Khảo sát hệ vi sinh vật và đánh giá mức độ an toàn vi sinh trong bia

h leân men Leân men laø moät trong hai quaù trình cô baûn trong saûn xuaát bia. Noù laø quaù trình chuyeån hoùa caùc loaïi ñöôøng coù trong dòch ñöôøng thaønh röôïu etanol, cacbonic vaø moät soá saûn phaåm phuï khaùc döôùi taùc duïng cuûa enzym trong naám men. Quaù trình leân men laø quaù trình bieán ñoåi caû veà soá löôïng vaø chaát löôïng caùc thaønh phaåm cuûa dòch ñöôøng ñeå taïo thaønh moät chaát hoaøn toaøn khaùc maø ngöôøi ta goïi laø bia. Quaù trình leân men bia chia laøm hai giai ñoaïn: leân men chính vaø leân men phuï. 2.5.3.7 Leân men chính Laø quaù trình nhaèm chuyeån hoùa caùc chaát hoøa tan trong dòch ñöôøng thaønh C2H5OH, CO2 vaø caùc saûn phaåm phu khaùc. Trong quaù trình leân men chính, naám men sinh tröôûng maïnh, neân caàn cung caáp ñuû oxy cho naám men sinh tröôûng. Trong quaù trình naøy, löôïng CO2 sinh ra nhieàu laøm taêng aùp suaát trong taêng nhanh choùng, do ñoù caàn coù bieän phaùp thu hoài CO2 nhanh choùng, ñeå ñaûm baûo an toaøn vaø coù CO2 söû duïng trong hai giai ñoaïn sau. Quaù trình leân men chính goàm coù boán giai ñoaïn. ÔÛ giai ñoaïn thöù ba, sau khi leân men hai ñeán ba ngaøy, quaù trình leân men dieãn ra maïnh meõ nhaát haøm löôïng chaát hoøa tan trong dòch len men giaûm töø 2,5 – 3,0% moãi ngaøy, nhieät ñoï taêng raát nhanh do ñoù phaûi thöôøng xuyeân kieåm tra vaø khoùng cheá nhieät ñoä döôùi 10oC. Keát thuùc quaù trình leân men chính, haøm löôïng CO2 gaàn nhö baèng khoâng. Ñeán ñaây saûn bia thu ñöôïc goïi laø bia non. Khi ñoä ñöôøng cuûa dòch leân men nhoû hôn hoaëc baèng 4o Plato laø coù theå chuyeån bia non sang giai ñoaïn leân men phuï (Hoà Söôûng, 1992). Thôøi gian leân men chính thöôøng keùo daøi töø naêm ñeán baûy ngaøy. 2.5.3.8 Leân men phuï Muïc ñích cuûa quaù trình naøy laø tieáp tuïc leân men phaàm chaát khoâ coøn laïi sau khi leân men chính (khoaûng 1%), giuùp baõo hoøa CO2 taïo boït cho bia, taêng cöôøng vaø oån ñònh muøi vò, ñoä trong cho bia, giuùp loaïi boû caùc hôïp chaát aûnh höôûng xaáu ñeán chaát löôïng bia nhö: diaxetyl, axetandehyt… Quaù trình leân men phuï coøn giuùp oån ñònh bia thoâng qua quaù trình keát tuûa laïnh caùc phöùc chaát protein – tanin. Quaù trình leân men phuï ñöôïc tieán haønh nhö sau: bia non sau khi leân men chính ñöôïc haï xuoáng nhieät ñoä 5 – 7oC trong voøng 48 giôø, sau ñoù giaûm tieáp veà 1 – 2oC. Trong quaù trình laøm laïnh teá baøo phaàn naám men laéng xuoáng ñaùy thuøng leân men ñöôïc laáy ra ñeå xöû lí. Thôøi gian leân men phuï vaø toàn tröõ laø 3 – 6 tuaàn. Trong quaù trình leân men phuï caàn chuù yù khi chuyeån bia non sang thuøng leân men kín, khoâng ñöôïc ñeå bia non tieáp xuùc vôùi khoâng khí. Neáu oxy xaâm nhaäp vaøo bia ôû giai ñoaïn naøy seõ gaây ra caùc phaûn öùng oxy hoùa (chaát maøu, polyphenol, axit amin, etanol…) laøm cho maøu, muøi vò bia bò aûnh höôûng xaáu. Oxy coøn laø taùc nhaân gaây neân oxy hoùa etanol taïo ra axetaldehyt, oxy hoùa methanol taïo ra fomandehyt laø nhöõng hôïp chaát gaây ñau ñaàu cho ngöôøi uoáng. Thôøi gian leân men phuï vaø uû chín bia raát quan troïng. Ñaây laø giai ñoaïn laøm cho muøi cuûa naám men töôi vaø vò ñaéng cuûa hoa houblon bieán maát, haøm löôïng diaxetyl giaûm ñöôïc 50%... Neáu ruùt ngaén giai ñoaïn naøy thì khoâng ñaûm baûo ñöôïc caùc tieâu chuaån veà muøi vò, ñoä beàn vaø giaù trò sinh hoïc cuûa bia. Neáu caùc quaù trình tröôùc dieãn ra khoâng thuaän lôïi khieán ñoä beàn cuûa bia khoâng ñaït yeâu caàu, thì ngay trong giai ñoaïn leân men phuï vaø giai ñoaïn uû bia phaûi co nhöõng bieän phaùp xöû lí kòp thôøi. Trong quaù trình leân men phuï vaø uû bia nhieàu loaïi hôïp chaát ñaõ ñöôïc chuyeån hoùa. Caùc hôïp chaát naøy neáu toàn taïi nhieàu trong bia seõ gaây aûnh höôûng ñeán muøi vò, caûm quan vaø giaù trò sinh hoïc cuûa bia. Diaxetyl laø hôïp chaát coù aûnh höôûng lôùn nhaát ñeán höông vò bia. Vai troø cuûa giai ñoaïn leân men phuï vaø uû bia laøm giaûm ñöôïc löôïng diaxetyl caøng nhieàu caøng toát. Hôïp chaát löu huyønh laø nhöõng hôïp chaát gaây neân vò xaáu vaø ñöôïc coi nhö laø nhöõng chaát chuû yeáu gaây ra vò chöa chín cuûa bia sau khi leân men. Theo Nguyeãn Thò Hieàn, 2007, caùc hôïp chaát coù chöùa nitô coù trong dòch ñöôøng trong quaù trình saûn sinh cuûa naám men. Baûng 2.8 Moät soá loaïi diaxetyl coù trong bia (P.S.Hughes vaø E.D.Baxter, 2001) Hôïp chaát diaxetyl Haøm löôïng trong bia (mg/l)Ngöôõng gaây muøi (mg/l)Muøi 2,3 – Butanedion0,01 – 0,400,07 – 0,15OÂi bô3 –Hydroxy – 2 – butanol1,00 – 10,00 17,00 Traùi caây moác, muøi goã2,3 – Butanediol50,00 – 150,004500,00Cao su2,3 – Pentanediol0,01 – 0,150,90OÂi bô, traùi caây3 – Hydroxy – 2 – pentanol0,05 – 0,070,90OÂi bô, traùi caây Andehyt cuõng laø moät trong nhöõng hôïp chaát coù aûnh höôûng lôùn ñeán muøi vò cuûa bia. Trong nhoùm naøy coù axetandehytñöôïc chuù yù nhaát. Noù khoâng nhöõng laø hôïp chaát gaây aûnh höôûng xaáu ñeán muøi vò maø coøn laø hôïp chaát chính gaây ñau ñaàu khi uoáng bia. Caùc thao taùc trong luùc chuyeån bia töø leân men leân chính sang leân men phuï, trong caùc coâng ñoaïn vaän chuyeån dòch, ly taâm, laøm laïnh coù theå gaây ra söï oxy hoùa bia, laøm chuyeån etanol sang axetandehyt (Nguyeãn Thò Hieàn, 2007). Moät soá hôïp chaùt andehyt coù trong bia ñöôïc chæ ra ôû baûng 2.9. Moät soá hôïp chaát khaùc xuaát hieän trong quaù trình leâm men phuï vaø toàn tröõ axit beùo maïch ngaén, caùc axit amin, photphat, axit nucleic, peptide, polyphenol… cuõng gaây nhöõng aûnh höôûng nhaát ñònh ñeùn chaát löôïng bia. Baûng 2.9 Moät soá hôïp chaát andehyt coù trong bia (P.S.Hughes vaø E.D.Baxter, 2001) Hôïp chaát andehyt Haøm löôïng trong bia (mg/l)Ngöôõng gaây muøi (mg/l)NguoànMuøiAxetandehyt 2 – Methylpropanan Hexanan Trans – 2 – Hexenan Nonanan Trans – 2 – Nonanan Fufuran2,000 – 20,000 0,020 – 0,500 0,003 – 0,070 0,005 – 0,010 0,001 – 0,011 1x10-5 – 2x10-3 0.010 – 1,0000,08 – 0,80 0,02 – 0,50 0,01 – 0,02 0,01 – 0,02 0,06 – 0,60 0,09 – 18,00 0,00 1 2 3 3 3 3 4Coû töôi, sôn Chuoái chanh Chaùt cuûa röôïu vang Chaùt vaø se Se vaø chaùt Muøi giaáy cacton Giaáy vaø voû khoâ * Nguoàn sinh ra: 1-Oxy hoùa caùc röôïu baäc thaáp. 2-Töø hoa houblon. 3-Oxy hoùa axit beùo. 4-Saûn phaåm cuûa phaûn öùng maillard. 2.5.3.9 Hoaøn thieän saûn phaåm 1. Loïc trong Coù hai phöông phaùp ñeå laøm trong bia laø loïc vaø ly taâm. Trong thöïc teá saûn xuaát thöôøng duøng caùch loïc coù boä trôï loïc diatomit. Nguyeân taéc cuûa quaù trình loïc laø bia vaø diatomot ñöôïc khuaáy troän thaønh huyeàn phuø, sau ñoù huyeàn phuø ñöôïc bôm quay voøng qua maùy loïc nhieàu laàn ñeå taïo maøng treân löôùi loïc. Sau khi ñaõ taïo ñöôïc maøng loïc thì bia seõ ñöôïc loïc qua lôùp diatomit naøy. Bia luùc ñaàu coøn ñuïc neân phaûi bôm hoài löu laïi, hoài löu lieân tuïc ñeán khi naøo bia trong thì cho vaøo TBF. Muïc ñích cuûa quaù trình loïc trong laø taïo ñoä trong “laáp laùnh” cho bia, loaïi boû ñaùng keå caùc vi sinh vaät bao goàm naám men coøn toàn taïi trong quaù trình taøn tröõ, loaïi boû caùc phöùc chaát protein, caùc haït daïng keo polyphenol, polysaccharide vaø protein ít tan, laøm cho bia trôû neân oån ñònh. Beân caïnh ñoù, moät löôïng ñaùng keå vitamin cuõng bò maát ñi trong quaù trình loïc trong. 2. Baõo hoøa CO2 Trong thöïc teá saûn xuaát, ít khi CO2 ñöôïc baõo hoøa theo phöông phaùp töï nhieân laïi ñaït ñeán noàng ñoä caàn thieát. Vì vaäy caàn phaûi coù coâng ñoaïn baõo hoøa CO2 cho bia. Bia ñöôïc cacbonic hoùa ôû nhieàu thôøi ñieåm khaùc nhau nhö sau leân men chính, sau leân men phuï vaø thôøi gian taøn tröõ. Nhöng phoå bieán nhaát laø sau khi loïc vaø tröôùc luùc chieát chai. 3. Chieát bia Muïc ñích cuûa quaù trình chieát bia laøm taêng thôøi gian baûo quaûn cho bia, oån ñòh chaát löôïng vaø muøi vò ñaëc tröng cuûa bia trong quaù trình vaän chuyeån. Bia ñöôïc chieát theo nguyeân taéc ñaúng aùp trong heä thoáng tuaàn hoaøn kín ñeå oån ñònh chaát löôïng bia. Trong quaù trình chieát bia phaûi giöõ traïng thaùi oån ñònh, haïn cheá thaáp nhaát söï xaùo troän bia ñeå traùnh gaây traøo bia vaø toån thaát CO2, giaûm thieåu söï xaâm nhaäp O2 vaø vi sinh vaät vaøo trong bia. Chai vaø boác phaûi veä sinh saïch tröôùc khi chieát. Giai ñoaïn naøy coù aûnh höôûng khaù nhieàu ñeán chaát löôïng bia. Neáu khoâng ñaûm baûo veä sinh seõ laøm cho bia bò nhieãm vi sinh vaät. Moät soá vi sinh vaät seõ aûnh höôûng ñeán giaù trò caûm quan, laøm thay ñoåi hoùa lí cuûa bia. Trong ñoù coù moät soá vi khuaån lactic coù theå tieác ra enzym decaboxylaza khöû tyrosin thaønh tyramin, laø hôïp chaát gaây ñau ñaàu cho ngöôøi uoáng. Ngoaøi ra, neáu trong quaù trình naøy oxy xaâm nhaäp vaøo bia nhieàu seõ gaây oxy hoùa etanol sinh ra axetandehyt, nguyeân nhaân chính gaây ñau ñaàu trong bia. 4.Thanh truøng bia Trong bia thaønh phaåm, saûn xuaát theo caùc phöông phaùp thoâng thöôøng luoân luoân chöùa caùc teá baøo coøn soáng, bao goàm naám men thuaàn chuûng vaø caùc vi sinh vaät laï khaùc. Moät soá vi sinh vaät ngoaïi lai nhö vi khuaån axetic, moät soá naám sôïi, vi khuaån thuoäc nhoùm E.coli vaø nhieàu loaïi khaùc khoâng theå phaùt trieån ñöôïc trong bia. Nguyeân nhaân laø vì trong ñoù khoâng coù oxy, laïi coù haøm löôïng ethanol ñaùng keå, caùc chaát ñaéng vaø pH cuõng töông ñoái thaáp. Naám men keå caû naám men gioáng vaø moät soá loaøi naám men daïi, vi khuaån lactic thuoäc nhoùm Sarcina vaø moät soá khaùc deã daøng phaùt trieån trong bia. Xöû lí nhieät laø moät trong nhöõng giaûi phaùp quan troïng nhaát ñeå dieät vi sinh vaät. Noäi dung naøy ñöôïc chia laøm hai caáp: tieät truøng vaø thanh truøng. Tieät truøng laø naâng nhieät ñoä leân ñeán 100 – 120oC, coøn thanh truøng chæ ôû 60 – 80oC. Thôøi gian caàn thieát ñeå dieät caùc teá baøo vi sinh vaät phuï thuoäc vaøo nhieät ñoä. Khaû naêng chòu nhieät cuûa caùc loaøi vi sinh vaät khaùc nhau cuõng khaùc nhau, vaø khaû naêng ñoù dao ñoäng trong khoaûng khaù roäng. Ngoaïi tröø moät soá,coøn ña soá naám men ñeàu bò dieät ôû nhieät ñoä 62 – 63oC trong voøng 2 phuùt, ôû nhieät ñoä ñoù, phaûi keùo daøi tôùi 15 – 20 phuùt nhieàu loaïi vi khuaån môùi bò tieâu dieät. Coøn vi khuaån chòu nhieät thì vôùi thôøi gian ñoù maø ôû nhieät ñoä 100oC chuùng vaãn khoâng cheát. Baøo töû cuûa naám men vaø naám moác keùm chòu nhieät hôn so vôùi baøo töû cuûa vi khuaån. Chuùng bò dieät ôû 80oC, coøn baøo töû cuûa vi khuaån , nhieàu tröôøng hôïp phaûi ôû nhieät ñoä 120oC trong 30 phuùt may ra môùi tieâu dieät ñöôïc chuùng. Thanh truøng bia seõ daãn ñeán söï thay ñoåi baát lôïi cho höông, vò vaø maøu saéc cuûa saûn phaåm. Ngay sau khi thanh truøng, nhöõng söï thay ñoåi ñoù raát khoù nhaän ra, nhöng sau moät thôøi gian baûo quaûn thì chuùng môùi loä roõ. Moät trong nhöõng nguyeân nhaân daãn ñeán söï thay ñoåi ñoù laø söï taïo thaønh melanoid. Coù hai phöông phaùp thanh truøng bia: thanh truøng caû khoái vaø thanh truøng trong bao bì. Thanh truøng caû khoái laïi coù hai phöông aùn: chieát chai ôû nhieät ñoä cao vaø chieát chai sau khi laøm laïnh. Trong caû hai phöông aùn naøy thì thieát bò trao ñoåi nhieät thoâng duïng nhaát vaãn laø maùy taám baûn. 2.6 Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán chaát löôïng bia 2.6.1 Loaïi naám men Chæ tieâu naøy aûnh höôûng ñeán caùc thoâng soá cuûa quaù trình coâng ngheä vaø ñeán höông vò cuûa saûn phaåm cuoái cuøng do khaû naêng keát boâng, laéng vaø khaû naêng soáng cuûa naám men. Chuûng naám men ñöôïc löïa choïn phaûi coù tính oån ñònh veà caùc ñaëc tröng treân. 2.6.2 Taêng tröôûng cuûa naám men Vaän toác leân men phuï thuoäc vaøo chaát löôïng cuûa naám men, vaøo nhieät ñoä vaø vaøo noàng ñoä ban ñaàu cuûa dòch ñöôøng. Taêng tröôûng cuûa naám men phuï thuoäc vaøo caùc yeáu toá sau: - Tyû leä men gioáng vöøa phaûi. - Caáy gioáng caøng sôùm caøng toát. - Söï phaân boá ñoàng ñeàu cuûa naám men trong dòch. - Khaû naêng sinh tröôûng cöïc ñaïi cuûa naám men. - Nhieät ñoä leân men vaø thoâng khí thích hôïp. 2.6.3 Löôïng naám men Caáy vaøo trong dòch khoaûng 10 – 18 trieäu teá baøo/ml dòch. Noàng ñoä bia caøng cao, tyû leä naám men caáy ban ñaàu caøng phaûi lôùn ñeå duy tì thôøi gian leân men. 2.6.4 Nhieät ñoä nuoâi caáy Nhieät ñoä phaûi naèm trong khoaûng 7 – 10oC ñeå ñaûm baûo quaù trình leân men baét ñaàu nhanh, tuy nhieân khoâng quaù nhanh. Quaù trình leân men khoâng ñöôïc baét ñaàu tröôùc khi meû dòch cuoái cuøng ñöa vaøo tank leân men. Seõ xuaát hieän khoù khaên neáu thôøi gian ñieàn ñaày dòch vaøo moät thieát bò leân men lôùn hôn 24h. 2.6.5 Thoâng khí Trong thieát bò leân men ñang ñöôïc ñieàn ñaày baèng caùc meû dòch lieân tieáp, caàn phaûi giaûm quaù trình thoâng khí. Neáu moät tank leân men nhaän ñöôïc 5 – 6 meû trong 24h, trong hai meû ñaàu caàn phaûi giaûm thoâng khí. Neáu quaù trình ñieàn ñaày dòch trong tank leân men coù theå tích lôùn bò keùo daøi seõ daãn ñeán giaûm söï hình thaønh caùc este vaø taêng söï hình thaønh caùc röôïu baäc cao, axetaldehyt vaø diaxetyl 2.6.6 Taêng tröôûng cuûa naám men Neáu trong quaù trình leân men, naám men phaùt trieån gaáp 3 laàn veà soá löôïng thì ñöôïc coi laø bình thöôøng, hai phaàn seõ ñöôïc laáy ra ñeå caáy vaøo caùc meû leân men sau, moät phaàn ñöôïc giöõ laïi trong quaù trình laøm chín bia. Naám men taêng tröôûng caøng nhieàu, söï hình thaønh röôïu baäc cao caøng taêng trong khi söï hình thaønh este laïi giaûm 2.6.7 Nhieät ñoä leân men Nhieät ñoä leân men caøng cao (khoaûng 10 – 25oC) cöôøng ñoä leân men caøng nhanh vaø löôïng este, diaxetyl hình thaønh caøng taêng. 2.6.8 Aûnh höôûng cuûa aùp suaát Söû duïng aùp suaát trong quaù trình leân men (0,3 – 0,7 bar) seõ laøm taêng söï hoøa tan CO2 nhöng laïi laøm giaûm taêng tröôûng naám men. Vì vaäy aûnh höôûng cuûa aùp suaát ñeán quaù trình leân men ngöôïc laïi so vôùi aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán quaù trình leân men. Noù chæ ñöôïc söû duïng trong phaàn lôùn caùc phöông phaùp leân men gia toác 2.6.9 Nhieät ñoä cuûa quaù trình leân men phuï Nhieät ñoä trong khi laøm chín bia coù theå laøm taêng leân baèng caùch giaûm diaxetyl ôû nhieät ñoä cao: 3 ngaøy 12oC vaø 1 ngaøy ôû 20oC nhöng seõ daãn ñeán nguy cô töï phaân. Quaù trình laøm chín bia coù theå thöïc hieän ôû 5 – 8oC ñaëc bieät ñoái vôùi naám men khoâng keát laéng. Bia ñöôïc giaûm töø leân men chính ñeán nhieät ñoä leân men phuï trong 24 – 36h. Nhieät ñoä naøy ñöôïc giöõ trong 5 – 8 ngaøy cho ñeán khi diaxetyl ñöôïc khöû hoaøn toaøn (< 0,1 mg/l). Caùc hôïp chaát khoâng mong muoán khaùc nhö axetaldehyt, H2S vaø mercaptan ñöôïc khöû trong quaù trình naøy 2.7 Heä vi sinh vaät trong bia 2.7.1 Vi sinh vaät gaây hö hoûng bia Bia laø moâi tröôøng ngheøo dinh döôõng, khoâng phaûi laø moâi tröôøng thuaän lôïi cho söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät. Noàng ñoä ethanol trong bia thöôøng laø 4 – 5%. Bia coù ñoä pH töø 3,8 – 4,7 thaáp hôn ñoä pH thích hôïp cho söï taêng tröôûng cuûa vi sinh vaät. Hôn nöõa, noàng ñoä CO2 cao vaø noàng ñoä O2 raát thaáp laøm cho bia gaàn nhö kî khí. Bia cuõng chöùa nhöõng hôïp chaát ñaéng cuûa hoa houblon (khoaûng 17 – 55ppm cuûa iso-α-acid) laø chaát ñoäc ñoái vôùi caùc vi khuaån Gram döông. Noàng ñoä chaát dinh döôõng chaúng haïn nhö saccharide, acid amin… raát thaáp vì haàu heát ñaõ ñöôïc tieâu thuï bôûi naám men trong quaù trình leân men. Vì vaäy, chæ coù moät soá loaøi vi khuaån coù theå phaùt trieån ñöôïc trong moâi tröôøng bia vaø coù theå laøm hö hoûng bia (xem baûng ), trong ñoù bao goàm caû loaøi vi khuaån Gram döông vaø vi khuaån Gram aâm. Vi khuaån Gram döông haàu heát ñeàu thuoäc nhoùm vi khuaån Lactic, ñöôïc xem laø nhoùm vi khuaån gaây haïi nhaát cho ngaønh coâng nghieäp saûn xuaát bia vaø nguyeân chính cuûa caùc söï coá gaây hö hoûng bia. Hieän nay, caùc loaøi vi khuaån hieáu khí khoâng phaûi laø moät vaán ñeà nghieâm troïng trong hö hoûng bia töø khi noàng ñoä O2 ñöôïc giaûm maïnh. Thay vaøo ñoù laø caùc vi khuaån kò khí: Pectinatus.spp. vaø Megasphaera cerevisiae gaây aûnh höôûng nghieâm troïng ñoái vôøi ngaønh coâng nghieäp saûn xuaát bia. 2.7.1.1 Vi khuaån gram (+) Haàu heát caùc vi khuaån Gram döông gaây hö hoûng bia thuoäc nhoùm vi khuaån lactic, nhöng chæ coù moät vaøi chuûng vi khuaån lactic laø taùc nhaân gaây hö hoûng bia: Lactobacillus vaø Pediococcus. Chuùng laø vi khuaån gram (+), khoâng sinh baøo töû, phaûn öùng aâm tính trong kieåm tra coù xuùc taùc (10% H2O2 taïo ra laøm suûi boït moâi tröôøng) a. Lactobacillus Hoï Lactobacillus laø hoï lôùn nhaát trong hoï vi khuaån lactic vôùi raát nhieàu loaøi. Chuùng ñöôïc söû duïng roäng raõi trong caùc quaù trình leân men khaùc nhau bao goàm caùc saûn phaåm thöïc phaåm nhö röôïu vang, bia, yoghurt vaø döa chua. Chuùng coù daïng hình que vôùi kích thöôùc 1,0 x (2 - 20)μm. Caùc vi khuaån chòu axit naøy bò öùc cheá bôûi noøng ñoä O2 thaáp va noàng ñoä CO2 cao. Quaù trình sinh tröôûng ñöôïc kích thích khi coù maët khí CO2, sinh tröôûng maïnh nhaát ôû 30oC. Quaù trình chuyeån hoùa cuûa vi sinh vaät coù theå leân men ñoàng hình, saûn phaåm cuoái cuøng taïo ra laø axit lactic Traùi vôùi yù kieán tin raèng taát caû caùc chuûng Lactobacillus ñeàu coù theå taêng tröôûng trong bia nhöõng moät soá baùo caùo chæ ra raèng chæ coù moät soá loaøi coù khaû naêng laøm bia hö hoûng. L.brevis laø loaøi gaây hö hoûng bia ñöôïc phaùt hieän thaáy nhieàu ôû trong bia vaø nhaø maùy bia, hôn moät nöûa söï coá laø do vi khuaån loaøi naøy gaây ra, phaùt trieån toái öu ôû nhieät ñoä 30oC, ñoä pH töø 4 – 6 vaø thöôøng khaùng vôùi hôïp chaát ñaéng cuûa hoa houblon. Ñieàu quan troïng thöù hai vi khuaån gaây hö hoûng trong bia, L.lindneri chieám 15 – 25% caùc vi khuaån gaây hö hoûng bia. Sinh lyù hoïc töông töï nhö L.brevis vaø gaàn ñaây ñöôïc coâng nhaän nhö moät loaøi rieâng bieät thuoäc hoï Lactobacillius. Khaû naêng choáng caùc hôïp chaát ñaéng raát cao, phaùt trieån toái öu ôû nhieät ñoä 19 – 23oC chòu nhieät hôn so vôùi caùc vi khuaån Latic khaùc. Moïi chuûng L.lindneri ñeàu coù khaû naêng gaây hö hoûng bia. L.lindneri phaùt trieån chaäm treân caùc moâi tröôøng thöôøng duøng, nhöng phaùt trieån raát nhanh trong bia laø moái nguy haïi cho caùc nhaø saûn xuaát bia. L. buchneri, L. casei, L. coryneformic, L. curvatus vaø L. plantarum ít phoå bieán hôn so vôùi hai loaøi moâ taû treân. L. buchneri töông töï nhö L.brevis nhöng khaùc ôû khaû naêng leân men melezitose, moät soá chuûng L. buchneri caàn coù riboflavin trong quaù trình taêng tröôûng cuûa chuùng. L. casei coù theå saûn sinh ra diacetyl gaây cho bia coù höông vò oâi bô gaây khoù chòu cho ngöôøi tieâu duøng. Ngöôõng giaù trò cuûa diacetyl trong bia thaáp hôn nhieàu (0,15 ppm) so vôùi acid lactic (300 ppm). Diacetyl cuõng ñöôïc saûn xuaát bôûi naám men trong quaù trình leân men vaø seõ ñöôïc saûn sinh ra nhieàu hôn neáu naám men daïi khoâng ñöôïc loaïi boû sau khi leân men chính. L. brevisimilis, L. malefermentans, L. parabuchneri, L. collinoides vaø L. paracasei subsp. Paracasei cuõng ñöôïc baùo caùo laø loaøi vi khuaån laøm hö hoûng bia. b. Pediococcus Pediococci laø vi khuaån leân men ñoàng hình coù theå taêng tröôûng thaønh töøng caëp hoaëc theo töøng cuïm boán teá baøo. Chuùng caàn coù vitamin ñeå sinh tröôûng hoaëc kích thích sinh tröôûng vaø nhieät ñoä toái öu laø khoaûng 25oC. Trong bia, cuoái quaù trình leân men vaø trong quaù trình baûo quaûn thì nhieãm taïp Pediococcus phoå bieán hôn so vôùi nhieãm taïp Lactobacillus. Ñaëc bieät chuùng laøm hoûng bia ôû nhieät ñoä thaáp. Keát quaû chuû yeáu laø taïo ra diaxetyl. Pediococcus coù theå ñöôïc phaân laäp treâm moâi tröôøng cuûa Lactobacillus. UÛ ôû 25oC trong ñieàu kieän yeám khí nhö caùc vi khuaån Gram(+)khaùc bò nhieãm nhieàu laàn laøm cho bia chua, vò oâi bô. Chuùng ñöôïc tìm thaáy ôû nhieàu giai ñoaïn trong quaù trình saûn xuaát bia. Moät soá Pediococci spp ñaõ ñöôïc tìm thaáy taïi caùc nhaø maùy bia: P. acidilactici, P. damnosus, P. dextrinicus, P. halophilus (gaàn ñaây ñöôïc phaân loaïi laø Tetragenococcus halophilus), P. inolinatus, P. parvulus vaø P. pentosaceus. Trong soá ñoù P. damnosus phoå bieán nhaát. Caùc tyû leä hö hoûng bia bôûi Pediococci ñaõ giaûm nhieàu laø keát quaû cuûa vieäc caûi thieän ñieàu kieän veä sinh trong nhaø maùy bia. P. damnosus thöôøng khaùng caùc hôïp chaát cuûa hoa houblon. Ñieàu thuù vò laø P. damnosus thöôøng ñöôïc tìm thaáy trong bia saûn phaåm vaø len men phuï. Ngöôïc laïi, P. inolinatus thöôøng xuaát hieän trong naám men nhöng hieám thaáy trong caùc giai ñoaïn leân men. P. dextrinicus, P. inolinatus phaùt trieån ôû pH treân 4,2, noàng ñoä ethanol thaáp vaø caùc hôïp chaát cuûa hoa houblon. P. acidilactici, P. pentosaceus chöa bao giôø ñöôïc baùo caùo laø gaây ra baát kì khieám khuyeát naøo trong bia thaønh phaåm. Soá löôïng diacetyl saûn xuaát bôûi loaøi pediococcus thay ñoåi tuøy töøng loaøi vôùi caùc loaøi P. damnosus saûn xuaát soá löôïng lôùn diacetyl, P. inolinatus vaø P. pentosaceus ít hôn( khoâng coù gì caû). Do ñoù caùc nhaø saûn xuaát thöôøng chuù yù ñeán P. damnosus. c. Caùc vi khuaån Gram döông khaùc Ngoaøi Pediococcus thuoäc hoï Lactobacillus, moät loaøi töø hoï Micrococcus thænh thoaûng cuõng gaây ra hö hoûng cho bia, coù theå phaùt trieån trong bia vôùi pH coù giaù trò treân 4,5, noàng ñoä ethanol vaø noàng ñoä caùc hôïp chaát ñaéng trong hoa houblon thaáp. Micrococcus cuõng coù theå phaùt trieån trong ñieàu kieän kò khí, noù taïo ra moät muøi höông traùi caây khoâng ñieån hình trong bia Vi khuaån gram aâm Moät soá hoï cuûa caùc vi khuaån Gram aâm ñöôïc bieát laø coù lieân quan ñeán söï hö hoûng cuûa bia. Söï hieän dieän cuûa maøng kò nöôùc ngoaøi laøm Gram aâm vi khuaån thöôøng khaùng vôùi caùc hôïp chaát ñaéng cuûa hoa houblon. Caùc söï coá hö hoûng trong bia do vi khuaån ñaõ ñöôïc giaåm ñaùng keå do löôïng O2 thaáp hôn nhieàu trong caùc quaù trình leân men vaø trong bia thaønh phaåm cuûa caùc nhaø maùy bia hieän ñaïi. Thay vaøo ñoù, söï xuaát hieän cuûa caùc vi khuaån kò khí trong caùc söï coá hö hoûng bia ñaõ taêng leân. Chuùng bao goàm caùc hoï Pectinatus, Megaspahera, Selenomonas, Zymomonas vaø Zymophilus. Ñaëc bieät Pectinatus vaø Megaspahera gaây ra nhieàu vaán ñeà nghieâm troïng cho caùc nhaø maùy bia hôn Lactobacilli vaø Pediococci, chuû yeáu laø gaây ra muøi tröùng thoái trong bia thaønh phaåm. a. Pectinatus Pectinatus .spp laø moät trong nhöõng vi khuaån gaây hö hoûng bia nguy hieåm nhaát. Chuùng ñoùng vai troø lôùn trong 2 – 3% söï coá hö hoûng bia do vi khuaån, chuû yeáu ôû bia hôi. Caùc moâi tröôøng soáng töï nhieân cuûa caùc loaøi Pectinatus vaãn coøn chöa bieát. Tröïc khuaån Gram (-), hôi cong, chuyeån ñoäng, troøn xoe ôû moät ñaàu hoaëc hai ñaàu. Teá baøo tröôûng thaønh raát linh hoaït vaø coù hình chöõ “X” laø do söï chuyeån ñoäng cuûa chuùng. Teá baøo giaø ñi chuyeån theo kieáu gioáng con raén. Kích thöôùc teá baøo laø (0,7 – 0,9) x (2,0 - 32)μm. Tieân mao nhoâ ra töø moät vò trí treân teá baøo. Ñöôïc xem laø trung gian giöõa vi khuaån Gram döông vaø vi khuaån Gram aâm. Nhieät ñoä taêng tröôûng töø 15 – 40oC vôùi nhieät ñoä toái öu 32oC, pH töø 3,5 – 6 vôùi pH toái öu 4,5. Acid propionic vaø acetic ñöôïc saûn xuaát nhieàu trong quaù trình taêng tröôûng cuõng nhö succinic, acid lactic vaø acetol. Pectinatus .spp cuõng coù theå leân men acid lactic. Tính naêng ñaëc tröng nhaát cuûa hö hoûng bia gaây ra bôûi Pectinatus .spp raát phong phuù: ñoä ñuïc, coù muøi tröùng thoái mang theo söï keát hôïp cuûa caùc acid beùo, hydro sulfua vaø mecaptan methyl. Hoaït ñoäng naøy gaây ra hö hoûng vaø thieät haïi nghieâm troïng cho caùc nhaø maùy bia. b. Megasphaera Megasphaera laø caàu khuaån Gram (-), baát ñoäng vaø yeám khí baét buoäc, khoâng sinh baøo töû, monofile, mesophilic caàu khuaån xaûy ra ñôn leû hoaëc theo töøng caëp vaø ñoâi khi nhö caùc chuoãi ngaén. Hoï naøy goàm hai loaøi: M. elsdenic vaø M. cerevisiae. M. cerevisiae phaùt trieån ôû 15 – 37oC, toái öu ôû nhieät ñoä 28oC vaø ôû giaù trò pH treân 4,1. Söï taêng tröôûng cuûa loaøi naøy bò öùc cheá ôû noàng ñoä ethanol 2,8 (w/v) nhöng vaãn coù theå leân ñeán 5,5(w/v). Söï hö hoûng bia laø do taïo ra moät löôïng ñaùng keå axit butyric vaø moät löôïng nhoû axit caproic. Megasphaera coù theå phaùt trieån ôû ñieàu kieän yeám khí trong moâi tröôøng bia ñöôïc laøm giaøu bôûi glucose vaø pepton (caùc peptit ñeõ tieâu hoùa trong thòt). Daáu hieäu bia hoûng gioáng nhö Pectinatus, saûn sinh ra hydro sunfua gaây ra muøi khoù chòu trong bia, laø moät trong nhöõng vi sinh vaät ñaùng sôï nhaát ñoái vôùi bia. Baûng 2.10 Caùc vi khuaån gaây hö hoûng bia Vi khuaån Gram döôngHình gaäyCaàu khuaånLactobacillus spp L. brevis L. brevisimilis L.buchneri L. casei L. coryneformic L. curvatus L. lindneri L. malefermentans L. parabuchneri L. PlantarumPediococcus spp P. damnosus P. dextrinicus P. inopinatus Micrococcus sp M. kristinae  Vi khuaån Gram aâmHình gaäyCaàu khuaånPectinatus spp P. cerevisiphilus P. frisingensis P. sp. DSM20764 Selenomonas sp S. lacticifex Zymophilus sp Z. raffinosivoransMegasphaera sp M. cerevisiae Zymomonas sp Z. mobilis 2.7.2 Vi sinh vaät gaây beänh Danh saùch caùc vi sinh vaät maø chuùng toâi ñeø caäp ñöôïc döïa treân TCVN 7042 : 2002 goàm caùc chæ tieâu vi sinh vaät nhö sau: toång soá vi khuaån hieáu khí, toång soá baøo töû naám men – moác, Coliform, Escheria coli, Staphylococcus areus, Clotridium perfrigens. Trong ñoù nhoùm vi khuaån Escheria coli, Staphylococcus areus, Clotridium perfrigens thuoäc vi khuaån gaây beänh, toång soá baøo töû naám men – moác thuoäc vi sinh vaät gay hö hoûng saûn phaåm, nhoùm Coliforms vaø toång soá vi khuaån hieáu khí chæ thò ñieàu kieän thöïc haønh saûn xuaát keùm. 2.7.2.1 Toång soá vi khuaån hieáu khí Chæ soá naøy coøn coù teân goïi khaùc laø: soá vi sinh vaät hieáu khí, toång soá ñeám treân ñóa, toång soá vi sinh vaät soáng, soá ñeám ñóa chuaån. Chæ tieâu naøy ñöôïc duøng ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä nhieãm taïp cuûa nguyeân lieäu vaø saûn phaåm. Töø ñoù ñaùnh giaù tình traïng veä sinh vaø caùc ñieàu kieän baûo quaûn saûn phaåm vaø döï ñoaùn khaû naêng hö hoûng cuûa saûn phaåm. Vi khuaån hieáu khí laø nhöõng vi khuaån taêng tröôûng vaø hình thaønh khuaån laïc trong ñieàu kieän coù söï hieän dieän cuûa oxy phaân töû (O2). Toång soá vi khuaån hieáu khí hieän dieän trong maãu chæ thò möùc ñoä veä sinh cuûa thöïc phaåm. Chæ soá naøy ñööïoc xaùc ñònh baèng phöông phaùp ñeám khuaån laïc moïc treân moâi tröôøng thaïch dinh döôõng töø moät löôïng maãu xaùc ñònh treân cô sôû xem moät khuaån laïc laø sinh khoái phaùt trieån töø moät teá baøo hieän dieän trong maãu vaø ñöôïc bieåu dieãn döôùi daïng soá ñôn vò hình thaønh khuaån laïc (colony forming unit, CFU) trong moät ñôn vò khoái löôïng thöïc phaåm. 2.7.2.2 Staphylococcus areus Staphylococcus areus laø vi sinh vaät coù khaû naêng saûn sinh moät loaïi ñoäc toá ñöôøng ruoät beàn nhieät, khoâng bò phaân huûy khi ñun ôû ôû 100oC trong khoaûng 30 phuùt. Staphylococcus areus khoâng coù khaû naêng caïnh tranh cao so vôùi caùc vi khuaån gaây hoûng thöïc phaåm khaùc nhöng ñoâi khi khoâng coù ñoái thuû caïnh tranh, chaúng haïn trong thöïc phaåm muoái hoaëc cheá bieán, chuùng coù theå sinh soâi vaø taïo ra ñoäc toá beàn nhieät. Khi vi sinh vaät naøy xaâm mhieãm vaøo trong thöïc phaåm, chuùng tieát ñoäc toá vaøo saûn phaåm vaø gaây ñoä ñoäc. Khi con ngöôøi tieâu thuï thöïc phaåm coù chöùa ñoäc toá naøy, sau 4 – 6 giôø uû beänh seõ boäc phaùt caùc trieäu chöùng laâm saøng nhö tieâu chaûy, noân möûa, caùc trieäu chöùng naøy keùo daøi töø 6 – 8 giôø. Caùc nguoàn laây nhieãm vaøo thöïc phaåm chuû yeáu töø caùc khaâu cheá bieán. Trong töï nhieân caùc vi sinh vaät naøy thöôøng tìm thaáy treân da, muõi, toùc hay loâng cuûa caùc loaøi ñoäng vaät maùu noùng 2.7.2.3 Clostridium perfrigens Laø tröïc khuaån gram (+), sinh baøo töû, di ñoäng, kò khí, coù trong phaân ngöôøi vaø ñoäng vaät cho neân cuõng ñöôïc laøm vi sinh vaät chæ thò veà khaû naêng nhieãm phaân. Baøo töû coù maët ôû khaép moïi nôi trong moâi tröôøng vaø deã daøng nhieãm vaøo thöïc phaåm. Quan nieäm veà söï ngoä ñoäc thöïc phaåm do Clostridium perfrigens gaây ra ñaõ coù nhöõng thay ñoåi trong nhöõng naêm gaàn ñaây. Theo nhöõng quan nieäm tröôùc ñaây cho raèng caùc doøng Clostridium perfrigens khaùng nhieät, taïo baøo töû vaø khoâng laøm tan maùu môùi coù theå gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm. Nhöng trong nhöõng naêm gaàn ñaây caùc doøng nhaïy caûm vôùi nhieät, khoâng laøm tan maùu cuõng ñöôïc tìm thaáy trong caùc vuï ngoä ñoäc do vi sinh vaät naøy gaây neân. Vì caùc baøo töû cuûa Clostridium perfrigens khaùng nhieät neân chuùng thöôøng soáng soùt qua quaù trình naáu chín. Tuy nhieân cuõng phuï thuoäc vaøo thôøi gian tieáp xuùc vôùi nhieät. Neáu nhöõng baøo töû soáng soùt, khi gaëp ñieàu kieän thích hôïp chuùng seõ naûy maàm vaø nhaân leân. Khi ñun naáu thöùc aên ôû nhieät ñoä thaáp vaø thôøi gian ngaén coù theå laøm cho caùc doøng khaùng nhieät toàn taïi vì theá chuùng seõ gaây taùi nhieãm sau khi baûo quaûn. Clostridium perfrigens gaây beänh ñöôøng tieâu hoùa cho ngöôøi tieâu duøng khi söû duïng thöïc phaåm coù moät löôïng lôùn teá baøo vi khuaån soáng. Maët khaùc khi vi khuaån hình thaønh baøo töû coù khaû naêng gaây ñoäc toá gaây chöùng beänh ngoä ñoäc. Beänh xuaát hieän vôùi nhöõng trieäu chöùng cuûa ngoä ñoäc do ñoäc toá cuûa vi sinh vaät naøy gaây ra: ñau thaét vuøng buïng, tieâu chaûy, ñoâi khi noân möûa xuaát hieän sau 8 – 20 giôø khi aên moät löôïng lôùn teá baøo soáng Clostridium perfrigens. Thôøi gian uû beänh laø 12 – 24 giôø. 2.7.2.4 Naám men – naám moác Ñaây laà nhoùm vi sinh vaät nhaân thaät, thuoäc nhoùm dò döôõng, chuùng caàn nguoàn carbon höõu cô ñeå cung caáp naêng löôïng töø moâi tröôøng beân ngoaøi, chuùng raát ña daïng veà chuûng loaïi. Haàu heát naám men vaø naám moác ñeàu thuoäc nhoùm vi sinh vaät hieáu khí baét buoäc, moät soá khaùc coù theå phaùt trieån trong dieàu kieän vi hieáu khí. Laø vi sinh vaät öa maùt, nhieät ñoä thích hôïp töø 20 – 28oC, moät soá khaùc öa laïnh hay öa noùng. Thoâng thöôøng chæ coù naám moác gaây ra ñoäc toá laøm truùng ñoäc. Ngöôøi aên phaûi naám moác coù theå bò khoái u trong gan, gaây ra ung thö gan, taùc ñoäng leân thaän laøm suy thoaùi thaän. 2.7.2.5 Coliforms Coliforms ñöôïc xem laø nhöõng vi sinh vaät chæ thò an toaøn veä sinh, bôûi vì soá löôïng cuûa chuùng hieän dieän trong maãu chæ thò khaû naêng coù söï hieän dieän cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh khaùc trong thöïc phaåm. Caùc nhaø nghieân cöùu cho raèng soá löôïng Coliforms trong thöïc phaåm caøng cao thì khaû naêng hieän dieän caùc vi sinh vaät gaây beänh khaùc cuõng raát lôùn. Coliforms laø nhoùm tröïc khuaån ñöôøng ruoät gram ( - ) khoâng sinh baøo töû, hieáu khí hoaëc kò khí tuøy nghi, coù khaû naêng sinh acid, sinh hôi do leân men lactose ôû 37oC trong voøng 24 giôø. Coliforms chòu nhieät laø nhöõng coliforms coù khaû naêng leân men lactose sinh hôi trong khoaûng 24 giôø khi ñöôïc uû ôû 44oC trong moâi tröôøng canh EC. Coliforms phaân (Faecal Coliforms hay E. coli giaû ñònh) laø coliforms chòu nhieät coù khaû naêng sinh indole khi ñöôïc uû khoaûng 24 giôø ôû 44,5oC trong canh trypton. Coliforms phaân laø moät thaønh phaàn cuûa heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät ôû ngöôøi vaø caùc ñoäng vaät maùu noùng khaùc, ñöôïc söû duïng ñeå chæ thò möùc ñoä veä sinh trong quaù trình cheá bieán, baûo quaûn, vaän chuyeån thöïc phaåm vaø nöôùc uoáng cuõng nhö ñeå chæ thò söï oâ nhieãm phaân trong maãu moâi tröôøng. Treân thöïc teá kieåm nghieäm Coliforms phaân ñöôïc quan taâm nhieàu hôn, ñaëc bieät laø E.coli laø loaïi ñöôïc quan taâm nhieàu nhaát veà veä sinh an toaøn thöïc phaåm. Nhoùm Coliforms goàm 4 gioáng ñoù laø Escherichia vôùi moät loaøi duy nhaát laø E.coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacte (goàm hai loaøi E.aerobacte vaø E.cloacae). Tính chaát sinh hoùa ñaëc tröng cuûa nhoùm naøy ñöôïc theå hieän qua caùc thöû nghieäm IMViC Baûng 2.11 Bieåu hieän sinh hoùa caùc gioáng cuûa Coliforms Phaûn öùngIndolMethyl RedVoges ProskauerCitratEscherichia+(-)+--Citrobacter-(+)+-+Klebsiella-(+)-++Enterobacte-(+)-++ Ghi chuù: (+) phaûn öùng döông tính, (-) phaûn öùng aâm tính, +(-) ña soá laø phaûn öùng döông tính vaø –(+) ña soá laø phaûn aâm tính Coliforms phaùt trieån toát treân nhieàu loaïi moâi tröôøng, nhieàu loaïi thöïc phaåm. Coù nhöõng nghieân cöùu cho thaáy chuùng coù theå phaùt trieån ôû nhieät ñoä thaáp ñeán -2oC vaø cao ñeán 50oC. Trong thöïc phaåm chuùng phaùt trieån yeáu vaø raát chaäm ôû 5oC tuy cuõng coù taøi lieäu ghi nhaän söï phaùt trieån cuûa chuùng ôû 3 – 6oC. Ngöôõng pH ñeå Coliforms coù theå phaùt trieån laø 4,4 – 9 E.coli coù theå phaùt trieån treân moâi tröôøng toái thieåu chæ chöùa moät nguoàn carbon duy nhaát (chaúng haïn glucose) vaø moät nguoàn nitô duy nhaát nhö (NH4)2SO4 cuøng vaøi loaïi khoaùng khaùc. Chuùng phaùt trieån toát treân moâi tröôøng thaïch thöôøng, cho nhöõng khuaån laïc thaáy ñöôïc sau 12 – 16 giôø ôû 37oC, phaùt trieån toát ôû raát nhieàu loaïi thöïc phaåm trong ñieàu kieän thích hôïp. Coliforms coù hai nhoùm: - Coliforms coù nguoàn goác töø phaân phaùt trieån nhanh, khoaûng 16 giôø, trong moâi tröôøng dinh döôõng ôû 44oC, khoâng moïc ôû 4oC trong 30 ngaøy. Laø loaïi vi khuaån öa nhieät, nhieät ñoä thích hôïp nhaát laø 41oC. - Coliforms khoâng coù nguoàn goác töø phaân, chuùng coù nguoàn goác thuûy sinh hay töø ñaát, moïc nhanh ôû 4oC trong 3 – 4 ngaøy vaø 10oC trong 1 ngaøy. Khoâng moïc ôû 41oC, ôû 44oC öùc cheá hoaøn toaøn söï phaùt trieån cuûa taát caû caùc coliforms khoâng coù nguoàn goác töø phaân. 2.7.2.6 Escherichia coli Vi khuaån Escherichia coli (E.coli) thuoäc: - Lôùp: Schazomyces. - Boä: Eubacteriales - Hoï: Enterobacteriaceae - Gioáng: Escherichia - Loaøi: Escherichia coli Escherichia coli coøn coù teân laø Bacteriam coli Commue ñöôïc oâng Escherich phaùt hieän naêm 1885 trong tröôøng hôïp tieâu chaûy ôû treû em. Theo P.J.Quinn vaø cs (1994), E.coli coù nhieàu trong ruoät cuûa ñoäng vaät aên thòt, aên taïp hôn laø ñoäng vaät aên coû, soáng vaøi tuaàn ñeán vaøi thaùng trong buïi, phaân, nöôùc, ngoaøi töï nhieân. Haàu heát chuùng khoâng gaây haïi cho ngöôøi vaø ñoäng vaät, giuùp oån ñònh sinh lí ñöôøng ruoät. Tuy nhieân cho ñeán nay ñaõ phaùt hieän ñöôïc 5 doøng coù khaû naêng gaây haïi cho ngöôøi vaø ñoäng vaät: - EAEC (Enteroaggregative E.coli), E. coli keát taäp ôû ruoät. - EHEC (Enterohemorrhagic E.coli), E. coli gaây xuaát huyeát ôû ruoät. - EPEC (Enteropathogenic E.coli), E. coli gaây beänh ñöôøng ruoät. - ETEC (Enterotoxigenic E.coli), E. coli sinh ñoäc toá ruoät. - EIEC (Enteroinvasive E.coli), E. coli xaâm laán nieâm maïc ruoät. E. coli laø tröïc khuaån hình gaäy ngaén, gram aâm baét maøu hoàng,hieáu khí hay kò khí tuøy nghi, kích thöôùc daøi hay ngaén tuøy thuoäc vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy trung bình 2 – 3 μm x 0,5μm, hai ñaàu troøn, coù loâng quanh teá baøo, ñöùng rieâng leû, ñoâi khi xeáp thaønh chuoãi ngaén, di ñoäng khoâng hình thaønh nha baøo. Nhieät ñoä phaùt trieån thích hôïp laø 37oC, pH = 7,4. Moïc toát treân moâi tröôøng dinh döôõng thoâng thoâng thöôøng ñöôïc nhieät ñoä bieán thieân töø 4 – 45oC. Hình 2.6 Vi khuaån Escherichia coli Baûng 2.12 ñaëc ñieåm hình thaùi khuaån laïc E. coli treân moät soá moâi tröôøng nuoâi caáy Moâi tröôøng nuoâi caáyÑaëc ñieåmThaïch dinh döôõngKhuaån laïc troøn öôùt, maøu traéng ñuïc hôi loài ñeå laâu coù daïng khoâ rìa hôi nhaênThaïch maùuChuûng dung huyeát α hoaëc βThaïch gelatinThaïch khoâng tan chaûy Moâi tröôøng canh dinh döôõngÑuïc ñeàu moâi tröôøng, sau laéng xuoáng ñaùy, coù maøu tro nhaït ñoâi khi coù maøu xaùm, coù muøi tröùng thoáiEosin mythylen (EMB)Khuaån laïc coù aùnh kim tímMacConkey (MCK)Taïo khoùm ñoû hoàngKligler iron agar (KIA)Leân men ñöôøng glucose vaø lactose (vaøng/vaøng), sinh gas, khoâng sinh H2SBrilliant green agar (BGA)Khuaån laïc xanh laù maï 2.8 Caùc phöông phaùp thoâng thöôøng phaùt hieän coliforms vaø Escherichia coli 2.8.1 Vaät lieäu vaø thieát bò - Ñaët trong beå ñieàu nhieät duy trì ôû nhieät ñoä 45,5oC ±2oC, möïc nöôùc phaûi ngaäp moâi tröôøng. - Loaïi nhieät keá giaønh cho phoøng thí nghieäm 1- 55oC, vôùi 0,1oC ñôn vò. - UÛ ôû 35oC ± 1oC. - Maùy laéc. - Voâ truøng pipet 1 vaø 10ml. - Voâ truøng duïng cuï xöû lí maãu. - Chuaån bò bình pha loaõng baèng thuûy tinh chòu nhieät, coå nhaùm, naép nhaùm baèng polyethylen. - Chuaån bò buret ñaõ voâ truøng chöùa dung dòch ñeäm phosphat. - pH keá. 2.8.2 Moâi tröôøng vaø hoùa chaát - Brilliant green lactose bile (BGLB) broth, 2%. - Lauryl tryptose (LST) broth - EC broth - Levine's eosin-methylene blue (L-EMB) agar - Tryptone (tryptophane) broth - MR-VP broth - Koser's citrate broth - Plate count agar (PCA) (standard methods) - Butterfield's phosphate-buffered water or equivalent diluent (except for shellfish) - Kovacs' reagent - Voges-Proskauer (VP) reagents - Gram stain reagents - Methyl red indicator - Violet red bile agar (VRBA) - VRBA-MUG agar - EC-MUG medium - Lauryl tryptose MUG (LST-MUG) broth - Peptone Diluent, 0.1% 2.8.3 MPN kieåm tra cho Coliforms, Coliform phaân vaø E.coli Caân 50g maãu cho vaøo bình voâ truøng vaø li taâm ôû toác ñoä cao. Neáu maãu löu tröõ treân 18 giôø phaûi ñöôïc ñoâng laïnh ôû nhieät ñoä 2 – 5 oC. Theâm 450 ml dung dòch ñeäm phosphat vaø li taâm trong voøng 2 phuùt. Chuaån bò dung dòch pha loaõng vôùi chaát pha loaõng voâ truøng. Soá löôïng caùc dung dòch pha loaõng phuï thuoäc vaøo maät ñoä Coliforms döï ñoaùn. Laéc 25 laàn hoaëc xoaùy troän 7giaây. Khoâng söû duïng pipets ñeå cung caáp lôùn hôn 10% toång khoái löôïng cuûa maãu.Chuyeån 1ml maãu vaøo 3 oáng nghieäm, moãi ñoä pha loaõng tieán haønh laëp laïi 3 laàn. Chuù yù: Söû duïng 5 oáng MPN ñeå phaân tích ñoäng vaät coù voû vaø vuøng nöôùc thu hoaïch soø oác. UÛ caùc oáng ôû 35oC thôøi gian 24h. Caùc oáng aâm tính ñöôïc uû tieáp ôû 24h ñeå kieåm tra vaø ghi laïi phaûn öùng. 2.8.4 MPN – kieåm tra caùc daïng vi khuaån Coli Töø moãi oáng nghieäm sinh khí ôû treân, laáy moät phaàn chuyeån sang oáng nghieäm chöùa moâi tröôøng BGBL.UÛ caùc oáng ôû 35oC, thôøi gian 48h. 2.8.5 MPN – thöû nghieäm IMViC a. Indole: Cấy VSV thử nghiệm qua môi trường canh trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s. Quan sát sau vài phút. Thử nghiệm (+): trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen. Thử nghiệm (-): không xuất hiện vòng đỏ. Hình 2.7 Thöû nghieäm Indole b. Voges – proskauer (VP): Cấy vi sinh vật vào trong môi trường glucose phosphate (MR-VP Broth). Ủ ở nhiệt độ 370C trong vòng từ 2-5 ngày. Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử anpha- naphtol 5% trong cồn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 %. với tỷ lệ 3:1. Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút. Thử nghiệm (+):xuất hiện màu đỏ hay hồng sáng trên mặt môi trường. Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu. Hình 2.8 Thöû nghieäm Voges – proskauer c. Methyl: sau khi thöû nghieäm VP, tieáp tuïc uû caùc oáng nghieäm treân theâm 48h ôû 35oC. Theâm 5 gioït dung dòch methyl ñoû vaøo moãi oáng. Neáu coù maøu vaøng laø phaûn öùng aâm tính. d. Citrat: moâi tröôøng thöû nghieäm khaû naêng bieán döôõng citrate söû duïng citrate laøm nguoàn cacbon duy nhaát coù chöùa muoái ammonium duøng laøm nguoàn ñaïm taêng giaù trò pH cuûa moâi tröôøng. Söï gia taêng giaù trò pH naøy ñöôïc chæ thò baèng söï ñoåi maøu cuûa chæ thò pH trong moâi tröôøng. e. Söû duïng ñöôøng lactose: caáy vaøo moät oáng cuûa LST vaø uû ôû 48h ôû 35oC. Neáu coù khí sinh ra laø phaûn öùng aâm tính Baûng 2.13 Baûng keát quaû thöû nghieäm IMViC STTThử nghiệm sinh hóaKết quảKết quảKết quả1 2 3 4Indol Methyl Red Voges Proskauer Khả năng sử dụng citrate+ + - -+ - + -- - + +Sự hiện diện của E.coli trong mẫuCóKhôngkhông CHÖÔNG III: THÖÏC NGHIEÄM 3.1 Ñònh löôïng Coliforms baèng phöông phaùp MPN 3.1.2 Giôùi thieäu phöông phaùp MPN Phöông phaùp MPN laø phöông phaùp coù theå thay theá phöông phaùp ñeám khuaån laïc ñeå xaùc ñònh maät ñoä vi sinh vaät trong maãu, phöông phaùp naøy ñöôïc döïa treân nguyeân taéc xaùc suaát thoáng keâ söï phaân phaân boá vi sinh vaät trong caùc ñoä pha loaõng khaùc nhau cuûa maãu. Moãi ñoä pha loaõng ñöôïc nuoâi caáy laëp laïi nhieàu laàn trong caùc moâi tröôøng loûng ñaõ ñöôïc choïn, thoâng thöôøng phaûi caáy laëp laïi töø 3-10 laàn taïi moãi noàng ñoä pha loaõng. Caùc ñoä pha loaõng ñöôïc tieán haønh sao cho trong caùc laàn laëp laïi coù moät soá laàn cho daàu hieäu döông tính vaø moät soá laàn cho daáu hieäu aâm tính. Soá laàn laëp laïi cho daáu hieäu döông tính vaø aâm tính ñöôïc ghi nhaän ñeå ñoái chieáu vôùi baûng thoáng keâ ( baûng Mac Crady ) seõ ñöôïc giaù trò öôùc ñoaùn soá löôïng vi sinh vaät trong maãu. Quy trình thöïc hieän cuûa phöông phaùp naøy nhö sau: cho vaøo caùc oáng nghieäm coù chöùa moâi tröôøng thích hôïp cho söï taêng tröôûng cuûa töøng loaïi vi sinh vaät caàn ñònh löôïng moät theå tích chính xaùc dung dòch maãu ñaõ ñöôïc pha loaõng .UÛ ôû nhieät ñoä vaø thôøi gian thích hôïp. Ghi nhaän laïi soá oáng cho keát quaû döông tính vaø aâm tính cuûa töøng ñoä pha loaõng .Söû duïng keát quaû naøy vaø tra baûng Mac Crady ñeå tính ñöôïc maät ñoä vi sinh vaät .Ñoâ chính xaùc cuûa phöông phaùp naøy phuï thuoäc vaøo soá oáng nghieäm laëp laïi trong moãi ñoä pha loaõng : soá laàn laëp laïi ôû moãi ñoä pha loaõng caøng lôùn thì ñoä chính xaùc cuûa trò soá MPN caøng cao. Phöông phaùp MPN ñöôïc duøng ñeå phaân tích Coliform vaø caùc nhoùm vi sinh vaät khaùc khi chuùng phaùt trieån ñöôïc trong moâi tröôøng loûng vaø taïo ra caùc tín hieäu deã daøng nhaän daïng nhö: sinh hôi, laøm ñuïc moâi tröôøng choïn loïc, laøm thay ñoåi pH moâi tröôøng… 1.1 1.2 1.3 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 Caùc noàng ñoä pha loaõng Hình : Heä thoáng ñònh löôïng vi sinh vaät baèng phöông phaùp MPN 3.2 Xaùc ñònh toång soá Coliforms 3.2.1 Ñònh nghóa Coliforms Coliforms laø nhöõng tröïc khuaån gram aâm, khoâng sinh baøo töû, hieáu khí hoaëc kò khí tuøy nghi, coù khaû naêng leân men lactose. Sau khi uû 37oC± 1oC trong 24 – 48 giôø. Nhoùm Coliforms hieän dieän khaép nôi trong töï nhieân, trong ruoät ngöôøi vaø ñoäng vaät. Coliforms ñöôïc xem laø nhoùm vi sinh vaät chæ thò: soá löôïng hieän dieän cuû chuùng trong thöïc phaåm trong thöïc phaåm, nöôùc hay caùc loaïi maãu moâi tröôøng ñöôïc duøng ñeå chæ thò khaû naêng hieän dieän cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh khaùc. 3.2.2 Nguyeân taéc Maãu ñaõ ñöôïc ñoàng nhaát ñöôïc caáy moät löôïng nhaát ñònh leân moâi tröôøng thaïch choïn loïc thích hôïp chöùa lactose. Sau khi uû ôû 37oC ± 1oC trong 24 = 48h, ñeám soá löôïng khuaån laïc Coliforms ñieån hình. Xaùc ñònh laïi baèng caùc phaûn öùng ñaëc tröng. Moâi tröôøng choïn loïc Coliforms laø moâi tröôøng chöùa lactose, ñaây laø nguoàn carbon duy nhaát, ñoàng thôøi moâi tröôøng coøn chöùa muoái maät nhö moät taùc nhaân choïn loïc caùc taùc nhaân chæ thò nhö neutral red, crystal violet. Khaúng ñònh caùc doøng khuaån laïc ñaëc tröng baèng moâi tröôøng canh choïn loïc nhö canh BGBL. 3.2.3 Moâi tröôøng söû duïng Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) 3.2.4 Duïng cuï Pipet, ñaàu type ñaõ voâ truøng OÁng nghieäm ñaõ voâ truøng OÁng Durnham ñaõ voâ truøng  thuûy tinh 250 ml Tuû aám 37oC 3.2.5 Qui trình phaân tích a. Chuaån bò maãu Maãu duøng laøm thí nghieäm: bia lon. Huùt 10ml maãu cho vaøo oáng nghieäm ñaõ coù moâi tröôøng.Taát caû caùc thao taùc treân ñeàu phaûi thöïc hieän trong ñieàu kieän voâ truøng. Khi ñoù, ta seõ coù dung dòch pha loaõng laø 10-1. Dòch pha loaõng seõ ñöôïc pha loaõng theo daõy thaäp phaân baèng caùch duøng micropipette (pipetman) voâ truøng chuyeån 1ml töø oáng nghieäm 10-1 vaøo oáng nghieäm thöù hai, ta seõ coù ñöôïc dòch pha loaõng 10-2. Tieáp tuïc thöïc hieän töông töï ñeå coù ñöôïc ñoä pha loaõng 10-3 . Nhöng quaù trình pha loaõng sao cho trong 1ml dung dòch pha loaõng maãu chöùa khoaûng <100 khuaån laïc. UÛ maãu ôû 37oC, thôøi gian 24h. a. Ñoïc keát quaû Caùc oáng nghieäm ñeàu khoâng coù heän töôïng sinh hôi, hay gaây ñuïc. Ñieàu naøy chöùng toû maãu bia khoâng heà bò nhieãm Coliforms an toaøn veà veä sinh thöïc phaåm. 3.3 Ñònh tính Ecoli 3.3.1 Ñònh nghóa Coliforms laø nhöõng tröïc khuaån gram aâm, khoâng sinh baøo töû, hieáu khí hoaëc kò khí tuøy nghi, coù khaû naêng leân men lactose. Sau khi uû 37oC± 1oC trong 24 – 48 giôø. Coliforms chòu nhieät laø Coliforms coù khaû naêng leân men lactose, sinh acid vaø sinh hôi ôû nhieät ñoä 44 oC trong 24 – 48h. Coliforms phaân (feacal Coliform) laø Coliform nhieät coù thöû nghieäm indol trong moâi tröôøng trypton döông tính. E.coli laø Coliforms phaân coù nghieäm phaùp IMViC laàn löôït laø + + - - 3.3.2 Nguyeân taéc Phöông phaùp naøy duøng ñeå ñònh tính vaø keát luaän phaùt hieän hay khoâng phaùt hieän E.coli trong moät khoái löôïng maãu xaùc ñònh. Caáy maãu vaøo moâi tröôøng taêng sinh (BGBL), kieåm tra treân moâi tröôøng phaân laäp (EMB) vaø thöû nghieäm baèng caùc phöông phaûn öùng sinh hoùa phuø hôïp (nghieäm phaùp IMViC) 3.3.3. Moâi tröôøng söû duïng Moâi tröôøng TSA  Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) Moâi tröôøng EMB Canh Trypton Canh MR – VP Thaïch Simon Citrate Thuoác thöû Kovac’s Thuoác thöû Methyl Red Thuoác thöû α– naphtol KOH 40% 3.3.4 Duïng cuï Ñóa petri OÁng nghieäm - oáng Durnham Beå ñieàu nhieät 44oC 3.3.5 Quy trình phaân tích a. Chuaån bò maãu Maãu duøng laøm thí nghieäm: bia lon Laáy 1ml maãu cho vaøo 3 oáng nghieäm ñaõ coù 10ml moâi tröôøng BGBL, uû 44oc trong 24h. Taát caû caùc thao taùc treân ñeàu phaûi thöïc hieän trong ñieàu kieän voâ truøng. b. Keát quaû Caùc oáng nghieäm ñeàu khoâng coù heän töôïng sinh hôi, hay gaây ñuïc. Ñieàu naøy chöùng toû maãu bia khoâng heà bò nhieãm E. coli an toaøn veà veä sinh thöïc phaåm CHÖÔNG IV: KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN Keát quaû ñaùnh giaù caûm quan 4.1.1Hình daïng bia lon Lon bia ñöôïc ñoùng naép chaéc, lon khoâng bò moùp, nhaõn coøn nguyeân veïn. Taát caû caùc maãu ñeàu ôû traïng thaùi trong , khoâng coù caën. Keát caáu Caùc maãu bia lon thaønh phaàn chính laø nöôùc, beân caïnh ñoù laø ethanol, CO2 moät soá saûn phaåm phuï taïo ra töø quaù trình leân men vaø caùc chaát hoøa tan khoâng leân men coøn laïi trong bia. 4.1.3 Maøu saéc Caùc maãu bia thu ñöôïc ñeàu coù maøu vaøng trong, saùng ñaëc tröng cuûa bia. 4.1.4 Muøi vò Caùc maãu thu ñöôïc coù vò ñaéng cuûa hoa houblon, muøi thôm cuûa malt ñaëc tröng cho bia. Khoâng coù maãu naøo coù muøi vò laï hay khoù chòu. Nhìn chung, caùc maãu ñöôïc laáy vaãn trong tình traïng raát toát, maøu saéc, muøi vaø vò bình thöôøng, khoâng coù bieåu hieän cuûa söï hö hoûng. Tuy caùc giaù trò caûm quan cuûa bia lon bình thöôøng nhöng nhö vaäy khoâng coù nghóa laø caùc saûn phaåm naøy ñaït chaát löôïng veà caùc chæ tieâu vi sinh. Ñaây laø chæ tieâu giuùp toâi ñaùnh giaù sô boä veà tình traïng maãu tröôùc khi ñaùnh giaù caùc chæ tieâu vi si 4.2. Ñaùnh giaù caùc chæ tieâu vi sinh vaät 4.2.1 Ñaùnh giaù möùc ñoä nhieãm Coliform ôû caùc loaïi bia lon khaûo saùt Möùc ñoä nhieãm laø khoâng coù. Saûn phaåm bia raát an toaøn 4.2.1 Ñaùnh giaù möùc ñoä nhieãm E.Coli ôû caùc loaïi bia lon khaûo saùt Möùc ñoä nhieãm laø khoâng coù. Saûn phaåm bia raát an toaøn CHÖÔNG V: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ 5.1 Keát luaän Tröôùc tình hình caùc saûn phaåm thöïc phaåm treân thò tröôøng bò aûnh höôûng veà vaán ñeà veä sinh an toaøn thöïc phaåm, ngöôøi tieâu duøng coù taâm lyù lo ngaïi khi söû duïng caùc saûn phaåm ñöôïc saûn xuaát trong nöôùc thì lieäu saûn phaåm bia lon coù traùnh khoûi söï ngôø vöïc naøy. Vì thôøi gian thöïc hieän ñeà taøi coù haïn neân toâi chæ tieán haønh kieåm tra caùc chæ tieâu vi sinh nhö: Coliforrms vaø Escherichia coli cuûa caùc saûn phaåm bia lon(: Zorok, Hanoi, Ñaïi Vieät, bigC, Sanmiguel) ñöôïc baùn taïi heä thoáng sieâu thò BigC ôû quaän Goø Vaáp. Nhaèm muïc ñích khaûo saùt ñoä an toaøn ñoái vôùi caùc saûn phaåm bia lon treân thò tröôøng thaønh phoá ngaøy nay. Sau khi tieán haønh khaûo saùt 3 ñôït lieân tieáp vôùi caùc maãu bia lon: : Zorok, Hanoi, Ñaïi Vieät, Hudar Hueá, Sanmiguel; ñieàu cho keát quaû ñeàu aâm tính. Söï hieän dieän cuûa vi sinh vaät gaây beänh cho ngöôøi tieâu duøng laø khoâng theå coù. Vaø toâi coù theå tin töôûng caùc nhaø saûn xuaát bia lon trong nöôùc, vôùi haøng Vieät Nam chaát löôïng cao. 5.2 Kieán nghò Töø keát quaû khaûo saùt treân cho thaáy raèng möùc ñoä an toaøn cuûa doøng saûn phaåm bia lon treân thò tröôøng thaønh phoá laø raát cao. Moïi ngöôøi coù theå yeân taâm, tin töôûng vaøo caùc nhaø saûn xuaát bia lon trong nöôùc, an toaøn khi söû duïng khoâng lo ngaïi ñeán söï aûnh höôûng cuûa vi sinh vaät ñeán söùc khoûe. Nhöng ngöôøi tieâu duøng caàn löu yù khoâng coù moät saûn phaåm thöïc phaåm naøo haïn duøng laø maõi maõi, moïi thöïc phaåm ñeàu coù haïn söû duïng.Vì theá moïi ngöôøi haõy xem kó haïn söû duïng tröôùc khi duøng. Ñaûm baûo quyeàn lôïi vaø söùc khoûe cuûa ngöôøi tieâu duøng laø traùch nhieäm cuûa caùc nhaø saûn xuaát vaø cô quan nhaø nöôùc. Taïo cho ngöôøi tieâu duøng coù caûm giaùc yeân taâm , a toaøn khi söû duïng saûn phaåm, khoâng chæ ñoái vôùi saûn phaåm bia lon maø coøn ñoái vôùi caùc saûn phaåm thöïc phaåm khaùc treân thò tröôøng, vaø ñoàng thôøi giaù caû cuõng phaûi hôïp lí. Nhö vaäy môùi phaùt trieån ñöôïc khaåu hieäu ngöôøi Vieät duøng haøng Vieät, giuùp cho neàn kinh teá nöôùc ta phaùt trieån maïnh hôn. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Buøi Aùi 2005. Coâng ngheä leân men öùng duïng trong coâng ngheä thöïc phaåm.NXB ÑH Quoác Gia Tp.HCM Buøi Aùi vaø Anh Thô,1995.Kyõ thuaät saûn xuaát bia. Tröôøng ÑH BK TP.HCM Laâm Thanh Hieàn, 2006. Coâng ngheä saûn xuaát nöôùc giaûi khaùt (phaàn hai).Tröôøng ÑH Noâng Laâm Tp.HCM Nguyeãn Thò Hieàn, 2007. Khoa hoïc - coâng ngheä malt vaø bia.NXB Khoa hoïc vaø kó thuaät Hoaøng Ñình Hoaø,2000.coâng ngheä saûn xuaát malt vaø bia.NXB khoa hoïc vaø kó thuaät Hoà Söôûng,1992.Coâng ngheä saûn bia.NXB khoa hoïc vaø kó thuaät Nguyeãn Ñöùc Löôïng (2006). Coâng ngheä vi sinh taäp 3 Thöïc phaåm leân men truyeàn thoáng. NXB Ñaïi hoïc Quoác gia TP.Hoà Chí Minh KS.Phaïm Minh Nhöït. Thöïc haønh vi sinh thöïc phaåm. Ñaïi hoïc kó thuaät coâng ngheä TP.Hoà Chí Minh