: Sắc ký bản mỏng cao Bu của cây Hydrocotyle bonariensis .................. 34 Hình 17: Sắc ký bản mỏng cao Bu của cây Hydrocotyle vulgaris ....................... 34 Hình 18: Định tính flavonoid cho kết quả dương tính của cây Hydrocotyle bonariensis ......................................................................... 39 Hình 19: Định tính flavonoid cho kết quả dương tính của cây Hydrocotyle vulgaris .............................................................................. 39 Hình 20: Định tính flavonoid cho kết quả dương tính của cây Hydrocotyle bonariensis ......................................................................... 41 Hình 21: Định tính flavonoid cho kết quả dương tính của cây Hydrocotyle vulgaris ............................................................................. 41 Hình 22: Sắc ký bản mỏng flavonoid thô của cây Hydrocotyle bonariensis ........ 44 Hình 23: Sắc ký bản mỏng flavonoid thô của cây Hydrocotyle vulgaris.............. 44 Hình 24: Sắc ký bản mỏng flavonoid thô của cây Hydrocotyl bonariensis .......... 45 Hình 25: Sắc ký bản mỏng flavonoid thô của cây Hydrocotyle vulgaris.............. 45 Hình 26: Định tính flavonoid thô của cây Hydrocotyle bonariensis .................... 47 Hình 27: Định tính flavonoid thô của cây Hydrocotyl vulgaris ........................... 47 Hình 28: Sắc ký bản mỏng cao flavonoid thô...................................................... 49 Hình 29: Sắc ký cột cao flavonoid thô ................................................................ 49 Hình 30: Kết quả sắc ký bản mỏng phân đoạn 6 ................................................. 50 Sơ đồ 1: Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng dung dịch acetate chì .................... 16 Sơ đồ 2: Trích flavonoid bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau........... 17 Sơ đồ 3: Trích rutin từ hoa Hòe........................................................................... 18 Sơ đồ 4: Trích polyphenol từ trà ......................................................................... 19 Sơ đồ 5: Tinh chế sơ bộ sản phẩm....................................................................... 20 Sơ đồ 6: Điều chế cao methanol tổng và cao nước .............................................. 28 Sơ đồ 7: Điều chế cao theo phương pháp trích lỏng – lỏng.................................. 31 Sơ đồ 8: Điều chế cao theo phương pháp trích rắn – lỏng ................................... 36 MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT  PE: Petroleum ether. C: Chloroform. Ea: Ethyl acetate. Bu: Buthanol. Me: Methanol. AcOH: Acid acetic. H+: Nước. PHẦN 1 TỔNG QUAN CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU CHUNG 1.1. Giới thiệu chung về cây Rau Má 1.1.1. Tên gọi Tên khoa học: Cetella asiatica. Tên đồng nghĩa: Hydrocotyle asiatica L. Tên khác: Liên Tiền Thảo, Tích Tuyết Thảo, Phắc Chèn (Tày). Tên nước ngoài: Indiana pennywort (Anh), Centelle. Họ: Hoa tán (Apiaceae).
Hình 1: Cây Rau Má 1.1.2. Sinh thái học của cây Rau Má [16-17]  Cây ưa ẩm, hơi chịu nóng, thường mọc thành đám ở vườn, bãi sông, nương rẫy, bờ ruộng cao và ven rừng. Rau Má sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm.  Thân thảo nhỏ, mọc bò, hơi có lông khi còn non, bén rễ ở các mấu. Lá mọc so le, nhưng thường tụ họp 5 – 6 lá ở một mấu, phiến lá nhẵn, mép khía tai bèo, cuốn lá mảnh, dài 3 – 5 cm, có khi 7 – 8 cm.  Cụm hoa gồm những tán đơn mọc riêng lẻ, mỗi tán mang 1- 5 hoa, hoa thường có màu trắng hoặc phớt đỏ, hoa giữa không có cuống, cánh hoa hình tam giác hoặc trái xoan, nhị có chỉ nhị ngắn, bao phấn hình mắt chim, bầu hình cầu.  Quả màu nâu đen, đỉnh lõm, có 7 – 9 cạnh lồi, nhẵn hoặc có lông nhỏ.  Mùa hoa quả từ tháng 4 đến tháng 6. 1.1.3. Phân bố  Hydrocotyle asiatica L. phân bố tập trung ở vùng Bắc Phi, một số ở vùng nhiệt đới Nam và Đông Nam Châu Á và các tỉnh Nam Trung Quốc.  Ở Việt Nam, Rau Má là loại cây rất quen thuộc. Cây mọc tự nhiên khắp nơi, từ vùng hải đảo, ven biển đến vùng núi. Ở vùng đồng bằng sông Cửu Long phát hiện hai loại giống Rau Má Lá Sen đã được định dạnh, đó là Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. và Rau Má Lá Sen Hydrocotyle vulgaris L.  Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi, Trần Hợp, [1,3,5] ở Việt Nam có hơn hai mươi loài Rau Má, đó là: Hydrocotyle asiatica, Hydrocotyle chevalieri (Chern) Tard, Hydrocotyle chinensis (Dunn) Craib, Hydrocotyle nepalensis Hook, Hydrocotyle petelotii Tard, Hydrocotyle pseudosanicula De Boiss, Hydrocotyle siamica Craib, Hydrocotyle sibthorpioides Lamk, Hydrocotyle tonkinensis Tard, Hydrocotyle wilfordii Maxim. 1.1.4. Thành phần hóa học Rau Má thường chứa những hợp chất thuộc nhiều nhóm hóa học khác nhau, sau đây là bảng thành phần hóa học và bảng các hợp chất hóa học của cây Rau Má. [16-17] Bảng 1: Thành phần hóa học của cây Rau Má Thành phần  Hàm lượng (%)   Nước  88,2   Protein  3,2   Glucid  1,8   Chất xơ  4,5   Khoáng toàn phần  2,3   Bảng 2: Các hợp chất hóa học trong cây Rau Má Triterpen  Saponin triterpenic, asiaticosid (madecassol), madecassoid, irahmosid, Brahminosid. Ngoài ra còn có thankunisid và isothankunisid. Khi thủy phân, thankunisid cho acid thankunic, glucose và rhamnose. Các acid triterpenic trong Rau Má là acid asiatic, acid brahmic, acid isobrahnic.   Tinh dầu  Phần trên mặt đất của cây Rau Má mọc ở Malaysia có 41 thành phần, trong đó 80% là các sesquiterpen (thành phần chính) và 10% germacren-D. Cây Rau Má mọc ở Srilanca chứa tinh dầu trong đó có -copaen 14%, -caryophylen 12%, trans--farnesen 53% và -humulen 9%.   Các hợp chất polyacetylen  Rau Má có 14 chất polyacetylen, trong đó 5 chất đã được nhận dạng là: pentadeca-2,9-dien-4,6-diyn-1-ol acetate; 3,8- diacetoxypentadeca-1,9-dien-4,6-diyn; 3-hydroxy-8-acetoxy- pentadeca-1,9-dien-4,6-diyn; 3-hydroxy-10-acetoxy- pentadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol.   Flavonoid  Các flavonoid gồm: kaempferol, quercetin, 3-glucosyl quecetin, 3-glucosyl-kaempferol.   Steroid  Các hợp chất steroid gồm: -sitosterol, stigmasterol và campestrol.   Dầu béo  Các glyceride của các acid oleic, linoleic, lignoceric, palmitic, stearic, linolenic, elaidic.   Acid amin  Acid glutamic, serin, alanin.   Các nhóm khác  Tanin, carotenoid, vitamin C, alkaloid (hydro cotylin), oligosaccharide (centelose).   1.2. Sơ lược về cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. và Hydrocotyle vulgaris L. 1.2.1. Cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. [4] 1.2.1.1. Tên gọi Tên khoa học: Hydrocotyle bonariensis L. Tên nước ngoài: Hydrocotyle petiolaris D.C, Hydrocotyle polystachyavar, guin queradiata Thourasex A. Rich, Pennywort, Kurnell curse, large leaf pennywoet paraguita. Tên thường gọi: Rau Má Lá Sen.
Hình 2: Cây Hydrocotyle bonariensis Hình 3: Hoa Hydrocoytyle bonariensis 1.2.1.2. Phân loại  Giới: Thực vật.  Ngành: Magnoliophyta.  Lớp: Magnoliophyta.  Thứ: Apiales.  Họ: Apiaceae.  Chi: Hydrocotyle.  Loài: Bonnarensis. 1.2.1.3. Sinh thái học  Cây sống dễ trong nước, những nơi đất cát, bờ biển, mương rãnh hay nơi đất lõm …, nhưng cũng chịu được môi trường khô. Xuất xứ ở Nam Mỹ, gần đây phát hiện mọc ở Việt Nam.  Là loại cỏ lưu niên, mọc bò, tại mỗi đốt có nhiều rễ và cho ra 1 – 2 lá vươn thẳng lên, cọng lá dài 15 – 35 cm. Lá hình lọng, phiến tròn, mỏng, rộng 3 – 12 cm, có thùy cạn, mép lá có khía tai bèo, cuống lá dính ở giữa chứ không phải ở mép như các cây khác.  Tán hoa có đường kính 1- 6 cm gồm nhiều tia tụ lại tạo vòng rộng, cọng cuống chính có thể dài tới 40 cm, cuống nhỏ dài 0,2 – 2 cm. Hoa nhỏ có 5 cánh màu trắng hoặc vàng kem, cánh hoa dài khoảng 0,5 mm, lá dài nhọn, màu lục, ra hoa từ đầu mùa xuân đến đầu mùa thu.  Quả hình bầu dục, dày 0,5 – 2 cm, rộng 2,5 – 3 mm, đáy và đỉnh có khía sống lưng và phần bên gân nổi rõ. 1.2.1.4. Thành phần hóa học Các nghiên cứu hóa học trên cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis cho biết khả năng hấp thụ muối NaCl của lá cây ở những vùng đất mặn có ảnh hưởng đến hàm lượng chlorophyl và làm thay đổi hàm lượng protein trong lá, do có sự điện chuyển. So với cây Foeniculum vulgare L. thì cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. nhận NaCl nhiều hơn. Cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. đã được người dân sử dụng để làm thực phẩm và theo họ cây có vị đắng hơn các loại Rau Má thường. Chưa có sự nghiên cứu nào về thành phần hóa học trên cây này. 1.2.2. Rau Má Lá Sen Hydrocotyle vulgaris L. [4] 1.2.2.1. Tên gọi Tên khoa học: Hydrocotyle vulgaris L. Tên khác: Marsh pennywort, Umbrella plant, Rau Má Lá Sen.
Hình 4: Cây Hydrocotyl vulgaris Hình 5: Hoa Hydrocotyle vulgaris 1.2.2.2. Sinh thái học  Cây sống trong môi trường ẩm ướt, tập trung thành quần thể lớn. Xuất xứ ở Châu Âu, vùng Bắc Phi, gần đây phát hiện ở Việt Nam.  Là loại cỏ lưu niên, dạng dây leo, cây mảnh khảnh, phân nhiều rễ ở các mấu đốt. Phiến lá hình tròn, đường kính khoảng 0,8-3,5 cm, có thể phát triển đến 3- 6 cm, có khía tai bèo, có 6-9 gân lá.  Hoa màu trắng, hồng nhạt hoặc hơi xanh, có đường kính 1 mm.  Quả hình trứng dài khoảng 2 mm, rộng khoảng 2,5 mm, dày 0,8 mm. 1.2.2.3. Thành phần hóa học Có hai nhóm chất chính đã được xác định trên cây Hydrocotyle vulgaris L. là triterpen và flavonoid.  Năm 1971, Hiller và các cộng sự [8]cô lập được các saponin từ Hydrocotyle vulgaris L. Kaempferol Kaempferol-3-O-D-galactoside  Năm 1974, Rzadkowska-Bodalska [9] đã cô lập từ cây được hai hợp chất quercetin-3-galactoside và quercetin-3-rhamnoglactoside. Quercetin-3-galactoside  Năm 1979, Hiller [10] và cộng sự đã cô lập được quercetin-3--D- galactopyranosyl-6-O--L-arabinopyranoside, còn gọi là rumarin, từ phần mọc trên mặt đất của cây Hydrocotyle vulgaris L. Quercetin-3--D-galactopyranosyl-6-O--L-arabinopyranoside  Năm 1981, Voigt [10] và các cộng sự cô lập từ Hydrocotyle vulgaris L. tươi được hỗn hợp gồm sáu flavonol glycoside bên cạnh các kaempferol và quercetin glycoside. Đó là các chất sau: quercetin-3-O-robinobioside, quercetin-3-O--D-galactopyranoside, quercetin-3-O--D-galactopyranosyl-6- O--L-arabinopyranoside, kaempferol-3-O-robinobioside, và hai chất với phần đường tương tự của kaemferol. Kaempferol-3-O-robinobioside 1.3. Công dụng của cây Rau Má  Rau Má có vị hơi đắng, tính mát, có tác dụng giải nhiệt nên được dùng trong thực phẩm như một loại rau gia vị hoặc dùng làm nước giải khát rất thích hợp trong mùa hè.  Ngoài ra Rau Má còn được dùng trong y học có thể chữa được nhiều loại bệnh như: Cầm máu, làm lành vết thương, bảo vệ thần kinh, trị mụn nhọt, trị kiết lị, trị bệnh chảy máu cam, chữa sốt, trị ho… 1.4. Giới thiệu chung về flavonoid 1.4.1. Định nghĩa  Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, có vai trò rất lớn trong việc tạo ra màu sắc của nhiều loại rau, hoa, quả…. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy flavonoid rất hữu ích trong việc điều trị và ngăn ngừa được nhiều loại bệnh. Flavonoid được tìm thấy nhiều trong các loại trái cây, các loài thực vật, trà, rượu, trái cây và cả rễ cây,… Sau đây là bảng một số nhóm flavonoid có chứa trong thực phẩm quen thuộc hằng ngày. Bảng 3: Một số nhóm flavonoid quen thuộc trong cuộc sống hằng ngày Hạt đậu tương (đậu nành)  Isoflavone   Mì  Rutin   Trà  Flavan-diol và Catechin   Cà chua  Naringeninchalcone   Rượu, cacao  Polyphenol    Về cấu trúc flavonoid là một nhóm chất thiên nhiên quan trọng có chứa 2 vòng benzene (ký hiệu là vòng A và vòng B) được nối với nhau bởi một mạch 3 cacbon. Mạch cacbon này được đánh theo thứ tự các số tương ứng là 2, 3, 4, có thể liên kết với 1 nhóm hydroxyl (-OH) ở vòng A để hình thành nên vòng C. Flavonoid được phân loại dựa theo cấu trúc của vòng C này. [6,12] Khung sườn của flavonoid  Khác với nhóm carotenoid vốn cũng có màu vàng và đỏ, không tan trong nước, các glucosid của flavonoid đều dễ tan trong nước. Một số tan trong rượu acid vô cơ loãng và bazơ loãng. Flavonoid cho kết tủa màu vàng cam hoặc đỏ với acetate chì, kết tủa màu xanh lục hoặc đỏ nâu với FeCl3. [6-7] 1.4.2. Phân loại 1.4.2.1. Phân loại dựa vào cấu trúc hóa học [13] Hơn 4000 hợp chất flavonoid đã được phân lập và phân loại dựa vào cấu trúc hóa học. Dựa vào cấu trúc hóa học flavonoid được phân ra làm 4 nhóm chính gồm: PCO, quercetin, biflavonoid cam quít và rượu đa chức ở trà xanh. 1.4.2.1.1. PCO Một trong những nhóm flavonoid thực vật hữu ích nhất là proanthocyanidins (còn được gọi là procyanidins). Nhóm này mang lại rất nhiều ích lợi cho sức khỏe. Mỗi proanthocyanidins liên kết với các loại proanthocyanidins khác tạo thành một hỗn hợp gồm các proanthocyanidins nhị trùng, tam trùng, tứ trùng và các phân tử trùng phân lớn hơn được gọi chung là procyanidolic oligomer, gọi tắt là PCO. PCO có trong nhiều loại thực vật và rượu vang đỏ, tuy nhiên về mặt thương mại người ta hay dùng PCO trong dịch trích hạt nho. 1.4.2.1.2. Quercetin Quercetin là một flavonoid làm xương sống cho nhiều loại flavonoid khác gồm: rutin, quercitrin, hesperidin – các flavonoid của cam quít. Những dẫn xuất này khác với quercetin ở chỗ chúng có các phân tử đường gắn chặt vào bộ khung quercetin. Quercetin là một flavonoid bền vững và hoạt động nhất trong các nghiên cứu và nhiều chế phẩm từ dược thảo có tác động tốt nhờ vào thành phần quercetin với hàm lượng cao. 1.4.2.1.3. Biflavonoid của họ chanh (cam, quít, chanh,…) Các Biflavonoid trong cam quít gồm: Rutin, hesperidin, quercitrin và naringin. Hầu hết các khảo sát về rutin và hỗn hợp biflavonoids thô đều được thực hiện trong thập niên 1970. Từ đó đến nay người ta thường dùng loại hỗn hợp rutinoside định chuẩn gọi là hydroxyethylrutosides (HER). Các bằng chứng lâm sàng rõ rệt nhất trong điều trị tăng tính thấm thành mạch, dễ bị vết bầm dưới da, trĩ và các trường hợp dãn tĩnh mạch. 1.4.2.1.4. Polyphenol của trà (chè) xanh Cả trà xanh và trà đen đều xuất nguồn từ cây trà (chè) (Camellia sinensis). Trà xanh được làm từ đọt lá, sấy nhẹ, còn trà đen được hình thành sau một quá trình oxy hóa lá trà. Polyphenol có chứa vòng phenol trong cấu trúc phân tử. Polyphenol chính trong trà xanh là các flavonoid (catechin, epicatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, và proanthocyanidin). 1.4.2.2. Phân loại dựa theo màu sắc [14] Dựa theo màu sắc flavonoid được phân ra làm 3 nhóm chính:  Anthocyanin cho màu đỏ, xanh, tím.  Anthoxanthin và flavone cho màu vàng.  Tanin thực phẩm: Bao gồm catechin và leucoanthocyanin không màu. 1.4.2.2.1. Anthocyanin  Các hợp chất thuộc nhóm này đều là những sắc tố quan trọng của hoa quả, chúng làm hoa quả có màu xanh đỏ với nhiều sắc thái khác nhau.  Các anthocyanin hiện diện trong thực vật ở dạng hợp chất glycoside với 1 hay 2 phân tử đường đơn như glucose, galactose, ramnose và có khi là pentose.  Có 3 loại anthocyanidin tìm thấy trong mô thực vật là: Pelagonidin. Cyanidin (phổ biến nhất). Delphinidin.  Màu sắc của các anthocyanin phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và nhiều yếu tố khác. Thí dụ: Cyanin ở pH <= 3: màu đỏ pH = 8: màu tím pH = 11: màu xanh  Việc tăng nhóm -OH trong phân tử anthocyanidin sẽ làm tăng cường độ màu xanh, còn khi tăng mức độ methyl hóa các nhóm -OH ở vòng benzene càng cao thì màu càng đỏ. 1.4.2.2.2. Anthoxathin và flavone  Là những sắc tố màu vàng, hòa tan trong dịch tế bào, thường ở dạng glycoside.  Flanone cho nhiều dẫn xuất như: flavonol, flavanonol và isoflavone.  Một số flavone thường gặp: Quercetin có trong vỏ củ hành, chanh, quýt. Apigenin là glycoside có trong cây ngò và thược dược. Hesperitin là sắc tố của cam, chanh.
1.4.2.2.3. Catechin và leucoanthocyanin Các chất này vô sắc, nhưng phản ứng với kim loại đều cho màu.  Catechin là cấu tử của chất tannin thu được từ một số cây như thông, liễu và nhất là trong chồi non cây trà. Catechin còn có trong một số loại quả như lê, táo, mận, nho.  Các tannin thiên nhiên đều là hỗn hợp của acid galic và acid digalic ở dạng tự do cũng như dạng kết hợp với glucose.  Dưới tác dụng của tannin, protein dễ bị đông vón, chúng rất bền với nước và các vi khuẩn gây tối, có tính dẻo, đàn hồi. 1.4.3. Một số cấu trúc phân tử thuộc nhóm sắc tố flavonoid Các flavonoid đều có chung một khung sườn flavonoid và chúng được phân loại dựa vào khung sườn này, sau đây là bảng trình bày một số cấu trúc phân tử thuộc nhóm flavonoid thường gặp: [12,15] Bảng 4: Một số cấu trúc phân tử thuộc nhóm flavonoid Tên  Cấu trúc phân tử  Thí dụ   Flavanone   Vỏ của mận, cam   Flavone   Ngò tây, cần tây   Dihydroflavonol   Nho   Flavonol   Củ hành, táo, trà   Flavan   Táo, trà, rượu   Anthocyanin   Nho   Isoflavonoid   Đậu   1.4.4. Tác dụng sinh học của nhóm sắc tố flavonoid  Kháng viêm, kháng dị ứng, chống virus và ung thư.  Hoạt tính chống oxy hóa mạnh tác dụng đến nhiều hệ enzyme và ít độc đối với cơ thể sống. Khi đưa vào cơ thể sống, flavonoid có thể tác động lên các biến đổi sinh hóa học bằng cách trực tiếp hay gián tiếp như thông qua hoạt động của các enzyme hay hệ thống thần kinh, nội tiết….  Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch,…nhờ khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol (cũng giống như các chất chống oxy hóa khác như vitamin C, E,…). [13]  Nhiều loại flavonoid có chứa vitamin P, tăng cường tác dụng của acid ascorbic, giúp củng cố các thành mạch máu đang bị suy yếu và có tác dụng làm dịu các cơn đau. Chúng còn được xem là một loại thuốc tiêu độc.  Ngoài ra, nếu lượng flavonoid cung cấp hàng ngày giảm đi, nguy cơ các bệnh lý này tăng lên rõ rệt. Khả năng chống oxy hóa của flavonoid còn mạnh hơn các chất khác như vitamin C, E, selenium và kẽm. Mỗi một loại flavonoid đều mang lại những lợi ích riêng, nhưng chúng thường hoạt động hỗ trợ cho nhau. CHƯƠNG 2 MỘT SỐ QUI TRÌNH TRÍCH FLAVONOID Ở VIỆT NAM 2.1. Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ 2.1.1. Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng dung dịch acetat chì [6] Cơ sở lý thuyết: Chuẩn bị cao cần để trích flavonoid. Hòa tan cao bằng dung dịch ethanol 10% trong nước, chứa trong một bình tam giác. Sau đó rót từ từ dung dịch nước 10% acetate chì vào bình tam giác này, khuấy nhẹ ta thu được tủa flavonoid. Lọc thu lấy tủa, hòa tan tủa trở lại vào dung dịch alcol loãng, khuấy nhẹ cho thành một dung dịch keo đồng nhất. Sau đó thêm từ từ dung dịch nước bão hòa Na2SO4, nhằm loại bỏ tủa PbSO4. Lọc lấy dung dịch nước, cô quay dịch lọc ở áp suất kém ta thu được cao thô chứa flavonoid toàn phần. Sắc ký cột để tách riêng các flavonoid. Qui trình: Cao trích Hòa vào ethanol 10% Dung dịch nước Dung dịch nước acetate chì 10%, khuấy đều, để yên, lọc. Dung dịch nước Tủa Hòa vào ethanol 10%. Thêm dung dịch nước bão hòa Na2SO4. Để yên. Lọc. Tủa PbSO4 Sơ đồ 1: Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng dung dịch acetate chì Dung dịch nước Cô quay Flavonoid thô + Na2SO4 dư Hòa vào methanol. Cô quay. Flavonoid thô Sắc khí cột Các flavonoid riêng 2.1.2. Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau [6] Cơ sở lý thuyết: Các flavonoid do có mang nhiều nhóm –OH phenol nên có thể tan được trong dung dịch kiềm. Dựa vào nguyên tắc này, sử dụng các dung dịch kiềm loãng hoặc nước vôi ta có thể trích được flavonoid ra khỏi cây cỏ, dung dịch trích sau đó sẽ được acid hóa để trả flavonoid về dạng –OH tự do, quá trình trích này được thực hiện như sau: Chuẩn bị cao cần để trích flavonoid. Hòa tan cao vào dung môi hữu cơ thích hợp thí dụ: chloroform, ethyl acetate… Tiến hành trích lỏng - lỏng dung dịch này với dung dịch nước kiềm 5 – 10% như: dung dịch NaHCO3, Na2CO3… Acid hóa các dịch trích. Sau đó sử dụng dung môi hữu cơ phù hợp để trích các flavonoid ra khỏi dung dịch nước. Làm khan nước bằng CaCl2, Na2SO4… Sau đó đuổi dung môi, ta thu được cao thô chứa flavonoid toàn phần. Tiến hành sắc ký cột để tách riêng các flavonoid. Qui trình:  Cao trích Hòa vào chloroform hoặc ethy acetate Dung dịch hữu cơ Thực hiện sự trích lỏng - lỏng với dung dịch nước kiềm 5 – 10% Pha hữu cơ Pha nước kiềm Acid hoá Pha nước acid Thực hiện sự trích lỏng - lỏng với dung môi hữu cơ: chloroform, ethyl acetate,… Pha nước Pha hữu cơ Làm khan nước. Đuổi dung môi. Flavonoid thô Sắc kí cột Các flavonoid riêng rẽ Sơ đồ 2: Trích flavonoid bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau 2.2. Trích rutin từ hoa Hòe [2] Cơ sở lý thuyết:  Nguyên liệu sử dụng chính là hoa Hòe khô. Sau khi mua về, sàng để loại đất cát, cành lá. Tất cả đem sấy khô ở nhiệt độ 50- 600C. Sau đó đem nghiền mịn, ta thu được bột hoa Hòe, bột này được bảo quản kín và sử dụng để đều chế rutin.  Bột hoa Hòe được trích với dung môi ở nhiệt độ sôi thích hợp, riêng với dung môi là NaOH thì thực hiện ở 750C. Tiến hành lọc để thu dịch lọc. Dịch lọc sau đó được acid hóa với HCl về pH = 3 – 4, sau đó làm lạnh và kết tinh.  Kết quả thu được nhận thấy khi độ phân cực của dung môi giảm dần, lượng rutin thu được cũng tăng dần. Hơn nữa, khi dung môi là nước thì những thành phần chất nhầy, nhựa, saponin, … cũng được trích ra và kết hợp với rutin mịn khi nhiệt độ hạ, tạo thành hệ gần như keo, làm quá trình lọc tách bã rất khó khăn. Các dung môi là cồn không gặp trở ngại này. Tiến hành tinh chế rutin sản phẩm bằng phương pháp kết tinh lại trong dung môi ethanol 800. Qui trình: Qui trình trích rutin từ hoa Hòe được tóm tắt trong sơ đồ sau: Dung môi Nguyên liệu Trích với dung môi Lọc nóng Bã Loại dung môi Làm lạnh, kết tinh Lọc Dịch Sấy ở 700C Rutin thô Sơ đồ 3: Trích rutin từ hoa Hòe 2.3. Trích polyphenol từ trà (có hỗ trợ bằng vi sóng) [11] Cơ sở lý thuyết: Trà tươi nguyên liệu sau khi được mang về phòng thí nghiệm được xử lý ức chế enzyme, để ráo và xay nhỏ bằng máy xay thực phẩm. Sau đó, bột trà được cân với lượng thích hợp rồi cho vào bình cầu, thêm dung môi và thực hiện quá trình trích ly. Để tránh hiện tượng quá nhiệt do chiếu vi sóng liên tục, quá trình chiếu sóng được thực hiện gián đoạn theo chu kì, 1 phút chiếu sóng, 2 phút làm mát bằng ống giải nhiệt trong bình, nhiệt độ trong suốt quá trình trích ly được giữ ở mức 75 – 800C. Sau khi kết thúc quá trình trích ly, dịch trà được đem lọc, bỏ bã, dịch lọc được định mức lên thể tích thích hợp và đem phân tích để đánh giá hiệu quả trích ly thu được. Qui trình: Qui trình trích polyphenol từ trà được tóm tắt trong sơ đồ sau: Búp trà nguyên liệu Diệt men Đánh giá: - Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi - Nồng độ dung môi - Thời gian chiếu vi sóng - Công suất lò - Chất kháng oxy hóa hỗ trợ - Thu suất trích ly Xay nhỏ Trích ly có hỗ trợ vi sóng Lọc Bã Dịch trích Xác định polyphenol tổng  Phương pháp so màu Đánh giá hiệu quả quá trình trích ly Sơ đồ 4: Trích polyphenol từ trà có hỗ trợ bằng vi sóng Sau khi polyphenol được trích ra từ trà, sẽ được tinh chế sơ bộ lại theo qui trình được thể hiện trong sơ đồ sau: Dịch lọc Dung dịch gelatin 25% Tỉ lệ 1: 60 Gia nhiệt đến 400C Tạo tủa (loại các phần tử lơ lửng) Làm lạnh dưới 100C Lọc hút chân không Tủa Vtđ Chloroform Dịch lọc Tách loại các chất màu Vtd ethyl acetate ( 200mlx2) Na2SO4 làm khan Chất bảo quản Trích Lớp nước Chuyển pha ethyl acetate Làm khan Cô chân không Sấy phun / Sấy thăng hoa  Lớp Chloroform Ethyl acetate Sản phẩm dạng bột Sơ đồ 5: Tinh chế sơ bộ sản phẩm Thuyết minh qui trình: Dịch trích thu được sau quá trình trích ly được tách loại sơ bộ các tạp chất lơ lửng, tách các tannin phân tử lớn bằng cách gia nhiệt đến 400C và tạo tủa với dung dịch gelatin 25%, sau đó dung dịch được làm lạnh đến < 100C và lọc bỏ tủa. Dịch trích thu được trong suốt, không bị tủa lại trong thời gian quan sát 1 tháng. Do các catechin không bị tủa với gelatin nên quá trình xử lý sẽ không ảnh hưởng đến thành phần catechin của dịch trích. Dịch trích sau khi lọc được tách loại chất màu và một phần caffeine bằng cách trích với chloroform, sau đó loại bỏ lớp chloroform (có màu xanh). Lớp nước thu được có màu vàng. Phần catechin trong lớp nước được chuyển sang lớp ethyl acetate, bằng cách trích với 3 thể tích ethyl acetate, dung dịch ethyl acetate sau cùng có màu vàng nhạt. Sau đó dịch ethyl acetate được tiến hành làm khan và cô đặc để loại bỏ dung môi, trong quá trình cô đặc một lượng nước thích hợp được thêm vào để tách hoàn toàn ethyl acetate. Dịch đặc được đem làm khô bằng cách sấy phun hoặc sấy thăng hoa. CHƯƠNG 3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TRÍCH TÁCH HỢP CHẤT RA KHỎI CÂY Có nhiều cách để trích tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Sau đây là một vài phương pháp trích tách hợp chất ra khỏi cây cỏ đã được thực hiện trong đề tài luận văn. 3.1 Phương pháp trích lỏng – lỏng [6] Phương pháp trích lỏng – lỏng thường được áp dụng để: Trích hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu. Phân chia cao alcol thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Việc trích lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng. Cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước để làm pha căn bản. Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ để trích ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau. Việc trích được thực hiện từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực. Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc trích được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, trích đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang trích với dung môi có tính phân cực hơn. Dung dịch của các lần trích được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan, đuổi dung môi thu được cao trích. Cần lưu ý là kỹ thuật trích lỏng – lỏng phải được thực hiện ở nhiệt độ phòng. Kỹ thuật trích lỏng – lỏng có nhược điểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần, nên ở những lần trích sau, dung môi trong bình lóng dễ tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp. 3.2. Phương pháp trích rắn – lỏng [6] 3.2.1. Phương pháp trích ngâm dầm Đây là kỹ thuật trích đơn giản nhất, có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Chỉ cần ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đặy. Rót dung môi vào bình sao cho xấp xỉ bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu và hòa tan các chất tự nhiên trong cây. Sau đó dung dịch trích được lọc qua giấy lọc, đuổi dung môi sẽ có được cao trích. Tiếp theo rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình trích cho đến khi trích kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả trích bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn bột cây hoặc dùng máy lắc để lắc nhẹ. 3.2.2. Phương pháp trích bằng máy Soxhlet Đây là kỹ thuật trích có sử dụng nhiệt, trong đó hợp chất cần trích ra được