Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm men RHODOTOR ULA SP trên môi trường bán rắn

t định mức đến 1 lít. Sau đó chỉnh pH của môi trường về 6,2 bằng máy đo pH, đem môi trường đi quay trong máy microwae. Sau đó phân phối vào các ống nghiệm, đậy nút bông lại và đem đi hấp tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút. Môi trường sau khi hấp tiệt trùng để nghiêng ống nghiệm thành môi trường thạch nghiêng, giống sẽ được cấy chuyền vào các ống nghiệm chứa môi trường MRS để giữ giống. Những ngày đầu thì nuôi ở nhiệt độ phòng (27 – 300C). Sau 4 – 5 ngày thì giữ ở nhiệt độ 80C. · Môi trường hoạt hóa nấm men Cách hoạt hóa nấm men Cân hóa chất theo tỉ lệ môi trường như trên sau đó phân phối vào các lọ, mỗi lọ 50ml môi trường, đậy nút bông, bọc giấy báo và đem hấp tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút. Môi trường sau khi hấp tiệt trùng, để nguội, dùng pipetman hút 0,5ml môi trường cho vào ống nghiệm rồi dùng que cấy lấy nấm men hòa đều vào 0,5 ml môi trường sau đó cho tất cả vào lọ môi trường. Để yên ở nhiệt độ từ 28 – 300C trong 48 giờ cho nấm men phát triển. · Môi trường nuôi cấy bán rắn a. Thành phần môi trường cơm · Cơ chất chính: Cơm tấm (Độ ẩm khoảng 60%) · Dầu ăn: 1% (v/w) thể tích /g khối lượng cơm tấm. · Bã đậu nành, bã cơm dừa, cám. · Khoáng: 1% (v/w) thể tích/g khối lượng cơm tấm. b. Thành phần môi trường dinh dưỡng khoáng bổ sung nuôi cấy bán rắn · NaNO3 4,55g · MgSO4.7H2O 1,154g · KH2PO4 0,878g · Saccarose 7,5g · Nước cất vừa đủ 250ml · Hiệu chỉnh pH 5,5 bằng HCL 0,1N 3.5 Phương pháp xử lý số liệu Kết quả được thống kê và xử lí kết quả bằng phần mềm Excel 2003 và phương pháp ANOVA từ chương trình Statgraphics Plus 3.0. 3.6 Phương pháp nghiên cứu 3.6.1 Các phương pháp phân tích, thu nhận các chỉ tiêu dùng trong nghiên cứu Xác định mật độ tế bào nấm men bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. a. Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu (Phụ lục 2) Có thể sử dụng buồng đếm hồng cầu để xác định số lượng vi sinh vật có kích thước tế bào lớn như nấm men, bào tử nấm mốc, các loại tảo có trong mẫu dưới kính hiển vi với hệ số phóng đại từ x100 đến x400. Đối với tế bào vi khuẩn, do kích thước tế bào nhỏ hơn nên cần phải sử dụng buồng đếm Petroff-hauser. Phương pháp đếm (b)(a) Bã đậu nành sau khi xay nhuyễ n và sấy trực tiếp còn giúp quan sát được hình thái tế bào. Hình thái tế bào không bình thường giúp nhận biết tế bào không phát triển trong điều kiện tối ưu, hoặc tế bào đã bị thay đổi về kiểu gen hay kiểu hình. Cấu tạo buồng đếm hồng cầu thường là một phiến kính dày 2 - 3 mm có một vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và được bao quanh bởi một rãnh. Đĩa đếm thấp hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10 mm, có hình tròn vì thế khi được phủ lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2 và được chia thành 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô là 1/25 mm2; mỗi ô vuông lớn này có 16 ô vuông nhỏ. Vì thế có tất cả 400 ô vuông nhỏ , mỗi ô có diện tích 1/400 mm2. Hình 3.1. Buồng đếm hồng cầu (a) Nhìn nghiêng và nhìn từ trên xuống (b) Ô trung tâm (khoanh tròn) được quan sát với độ phóng đại 100 lần b. Cách tính Thể tích dịch huyền phù chứa trên ô trung tâm (gồm 25 ô vuông lớn hay 400 ô vuông nhỏ) là 1 x 0,1=0,1mm3 (vì diện tích tổng cộng của ô trung tâm là 1mm2). Tuy nhiên chỉ đếm số tế bào trên 5 ô vuông lớn đại diện cho 25 ô vuông lớn trên ô trung tâm. Khi đó số lượng tế bào trong một ml mẫu nước được tính theo công thức: N= [(a/b) * 400/0,1 * 103 * 10n] N : số lượng tế bào trong một ml mẫu nghiên cứu; a : số lượng tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ); b : số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (16 x 5 = 80 ô vuông nhỏ); 400: tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm; 0,1: thể tích dịch tế bào (tính bằng 1mm3 ) chứa trên ô trung tâm; Môi trường MRS agar Cấy chuyền giữ giống 103: số chuyển mm3 thành ml (1000 mm3 = 1 ml) 10n: độ pha loãng mẫu Lưu ý: Số tế bào đếm được trong 5 ô vuông lớn phải trên 200 mới đảm bảo được mức độ chính xác của phương pháp. 3.6.2 Phương pháp phân lập và chọn giống a. Nguyên tắc Phân lập là quá trình tách riêng một vi sinh vật từ mẫu vật hoặc từ một quần thể vi sinh vật ban đầu dựa trên các kỹ thuật pha loãng và tiến hành nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc. Sau đó tùy từng loại vi sinh vật mà tiến hành nuôi ủ ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau để tạo điều kiện phù hợp cho vi sinh vật phân lập phát triển tạo thành một quần thể riêng biệt khác gọi là khuẩn lạc. Sau đó lấy một ít khuẩn lạc cho vào môi trường thạch sâu hoặc thạch nghiêng để giữ giống cùng với một điều kiện nuôi ủ như trên để chúng phát triển thành chủng thuần. b. Phương pháp thực hiện Hình 3.2. Sơ đồ quy trình phân lập và chọn giống Bước 1: Phân lập mẫu Lấy 1g (hoặc hút 1 m l ) nguồn giống cho vào 9ml nước cất vô trùng trong cốc, lắc đều để hoà tan nấm men, ta có được độ pha loãng 10-1 . Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch pha loãng ở trên cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước cất vô trùng, lắc đều, ta được độ pha loãng 10-2 . thực hiện tiếp tục như vậy cho đến khi được độ pha loãng ở nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 . Từ các dịch pha loãng ở các nồng độ như trên, dùng pipet khử trùng hút mỗi lần 0,1ml từ các dịch pha loãng ở các nồng độ vào các đĩa môi trường đã chuẩn bị, dùng que cấy trang vô trùng trang đều dịch mẫu trên mặt thạch, bao gói. Tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ 280C - 300C, thời gian 3 ngày, các khuẩn lạc sẽ mọc. Quan sát nhận dạng, đếm số khuẩn lạc. Bước 2: Cấy chuyền và chọn lọc giống · Quan sát khuẩn lạc từ mẫu cấy được phân lập. · Chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ (khuẩn lạc tròn đều, màu đỏ). · Cấy chuyền trên môi trường thạch Hensen. 3.6.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm A. Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula Gạo tấm Ngâm Hồ hóa Phối trộn Tiệt trùng Nuôi bán rắn Sấy khô bằng nhiệt Sản phẩm Cấy giống Hoạt hóa Giống nấm men Rhodotorula Sinh khối Bã đậu nành Khoáng Dầu ăn Lõi bắp Hình 3.3. Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men Rodotorula B. Thuyết minh quy trình nuôi cấy · Ngâm gạo Nguyên liệu gạo tấm sẽ được ngâm trong thời gian 24 giờ với nước có pH 4,0 (hiệu chỉnh pH bằng dung dịch HCl 0,1N), giúp cho quá trình thủy phân một phần tinh bột và giúp gạo hút nước, trương nở tạo điều kiện cho quá trình hồ hóa được diễn ra dễ dàng hơn. · Hồ hóa Sau khi ngâm 24 giờ, gạo tấm được đem đi hồ hóa với nước có pH 5,8, theo tỉ lệ gạo: nước là 1 : 1,2 tương đương 0,5kg gạo tấm với 600ml nước. Quá trình này sẽ giúp quá trình lên men bán rắn của nấm men tốt hơn, do hệ cơ chất dễ sử dụng. · Phân phối Gạo tấm nấu xong theo các tỷ lệ trên, sẽ được cơm tấm (với pH khoảng 5,5; độ ẩm khoảng 60%), tiến hành phân phối vào các hộp nhựa lớn với dung tích 1 lít chịu được nhiệt độ thanh trùng. Ngoài các thành phần môi trường chính, bổ sung dầu ăn và các tỉ lệ khoáng thành phần như ở mục (3.4). Cuối cùng trộn thật đều các thành phần môi trường với nhau trước khi tiến hành quá trình tiệt trùng. · Tiệt trùng Các hộp canh trường đã được phân phối các thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp được đem tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 30 phút. · Cấy vi sinh vật Giống nấm men Rhodotorula được hoạt hóa trong môi trường MRS broth trong 24 – 48 giờ. Giống sản xuất được đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu để tính tỷ lệ cấy giống vào môi trường sau khi thanh trùng để nguội, với tỷ lệ giống cấy nấm men Rhodotorula đã hoạt hóa vào khoảng 3.107 CFU/g canh trường. · Nuôi bán rắn Nuôi nấm men ở điều kiện nhiệt độ phòng (28 -300C), trong thời gian từ 5 – 7 ngày. Thu toàn bộ canh trường và đem đi sấy khô bằng nhiệt. 3.6.3.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái của chủng nấm men a. Nguyên tắc Nấm men là một nhóm vi sinh vật được dùng nhiều trong công nghiệp, hầu như nấm men là đơn bào, không chuyển động. Hình dạng và kích thước của chúng thay đổi tùy điều kiện môi trường. Nói chung nấm men có kích thước tương đối lớn, chiều dài từ 6 – 10 µm có khi 12 – 18 µm, có chiều ngang từ 4 – 8 µm. Trong quá trình phát triển, hình thái nấm men có thể thay đổi như sau: - Ở nấm men trẻ (qua 12 – 16 giờ nuôi cấy); màng mỏng, tế bào chất đồng nhất, không bào chưa có hoặc mới bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao. - Ở nấm men trưởng thành (24 - 48 giờ nuôi cấy): kích thước điển hình, không bào lớn, số không bào có thể đến hai, lượng glycogen tăng, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao. - Ở nấm men già (đã nuôi cấy từ 72 giờ trở lên): màng dày nhẵn, tế bào chất không đồng nhất, không bào lớn, lượng chất béo tăng, tế bào hầu như không sinh sản nữa, không có glycogen, tế bào chết chiếm tỷ lệ lớn. b. Cách thực hiện · Làm tiêu bản giọt ép để quan sát hình thái của nấm men - Lau phiến kính bằng cồn 700 - Đốt đèn cồn lên - Nhỏ một giọt nước cất lên chính giữa phiến kính - Tay trái giữ ống giống vi sinh vật nghiêng trên ngọn lửa đèn cồn - Tay phải hơ nóng đỏ que cấy, sau đó mở nút bông bằng ngón út và lòng bàn tay phải - Tay trái hơ miệng ống giống trên ngọn lửa - Nhanh chóng và khéo léo dùng que cấy vòng lấy nấm men (chạm đầu que cấy vào môi trường, không lấy thạch ra) rồi rút que cấy ra - Lại hơ miệng ống giống trên ngọn lửa và đậy nút bông, để ống giống vào vị trí cũ. - Dàn đều giống vừa lấy ra với giọt nước cất trên phiến kính Đặt lamen vào mép phiến kính 1 góc 450 và hạ xuống phiến kính, sao cho không tạo bọt khí bên trong. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40, vật kính 100. 3.6.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn · Mục đích Khảo sát và chọn ra môi trường nuôi cấy bán rắn thích hợp nhất đối với chủng nấm men Rhodotorula sp dựa trên các nguồn nguyên liệu là các phụ phẩm nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố. Nhân tố môi trường (MT): nguồn nguyên liệu môi trường nuôi cấy với MT1, MT2, MT3 tương ứng với các hỗn hợp môi trường được khảo sát là môi trường 1, môi trường 2, và môi trường 3. · Thành phần môi trường 1 Cơm: 70% (70g) Lõi bắp: 10% (10g) Bã dừa: 25% ( 25g) Khoáng: 1% (v/w) thể tích/ 1g canh trường (1ml) · Thành phần môi trường 2 Cơm: 89% (89g) Lõi bắp: 10% (10g) Bã đậu nành: 1% (2g) Dầu ăn: 1% (v/w) thể tích/ 1g canh trường (1ml) Khoáng: 1% (v/w) thể tích / 1g canh trường (1ml) · Thành phần môi trường 3 Cơm: 68% (68g) Lõi bắp: 10% (10g) Bã dừa: 25% (25g) Cám gạo: 2% (2g) Khoáng: 1% (v/w) thể tích/ 1g canh trường (1ml) Thí nghiệm được lặp lại 2 lần, tổng nghiệm thức (TNT) TNT = 3 x 2 = 6 nghiệm thức · Phương pháp thực hiện Nuôi bán rắn Sấy khô …… Gạo tấm Ngâm Hồ hóa Phối trộn MT1 MT2 MT3 Sản phẩm Hình 3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 · Chỉ tiêu theo dõi Mật độ tế bào được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. · Cách thực hiện Nguyên liệu gạo tấm sẽ được ngâm trong thời gian 24 giờ với nước có pH 4,0 được điều chỉnh bằng acid HCl 0,1N. Sau khi ngâm được chỉnh pH về 5,8, và đem đi hồ hóa theo tỉ lệ gạo : nước là 1 : 1,2. Khi nấu xong theo các tỷ lệ trên, sẽ được cơm tấm ( với pH khoảng 5,5; độ ẩm khoảng 60%), đựơc tiến hành phân phối thành phần môi trường theo các tỷ lệ đã khảo sát trên vào các hộp nhựa lớn với dung tích 1 lít chịu được nhiệt độ thanh trùng (khối lượng môi trường khoảng 100g). Các hộp canh trường được đem tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 30 phút, để nguội và bổ sung 10ml tỷ lệ giống cấy nấm men Rhodotorula đã hoạt hóa. Nuôi nấm men ở điều kiện nhiệt độ phòng, trong thời gian 6 ngày. Đếm mật độ tế bào trong thời gian nuôi nấm men trên môi trường bán rắn. Thu toàn bộ canh trường đem đi sấy khô bằng nhiệt. 3.6.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và thời gian ngâm gạo · Nguyên tắc pH có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, sự tăng hoặc giảm pH đều có ảnh hưởng có lợi hoặc có hại đối với từng loại vi sinh vật vì các vi sinh vật khác nhau chỉ có thể sinh trưởng và phát triển tối ưu tại một pH nhất định nào đó. Tuy nhiên, phần lớn các vi sinh vật sinh trưởng tối ưu ở môi trường pH trung tính. · Mục đích Chọn ra pH và thời gian ngâm thích hợp nhất cho quá trình thủy phân tinh bột, giúp gạo hút nước, trương nở hỗ trợ cho quá trình hồ hóa tinh bột cũng như sự phát triển và sử dụng cơ chất của nấm men được diễn ra dễ dàng hơn. · Phương pháp thực hiện Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 yếu tố · Nhân tố pH: pH nước ngâm gạo pH1, pH2, pH3, pH4 tương ứng với pH được khảo sát ở mức 2, 3, 4, 5. · Nhân tố thời gian (TG): thời gian ngâm với TG1, TG2, TG3, tương ứng với mức thời gian ngâm là 6, 24, 30 giờ . Thí nghiệm được lặp lại 2 lần, tổng nghiệm thức (TNT) TNT = 12 x 2 = 24 Bảng 3.3 Bảng phân phối nghiệm thức pH nước ngâm Thời gian ngâm TG1 (6 giờ) TG2 (24giờ) TG3 (30giờ) P1 (pH = 2) P1TG1 P1TG2 P1TG3 P2 (pH = 3) P2TG1 P2TG2 P2TG3 P3 (pH = 4) P3TG1 P3TG2 P3TG3 P4 (pH = 5) P4TG1 P4TG2 P4TG3 Gạo tấm Ngâm TG2 TG3TG1 P1 P2 P3 P4 P1 P2 P3 P4 P1 P2 P3 P4 Hồ hóa Phối trộn ….. Sấy khô Nuôi bán rắn Sản phẩm Hình 3.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 · Chỉ tiêu theo dõi Mật độ tế bào nấm men được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. · Cách thực hiện Nguyên liệu gạo tấm sẽ được ngâm trong khoảng thời gian và pH nước ngâm được khảo sát như trên. Sau khi ngâm được chỉnh pH về 5,8 và đem đi hồ hóa theo tỉ lệ gạo : nước là 1 : 1,2. Khi nấu xong sẽ được cơm tấm (với pH khoảng 5,5; độ ẩm khoảng 60%), đựơc tiến hành phân phối theo môi trường thu được ở thí nghiệm 2 vào các hộp nhựa lớn với dung tích 1 lít chịu được nhiệt độ thanh trùng (khối lượng môi trường khoảng 100g). Sau đó được đem tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 30 phút, để nguội, bổ sung 10ml tỷ lệ giống cấy nấm men Rhodotorula đã hoạt hóa. Nuôi nấm men ở điều kiện nhiệt độ phòng, trong thời gian 6 ngày. Thu toàn bộ canh trường đem đi sấy khô bằng nhiệt. 3.6.3.4 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy a. Tối ưu tỉ lệ cơm tấm bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn · Mục đích Khảo sát và chọn ra tỉ lệ cơm tấm thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm men đỏ để thu được mật độ tế bào cao nhất. · Chỉ tiêu theo dõi Mật độ tế bào nấm men được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. · Cách thực hiện Nguyên liệu gạo tấm sẽ được ngâm trong thời gian và pH nước ngâm phù hợp ở thí nghiệm 2, sau khi ngâm được chỉnh về pH 5,8 và đem đi hồ hóa theo tỉ lệ gạo : nước là 1:1,2 tương đương với 0,5kg gạo tấm với 600ml nước. Khi nấu xong theo các tỷ lệ trên, sẽ được cơm tấm (với pH 5,5; độ ẩm khoảng 60%), được tiến hành phân phối thành phần môi trường với tỉ lệ cơm tấm 80%, 85%, 90%, 95% và 100%. Các thành phần khác bổ sung theo kết quả thu nhận từ thí nghiệm 2 vào các hộp nhựa lớn với dung tích 1 lít chịu được nhiệt độ thanh trùng. Các hộp canh trường sau đó được đem tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 30 phút, để nguội và được cấy giống với tỷ lệ 10ml tỷ lệ giống cấy nấm men Rhodotorula đã hoạt hóa. Tiến hành nuôi bán rắn tế bào nấm men ở điều kiện nhiệt độ phòng (khoảng 280 – 300C) trong khoảng thời gian khảo sát là 7 ngày. Các mẫu sẽ được tiến hành đo chỉ tiêu mật độ tế bào sau mỗi 24 giờ ở cùng khoảng thời gian cố định mỗi ngày. Thành phần môi trường gồm có: · Cơm: bổ sung theo tỉ lệ khảo sát như trên · Lõi bắp: 10% (9g) · Bã đậu nành: 1% (1g) · Dầu ăn: 1% (v/w) thể tích/1g canh trường (1ml) · Khoáng: 1% (v/w) thể tích /1g canh trường (1ml) b.Tối ưu tỉ lệ lõi bắp bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn · Mục đích Tìm ra tỉ lệ lõi bắp tạo cho môi trường có độ ẩm thích hợp nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm men để thu được mật độ tế bào cao nhất. · Chỉ tiêu theo dõi Mật độ tế bào được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. · Cách thực hiện Nguyên liệu gạo tấm sẽ được ngâm trong thời gian và pH nước ngâm phù hợp ở thí nghiệm 2, sau khi ngâm được chỉnh về pH 5,8 và đem đi hồ hóa theo tỉ lệ gạo : nước là 1:1,2 tương đương với 0,5kg gạo tấm với 600ml nước. Khi nấu xong theo các tỷ lệ trên, sẽ được cơm tấm (với pH 5,5; độ ẩm khoảng 60%), được tiến hành phân phối thành phần môi trường thu nhận từ thí nghiệm 1 vào các hộp nhựa lớn với dung tích 1 lít chịu được nhiệt độ thanh trùng. Các thành phần đều được giữ cố định nhưng với thành phần lõi bắp thì thay đổi với tỉ lệ 0%, 5%, 10%, 15% và 20%. Các hộp canh trường sau đó được đem tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 30 phút, để nguội và được cấy giống với tỷ lệ 10ml tỷ lệ giống cấy nấm men Rhodotorula sp đã hoạt hóa. Tiến hành nuôi bán rắn tế bào nấm men ở điều kiện nhiệt độ phòng (khoảng 280 – 300C) trong khoảng thời gian khảo sát là 7 ngày. Các mẫu sẽ được tiến hành đo chỉ tiêu mật độ tế bào sau mỗi 24 giờ ở cùng khoảng thời gian cố định mỗi ngày. Thành phần môi trường gồm có: · Cơm: 90% · Lõi bắp: 0%, 5%, 10%, 15%, 20%. · Bã đậu nành: 1% (1g) · Dầu ăn: 1% (v/w) thể tích/1g canh trường (1ml) · Khoáng: 1% (v/w) thể tích /1g canh trường (1ml) 3.6.4 Thử nghiệm sản xuất chế phẩm · Nguyên tắc Sấy là quá trình sử dụng nhiệt để làm khô sản phẩm, tùy từng loại sản phẩm mà điều chỉnh nhiệt độ và thời gian phù hợp để thu được sản phẩm khô như mong muốn. · Chỉ tiêu thu nhận Sản phẩm bột canh trường beta-caroten_ sản phẩm dạng bột min. · Phương pháp tiến hành Qua quá trình khảo sát môi trường tối ưu cho sự phát triển của nấm men Rhodotorula sp, chọn ra môi trường nuôi cấy tối ưu, pH và thời gian ngâm gạo thích hợp nhất để tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa beta-caroten bằng phương pháp sấy khô. Toàn bộ canh trường nấm men sau thời gian nuôi cấy thu beta-caroten với hàm lượng cao nhất, được đem đi sấy khô ở nhiệt độ khoảng 45 – 500C trong khoảng 24 – 48 giờ đến khi đạt được độ ẩm theo yêu cầu khoảng 11 – 12%, được đem đi nghiền bằng cối xay thu được chế phẩm bột canh trường nấm men Rhodotorula sp. Chương 4 K ẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái của nấm men đỏ Rhodotorula Qua quá trình khảo sát chúng tôi nhận thấy rằng, nấm men Rhodotorula sp phát triển tốt nhất ở khoảng nhiệt độ phòng từ 28 – 300C trong khoảng từ 24 – 48 giờ. Hình 4.1. Cấy ria nấm men đỏ trên môi trường thạch Hansen Nhận xét Nấm men Rohodotorula sp khi cấy ria trên môi trường thạch Hansen có màu kem hồng, bề mặt mịn và có dạng bơ. Hình 4.2: Cấy trang quan sát khuẩn lạc trên môi trường thạch Hansen ở độ pha loãng 10-7 Nhận xét Khuẩn lạc của nấm men đỏ Rhodotorula sp có màu kem hồng, khuẩn lạc có hình dạng tròn cầu, bề mặt mịn, trơn, bóng sáng và có dạng bơ, mép khuẩn lạc không có răng cưa. Đường kính khuẩn lạc khoảng từ 2 -5 mm. Hình 4.4. Nấm men đỏ quan sát dưới vật kính x100 Hình 4.3. Nấm men đỏ quan sát dưới vật kính 40 Hình 4.5. Nấm men đỏ quan sát dưới vật kính x100_Hình ảnh phóng to Nhận xét Tế bào nấm men Rhodotorula sp khi quan sát dưới vật kính x100 có hình tròn cầu, kích thước tế bào trong khoảng 2 – 4 μm chiều rộng và 2,5 – 5 μm chiều dài. Tế bào có hình dạng và kích thước giống với Saccharomyces cerevisae. 4.2. Khảo sát thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn Nguyên liệu ban đầu sử dụng cho quá trình lên men bán rắn chủ yếu là phế phụ phẩm từ các ngành nông nghiệp và công nghiệp nên có thành phần dinh dưỡng không cân đối. Vì vậy việc phối trộn các thành phần với nhau sẽ bổ sung được những khiếm khuyết về mặt dinh dưỡng trong quá trình lên men bán rắn. Bảng 4.1. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu của nguyên liệu ban đầu Chỉ tiêu Tên nguyên liệu Gạo tấm Cám gạo Bã cơm dừa Bã đậu nành Độ ẩm % 12,8 14,2 46,16 13,14 Protein tổng (%CK) 6,7 9,5 5,61 43,12 Lipid tổng (%CK) 1,6 17,3 7,505 17,54 Tinh bột (%CK) 62,76 - - - Đường tổng (%CK) - - 6,23 4,59 Chỉ số iot (IoV) - - 25,69 - Chỉ số peroxyt (PoV) - - 4,93 - %CK: % tính theo chất khô -: Không phân tích Lựa chọn nguyên liệu gạo tấm làm cơ chất chính trong quá trình lên men bán rắn giúp giảm chi phí trong sản xuất, đồng thời gạo tấm sau khi hồ hóa cho cơm dẻo, độ ẩm vừa phải tạo độ bám dính thích hợp cho nấm men trên bề mặt môi trường lên men bán rắn. Gạo tấm có thành phần tinh bột cao nhất sẽ cung cấp nguồn cacbon chính cho sự phát triển của nấm men (tinh bột chiếm 62,76% chất khô). Nguồn nitogen có tác dụng kích thích quá trình tích lũy sinh khối lớn nhất. Do vậy bã đậu nành, cám gạo sẽ là nguồn cung cấp chính nitrogen cho sự phát triển của nấm men. Bảng 4.2. Kết quả khảo sát môi trường lên men bán rắn Môi trường Mật độ tế bào (CFU/g) 1 3,55. 108 b 2 7,40. 108 a 3 3,95. 108 b (a, b chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%) F = 14,76 p = 0,0280 Biểu đồ 4.1. Khảo sát môi trường lên men bán rắn Nhận xét Quá trình nuôi cấy sử dụng các nguyên liệu là phụ phẩm của các ngành công nghiệp và nông nghiệp nên thành phần dinh dưỡng giữa các nguyên liệu là không cân đối. Vì vậy việc phối trộn các nguyên liệu với nhau sẽ giúp bổ sung về mặt dinh dưỡng giữa các thành phần và đem lại hiệu quả cho quá trình lên men bán rắn. Môi trường 1 có thành phần bã dừa và lõi bắp làm cho môi trường có độ ẩm và độ xốp cao làm cho khả năng phát triển của nấm men trên bề mặt cơ chất bị giảm so với môi trường không có bã dừa và lõi bắp. Đối với môi trường 3 tỉ lệ bã dừa và lõi bắp tương tự môi trường 1 lại cộng thêm cám gạo. Vì vậy cũng có độ xốp quá cao làm cho khả nấm phát triển của nấm men càng giảm xuống. Riêng với môi trường 2, bã đậu nành có độ ẩm thấp, thành phần chất lượng ổn định và tỉ lệ lõi bắp vừa đủ tạo cho môi trường lên men có độ ẩm khoảng 60% thích hợp cho sự phát triển của nấm men trên bề mặt cơ chất. Vì vậy môi trường 2 được chọn để khảo sát các yếu tố khác. Bàng 4.3. Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men theo ngày Thời điểm (Ngày) Môi trường 1 (CFU/g) Môi trường 2 (CFU/g) Môi trường 3 (CFU/g) 2 2,46. 108 3,23. 108 1,65. 108 4 2,92. 108 3,49. 108 1,99. 108 6 4,06. 108 7,62. 108 3,56. 108 8 3,39. 108 6,37. 108 2,85. 108 Biểu đồ 4.2. Sự phát triển của nấm men trên môi trường bán rắn Nhận xét Qua quá trình nuôi cấy chúng tôi nhận thấy, trên môi trường 1 sự sinh trưởng và phát triển của nấm men tăng dần đều từ những ngày đầu nuôi cấy cho đến ngày nuôi thứ 6 và thứ 7 thì đạt được mật độ tế bào cao nhất (4,06.108CFU/g). Và khi bước vào ngày thứ 8 trở đi mật độ tế bào nấm men giảm dần. Đối với môi trường 2, ở những ngày đầu mật độ tế bào nấm men tăng chậm. Do nấm men phải thích nghi với điều kiện nuôi cấy bán rắn nên quá trình sinh trưởng phát triển diễn ra chưa mạnh mẽ. Sau ngày thứ 2 mật độ tế bào nấm men tăng rõ rệt. Nấm men đã thích nghi với điều kiện nuôi cấy và khi bước sang ngày nuôi thứ 6 và thứ 7 thì mật độ tế bào đạt cực đại (khoảng 7,62.108CFU/g), lúc này chúng ta có thể nhận thấy sự thay đổi màu sắc rõ rệt của môi trường lên men so với những ngày đầu và đây gần như là giai đoạn ổn định của nấm men, mật độ tế bào nấm men không tăng nữa. Và sau ngày nuôi thứ 7 trở đi thì nấm men bước vào giai đoạn suy vong, tốc độ chết tăng, nấm men không sinh sản nữa do đó mật độ tế bào nấm men giảm dần. Đối với môi trường 3, nhìn từ biểu đồ có thể thấy sự sinh trưởng và phát triển diễn ra tương tự như ở môi trường 1. Mật độ tế bào nấm men tăng dần đều từ những ngày đầu nuôi cấy và đạt được mật độ tế bào cực đại vào ngày nuôi thứ 6 và thứ 7 (3,56.108CFU/g). Và kể từ ngày nuôi thứ 8 trở đi thì mật độ tế bào cũng giảm dần. Từ kết quả khảo sát trên chúng tôi chọn môi trường 2 cho việc khảo sát các yếu tố tiếp theo. 4.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH và thời gian ngâm gạo pH nước ngâm và thời gian ngâm gạo sẽ giúp quá trình trương nở của gạo được tốt hơn, tạo điều kiện cho nấm men sử dụng cơ chất dễ dàng hơn. Bảng 4.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và thời gian ngâm gạo pH nước ngâm Thời gian ngâm (Giờ) Mật độ tế bào nấm men (CFU/g) 2 6 6,6. 108 2 24 12,6. 108 2 30 5,6. 108 3 6 5,4. 108 3 24 8,7. 108 3 30 5,3. 108 4 6 5,2. 108 4 24 8,7. 108 4 30 5,0. 108 5 6 5,0. 108 5 24 6,1. 108 5 30 5,3. 108 Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của pH ngâm gạo đến mật độ nấm men phát triển trong quá trình nuôi cấy pH nước ngâm Mật độ tế bào nấm men (CFU/g) 2 8,3. 108 3 6,5. 108 4 6,3. 108 5 5,5. 108 Biểu đồ 4.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH nước ngâm gạo Nhận xét Khi ngâm gạo ở pH có giá trị từ 3 đến 5, nước ngâm có pH trung tính. Vì vậy tinh bột bị thủy phân thành các chất đơn giản và tạo điều kiện cho các vi sinh vật phát triển làm cho gạo ngâm có hiện tượng sủi bọt, tạo màng trên bề mặt và có mùi chua làm ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy bán rắn và làm giảm mật độ tế bào nấm men. Nhưng khi ở giá trị pH = 2, nước ngâm có pH axit thì hạn chế được sự phát triển của vi sinh vật, không gây ra hiện tượng sủi bọt, tạo màng, gây mùi chua. Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của thời gian ngâm gạo đến mật độ tế bào nấm men phát triển trong quá trình nuôi cấy Thời gian ngâm (Giờ) Mật độ tế bào nấm men (CFU/g) 6 5,8. 108 24 9,0. 108 30 5,3. 108 Biểu đồ 4.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm gạo Nhận xét Qua việc khảo sát chúng tôi nhận thấy, với thời gian ngâm 6 giờ gạo chưa trương nở nhiều so với thời gian ngâm 24 giờ, nhưng ở thời gian ngâm 30 giờ gạo ngâm có hiện tượng sủi bọt nhẹ, và có mùi chua do sự phát triển của vi sinh vật làm ảnh hưởng đến chất lượng gạo. Vì vậy thời gian 24 giờ là tốt nhất cho quá trình ngâm gạo. Chúng tôi nhận thấy rằng pH càng tăng thì mật độ tế bào nấm men càng giảm. Do đó điều kiện ngâm tốt nhất là pH = 2 và thời gian ngâm trong khoảng 24 giờ. 4.4. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy 4.4.1 Tối ưu tỉ lệ cơm tấm bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn Nhằm chọn ra tỉ lệ cơ chất chính (cơm tấm) thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm men đỏ để thu được mật độ tế bào cao nhất. Sau khi tiến hành thí nghiệm thu được kết quả như sau Bảng 4.7. Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa thành phần cơm Tỉ lệ cơm tấm (%) Mật độ tế bào nấm men (CFU/g) 80 12,5. 108 b 85 13,4. 108 b 90 14,7. 108 a 95 10,5. 108 b 100 8,7. 108 b F = 16,68 p = 0,0043 Biểu đồ 4.5. Kết quả tối ưu hóa thành phần cơm Nhận xét Cơ chất chính cho môi trường lên men là gạo tấm, đồng thời gạo tấm cũng là nguồn cung cấp cacbon cho quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men. Nấm men phát triển trên bề mặt của cơ chất và môi trường nuôi cấy cần có độ ẩm khoảng 60% tạo độ bám thích hợp cho nấm men phát triển. Vì vậy khi phối trộn cơm tấm : lõi bắp : bã đậu nành theo tỉ lệ 90 : 10 :1 canh trường đạt ẩm độ khoảng 60%, cho ta thu được mật độ tế bào nấm men cao nhất (14,7.108CFU/g). Còn ở những tỉ lệ phối trộn khác canh trường có độ ẩm quá cao hoặc quá thấp đã hạn chế sự phát triển của nấm men. Vì vậy tỉ lệ cơm tấm chiếm 90% thành phần môi trường là thích hợp cho quá trình lên men bán rắn. 4.4.2 Tối ưu tỉ lệ lõi bắp bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn Tỉ lệ lõi bắp cũng là một trong những yếu tố quyết định ẩm độ, tạo độ xốp cho môi trường nuôi cấy. Khảo sát tỉ lệ lõi bắp để tìm ra một tỉ lệ thích hợp cho môi trường nuôi cấy. Sau khi tiến hành thí nghiệm thu được kết quả như sau Bảng 4.8. Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa tỉ lệ lõi bắp Tỉ lệ lõi bắp (%) Mật độ tế bào nấm men (CFU/g) 0 7,8. 108 b 10 18,8. 108 a 20 5,5. 108 b 30 3,3. 108 b F = 82,30 p = 0,0005 Biểu đồ 4.6. Kết quả tối ưu hóa tỉ lệ lõi bắp Nhận xét Khi tăng dần tỉ lệ lõi bắp thì mật độ tế bào nấm men cũng tăng theo và giới hạn ở mức lõi bắp chiếm 10% thành phần môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng tỉ lệ lõi bắp từ 20% trở đi thì mật độ tế bào nấm men sẽ giảm. Nếu tỉ lệ lõi bắp quá cao sẽ ức chế sự phát triển của nấm men làm cho mật độ tế bào sinh ra sẽ giảm. Nguyên nhân do độ ẩm của môi trường nuôi cấy cũng là một trong những thông số quan trọng quyết định sự sinh trưởng phát triển của tế bào nấm men. Khi ẩm độ của môi trường quá thấp (tỉ lệ lõi bắp từ 20% - 30%) làm giảm sự trương nở của cơ chất và giảm sự phát triển của nấm men. Tuy nhiên khi mức độ ẩm quá cao sẽ làm giảm độ xâm nhập vào khoảng không nội bào, khả năng khuếch tán oxy thấp, giảm sự trao đổi khí, giảm bề mặt cơ chất và tăng nguy cơ nhiễm tạp khuẩn. Vì vậy với độ ẩm trung bình khoảng 60% tỉ lệ lõi bắp chiếm 10% là điều kiện tối ưu cho sự phát triển của nấm men và cho ta thu được mật độ tế bào cao nhất. Qua quá trình tối ưu hóa các thành phần môi trường nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy tỉ lệ cơm tấm chiếm 90% và tỉ lệ lõi bắp 10% là tỉ lệ thích hợp được chọn cho quá trình thử nghiệm sản xuất chế phẩm. 4.5 Thử nghiệm sản xuất chế phẩm Qua quá trình khảo sát môi trường tối ưu cho sự phát triển của nấm men Rhodotorula sp. Chúng tôi chọn được pH ngâm gạo là pH = 2 trong thời gian 24 giờ và thành phần môi trường nuôi cấy gồm: Cơm 90% (90g) Lõi bắp 10% (10g) Bã đậu nành 1% (1g) Dầu ăn 1% (v/w) thể tích/ 1g canh trường (1ml) Khoáng 1% (v/w) thể tích / 1g canh trường (1ml) Gạo sau khi ngâm được chỉnh pH về 5,8 và đem đi hồ hóa theo tỉ lệ gạo : nước là 1 : 1,2. Khi nấu xong sẽ được cơm tấm (với pH khoảng 5,5; độ ẩm khoảng 60%), đựơc tiến hành phân phối theo tỉ lệ môi trường thu như trên vào các hộp nhựa lớn với dung tích 1 lít chịu được nhiệt độ thanh trùng (khối lượng môi trường khoảng 100g). Sau đó được đem tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 30 phút, để nguội và bổ sung 10ml tỷ lệ giống cấy nấm men Rhodotorula sp đã hoạt hóa (tỷ lệ giống cấy lớn hơn 3.107CFU/ml). Nuôi nấm men ở điều kiện nhiệt độ phòng (28 -300C), trong thời gian 7 ngày. Mật độ tế bào nấm men sau thời gian 7 ngày nuôi cấy là 18,7.108CFU/g. Chúng tôi thu toàn bộ canh trường và đem đi sấy khô bằng nhiệt. Sau đó được đem đi nghiền bằng cối xay thu được chế phẩm bột canh trường nấm men Rhodotorula sp. Chương 5 KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ Qua thời gian thực tập tốt nghiệp với đề tài “Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn”. Chúng tôi tạm thời rút ra một số kết luận và đề nghị sau. 5.1 Kết luận · Thành phần môi trường nuôi cấy gồm có cơm tấm, lõi bắp, bã đậu nành, dầu ăn, khoáng theo tỉ lệ 90% : 10% : 1% : 1%. · Thời gian ngâm gạo là 24 giờ, pH = 2 trước khi tiến hành hồ hoá. · Điều kiện nuôi cấy tối ưu với các thông số ban đầu: pH = 5,5; Ẩm độ = 60%; mật độ cấy giống 3.107 CFU/g cơ chất. · Nuôi nấm men ở điều kiện nhiệt độ phòng (28 – 300C) với thời gian thu nhận là 7 ngày. · Sấy toàn bộ canh trường ở 45 - 500C trong 24 – 48 giờ sau đó đem đi nghiền bằng cối xay. 5.2 Kiến nghị Qua thời gian thực tập chúng tôi đã tiến hành khảo sát các điều kiện tối ưu để nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn về thành phần môi trường, thời gian và pH, tối ưu các thành phần môi trường. Tuy nhiên do thời gian có hạn nên chúng tôi chưa khảo sát được các điều kiện khác. Xin kiến nghị tiếp tục: · Khảo sát mật độ giống sản xuất. · Khảo sát bổ sung tỉ lệ bã đậu nành. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Phùng Tiến, (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật. [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, (2003), Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục. [3] Vương Thị Việt Hoa, Công nghệ lên men, Tài liệu học tập. [4] Tạ Đăng Khoa, (2008), Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn để thu nhận Betacaroten, Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG Tp.Hồ Chí Minh. [5] Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn (2001), Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, Trường ĐH Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh. [6] Nguyễn Đức Lượng, (2000), .Công nghệ vi sinh vật_ tập 1, Trường Đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh. [7] Nguyễn Đức Lượng, (2006), Cơ sở vi sinh vật công nghiệp_ tập 1, NXB Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chính Minh. [8] Nguyễn Đức Lượng – Phan Thị Huyền - Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học (tập 2) – Thí nghiệm vi sinh vật, NXB Đại học Bách Khoa Tp. HCM. [9] Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương, Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm _NXB Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. [10] Nguyễn Thị Minh Nguyệt, (2001), Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng tạo sinh khối từ rỉ đường mía của chủng nấm men phân lập từ lá hoa dâm bụt, Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG Tp.Hồ Chí Minh. [11] Tôn Nữ Minh Nguyệt (2001), Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp carotenoid của nấm men Rhodotorula, Luận văn thạc sĩ, Đại Học Bách Khoa ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh. [12] Lương Đức Phẩm, (2006), Nấm men công nghiệp, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật_Hà Nội. [13] Võ Viết Phi, (2005), Nghiên cứu thu nhận Glucoamylaza từ nấm mốc Asoegillus Kawasakii, Luận văn thạc sĩ, Đại Học Bách Khoa ĐHQG TpHCM. [14] Nguyễn Đình Thịnh, Nghiên cứu thu nhận sinh khối nấm men Rhodotorula trên môi trường bán rắn, tạo chế phẩm thức ăn cho gia cầm, Luận văn thạc sĩ, Đại Học Bách Khoa ĐHQG TpHCM. TÀI LIỆU TIẾNG ANH. [15] C.Malisorn, W. Suntornsuk, Optimization of b-carotene production by Rhodotorula glutinis DM28 in fermented radish brine, 2007, Bioresource Technology, Department of Microbiology, Faculty of Science, King Mongkut’s University of Technology Thonburi, Tungkru, Bangkok 10140, Thailand. [16] Joseph Hirschberg, Merav Cohen, Mark Harker, Tamar Lotan, Varda Mann and Iris Pecker, (1997), Molecular genetics of the carotenoid biosynthesis pathway in plants and algae. Pure and Appl. Chem, Britain, Vol. 69, No. 10, pp. 2151 – 2158. ĐỊA CHỈ WEBSITES [17] [18] [19] [20] [21] [22] PHỤ LỤC 1 DANH SÁCH CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG 1.1 MÔI TRƯỜNG GIỮ GIỐNG NẤM MEN 1.1.1 Môi trường thạch MRS Thành phần môi trường gồm có: Peptone 10g Bột Lab-Lemco 8g Bột chiết nấm men 4g Glucose 20g Sorbitan mono-oleate 1ml K2HPO4 2g Sodium acetate 3H2O 5g Triammonium sulphate 7H2O 2g Magnesium sulphate 7H2O 0,2g Magnesium sulphate 4H2O 0,05g Thạch 10g Nước cất vừa đủ 1 lít pH cuối 6,2 ± 0,2 1.1.2 Môi trường thạch Hansen Thành phần môi trường gồm có Glucose 50g K2HPO4 3g Peptone 10g MgSO4.7H2O 3g Agar 20g Nước cất vừa đủ 1 lit 1.2 MÔI TRƯỜNG HOẠT HOÁ NẤM MEN · Môi trường MRS broth (Man, Rogoso, Sharpe) - Pepton 10g - Cao nấm me 5g - Cao thịt 10g - Glucose 20g - Tween 80 10/00 - Amonium athate (NH4)3C6H5O7 2g - CH3COONa 5g - MgSO4 0,05g - MnSO4 0,05g - K2HPO4 2g - L-cysterin 0,5g - pH = 6,8 PHỤ LỤC 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÍ NGHIỆM 2.1 ĐẾM KHUẨN LẠC TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH 2.1.1 Nguyên tắc Phương pháp này cho phép xác định số tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu do các tế bào còn sống có khả năng phân chia tạo khuẩn lạc trên môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. 2.1.2 Phương pháp tiến hành Mẫu được pha loãng thành các nồng độ khác nhau. Chọn 2 hoặc 3 nồng độ pha loãng liên tiếp mà dự kiến chứa số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250 khuẩn lạc trễn mỗi đĩa môi trường. Mỗi bậc pha loãng hút ra thể tích khoảng 0,1ml đem trãi trên đĩa petri. Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ sau đó đem đếm số khuẩn lạc. Mật độ tế bào được tính theo công thức sau : C (CFU/ml) = C (CFU/ml) :số tê 1bào vi khuẩn trong 1ml mẫu N (CFU) : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa ni : số đĩa cấy ở nồng độ pha loãng thứ i Vi (ml) : thể tích mẫu cấy trong mỗi đĩa f1 : độ pha loãng thứ i % tế bào sống sót = N0 (CFU/ml) : mật độ tế bào ban đầu . 2.2 CÁCH XÁC ĐỊNH TRỰC TIẾP SỐ LƯỢNG TẾ BÀO BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU 2.2.1 Cách tiến hành Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào, nhỏ một giọt lên bề mặt buồng đếm kề với cạnh của lá kính nhờ một pipetman. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được điền bởi dịch huyền phù tế bào, còn các rảnh xung quanh thì không bị dính ướt. Dịch chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang. Khi đó, dịch nằm trong khoang có độ dày khoảng 0,1mm. Đặt buồng đếm lên bàn kính kính hiển vi. Điều chỉnh cường độ ánh sáng để có thể quan sát rõ rang các tế bào lẫn các đường kẻ. tùy thuộc vào số lượng tế bào mà có thể chọn các h đếm tất cả các tế bào có trong ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào có trong một số các ô vuông lớn đại diện. Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3-5 phút; phải đếm các tế bào nằm trên các đường kẻ nhưng không lặp lại khi chuyển qua đếm tế bào trên một ô kế cận. 2.2.2 Cách tính Thể tích dịch huyền phù chứa trên ô trung tâm (gồm 25 ô vuông lớn hay 400 ô vuông nhỏ) là 1 x 0,1=0,1mm3 ( vì diện tích tổng cộng của ô trung tâm là 1mm2). Tuy nhiên chỉ đếm số tế bào trên 5 ô vuông lớn đại diện cho 25 ô vuông lớn trên ô trung tâm. Khi đó số lượng tế bào trong một ml mẫu nước được tính theo công thức: N= [(a/b) * 400/0,1 * 103 * 10n] N: số lượng tế bào trong một ml mẫu nghiên cứu; a : số lượng tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ); b : số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn ( 16 x 5 = 80 ô vuông nhỏ); 400 : tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm ; 0,1 : thể tích dịch tế bào (tính bằng 1mm3 ) chứa trên ô trung tâm; 103 : số chuyển mm3 thành ml ( 1000 mm3 = 1 ml) 10n : độ pha loãng mẫu Lưu ý: Số tế bào đếm được trong 5 ô vuông lớn phải trên 200 mới đảm bảo được mức độ chính xác của phương pháp. 2.2.3 Thực nghiệm sử dụng buồng đếm hồng cầu để định lượng tế bào nấm men a. Vật liệu - Giống nấm men - Phiến kính và lá kính - Pipet Pasteur - Kính hiển vi - Buồng đếm hồng cầu b. Cách tiến hành - Lắc đều dịch tế bào nấm men và dùng pipet Pasteur để lấy một ít dịch cho vào khe ở mép giữa buồng đếm. Tránh tạo bọt khí. - Đặt buồng đếm vào bàn kính hiển vi và để yên vài phút. - Chỉnh kính hiển vi với vật kính x40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn ( 4 x 4 = 16 ô nhỏ). - Đếm số tế bào và tính toán theo công thức. 2.3 PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG: phương pháp cấy chuyền và bảo quản lạnh. · Nguyên tắc: dựa vào sự trao đổi chất theo một khoảng thời gian nhất định của VSV và dựa vào tác động của nhiệt độ thấp để làm giảm quá trình trao đổi chất và quá trình hô hấp của VSV. · Phương pháp thực hiện: trước khi bảo quản, tiến hành cấy chuyền giống VSV vào ống thạch nghiêng. Chuẩn bị môi trường dùng để giữ và nhân giống, sau đó phân môi trường vào khoảng 2/3 ống nghiệm. Sau khi hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, 1atm trong 20 phút, đặt nghiêng ống nghiệm. Chờ môi trường đông, nguội lại thì tiến hành cấy nấm mốc vào và nuôi ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 – 6 ngày. Một số ống sẽ dùng cho nghiên cứu và một số ống sẽ dùng cho bảo quản giống ở nhiệt độ lạnh khoảng 40C. Sau 1 tháng rưỡi chất dinh dưỡng trong ống nghiệm cạn kiệt thì lặp lại quy trình trên một lần. · Dán nhãn ghi Tên giống vi sinh vật Ngày cấy vào thành ống nghiệm, dưới nút bông một chút. · Tay trái cầm 2 ống nghiệm: 1 ống giống 1 ống môi trường · Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy. · Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống giống ra · Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm · Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống. · Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa ống vào môi trường để thực hiện các thao tác cấy truyền. · Khử trùng que cấy sau khi đã sử dụng xong · Chú ý: · Nếu ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipet hút canh trường thay que cấy. · Thao tác khử trùng ống hút bắt đầu thực hiện ở đầu nhỏ ống hút sau khi đã tháo giấy bao gói. · Sử dụng xong cắm ống hút vào dung dịch crômic để khử trùng. PHỤ LỤC 3 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH KHẢO SÁT Tế bào nấm men quan sát trên buồng đếm hồng cầu Cấy chuyền giữ giống trên môi trường thạch Hansen Giống nấm men hoạt hóa trong môi trường MRS broth Bã dừa sau khi vắt lấy nước cốt Bã đậu nành sau khi xay nhuyễn và sấy khô Lõi bắp sau khi được xay nhuyễn và sấy khô Gạo tấm nguyên liệu sau khi ngâm Gạo tấm sau khi hồ hoá và chuẩn bị phối trộn Canh trường đã được phối trộn các thành phần Canh trường sau khi tiệt trùng và chuẩn bị cấy giống Nấm men vào những ngày đầu và ngày cuối sinh beta-caroten Canh trường ở giai đoạn sấy khô Chế phẩm beta-caroten dạng bột mịn Chế phẩm beta-caroten đã đóng gói và dán nhãn PHỤ LỤC 4 CÁC BẢNG PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 4.1 CÁC BẢNG PHÂN TÍCH 4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường nuôi cấy bán rắn thích hợp 4.1.1.1 Bảng phân tích ANOVA ANOVA Table for Mat do te bao by Moi truong Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ------------------------------------------------------------------------- Between groups 7.80803 2 3.90402 14.76 0.0280 Within groups 0.79345 3 0.264483 ------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 8.60148 5 4.1.1.2 Bảng Trắc nghiệm LSD Multiple Range Tests for Mat do te bao by Moi truong ------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Moi truong Count Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- 1 2 4.36 X 3 2 4.76 X 2 2 6.955 X ------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *-2.595 1.63667 1 - 3 -0.4 1.63667 2 - 3 *2.195 1.63667 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và thời gian ngâm gạo 4.1.2.1 Bảng phân tích ANOVA Analysis of Variance for Mat do te bao - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:pH 4.81125 3 1.60375 9.30 0.0006 B:Thoi gian 15.1233 2 7.56167 43.84 0.0000 RESIDUAL 3.105 18 0.1725 ------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 23.0396 23 ------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. 4.1.2.2 Bảng Trắc nghiệm LSD Multiple Range Tests for Mat do te bao by pH ------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- 5 6 5.86667 X 4 6 6.33333 X 3 6 6.36667 X 2 6 7.11667 X ------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------------- 2 - 3 *0.75 0.503784 2 - 4 *0.783333 0.503784 2 - 5 *1.25 0.503784 3 - 4 0.0333333 0.503784 3 - 5 0.5 0.503784 4 - 5 0.466667 0.503784 ------------------------------------------------------------------------- · denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Mat do te bao by Thoi gian ------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- 30 8 5.7625 X 6 8 5.9625 X 24 8 7.5375 X ------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------------- 24 - 30 *1.775 0.43629 24 - 6 *1.575 0.43629 30 - 6 -0.2 0.43629 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 4.1.3. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy 4.1.3.1 Tối ưu tỉ lệ cơm tấm bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn a. Bảng phân tích ANOVA ANOVA Table for Mat do te bao by Ti le com tam Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ------------------------------------------------------------------------- Between groups 4.336 4 1.084 16.68 0.0043 Within groups 0.325 5 0.065 ------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 4.661 9 b. Bảng trắc nghiệm LSD Multiple Range Tests for Mat do te bao by Ti le com tam ------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Ti le com tam Count Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- 100 2 7.5 X 95 2 8.1 XX 80 2 8.7 XX 85 2 9.0 X 90 2 9.35 X ------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------------- 100 - 80 *-1.2 0.655374 100 - 85 *-1.5 0.655374 100 - 90 *-1.85 0.655374 100 - 95 -0.6 0.655374 80 - 85 -0.3 0.655374 80 - 90 -0.65 0.655374 80 - 95 0.6 0.655374 85 - 90 -0.35 0.655374 85 - 95 *0.9 0.655374 90 - 95 *1.25 0.655374 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Mat do te bao by Ti le com tam ------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Ti le com tam Count Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- 100 2 13.56 X 95 2 14.065 XX 80 2 14.605 XX 85 2 14.885 X 90 2 15.16 X ------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------------- 100 - 80 *-1.045 0.555092 100 - 85 *-1.325 0.555092 100 - 90 *-1.6 0.555092 100 - 95 -0.505 0.555092 80 - 85 -0.28 0.555092 80 - 90 -0.555 0.555092 80 - 95 0.54 0.555092 85 - 90 -0.275 0.555092 85 - 95 *0.82 0.555092 90 - 95 *1.095 0.555092 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 4.1.3.2 Tối ưu tỉ lệ lõi bắp bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn a. Bảng phân tích ANOVA ANOVA Table for Mat do ta bao by Ti le loi bap Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ------------------------------------------------------------------------- Between groups 38.885 3 12.9617 82.30 0.0005 Within groups 0.63 4 0.1575 ------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 39.515 7 b. Bảng trắc nghiệm LSD Multiple Range Tests for Mat do ta bao by Ti le loi bap ------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Ti le loi bap Count Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- 30 2 4.1 X 20 2 5.9 X 0 2 7.15 X 10 2 10.15 X ------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------------- 0 - 10 *-3.0 1.10187 0 - 20 *1.25 1.10187 0 - 30 *3.05 1.10187 10 - 20 *4.25 1.10187 10 - 30 *6.05 1.10187 20 - 30 *1.8 1.10187 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 4.2 CÁC BẢNG XỬ LÝ SỐ LIỆU 4.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường nuôi cấy bán rắn thích hợp Kết quả khảo sát môi trường lên men bán rắn Môi trường Mật độ tế bào (CFU/g) Log Trung bình 1 3,0. 108 3,82 1 4,1. 108 4,90 4,36 2 7,2. 108 6,86 2 7,6. 108 7,05 6,96 3 4,3. 108 5,07 3 3,6. 108 4,45 4,76 Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men theo ngày Thời điểm (Ngày) Môi trường 1 (CFU/g) Log Môi trường 2 (CFU/g) Log Môi trường 3 (CFU/g) Log 2 2,46. 108 3,13 3,23. 108 4,07 1,65. 108 1,74 4 2,92. 108 3,72 3,49. 108 4,34 1,99. 108 2,39 6 4,06. 108 4,87 7,62. 108 7,06 3,56. 108 4,41 8 3,39. 108 4,24 6,37. 108 6,43 2,85. 108 3,64 4.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và thời gian ngâm gạo Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và thời gian ngâm gạo STT pH nước ngâm Thời gian ngâm (Giờ) Mật độ tế bào nấm men (CFU/g) Log 1 2 6 6,8. 108 6,7 2 2 6 6,5. 108 6,5 3 2 24 12,5. 108 8,8 4 2 24 12,6. 108 8,8 5 2 30 5,6. 108 5,9 6 2 30 5,7. 108 6,0 7 3 6 5,5. 108 5,9 8 3 6 5,4. 108 5,8 9 3 24 8,9. 108 7,6 10 3 24 8,4. 108 7,4 11 3 30 5,2. 108 5,7 12 3 30 5,4. 108 5,8 13 4 6 5,3. 108 5,7 14 4 6 5,5. 108 6,0 15 4 24 8,4. 108 7,4 16 4 24 9,1. 108 7,7 17 4 30 5,1. 108 5,7 18 4 30 4,9. 108 5,5 19 5 6 5,2. 108 5,7 20 5 6 4,8. 108 5,4 21 5 24 5,8. 108 6,1 22 5 24 6,5. 108 6,5 23 5 30 5,5. 108 5,9 24 5 30 5,0. 108 5,6 Kết quả ảnh hưởng của pH ngâm gạo đến mật độ nấm men phát triển trong quá trình nuôi cấy pH nước ngâm Mật độ tế bào nấm men (CFU/g) Log 2 8,3. 108 7,4 3 6,5. 108 6,5 4 6,3. 108 6,4 5 5,5. 108 5,9 Kết quả ảnh hưởng của thời gian ngâm gạo đến mật độ tế bào nấm men phát triển trong quá trình nuôi cấy Thời gian ngâm (Giờ) Mật độ tế bào nấm men (CFU/g) Log 6 giờ 5,8. 108 6,1 24 giờ 9,0. 108 7,6 30 giờ 5,3. 108 5,8 4.2.3 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy 4.2.3.1 Tối ưu tỉ lệ cơm tấm bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa thành phần cơm STT Tỉ lệ cơm tấm (%) Mật độ tế bào nấm men (CFU/g) Log Trung bình 1 80 11,6. 108 8,5 2 80 12,9. 108 8,9 8,7 3 85 13,4. 108 9,0 4 85 13,5. 108 9,0 9,0 5 90 15,4. 108 9,5 6 90 14,0. 108 9,2 9,35 7 95 11,2. 108 8,4 8 95 9,5. 108 7,8 8,1 9 100 8,8. 108 7,6 10 100 8,5. 108 7,4 7,5 4.2.3.2 Tối ưu tỉ lệ lõi bắp bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa tỉ lệ lõi bắp STT Tỉ lệ lõi bắp (%) Mật độ tế bào nấm men (CFU/g) Log Trung bình 1 0 8,4. 108 7,4 2 0 7,2. 108 6,9 7,15 3 10 19,1. 108 10,2 4 10 18,5. 108 10,1 10,15 5 20 5,9. 108 6,2 6 20 5,0. 108 5,6 5,9 7 30 3,7. 108 4,5 8 30 2,9. 108 3,7 4,1