Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn bacillus subtilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  NGUYỄN DUY KHÁNH KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN DUY KHÁNH KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  EXAMINE CULTURE CONDITION AND SPORULATION OF Bacillus subtilis GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr.NGUYEN NGOC HAI NGUYEN DUY KHANH TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường. Em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hướng dẫn dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cám ơn TS. Lê Anh Phụng, BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Phòng vi sinh, Khoa Chăn nuôi – Thú Y đã cho phép và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại phòng. Tôi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 28 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sinh viên thực hiện Nguyễn Duy Khánh ii TÓM TẮT NGUYỄN DUY KHÁNH, ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis”. Hội đồng hướng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Việt nam là một nước nông nghiệp có nghành chăn nuôi rất phát triển và có đóng góp rất lớn vào sự phát triển kinh tế của đất nước. Vì vậy, vấn đề nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm và cải thiện môi trường chăn nuôi rất được quan tâm ở nước ta hiện nay. Xuất phát từ vấn đề này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtils, tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp và xử lí bào tử để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm cung cấp những thông tin để chọn lựa những điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, từ đó sản xuất chế phẩm sinh học cung cấp cho nghành chăn nuôi. Qua quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đã có những ghi nhận sau: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) thì chế độ nuôi cấy lắc cho số lượng vi khuẩn cao hơn. Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường khác nhau (TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men) thì môi trường TSB cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, 3 môi trường còn lại là những môi trường phù hợp cho Bacillus subtilis phát triển. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường (pH 7 và 7,5), thời gian (24,36 và 48 giờ) và nhiệt độ nuôi cấy (nhiệt độ phòng, 37oC) thì ở pH 7, thời gian 48 giờ và nhiệt độ nuôi cấy 37oC cho số lượng vi khuẩn lớn nhất. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (50, 70), pH (6, 9) và thời gian xử lí (3, 5 và 7 giờ) đến sự hình thành bào tử thì khi xử lí ở các nhiệt độ và pH này có sự ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis. iii MỤC LỤC Trang tựa Lời cảm tạ ........................................................................................................... i Tóm tắt ............................................................................................................... ii Mục lục ............................................................................................................. iii Danh sách chữ viết tắt ...................................................................................... iv Danh sách các hình ............................................................................................ v Danh sách các bảng .......................................................................................... vi Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................... 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu ........................................................................... 1 Phần 2. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2 2.1. Đại cương về vi khuẩn Bacilus subtilis ........................................... 2 2.1.1. Lịch sử phát triển .................................................................... 2 2.1.2. Đặc điểm phân loại ................................................................. 2 2.1.3. Đặc điểm phân bố ................................................................... 2 2.1.4. Đặc điểm hình thái .................................................................. 2 2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy ................................................................... 3 2.1.6. Đặc điểm sinh hoá ................................................................... 3 2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên ........................................................... 4 2.1.8. Tính chất đối kháng của B. subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh ....................................................................................... 4 2.2. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis............................................... 5 2.2.1. Khả năng sinh bào tử................................................................ 6 2.2.2. Cấu tạo của bào tử .................................................................... 7 2.2.3. Thành phần hoá học của bào tử ................................................ 8 2.2.4. Sự nảy mầm của bào tử ............................................................ 9 2.2.5. Sức đề kháng của bào tử .......................................................... 9 2.3. Hệ vi sinh vật đường ruột và sự loạn khuẩn ................................... 10 2.3.1. Hệ vi sinh vật đường ruột ....................................................... 10 2.3.2. Vai trò của hệ vi sinh vật đường ruột ...................................... 11 iv 2.3.3. Sự loạn khuẩn ......................................................................... 12 2.4. Giới thiệu chung về probiotic ......................................................... 13 2.4.1. Định nghĩa .............................................................................. 13 2.4.2. Chức năng sinh học của probiotic .......................................... 13 2.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis .............................................................. 14 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................ 16 3.2. Vật liệu thí nghiệm .......................................................................... 16 3.2.1. Giống vi khuẩn ....................................................................... 16 3.2.2. Môi trường nuôi cấy ............................................................... 16 3.2.3. Hoá chất .................................................................................. 16 3.2.4. Thiết bị và dụng cụ .................................................................. 16 3.3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 17 3.4. Phương pháp thực hiện đề tài ......................................................... 17 3.4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .................. 17 3.4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis ........................................ 17 3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn ............................. 17 3.4.2.2. Khảo sát môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối .................... 18 3.4.2.3. Khảo sát pH môi trường thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn Bacilus subtilis .......................................................... 19 3.4.3. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis ............................. 20 3.4.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................ 20 3.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ....................................................... 21 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 22 4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .................................... 22 4.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus sutilis .......................................... 22 v 4.1.2. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis ......................... 22 4.1.3. Quan sát dăc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trường canh23 4.1.4. Tính chất sinh hoá ........................................................................... 23 4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtíils ......................................................... 25 4.2.1. Khảo sát chế độ (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) và thời gian nuôi cấy thích hợp ................................................................................. 25 4.2.2. Khảo sát môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp .................... 27 4.2.3. Khảo sát pH môi trường nuôi cấy vi khuẩn thích hợp .................... 29 4.2.4. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis ..................................... 30 4.2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của Bacillus subtilis ......................................................................... 30 4.2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................... 32 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 34 5.1. Kết luận.................................................................................................... 34 5.2. Đề nghị .................................................................................................... 34 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................. 36 Phần 7. PHỤ LỤC ........................................................................................ 38 vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................. 3 Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử ........................................................................... 6 Hình 2.3. Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis ........................................................... 7 Hình 4.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần ..................................................................... 22 Hình 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis trên môi trường TSA ..... 23 Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trường thạch tinh bột ............. 23 Hình 4.4. Phản ứng lên men một số loại đường của vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................ 25 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hoá của Bacillus subtilis ..................................... 4 Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dưỡng của Bacillus subtilis 8 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 1 .......................................................................... 18 Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm 2 .......................................................................... 19 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm 3 .......................................................................... 20 Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm 4 .......................................................................... 21 Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm 5 .......................................................................... 21 Bảng 4.1. Ảnh hưởng của thời gian và chế độ nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................... 25 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................... 27 Bảng 43. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................................... 29 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................................... 30 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................................................... 32 viii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy và thời gian đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis.............................................................. 26 Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của thời gian và môi trường nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................. 28 Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................ 29 Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................ 31 Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................................... 33 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay, các loại chế phẩm sinh học từ vi sinh vật đã và đang được sử dụng ngày càng phổ biến. Đặc biệt là các chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Nước ta là một nước nông nghiệp, ngành chăn nuôi rất phát triển. Với mục đích tăng năng suất chất lượng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các loại hoá chất độc hại và đặc biệt là nhằm hạn chế dần việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, chế phẩm sinh học là một giải pháp tối ưu để thực hiện mục đích này. Vì vậy, các nhà chăn nuôi đã rất chú ý đến vấn đề sử dụng chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật sống có lợi, người ta chọn lọc các vi sinh vật có lợi có tính đối kháng cao để đưa vào đường ruột tạo sự cân bằng có lợi cho hệ vi sinh vật đường ruột, khôi phục lại hoạt động bình thường, ức chế vi sinh vật có hại cho vật nuôi. Ngoài ra, chế phẩm sinh học còn cải thiện lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hoá, cung cấp chất dinh dưỡng… Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis”. 1.2. Mục đích – Yêu cầu  Mục đích Tìm hiểu điều kiện: nhiệt độ, thời gian, pH, môi trường nuôi cấy thích hợp và nhiệt độ, pH xử lý bào tử để ứng dụng sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.  Yêu cầu  Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis: về hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn…  Tìm điều kiện: nhiệt độ, pH, môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp.  Tìm điều kiên: nhiệt độ, pH xử lý tạo bào tử. 2 Phần 2. TỔNG QUAN 2.1. Đại cƣơng về vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát triển Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các bệnh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc sử dụng để điều trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 - 1957 khi Henry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó, “subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi, y học, thực phẩm…. 2.1.2. Đặc điểm phân loại Theo khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 2.1.3. Đặc điểm phân bố Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước…. Phần lớn chúng tồn tại ở trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào sinh dưỡng Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996). 2.1.4. Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là vi khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,8 – 3 µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, 8 - 12 lông. Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm. 3 Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ…(Tô Minh Châu, 2000). Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis (www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba..._) 2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 37oC. Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi trường thiếu oxy. Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 – 7,4. Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 - 5mm. Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo màu hơi sẩm. Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn sóng. Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên. Dinh dưỡng cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác. 2.1.6. Đặc điểm sinh hoá Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose, arabinosse. Indol (-), nitrate (-), VP (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+). Dung huyết: một số dòng gây dung huyết ở dạng trên thạch máu ngựa và thỏ do tác động của hemolysine. 4 Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hoá của Bacillus subtilis Phản ứng sinh hoá Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh Indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử Nitrate + Tan chảy Gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) 2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L - acid glutamic. Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G-. Bệnh học: đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh. 2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả năng chịu đựng được acid dạ dày , các chất dịch tiêu hoá trong đường ruột. Chúng còn có khả năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột. 5  Với các vi sinh vật gây bệnh Môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh trạnh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế.  Với đồng loại Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đông”, hay nghỉ ngơi trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đó bằng cách tạo ra bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỉ. Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus đã tạo ra kháng sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ. Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng lượng, phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ cố gắng tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt. Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt những kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Công Dung, 2004). 2.2. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩn vượt qua những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không thích hợp, môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi…. Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm để trở về dạng tế bào sinh dưỡng. 6 2.2.1. Sự hình thành bào tử Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ, nhiệt độ…) (Tô Minh Châu, 2000). Quá trình hình thành bào tử gồm các bước 1. Hình thành vách ngăn. 2. Sự tạo tiền bào tử. 3. Tạo lớp vỏ bào tử. 4. Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử. 5. Sự giải phóng bào tử. Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc và tạo thành tiền bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải và bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước và bị trương ra. Sau đó vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004). 7 2.2.2.Cấu tạo của bào tử Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hoá học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới. Phía ngoài của nguyên sinh chất được bao bọc bởi nhiều lớp màng. Hình 2.3. Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, rất mỏng nhưng không thấm nước, cấu tạo chủ yếu là lipoprotein. Dưới lớp màng là vỏ, vỏ bào tử có nhiều lớp, bề mặt của các lớp này xù xì, thành phần hoá học là protein và có sự tham gia của keratin đây là những lớp có khả năng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước, chúng có tác dụng tăng cường khả năng bảo vệ bào tử trước các điều kiện bất lợi. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương. 2004). Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học, tính chất sinh lí. 8 Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dƣỡng của B. subtilis Đặc tính Tế bào sinh dưỡng Bào tử Cấu trúc Tế bào G+, điển hình Vỏ bào tử dày, khó thấm nước Thành phần hoá học Canxi Thấp Cao Protein Thấp hơn Cao hơn Hoạt tính enzyme Cao Thấp Đặc tính chịu nhiệt Yếu Cao Đặc tính chịu bức xạ Kém Mạnh Đặc tính chịu các chất hoá học và acid Yếu Cao Khả năng bắt màu chất nhuộm Dễ nhuộm Phải sử dụng phương pháp đặc biệt 2.2.3. Thành phần hoá học của bào tử Các lớp bao và màng của bào tử có cấu tạo cơ bản là protein có chứa nhiều glyxin, tyroxin và đặc biệt là cystein, ngoài ra còn có sự tham gia của keratin. Nguyên sinh chất của bào tử có chứa nhiễm sắc thể, ribosome và enzyme chuyển hoá ở trạng thái không hoạt động. Khi bào tử nảy mầm thì những enzyme này bắt đầu hoạt động. Bào tử có chứa một lượng lớn canxi, magie và acid dipicolinic. Acid này chiếm từ 5- 12% khối lượng khô của bào tử (acid này không bao giờ có trong tế bào sinh dưỡng, nó được hình thành trong quá trình hình thành bào tử và mất đi khi nảy mầm). Lượng nước trong bào tử rất thấp và tồn tại ở dạng liên kết. 2.2.4. Sự nảy mầm của bào tử (Nguyễn Lân Dũng và các cộng sự, 1998) Quá trình chuyển bào tử từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình này gồm 3 giai đoạn: hoạt hoá, nảy mầm và sinh trưởng: 9  Hoạt hoá Sau khi cho bào tử Bacillus subtilis tồn tại ở trạng thái nghỉ 7 ngày, ta xử lí ở 60 oC trong 5 phút có thể xúc tiến quá trình nảy mầm. Sau khi xử lí nhiệt, ta chuyển vào môi trường nuôi cấy thích hợp.. Có một số hoá chất đặc biệt có thể xúc tiến quá trình nảy mầm của bào tử. Ví dụ: L-alanine, Mn 2+, chất hoạt động bề mặt, glucose,…. Cũng có những chất lại có tác dụng ức chế quá trình nảy mầm: D-alanine, natri bicarbonate…  Nảy mầm Protein có chứa nhiều cystein trong áo bào tử hoá xốp lên làm tăng tính thấm, xúc tiến sự hoạt động của enzyme protease. Khi đó lượng protein trong bào tử áo giảm xuống. Các cation bên ngoài co thể xâm nhập vào lớp vỏ bào tử và làm trương lớp vỏ bào tử lên, sau đó làm tan ra và tiêu đi. Khi đó, nước bên ngoài sẽ xâm nhập vào lớp lõi của bào tử, làm cho lõi trương to lên, các loại enzyme bắt đầu được hoạt hoá, bắt đầu quá trình tổng hợp thành tế bào. Trong quá trình nảy mầm các đặc tính chịu nhiệt, tính chiết quang…bắt đầu giảm dần; lượng dipicolinate-canxi, acid amin, polipeptide dần dần mất đi; bắt đầu việc tổng hợp DNA, RNA và protein trong vỏ bào tử. Bào tử chuyển thành tế bào sinh dưỡng. Khi nảy mầm, bào tử có thể đâm ra theo phía cực hoặc đâm ngang. Lúc đó thành tế bào còn rất mỏng và chưa hoàn chỉnh, do đó nâng cao khả năng tiếp nhận thêm DNA ngoại lai để thực hiện quá trình biến nạp. 2.2.5. Sức đề kháng của bào tử Bào tử có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hoá học như: nhiệt độ, tia cực tím, áp suất và chất sát trùng. Sỡ dĩ bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do các yếu tố sau:  Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ.  Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2+ và acid dipicolinic, protein của bào tử kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính chất ổn định cao đối với nhiệt độ.  Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài. 10  Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm cho các chất hoá học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử. 2.3. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột và sự loạn khuẩn 2.3.1.Hệ vi sinh vật đƣờng ruột Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1987), ở ruột và dạ dày động vật khi mới sinh ra hoàn toàn không có vi khuẩn, sau vài giờ từ khi chúng sinh ra mới thấy có sự xuất hiện của một vài vi khuẩn và từ đó chúng bắt đầu sinh sản dần. Sau đó một vài vi khuẩn khác sẽ theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hoá, sống và sinh sôi nảy nở ở đó, chúng sẽ biến đổi ít nhiều nhưng cơ bản chúng vẫn tồn tại cho đến khi con vật chết. Thành phần, số lượng của vi sinh vật đường tiêu hoá phụ thuộc vào tuổi tác của gia súc, cách nuôi dưỡng, chăm sóc…ngoài ra còn có các điều kiện vật lí, hoá học của môi trường đường tiêu hóa. Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1970) và nhiều tác giả khác, có thể chia hệ vi sinh vật đường tiêu hoá ra làm 2 nhóm:  Nhóm vi sinh vật tuỳ nghi Một số những vi sinh vật này là những vi sinh vật có hại, chúng thay đổi theo điều kiện thức ăn, môi trường, đường tiêu hoá, khả năng đề kháng của cơ thể…như: Samonella, Klebsiella, E. coli, Clostridium, Shigella, Staphylococus…. Đa số chúng thích nghi với môi trường pH trung tính đến kiềm. Dưới những điều kiện môi trường thích hợp chúng phát triển, sản sinh độc tố xâm nhập phá vỡ tế bào đường ruột, gây tổn thương thành đường ruột nguy hại cho gia súc gia cầm.  Nhóm vi sinh vật bắt buộc Đây là những vi sinh vật chịu được độ pH thấp, chúng phát triển tốt trong đường ruột của gia súc, gia cầm và định cư vĩnh viễn ở đó. Đa số chúng có thể giúp cơ thể động vật tiêu hoá thức ăn tốt hơn nhờ vào hệ thống enzyme của chúng và giúp cơ thể phòng chống một số bệnh do vi sinh vật cơ hội gây ra. Nhóm vi sinh vật bắt buộc gồm có:  Vi khuẩn: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Streptococus lactic (hiện nay gọi là Lactococus lactis), Bacillus subtilis, Bifidobacterium, Cellulosemonas…  Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bouladii… 11  Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor spp…  Protozoa: Entodinium, Diploinium… Ngoài ra, người ta cũng chia hệ vi sinh vật đường ruột ra làm 3 nhóm dựa vào số lượng của chúng có trong đường ruột như  Nhóm hệ phổ chính: chiếm tổng số trên 90% số lượng vi sinh vật đường ruột như: Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacterioides…  Nhóm hệ phổ vệ tinh chiếm dưới 10% bao gồm: nấm men, Clostridium, Proteus, Samonella…  Nhóm tuỳ nghi: chiếm 0,1% gồm: Clostridium, Samonella… (Tô Minh Châu, 2000) Hai nhóm vi sinh vật trên luôn ở trạng thái cân bằng động và cũng là điều kiện cần thiết bảo đảm cho sức khoẻ vật chủ. Cũng có thể hai nhóm vi khuẩn khác nhau tranh chấp cùng một chất dinh dưỡng có khối lượng rất ít trong ống tiêu hoá. Vi khuẩn nào đồng hoá chất dinh dưỡng này tốt thì sẽ loại trừ vi khuẩn kia. Một số vi khuẩn có thể làm thay đổi một số đặc điểm lí hoá của hệ thống tiêu hoá như: độ pH, tiềm năng oxy hoá khử, nồng độ các chất chuyển hoá làm cho một số vi sinh vật khác phát triển hoặc không phát triển được (Nguyễn Kiều Uyên Vi, 2004). 2.3.2. Vai trò của hệ vi sinh vật đƣờng ruột Giúp cho quá trình tiêu hoá tốt hơn nhờ vào hệ enzyme. Đa số các vi khuẩn có lợi trong đường ruột tham gia vào quá trình tiêu hoá, phân giải tinh bột, đường, đạm và chất xơ thành những sản phẩm dễ hấp thu hơn. Nhóm này gồm những vi sinh vật sinh một số enzyme có khả năng phân huỷ các chất trên: amylase, protease, glucanase, cellulase… gồm các vi khuẩn Lactic, Bacillus subtilis, Isotrichs, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… Theo Nguyễn Thị Vân Hương (1990), bổ sung chế phẩm Saccharomyces boulardii vào khẩu phần gà thịt làm giảm được hệ số chuyển biến thức ăn trên 1 kg tăng trọng, làm tăng sức kháng bệnh của gà làm giảm tỉ lệ chết, từ đó góp phần làm tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. Đối với thú trưởng thành tiêu hoá chủ yếu nhờ enzyme thì sự xuất hiện của vi sinh vật sản sinh enzyme cũng giúp thú tiêu hoá thức ăn tốt hơn. So với enzyme tổng 12 hợp, nguồn enzyme của các vi sinh vật tương đối lí tưởng, do có nhiều ưu điểm hơn so với các nguồn từ động vật và thực vật như:  Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất nhanh.  Nguồn nguyên liệu dễ nuôi cấy, dễ kiếm và rẻ tiền.  Các enzyme của vi sinh vật có hoạt tính cao. Ngoài ra, có thể điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuôi cấy để đạt được hiệu quả cao trong sản xuất (Trần Thị Minh Chiến, 2002). 2.3.3. Sự loạn khuẩn Từ loạn khuẩn được Nissle đưa ra vào năm 1916. Ông cho rằng các vi khuẩn có trong ruột người và gia súc luôn ở thế quân bình để đảm bảo cho sự tiêu hoá bình thường của vật chủ. Thế quân bình này dựa vào 2 cơ chế: (1) Cùng tranh giành chất dinh dưỡng nào đó cần cho sự sinh trưởng của chúng. (2) Chúng có thể tiết ra chất có tính kháng đối với các vi khuẩn khác.  Các nguyên nhân gây loạn khuẩn: Theo Tô Minh Châu (2004) thì có 3 nguyên nhân:  Do kháng sinh có phổ rộng lâu ngày làm mất đi sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột.  Do yếu tố ngoại cảnh: thức ăn kém phẩm chất, thú bị stress, thay đổi thời tiết, vệ sinh kém…  Do yếu tố sinh lý của thú con: Sức đề kháng của cơ thể còn yếu…  Cơ chế của hiện tƣợng loạn khuẩn Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1977), khi cơ thể khoẻ mạnh, hai nhóm vi sinh vật bắt buộc và tuỳ nghi luôn ở thế cân bằng có lợi nhờ cơ chế cạnh tranh sinh học. Khi một trong hai hệ này mất cân bằng thì dễ gây ra sự rối loạn hệ vi khuẩn đường ruột. Thông thường, hệ vi khuẩn tuỳ nghi lấn át hệ vi khuẩn bắt buộc. Dưới tác động của một vài điều kiện bất lợi nào đó, làm cho sức đề kháng của cơ thể giảm hoặc do dùng kháng sinh lâu ngày, trúng độc…làm cho hệ vi sinh vật đường ruột bị thay đổi về số lượng, về các dòng vi khuẩn cũng như vị trí cư trú của chúng. Từ đó, gây giảm độ tiêu hoá, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối hoạt động, gây ra quá trình thối rửa, phân giải các chất trong ruột sinh ra khí CO2, H2S, CH4… Những 13 chất này sẽ phá huỷ các phản ứng bình thường trong dạ dày, ruột phá hoại quá trình tạo men của thức ăn, gây ra những phản ứng trên ống tiêu hoá như: biểu mô niêm mạc bị phồng lên, rộp ra và tróc đi tạo điều kiện cho thuận lợi cho sự xâm nhập của những vi khuẩn gây hại. Do đó để ổn định hệ vi sinh vật có lợi, đồng thời giúp cho vật nuôi sớm trở lại trạng thái ban đầu thì việc bổ sung chế phẩm vi sinh vật có lợi cho đường ruột là một vấn đề rất thiết thực cần được quan tâm. 2.4. Giới thiệu chung về probiotic 2.4.1. Định nghĩa Thuật ngữ probiotic được đưa ra lần đầu tiên bởi Lilly và Stillwel (1965) để mô tả những yếu tố kích thích sinh trưởng được sản sinh bởi vi sinh vật. Probiotic được bắt nguồn từ nguồn gốc Hy Lạp với nghĩa “ tiền sự sống” (prolife) Năm 1989, Fuller định nghĩa probiotic như là thức ăn bổ sung vi sinh vật sống có tác động có lợi đến động vật chủ thông qua cải tiến cân bằng vi sinh vật của nó. Năm 1992, Havenar và cộng sự chỉ ra rằng định nghĩa probiotic của Fuller bị hạn chế ở những thức ăn bổ sung cho động vật qua đường ruột. Ông mở rộng định nghĩa probiotic của Fuller như là một lứa cấy đơn hoặc hỗn hợp các vi sinh vật sống mà chúng có ảnh hưởng có lợi đối với vật chủ bằng cách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật bản xứ. 2.4.2.Chức năng sinh học của probiotic  Trung hoà độc tố, khử độc và phân huỷ một số thuốc có độc tính cao.  Kích thích hệ thống miễn dịch.  Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột  Làm tăng thức ăn ăn vào và làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme  Tổng hợp vitamine nhóm B và K ở manh tràng. 2.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis  Trong y học và chăn nuôi Trong kháng chiến chống Pháp Bacillus subtilis được các giáo sư Đặng Đức Trạch, Hoàng Thuỷ Nguyên (là các bác sĩ quân y) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis để đưa ra chiến trường nhằm giải quyết dịch tiêu chảy. 14 Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa vi khuẩn Bacillus subtilis chủng IB 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng ống và viên nang. Năm 1962,Guy Albot phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn, trộn thêm với các vi khuẩn lên men lactic khác chữa loạn khuẩn đường ruột rất hiệu quả. 1958 - 1960 bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm Bacillus subtilis dùng trị bệnh đường ruột. Khoa vệ sinh y học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dùng điều trị bệnh tiêu chảy ở người. Viện bào chế Pharimex Tp.HCM, Viện Pasteur Nha Trang đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis. 1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyên Văn Hùng đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dạng viên nuôi cấy trên môi trường đậu tương, cua đồng…hấp thu bằng tinh bột tan. Chế phẩm này dùng cho heo uống từ 0,5 - 1g/kg thể trọng. Kết quả heo sau khi sử dụng chế phẩm Bacillus subtilis tăng trọng nhanh. 1982 Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm coli_subtly (Escherichia coli và Bacillus subtilis) làm giảm tái phát do bệnh tiêu chảy gây ra ở lợn so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt. Nghiên cứu của Baker, Braude và Kon (1925), Hauser (1957) khi bổ sung kháng sinh liều lượng thấp vào thức ăn thú nhận thấy: acid folic, acid patothenic, vitamin A, vitamin B12 tích tụ trong gan cao. Ngoài ra Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic…  Trong nông nghiệp Chế phẩm Bacillus subtilis được dùng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoetonia solani, Fusarium sp, Pyriculariaoryaze… và trong bảo vệ nông sản sau thu hoạch. Trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất thuộc bộ công nghiệp nặng Tp.HCM, đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bactophyl từ Bacillus subtilis để phòng trừ các loại nấm gây bệnh trên rau cải. 15 Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình Trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis để phòng trừ nấm gây bệnh ở bắp Ostrinia furnacalis. 1940 Norio Kimura Yokohamo đã sử dụng chế phẩm Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergilus flavus, Aspergillus paraciticus. Roman và các cộng sự đã nghiên cứu B. subtilis (ATCC_6633, ATCC_9372) làm giảm đi 40 - 50% aflatoxin trong dịch chứa aflatoxin trong vòng 20 ngày. 16 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện tại Phòng Vi sinh – Khoa Chăn nuôi Thú Y - Trường đại học Nông Lâm Tp.HCM. Thời gian thực hiện: từ 3/2006 đến 7/2006. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Giống vi khuẩn Giống vi khuẩn Bacillus subtilis được cung cấp từ phòng vi sinh khoa Chăn nuôi Thú y trường đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. 3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy  Môi trường giữ giống, đếm số lượng tế bào: TSA (Trypticase Soya Agar).  Môi trường khảo sát đặc điểm sinh học: TSB (Tripticase Soya Broth), Simmon Citrate, môi trường lên men các loại đường…  Các môi trường đều đươc vô trùng trước khi sử dụng. 3.2.3. Hoá chất  Hoá chất cơ bản: NaOH 1N, HCl 1%, NaCl,…  Hoá chất dùng khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn: dầu soi, xylen,…  Thuốc thử Kowac’s, Methyl-Red, …  Thuốc nhuộm Gram:  Thuốc nhuộm bào tử. 3.2.4. Thiết bị và dụng cụ  Thiết bị Kính hiển vi, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp autoclave, tủ lạnh, cân điện tử, nồi cách thuỷ, microwave…  Dụng cụ Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, lame, đũa thuỷ tinh, pipette, ống Durham, đầu tip vô trùng… 17 3.3. Nội dung nghiên cứu  Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis: hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn, tính chất nuôi cấy trên một số môi trường, thử đặc tính sinh hoá.  So sánh phương pháp đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa và phương pháp đếm trên kính hiển vi.  Ảnh hưởng của hình thức và thời gian nuôi cấy đến số lượng tế bào vi khuẩn.  Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến số lượng tế bào vi khuẩn. 3.4. Phƣơng pháp thực hiện đề tài 3.4.1.Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis  Quan sát đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis Vi khuẩn Bacillus subtilis được nuôi trong môi trường thạch nghiêng TSA . Sau 24 giờ đem nhuộm Gram và xem dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần (Xem phương pháp nhuộm Gram ở phần phụ lục).  Quan sát đặc điểm nhóm của Bacillus subtilis Phân phối 15ml môi trường TSA đã được hấp tiệt trùng vào đĩa petri vô trùng rồi để nguội. Hoà vi khuẩn vào nước muối sinh lí đã được hấp tiệt trùng, lấy 10 dịch pha loãng trang lên môi trường để tạo khuẩn lạc đơn của vi khuẩn Bacillus subtilis. Sau đó, gói đĩa petri và ủ ỏ nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Quan sát đặc điểm nuôi cấy của Bacillus subtilis trong môi trƣờng canh Môi trường TSB được phân phối 4 - 5 ml vào ống nghiệm vô trùng, đem hấp tiệt trùng và làm nguội. Cấy giống vi khuẩn vào môi trường và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Sau đó quan sát và xem sự thay đổi của môi trường nuôi cấy. 3.4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis 3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) và thời gian nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn  Nguyên tắc Khi nuôi cấy vi sinh vật trong cùng một loại môi trường nhưng khác nhau về thời gian và chế độ nuôi cấy (Nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc) thì cho lượng sinh khối khác nhau.  Mục đích Xác định số lượng vi khuẩn ở thời gian và chế độ nuôi cấy nào là phù hợp. 18 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 1 Thời gian Môi trường Nuôi cấy tĩnh Nuôi cấy lắc 24h 36h 48h  Cách làm Cấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 - 5 ml môi trường TSB đã được hấp tiệt trùng (121oC/15 phút), đem đi ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó, cấy vi khuẩn từ ống nghiệm vào bình tam giác chứa 50ml môi trường TSB với tỉ lệ 2%, nuôi cấy trong 2 chế độ khác nhau: nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc (lắc 15 phút, nghỉ 45 phút) ở điều kiện 37oC. Kiểm tra số lượng vi khuẩn sau thời gian 24, 36, 48 giờ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ khảo sát trên chúng tôi chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtiis thích hợp để tiếp tục khảo sát thi nghiệm tiếp theo. 3.4.2.2. Khảo sát môi trƣờng và thời gian nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối  Nguyên tắc Khi nuôi cấy vi khuẩn trong các loại môi trường khác nhau ở điều kiện nuôi cấy giống nhau (pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy) thì số lượng vi khuẩn sẽ khác nhau.  Mục đích Xác định môi trường nuôi cấy nào là thích hợp.  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml môi trường TSB, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. 19 Sau đó, chuyển vi khuẩn từ ống nghiệm vào 4 loại môi trường khác nhau: TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men (với tỉ lệ 2%). Sau đó đem nuôi cấy ở chế độ đã được chọn ra từ thí nghiệm 1, đếm số lượng vi khuẩn sau 24, 36, 48 giờ nuôi cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ khảo sát trên chúng tôi chọn được loại môi trường nuôi cấy thích hợp để tiếp tục khảo sát thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm 2 Thời gian (giờ) Môi trường TSB TSB+1%Glucose TSB + 1%Cao nấm men TSB + 1%Glucose + 1%Cao nấm men 24 36 48 3.4.2.3. Khảo sát pH, môi trƣờng thích hợp nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis  Nguyên tắc Mỗi loại vi khuẩn thích hợp với một độ pH khác nhau, vì vậy khi nuôi cấy vi khuẩn trong cùng một loại môi trường nhưng ở các độ pH khác nhau thì số lượng vi khuẩn phát triển sau cùng một khoảng thời gian là khác nhau. Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm 4 Thời gian (giờ) pH 7,0 7,5 Nhiệt độ phòng 37oC Nhiệt độ phòng 37oC 24 36 48 20  Mục đích Xác định pH môi trường nuôi cấy thích hợp.  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 -5 ml môi trường TSB, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Sau đó, chuyển vi khuẩn từ ống nghiệm vào môi trường được chọn từ thí nghiệm 2 ở các pH khác nhau với tỉ lệ 2% và nuôi cấy ở chế độ nuôi cấy (1). Sau 48 giờ đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ thí nghiệm chúng tôi chọn ra pH môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp. 3.4.3. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis 3.4.3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ông giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml môi trường TSB, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Sau đó, chuyển vi khuẩn vào môi trường đã được chọn từ các thí nghiệm trên. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp chúng tôi xử lí nhiệt độ. Xử lí ở 50oC và 70oC, đếm số lượng bào tử hình thành sau 3, 5, 7 giờ xử bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (xem phần phụ lục) Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm 4 Thời gian (giờ) Nhiệt độ 50 o C 70 o C 3 5 7 21 3.4.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml môi trường TSB, ủ ở 37 o C trong 24 giờ. Sau đó, chuyển vi khuẩn vào môi trường đã được chọn từ các thí nghiệm trên. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp chúng tôi xử lí pH. Đếm số lượng bào tử hình thành sau 3, 5, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm 5 Thời gian (giờ) pH 6 9 3 5 7 22 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 4.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus sutilis Sau khi tiêu bản vi khuẩn được nhuộm Gram và được quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy vi khuẩn Bacillus subtilis là :  Trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn và nhỏ.  Kích thước từ 0,5 - 0,8 µm x 1,5 -3 µm, hai đầu tròn, đôi khi nối thành chuỗi dài, có tạo bào tử không làm phình tế bào. Hình 4.1. Tế bào vi khuẩn B. subtilis dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần : www.answers.com/ topic/bacillus-1 4.1.2. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis Vi khuẩn được cấy trên môi trường TSA, sau 24 giờ cho thấy hình dạng của khuẩn lạc: khuẩn lạc khô, có màu xám nhạt trắng, tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm, bám chặt vào môi trường thạch. Hình 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis trên môi trƣờng TSA 23 4.1.3. Quan sát dăc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trƣờng canh Sau khi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis vào môi trường canh TSB, đem ủ ở 37oC:  Sau 12 giờ thì vi khuẩn làm đục môi trường.  Nuôi cấy đến 24 giờ thì thấy vi khuẩn tạo váng trển bề mặt của môi trường và làm cho môi trường ở phía dưới trong hơn. 4.1.3. Tính chất sinh hoá Bảng 4.1. Các phản ứng sinh hoá khác của Bacillus subtilis Thử nghiệm Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh Indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử Nitrate + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + Ghi chú: (-) là kết quả âm tính (+) là kết quả dương tính Qua bảng cho thấy kết quả khảo sát của chúng tôi phù hợp với tính chất sinh hoá của Bacillus subtilis (Nguyễn Vĩnh Phước, 1976). Ngoài ra chung tôi còn khảo sát thấy được rằng Bacillus subtilis có khả năng sử dụng các chất như: glucose, citrate, hợp chất chứa nitrogen và có khả năng di động. Tuy nhiên, Bacillus subtilis lại không có enzyme tryptophase để phân giải tryptophan tạo Indol. 24 Hình 4.4. Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn Bacillus subtilis  Khả năng phân giải tinh bột Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng sử dụng tinh bột bằng cách đo đường kính vòng phân giải trên môi trường thạch tinh bột (Starch agar) và thu được kết quả đường kính vòng phân giải trung bình là 2,9 cm. Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trƣờng thạch tinh bột. 4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis 4.2.1. Khảo sát chế độ (nuôi cấy tĩnh, lắc) và thời gian nuôi cấy thích hợp Chúng tôi tiến hành:  Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường TSB ở hai chế độ nuôi cấy khác nhau: nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ).  Đếm số lượng vi khuẩn ở 3 thời điểm: 24giờ, 36giờ, 48 giờ bằng phương pháp đỗ đĩa (thí nghiệm được lặp lại 2 lần). Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. 25 Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian và chế độ nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Thời gian (giờ) Chế độ nuôi cấy Nuôi cấy lắc Nuôi cấy tĩnh 12 10,15 8,79 18 11,07 9,92 24 11,16 9,95 X 10,79 9,55 (Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit) 0 2 4 6 8 10 12 12 18 24 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (tính theo logarit) Nuôi cấy lắc Nuôi cấy tĩnh Biểu đồ 4.1 Ảnh hƣởng của chế độ và thời gian nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn B. subtilis Qua kết quả ở bảng 4.1 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh khuẩn ở chế độ nuôi cấy lắc là 10,79 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,17.1010) cao hơn so với số lượng vi khuẩn trung bình ở chế độ nuôi cấy tĩnh 9,55 (giá trị logarit) (số thực tế là 35,48.108). Kết quả xử lí thống kê cho thấy rằng có sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa hai chế độ nuôi cấy tĩnh và lắc, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (với P<0,05). Điều này có nghĩa là khi nuôi cấy lắc thì lượng oxy và chất dinh dưỡng sẽ phân bố đồng đều hơn trong môi trường giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh hơn khi 26 nuôi cấy tĩnh (vì Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nên khi cung cấp nhiều oxy hơn thì chúng sinh sản và phát triển mạnh hơn). Kết quả xử lí thống kê cũng cho thấy rằng có sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuôi cấy (12 giờ, 18 giờ và 24 giờ) (với P<0,05). Qua bảng kết quả, khi nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis sau 24 giờ ở chế độ nuôi cấy lắc thì cho số lượng tế bào vi khuẩn là 11,16 (giá trị logarit) cao hơn ở các mức thời gian 12 giờ, 18 giờ (10,15; 11,07). Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chế độ nuôi cấy lắc để khảo sát số lương vi khuẩn trong các loại môi trường nuôi cấy khác nhau ở thí nghiệm tiếp theo. 4.2.2. Khảo sát môi trƣờng và