Khảo sát hiệu quả một số thuốc bảo vệ thực vật dùng phòng trị bệnh rụng lá Corynespora (Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.) trên cây cao su

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HIỆU QUẢ MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT DÙNG PHÕNG TRỊ BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.) TRÊN CÂY CAO SU Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HIỆU QUẢ MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT DÙNG PHÕNG TRỊ BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.) TRÊN CÂY CAO SU Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. PHAN THÀNH DŨNG NGUYỄN VĂN PHƢƠNG TS. TRẦN VĂN CẢNH TS. PHAN PHƢỚC HIỀN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy - Cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. TS. Phan Phƣớc Hiền, ThS. Phan Thành Dũng và TS. Trần Văn Cảnh đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. KS. Vũ Thị Quỳnh Chi cùng các cô chú, anh chị cán bộ công nhân viên Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật - Viện Nghiên Cứu Cao Su đã nhiệt tình giúp đỡ và hƣớng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Bạn Phạm Ngọc Chinh và bạn Nguyễn Ngọc Thanh Trang đã chia sẻ khó khăn và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng nhƣ thời gian thực tập tốt nghiệp. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Phƣơng iv TÓM TẮT NGUYỄN VĂN PHƢƠNG, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2007. “Khảo sát hiệu quả một số thuốc bảo vệ thực vật dùng phòng trị bệnh rụng lá Corynespora (Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.) trên cây cao su”. Bệnh rụng lá Corynespora gây ra bởi nấm C. cassiicola đang đƣợc xem là bệnh lá nguy hiểm nhất cho các vùng trồng cao su trên thế giới. Ở Việt Nam, bệnh xuất hiện lần đầu vào tháng 8 năm 1999. Hiện nay, bệnh đang trong giai đoạn tích lũy và có thể bùng phát trong tƣơng lai. Do đó, công tác phòng trừ bệnh đang rất đƣợc quan tâm. Đề tài này thực hiện khảo sát 9 loại thuốc bảo vệ thực vật dùng phòng trị nấm C. cassiicola. Kết quả đạt đƣợc trong các thí nghiệm nhƣ sau: Thí nghiệm in vitro: có 6 loại thuốc cho hiệu quả ức chế nấm cao là: Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole. Thuốc Difenoconazole cho hiệu quả ức chế cao ngay từ nồng độ thấp, nhƣng khi tăng nồng độ lên cao thì hiệu quả lại tăng rất ít. Không có loại thuốc nào ức chế khả năng hình thành bào tử trên môi trƣờng nhân tạo. Ngƣợc lại, một số thuốc Hexaconazole, Flusilazole, Cyproconazole, Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Triadimefon còn làm tăng mật độ bào tử ở các nồng độ ức chế cao. Các loại thuốc cũng không ảnh hƣởng tới hình thái và tỉ lệ nảy mầm của bào tử. Thí nghiệm trên lá cắt rời: cả 6 loại thuốc thí nghiệm Cyproconazole, Difenoconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Tebuconazole, Propiconazole đều có hiệu quả giảm mức độ bệnh so với đối chứng. Nhƣng thuốc Difenoconazole có thời gian bảo hộ ngắn hơn. Thí nghiệm ngoài đồng: cả 5 loại thuốc Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Tebuconazole, Propiconazole đều có hiệu quả phòng trị nấm cao. Tỉ lệ khỏi bệnh hoàn toàn tới 65 đến 79%, mức độ bệnh giảm tử 79 đến 87%. Trong đó thuốc Hexaconazole và Flusilazole luôn thể hiện hiệu quả cao nhất ở tất cả các thử nghiệm. v SUMMARY NGUYEN VAN PHUONG, Nong Lam University, Ho Chi Minh City. Sectember, 2007. “Investigation effect of some pesticides use control of Corynespora leaf disease (Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.) of Hevea brasiliensis” Corynespora leaf fall disease caused by C. cassiicola was considered as one of the most serious leaf diseases on rubber tree. In Vietnam, the disease was first detected in August, 1999. At present, the disease is spreading and developing into epidemics in future. Because of that, the control of disease has being very considered. Nine pesticides are tested on C. cassiicola, the result is mentioned below: In vitro tests: Six pesticides included Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, and Propiconazole are highly to inhibit the growth of fungal colonies. Difenoconazole is the most effective at the low dose, but its effect doesn’t increase when its degree of concentration increase. All tested fungicides are not able to reduce a number of fungal spores on artificial medium. Conversely, some pesticide as Hexaconazole, Flusilazole, Cyproconazole, Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Triadimefon even make to increase density spores at the high dose. These pesticides don’t also affect to spore form and percentage of spore germination. Detected leaves tests: Cyproconazole, Difenoconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Tebuconazole and Propiconazole are highly effective to inhibit on disease development compared to the control. Among them, Difenoconazole is less remain the effectiveness after each application. Field tests: Five fungicides included Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Tebuconazole and Propiconazole are found very effect to control the disease development. Hexaconazole and Flusilazole are showed the most effective to reduce the disease infection. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .................................................................................................................. iii Tóm tắt ....................................................................................................................... iv Summary ..................................................................................................................... v Mục lục ....................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... ix Danh sách các hình ...................................................................................................... x Danh sách các bảng .................................................................................................. xi Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu .......................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ..................................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ........................................................................................................................ 2 1.3. Giới hạn đề tài .................................................................................................... 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 4 2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg ................................... 4 2.2. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su. ................................. 7 2.2.1. Phân loại học .............................................................................................................. 7 2.2.2. Hình thái khuẩn ty, khuẩn lạc, bào tử và điều kiện nuôi cấy ................................... 7 2.2.3. Phổ kí chủ, sự xâm nhiễm của nấm C. cassiicola .................................................... 9 2.3. Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su H. brasiliensis Muell. Arg. ............ 9 2.3.1. Nguyên nhân và triệu chứng ..................................................................................... 9 2.3.2. Điều kiện phát sinh bệnh .......................................................................................... 11 2.3.3. Tác hại của bệnh và cách phòng trị ......................................................................... 11 2.4. Phòng trị bệnh bằng thuốc bảo vệ thực vật ...................................................... 12 vii 2.4.1. Lịch sử và phân loại thuốc bảo vệ thực vật ............................................................ 12 2.4.2. Triazole - Nhóm thuốc trừ nấm ............................................................................... 13 2.4.3. Tình hình sử dụng hóa chất trong kiểm soát bệnh rụng lá Corynespora .............. 14 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 16 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ...................................................................... 16 3.2. Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................................... 16 3.3. Phƣơng pháp cơ bản ......................................................................................... 16 3.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu .............................................................................................. 16 3.3.2. Phân lập ..................................................................................................................... 17 3.3.3. Phƣơng pháp nhân số lƣợng bào tử ......................................................................... 18 3.4. Khảo sát hiệu quả sử dụng hóa chất................................................................. 19 3.4.1. Hoá chất ................................................................................................................... 19 3.4.2. Khảo sát hiệu quả thuốc trên đĩa petri ..................................................................... 20 3.4.3. Khảo sát hiệu quả thuốc trên lá bệnh cắt rời ........................................................... 21 3.4.4. Khảo sát hiệu quả thuốc trên vƣờn gỗ ghép ........................................................... 23 3.5. Xử lý số liệu ..................................................................................................... 24 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 25 4.1. Kết quả phân lập mẫu nấm .............................................................................. 25 4.2. Khảo sát ảnh hƣởng các loại thuốc trên môi trƣờng in vitro ........................... 26 4.2.1. Hiệu quả ức chế đƣờng kính khuẩn lạc của các loại thuốc ................................... 26 4.2.2. Ảnh hƣởng của thuốc đến mật độ, kích thƣớc và tỉ lệ nảy mầm của bào tử ......... 38 4.2.2.1. Sự ảnh hƣởng của thuốc đến mật độ bào tử hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc ............................................................................................. 39 4.2.2.2. Sự ảnh hƣởng của thuốc đến hình thái bào tử hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc ............................................................................................. 41 4.2.2.3. Sự ảnh hƣởng của thuốc đến khả năng nảy mầm của bào tử hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc ...................................................................................... 42 4.3. Kết quả thí nghiệm trên lá cắt rời .................................................................... 44 4.4. Kết quả thí nghiệm ngoài đồng ........................................................................ 48 viii 4.4.1. Ảnh hƣởng của các loại thuốc đến tỉ lệ nhiễm bệnh. ............................................. 49 4.4.2. Ảnh hƣởng của các loại thuốc đến mức độ nhiễm bệnh. ....................................... 51 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................... 53 5.1. Kết luận ............................................................................................................ 53 5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 53 Chƣơng 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 55 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 58 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật. CSB: Chỉ số bệnh. Ctv: Cộng tác viên. Dvt: Dòng vô tính. LD50: Liều lƣợng làm chết 50% cá thể (Lethal Dose). LD90: Liều lƣợng làm chết 90% cá thể. LLL: Lần lặp lại. PDA: Potato Dextrose Agar. PSA: Potato Saccharose Agar. TLB: Tỉ lệ bệnh. VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. x DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1. Triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora trên lá trƣởng thành ............. 10 Hình 2.2. Triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora trên lá non và cành............... 10 Hình 4.1. Khuẩn lạc và bào tử nấm C. cassiicola sau khi phân lập .......................... 26 Hình 4.2. Bào tử nấm C. cassiicola trên lá cao su .................................................... 26 Hình 4.3. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Cyproconazole sau 7 ngày cấy nấm ......................................................... 33 Hình 4.4. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Difenoconazole sau 7 ngày cấy nấm ....................................................... 34 Hình 4.5. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Flusilazole sau 7 ngày cấy nấm ................................................................ 34 Hình 4.6. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Hexaconazole sau 7 ngày cấy nấm ........................................................... 35 Hình 4.7. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Triadimenol sau 7 ngày cấy nấm .............................................................. 35 Hình 4.8. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Tebuconazole sau 7 ngày cấy nấm ........................................................... 36 Hình 4.9. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Triacyclazole sau 7 ngày cấy nấm ............................................................ 36 Hình 4.10. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Propiconazole sau 7 ngày cấy nấm .......................................................... 37 Hình 4.11. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Triadimefon sau 7 ngày cấy nấm .............................................................. 37 Hình 4.12. Bào tử và ống mầm nấm C. cassiicola .................................................... 43 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Bảng 3.1 Thành phần môi trƣờng PSA, PDA ........................................................... 17 Bảng 3.2. Các loại thuốc sử dụng trong thí nghiệm .................................................. 19 Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng .......................................................... 24 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của thuốc trừ nấm đến đƣờng kính khuẩn lạc C. cassiicola ...... 28 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của thuốc trừ nấm đến tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc ............................................................................... 31 Bảng 4.3: Phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính và chỉ số LD50 của các loại thuốc sau 7 ngày nuôi cấy. ................................................... 32 Bảng 4.4.Sự ảnh hƣởng của các loại thuốc lên mật độ, kích thƣớc và tỉ lệ nảy mầm của bào tử ...................................................................... 40 Bảng 4.5. Chỉ số bệnh trung bình sau 1, 3, 5, 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời .......... 45 Bảng 4.6. Tỉ lệ bệnh trung bình sau 1, 3, 5, 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời ............. 48 Bảng 4.7. Nồng độ các thuốc sử dụng trong thí nghiệm ngoài đồng ........................ 49 Bảng 4.8. Tỉ lệ bệnh trung bình trƣớc và sau các lần xử lý thuốc ngoài đồng ......... 49 Bảng 4.9. Chỉ số bệnh trung bình trƣớc và sau các lần xử lý thuốc ngoài đồng....... 51 Biểu đồ 4.1. Chỉ số bệnh trung bình sau 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời .................. 47 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. gây ra, là loại bệnh mới và có tác hại lớn chƣa từng có từ trƣớc tới nay ở các nƣớc trồng cao su tại Đông và Nam Á. Bệnh xuất hiện lần đầu trên cây cao su thực sinh tại Châu Phi năm 1949, tiếp theo nghi nhận tại Ấn Độ năm 1958, Malaysia năm 1961, Thái Lan, Sri Lanka và Indonesia năm 1985, Brazil và Bangladesh năm 1988 (Phan Thành Dũng, 2004), và gần đây nhất tại Trung Quốc năm 2007 (Jinji và ctv, 2007). Bệnh gây thiệt hại nặng nhất tại Sri Lanka, nơi phải nhổ bỏ và trồng lại trên 5.000 ha. Tại Malaysia, Thái Lan và Indonesia nhiều ngàn ha cao su bị hại nặng làm ảnh hƣởng lớn đến sản lƣợng và sinh trƣởng đôi khi gây chết toàn bộ cây. Tại Ấn Độ, dòng vô tính RRII 108 đƣợc trồng chiếm 80% tổng diện tích cao su cả nƣớc bị nhiễm loại bệnh này, hàng năm phải sử dụng hoá chất để phòng trị hàng chục ngàn ha. Nhiều dòng vô tính (dvt) sinh trƣởng nhanh và sản lƣợng cao ngày càng dễ nhiễm. Hơn nữa, tính kháng bệnh của dvt biến thiên nhiều theo từng vùng khí hậu khác nhau. Trên cây cao su, bệnh gây hại ở tất cả các bộ phận trên mặt đất nhƣ: lá, cuống và chồi (Phan Thành Dũng, 2004). Ở Việt Nam, bệnh đƣợc ghi nhận lần đầu vào tháng 8 năm 1999, gây hại nặng cho dvt RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Hiện nay, số lƣợng dvt bị nhiễm bệnh tăng lên nhiều và cũng đã xuất hiện tại một số công ty cao su tại Đông Nam Bộ (Phan Thành Dũng, 2004). Hiện nay, bệnh đang trong giai đoạn tích lũy và có thể bùng phát trong tƣơng lai (Phan Thành Dũng, 2006). Nguy cơ có thể cao hơn nữa, do sự phá vỡ tính kháng của chủng nấm đối với các dvt ngày càng nhanh, sự thay đổi khí hậu thất thƣờng cũng nhƣ sự trao đổi thƣơng mại các sản phẩm nông nghiệp 2 đang trên đà tăng nhanh. Do đó, việc nghiên cứu về các đặc điểm cũng nhƣ các biện pháp phòng trừ hiệu quả bệnh rụng lá Corynespora đang rất đƣợc quan tâm hiện nay. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát hiệu quả một số thuốc bảo vệ thực vật dùng phòng trị bệnh rụng lá Corynespora (Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.) trên cây cao su”. 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Mục đích của đề tài là tìm ra những hóa chất bảo vệ thực vật thích hợp cho việc phòng và trị bệnh rụng lá Corynespora. Từ mục đích trên, nghiên cứu đƣợc hiện với mục tiêu cụ thể sau: Phân lập và nuôi cấy nấm C. cassiicola trên môi trƣờng in vitro. Khảo sát hiệu quả hóa chất trên môi trƣờng in vitro, nghiên cứu ảnh hƣởng hoá chất đến khả năng hình thành bào tử, hình thái và khả năng nảy mầm của bào tử. Khảo sát hiệu quả hóa chất trên lá cao su cắt rời đƣợc lây bệnh bằng bào tử. Khảo sát hiệu quả hóa chất trên vƣờn gỗ ghép đã nhiễm bệnh. 1.2.2. Yêu cầu Hiểu biết căn bản về bệnh cây cao su, bệnh rụng lá Corynespora nhận diện đƣợc triệu chứng đặc trƣng của bệnh. Nắm vững quy trình phân lập, nuôi cấy và thử nghiệm thuốc trong phòng. Hiểu biết về thuốc bảo vệ thực vật và các kỹ thuật liên quan . Nắm vững các thao tác trong phòng thí nghiệm và trên vƣờn thực nghiệm. Vận hành các máy móc thiết bị hiện có, củng cố nắm vững kiến thức đã học. 3 1.3. Giới hạn đề tài Thời gian thực tập hạn chế (từ tháng 03/03/2007 – 30/07/2007). Khối lƣợng mẫu thí nghiệm lớn nên độ lặp lại của một số thí nghiệm có phần hạn chế. Khi xử lý ngoài đồng thì vào thời điểm mƣa nhiều nên ảnh hƣởng đến kết quả phun thuốc thí nghiệm. Do kinh nghiệm bản thân về bảo vệ thực vật còn hạn chế nên việc đánh giá kết quả chƣa hoàn hảo. 4 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg. Những cây có nhựa mủ có thể sản xuất ra cao su trên thế giới thuộc vào năm họ thực vật sau: Euphorbiaceae, Moraceae, Apocynaceae, Aslepiadaceae, Compositae. Nhƣng cây cao su thuộc loại H. brasiliensis (giống Hevea, họ Euphorbiaceae) là cây duy nhất đƣợc chọn để canh tác đại qui mô (Nguyễn Hữu Trí, 2004). Cây cao su có nguồn gốc tự nhiên ở vùng rừng lƣu vực Amazone, Nam Mỹ, trải rộng từ vĩ tuyến 15 Nam đến vĩ tuyến 16 Bắc và kinh tuyến 46 – 77 Tây, bao gồm các nƣớc Brazil, Bolivia, Colombia, Peru, Ecuador, Venezuela, French Guiana, Surinam và Guyana. Dân địa phƣơng đã dùng mủ cao su để làm các vật dụng chống thấm và có tính đàn hồi nhƣ quả bóng đồ chơi thể thao, tấm lợp nhà, túi đựng nƣớc, các hình tƣợng trong lễ hội tôn giáo… Cây cao su đƣợc ngƣời châu Âu biết lần đầu sau chuyến thám hiểm của ông Christopher Columbus đến châu Mỹ năm 1492. Sau đó, một số nhà khoa học châu Âu đã khám phá các đặc tính của mủ cao su: đàn hồi, dẻo, không thấm nƣớc. Cao su đƣợc sử dụng làm nguyên liệu chế tạo vỏ ruột xe đạp từ 1888 và vỏ ruột xe hơi từ 1895. Những phát minh lƣu hoá cao su và hoà trộn mủ cao su với các nguyên liệu khác (bột than, thép, kaolin, đất đỏ…) đã làm các sản phẩm từ mủ cao su ngày càng phong phú, đa dạng, từ đó nhu cầu cao su tăng nhanh. Cho đến cuối thế kỷ 19, cao su thiên nhiên là do Brazil độc quyền cung cấp từ các cây rừng. Để giải quyết nhu cầu về cao su ngày càng tăng, nƣớc Anh đã tìm cách trồng cây cao su ở các nƣớc châu Á. Năm 1876, Henry Wickham, nhà thực vật 5 Anh, đã chuyển 70.000 hạt cao su từ Brazil về Anh, sau đó những cây con từ nguồn hạt này đƣợc mang sang trồng ở Sri Lanka, Singapore, Malaysia và Indonesia. Từ 1883, cây cao su ở Sri Lanka và Malaysia có hạt và làm nguồn giống cung cấp cho nhiều nƣớc châu Á và châu Phi. Sau năm 1889, các vƣờn cao su châu Á bắt đầu sản xuất mủ, nhanh chóng vƣợt Brazil và đến nay vẫn giữ vị trí chủ đạo, đứng đầu là Thái Lan, Indonesia và Malaysia (Đặng Văn Vinh, 1997). Năm 1897 đánh dấu sự hiện diện của cây cao su ở Việt Nam. Công ty cao su đầu tiên đƣợc thành lập là Suzannah (Dầu Giây, Long Khánh, Đồng Nai) năm 1907. Tiếp theo sau hàng loạt đồn điền và công ty ra đời, chủ yếu là của ngƣời Pháp và tập trung ở Đông Nam Bộ: SIPH, SPTR, CEXO, Michelin,… Một số đồn điền cao su tƣ nhân Việt Nam cũng đƣợc thành lập. Đến năm 1920, miền Đông Nam Bộ có khoảng 7.000 ha và sản lƣợng 3.000 tấn. Cây cao su đƣợc đƣa vào trồng ở Tây Nguyên từ năm 1923 và phát triển mạnh trong giai đoạn 1960 – 1962, trên những vùng đất có cao trình 400 – 600 m, sau đó ngƣng vì chiến tranh. Trong thời kỳ trƣớc 1975, để có nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp miền Bắc, cây cao su đã đƣợc trồng vƣợt trên vĩ tuyến 17º Bắc (Quảng Trị, Quảng Bình, Nghệ An, Thanh Hoá, Phú Thọ) trong giai đoạn 1958 – 1963 từ nguồn giống từ Trung Quốc, diện tích đã lên tới khoảng 6.000 ha. Đến năm 1976, Việt Nam còn gần 76.000 ha, tập trung ở Đông Nam Bộ khoảng 69.500 ha, 3.482 ha ở Tây Nguyên và 3.636 ha ở các tỉnh duyên hải miền Trung và khu Bốn cũ. Sau năm 1975, cây cao su đƣợc tiếp tục phát triển chủ yếu ở Đông Nam Bộ tại các tỉnh Đồng Nai, Bình Dƣơng, Bình Phƣớc, Tây Ninh và Bà Rịa. Từ năm 1977, Tây Nguyên bắt đầu lại chƣơng trình trồng mới cao su, đầu tiên do các nông trƣờng quân đội, sau năm 1985 do các công ty quốc doanh và tƣ nhân đã tham gia trồng cao su từ năm 1992 đến nay. Ở miền Trung, sau năm 1984, cây cao su đƣợc phát triển ở Quảng Trị, Quảng Bình trong các công ty quốc doanh. (Trần Thị Thuý Hoa, 2006). 6 Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, cung cấp mủ và gỗ cho rất nhiều ngành công nghiệp. Đây cũng là loại cây có giá trị kinh tế cao trong các lĩnh vực nông – lâm – công nghiệp. Trong những năm gần đây, sản lƣợng mủ không ngừng đƣợc nâng cao nhờ những cải tiến về giống, kỹ thuật nông nghiệp, quy trình khai thác. v.v. Tính đến cuối năm 2006, diện tích cao su cả nƣớc đã đạt gần 511.900 ha với sản lƣợng 546.900 tấn, năng suất bình quân đạt 1.370 kg/ha/năm. Riêng các diện tích do Tập đoàn Cao su Việt Nam quản lý đạt năng suất bình quân là 1,86 tấn/ha/năm, đứng đầu trên thế giới. Năm 2006, toàn Ngành cao su xuất khẩu 707.895 tấn đạt kim ngạch xuất khẩu gần 1,3 tỷ USD, là nông sản đứng thứ 2 về kim ngạch xuất khẩu sau lúa (Tập đoàn Cao su Việt Nam, 2007). Trong tƣơng lai khi nghị định thƣ Kyoto đƣợc thông qua thì việc bán hạn ngạch về khí thải sẽ mang lại cho ngƣời trồng cao su thêm một khoản thu nhập đáng kể (Trần Văn Cảnh, 2006). Cùng với sự phát triển mạnh cây cao su thì những thiệt hại do bệnh gây ra cũng gia tăng đáng kể. Một phần do việc chọn lọc theo hƣớng sản lƣợng cao, sinh trƣởng nhanh đã làm thất thoát gen kháng bệnh. Mặt khác, do tình hình thời tiết – khí hậu có nhiều thay đổi và diễn biến phức tạp. Thêm vào đó, việc phát triển và chuyên canh cây trồng trên diện rộng trong vùng khí hậu nóng ẩm, mƣa nhiều đã dẫn đến sự phát sinh – phát triển mạnh về cả chủng loại cũng nhƣ mức độ bệnh, gây ảnh hƣởng không nhỏ đến vấn đề canh tác và hiệu quả kinh tế của nó, thiệt hại đến sản lƣợng và gia tăng chi phí sản xuất. Hiện nay, cao su đƣợc phát triển mạnh dƣới dạng tiểu điền, nên thiệt hại do bệnh gây ra đã ảnh hƣởng trực tiếp đến đời sống của những ngƣời trồng cao su. Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công, trong đó có 24 loài có tầm quan trọng về kinh tế. Đến năm 2003, Phan Thành Dũng và cộng tác viên (ctv) cho biết có 8 loại bệnh cao su chính gây ảnh hƣởng trực tiếp đến sinh trƣởng và sản lƣợng cây cao su trong nƣớc, trong đó có 4 loại bệnh lá, 2 bệnh thân cành, 1 bệnh mặt cạo và 1 bệnh rễ. Đáng kể trong các loại trên, bệnh rụng lá 7 Corynespora là bệnh mới xuất hiện năm 1999 và đang có chiều hƣớng mở rộng phạm vi gây hại cho các dvt cao su mới (Phan Thành Dũng, 2004). 2.2. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su. 2.2.1. Phân loại học Bệnh rụng lá Corynespora đƣợc ghi nhận xuất hiện lần đầu tiên trên cây cao su thực sinh tại Sierra Leone (châu Phi) năm 1949. Năm 1954, Wei. tổng hợp và đặt tên nấm gây bệnh là Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.. Theo nghiên cứu phân loại gần đây nhất (Kirk và Paul, 2004 – trích dẫn bởi Lê Văn Huy, 2006) thì nấm C. cassiicola đƣợc phân loại nhƣ sau: Giới nấm (Fungi). Ngành (Phylum): Ascomycota. Lớp (Class): Ascomycetes. Bộ (Order): Pleosporales. Họ (Family): Corynesporascaceae. Giống (Genus): Corynespora. (Nguồn: 2.2.2. Hình thái khuẩn ty, khuẩn lạc, bào tử và điều kiện nuôi cấy Khuẩn ty của nấm có màu xám đến nâu. Khuẩn lạc biến thiên rất lớn về tốc độ sinh trƣởng, hình thái, độ dày, độ mịn và màu sắc khuẩn lạc cho dù đƣợc phân lập từ một bào tử duy nhất (Dung, 1995). Trên môi trƣờng PDA (Potato Dextrose Agar), PSA (Potato Sucrose Agar) khuẩn lạc có màu xám đến nâu (Liyanage & Jayasinghe, 1988). Về hình thái và hình dạng bào tử trên vết bệnh cũng nhƣ trong môi trƣờng nhân tạo có sự biến thiên rất lớn. Bào tử trên lá có màu nâu nhạt với dạng hình lƣỡi liềm hay thẳng chứa nhiều vách ngăn. Chiều dài biến thiên lớn (22 – 300 m), đôi 8 khi đạt 700 m. Chiều rộng biến thiên từ 5 – 10 m. Bào tử dạng đơn, đôi khi dạng chuỗi dính với nhau ở hai đầu gọi là hilum. Bào tử phát tán nhờ gió và hạt mƣa, phóng thích vào ban ngày, và tại Việt Nam cao điểm từ 8 – 11 giờ sáng. Sau thời gian mƣa nhiều và tiếp theo nắng ráo, số lƣợng bào tử phóng thích nhiều nhất do nấm cần ẩm độ cao để hình thành bào tử (Phan Thành Dũng, 2004; Ellis và Holiday, 1971). Trên vết bệnh, số lƣợng bào tử có khi lên đến 1.200 bào tử/cm2. Nấm C. cassiicola rất ít hình bào tử trên môi trƣờng nhân tạo, số lƣợng bào tử cũng thay đổi tùy dvt. Có dvt sản xuất trên 100.000 bào tử trên 1 đĩa petri trong khi chủng khác lại không tạo bào tử (Liyanage và Jayasinghe, 1986). Nếu dùng các biện pháp kích thích nhƣ: để tối liên tục 3 ngày, sau đó chiếu sáng liên tục 3 ngày bằng ánh sáng huỳnh quang hay chiếu sáng bằng tia cực tím trong thời gian ngắn.v.v... sẽ làm tăng số lƣợng bào tử (Chee, 1988). Dƣới điều kiện tối ƣu: phạm vi nhiệt độ từ 25 – 30oC, ẩm độ 100% bào tử nảy mầm trong 3 giờ (Liyanage và Jayasinghe, 1988) và phát triển ống mầm ở vị trí nằm giữa hai vách, nhƣng phổ biến nhất ở hai đầu của bào tử. Nhiệt độ từ 15 – 20oC, bào tử nảy mầm sau 12 giờ và khi nhiệt độ trên 35 – 40oC bào tử không nảy mầm đƣợc. Ẩm độ trên 96% và nếu không có nƣớc tự do hiện diện thì bào tử vẫn có thể nảy mầm đƣợc nhƣng thời gian ủ bệnh kéo dài hơn 24 giờ. Bào tử có khả năng tồn tại trên các vết bệnh cũng nhƣ trong đất với thời gian kéo dài, trên lá cao su khô nấm vẫn tồn tại và giữ nguyên khả năng gây bệnh đến 3 tháng (Phan Thành Dũng, 2004). Điều kiện nuôi cấy: Nấm có thể nuôi cấy trên nhiều môi trƣờng khác nhau, với pH thay đổi tùy môi trƣờng: PDA (pH: 6,8 – 7), PSA (pH: 6,8 – 7,0): Rose Ben Agar (pH: 5,5); Czapek Dox Agar (pH: 6,8 – 7,2); Corn Meal Agar (pH: 6,8 – 7,0). Richard’s medium (pH: 5,4). Tuy nhiên môi trƣờng PDA là môi trƣờng tối ƣu cho sự phát triển của nấm, 9 môi trƣờng PSA hay dịch chiết cao su + dextrose + agar là hai môi trƣờng thích hợp nhất cho sự hình thành bào tử (Liyanage và cộng sự, 1986). 2.2.3. Phổ kí chủ, sự xâm nhiễm của nấm C. cassiicola Nấm C. cassiicola có phổ kí chủ rộng, gồm khoảng 150 loài ký chủ thuộc các nhóm cây ăn quả, cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây ngũ cốc, cây rau màu và nhiều loại cây cảnh khác. Chúng phân bố trên 80 nƣớc, ở nhiều vùng khí hậu từ nhiệt đới đến ôn đới và gây hại trên tất cả bộ phận của cây từ lá tới rễ. Tuy nhiên, nấm C. cassiicola trên cây cao su là ký sinh chuyên biệt (Phan Thành Dũng, 2004). Nấm xâm nhập chủ yếu ở mặt dƣới lá qua biểu bì và khí khổng, ngoài ra nấm còn tiết ra men cellulozase giúp phân hủy màng tế bào. Sau khi bào tử nảy mầm, chúng mọc sâu vào vị trí vách ngăn của các tế bào dậu, sau đó khuẩn ty phân nhánh xâm nhiễm vào tế bào và hình thành bào tử 96 giờ sau đó. Trong quá trình sinh trƣởng nấm tiết ra độc tố cassiicolin (CC. toxin) chứa các amino acid, hợp chất này rất độc cho cao su cho nên chỉ với một vết bệnh nhỏ trên gân lá chính cũng đủ gây rụng lá (Phan Thành Dũng, 2004). Đây là loại độc tính chuyên biệt, có tác động đến hiện tƣợng chết mô lá, vỏ và kích thích lá hình thành tầng rời, hậu quả là gây rụng lá. 2.3. Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su H. brasiliensis Muell. Arg. 2.3.1. Nguyên nhân và triệu chứng Bệnh do nấm C. cassiicola gây nên, nấm có khả năng gây hại cho cả lá già và lá non cũng nhƣ cuống lá và chồi với các triệu chứng biểu hiện rất khác nhau (Phan Thành Dũng, 2004). Trên lá: Vết bệnh màu đen với hình dạng xƣơng cá dọc theo gân lá, vết bệnh lan rộng nếu điều kiện thuận lợi, gây chết từng phần lá do sự phá hủy của lục lạp, sau đó lá đổi màu vàng cam và rụng từng lá một. Trên lá non vết bệnh hình tròn màu xám đến nâu với quầng màu vàng xung quanh, có khi hình thành lỗ thủng. Lá quăn và biến dạng, sau đó rụng toàn bộ. 10 Hình 2.1. Triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora trên lá trƣởng thành Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN. Hình 2.2. Triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora trên lá non và cành Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN. Trên chồi và cuống lá: Các chồi xanh dễ nhiễm bệnh, đôi khi nấm bệnh cũng gây hại chồi đã hóa nâu. Dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có dạng hình thoi, có mủ rỉ ra sau đó hóa đen, vết bệnh có thể phát triển dài đến 20 cm gây chết chồi, đôi khi chết cả cây. Nếu dùng dao cắt bỏ lớp vỏ ngoài sẽ xuất hiện những sọc đen ăn sâu trên gỗ, chạy dọc theo vết bệnh. Trên cuống lá với vết nứt màu đen có chiều dài 0,5 – 3,0 mm. Nếu cuống lá bị hại, toàn bộ lá chét bị rụng khi còn xanh mặc dù không có một triệu chứng nào xuất hiện trên phiến lá. 11 2.3.2. Điều kiện phát sinh bệnh Có ba yếu tố dẫn đến sƣ phát sinh bệnh trên cây cao su gồm: a. Dòng vô tính cao su mẫn cảm : tính mẫn của của các dvt cao su thì tùy thuộc vào điều kiện từng nƣớc cũng nhƣ giai đoạn phát triển. Nhƣ dvt RRIC 103 trƣớc đây đƣợc xem là kháng bệnh ở Indonesia nhƣng đột nhiên trở nên nhiễm nặng. Trong khi dvt PB 260 là dvt có triển vọng về sản lƣợng và kháng bệnh tại Malaysia, Indonesia, nhƣng bị hại rất nặng tại Cameroon và Châu Phi. Dòng vô tính RRIM 725 mẫn cảm ở giai đoạn cây con nhƣng kháng khi trƣởng thành (Darussamin và Pawirosoemardjo, 1996). b. Nấm hình thành nòi mới: nấm dễ thích nghi với điều kiện môi trƣờng để hình thành nòi mới, vƣợt qua tính kháng của một số dvt, cũng nhƣ đáp ứng khác nhau với thuốc trị bệnh. Nòi mới hình thành gồm ba yếu tố sau: đáp ứng với điều kiện địa lí, đáp ứng với cây ký chủ khác, đáp ứng với dvt cao su, trong đó yếu tố đầu và cuối có vai trò quan trọng đến mức độ gây hại của nấm với cao su từng vùng. c. Môi trƣờng thuận lợi cho nấm bệnh cao su phát triển: cũng nhƣ nhiều loại bệnh khác, sự phát dịch, lây lan và tác hại của C. cassiicola có liên quan đến các yếu tố môi trƣờng nhƣ độ ẩm, nhiệt độ, lƣợng mƣa, độ cao và độ màu mỡ của đất (CFC/INRO A Proposal, 1999). RRIM 600 nhiễm bệnh nặng tại Johore (Malaysia), nhƣng không bị bệnh ở vùng có mùa khô kéo dài nhƣ Kedah và Pelis (Darussamin và Pawirosoemardjo, 1996). Một số ghi nhận cho rằng, ở độ cao trên 300 m thì cao su ít bị bệnh hơn (Jaysinghe, 2000). 2.3.3. Tác hại của bệnh và cách phòng trị Tác hại Mức nguy hại của bệnh tùy thuộc vào mức độ kháng của dvt và giai đoạn tuổi. Tùy theo sự tƣơng thích giữa ký sinh, ký chủ và môi trƣờng. Bệnh gây hại quanh năm vào mọi giai đoạn sinh trƣởng của cây cao su. 12 Ở cây con trong giai đoạn kiến thiết cơ bản, bệnh xuất hiện quanh năm gây rụng lá, làm chậm sự phát triển, cuối cùng gây chết cây. Ở cây cao su trƣởng thành mẫn cảm với bệnh có thể gây giảm 20 – 25% sản lƣợng. Do bệnh có khả năng gây hại cho mọi lứa tuổi cây và xuất hiện quanh năm nên việc sử dụng dvt kháng bệnh là biện pháp khả thi nhất. Cách phòng trị: (Phan Thành Dũng, 2004) Không trồng các dvt mẫn cảm với bệnh nhƣ RRIC 103, 104, KRS 21, RRIM 725, RRIM 600, Fx 25, IAN 873, PPN 2058, 2444, 2447. Ghép tán bằng dvt kháng bệnh. Tạo tuyển các dòng cao su kháng bệnh. Cần sự hỗ trợ của công nghệ sinh học nhằm tạo tuyển nhanh, chính xác và kinh tế các dvt kháng bệnh. Trị bệnh bằng thuốc trừ nấm nhƣ: Bordeaux 0,75%, Zineb 80WP 0,75%, Benlate 50WP 0,5%, Score, Anvil 5SC, Propineb 50WP 0,5% chu kỳ 10-14 ngày/lần. Chú ý phun mặt dƣới lá nơi nấm thƣờng xâm nhiễm. Tuy nhiên, biện pháp sử dụng hóa chất hiện nay chỉ áp dụng cho pham vi qui mô nhỏ, vƣờn ƣơm, vƣờn nhân, cây cao su trong giai đoạn kiến thiết cơ bản vì lý do kinh tế và hiệu quả. 2.4. Phòng trị bệnh bằng thuốc bảo vệ thực vật 2.4.1. Lịch sử và phân loại thuốc bảo vệ thực vật Thuốc bảo vệ thực vật đƣợc biết vào thời cổ đại, khi ngƣời La Mã biết dùng hơi lƣu huỳnh để trừ côn trùng và muối để trừ cỏ. Vào thế kỷ thứ 9, ngƣời Trung Hoa sử dụng arsenic hòa trong nƣớc diệt trừ côn trùng. Đầu thế kỷ 19, pyrethrin và rotenone chiết xuất từ cây cúc dại và cây thuốc cá cũng đƣợc dùng trừ nhiều loại côn trùng. Hỗn hợp Paris xanh gồm CuSO4 và arsenic dùng trừ bọ cánh cứng Colorado khoai tây năm 1865. Ngày nay, với sự phát triển nhanh chóng của ngành hoá học, đã có rất nhiều loại hóa chất ra đời để đáp ứng nhu cầu bảo vệ thực vật của con ngƣời (Phan Thành Dũng, 2004). 13 Có nhiều cách phân loại thuốc bảo vệ thực vật, nhƣng thƣờng phân loại theo đối tƣợng phòng trừ nhƣ: Thuốc trừ sâu, trừ bệnh, trừ cỏ, trừ chuột, trừ nhện, trừ ốc sên, thuốc điều tiết sinh trƣởng cây trồng,... Trong mỗi nhóm trên, thƣờng phân ra các nhóm nhỏ hơn theo gốc hóa học. Nhƣ thuốc trừ bệnh gồm có 2 nhóm lớn là nhóm vô cơ và nhóm hữu cơ. Nhóm vô cơ nhƣ nhóm đồng, nhóm lƣu huỳnh, nhóm thủy ngân. Nhóm hữu cơ nhƣ nhóm lân hữu cơ, nhóm Carbamate, nhóm Dithiocarbamate, nhóm Triazole. Ngoài ra còn có nhóm Dicarboximit, nhóm thuốc sinh học (Phạm Văn Biên và ctv, 2006). 2.4.2. Triazole - Nhóm thuốc trừ nấm Nhóm thuốc Triazole là những thuốc trừ nấm thế hệ mới nhất, có tính chọn lọc cao, nội hấp, hiệu lực mạnh, đang đƣợc phát triển và sử dụng nhiều. Nó là nhóm thuốc có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp ergosterol, liều sử dụng thấp, ít độc với ngƣời và gia súc. Nó thuộc nhóm chất lƣu dẫn, đƣợc cây hấp thu qua rễ, thân, lá và dịch chuyển đến các bộ phận khác qua hệ thống bó mạch. Thuốc lƣu dẫn theo hƣớng lên và hiếm khi từ trên xuống. Các loại thuốc này hiệu quả trong phòng cũng nhƣ trị bệnh (Phan Thành Dũng, 2004; Phạm Văn Biên và ctv, 2006). Cơ chế tác động của thuốc nhóm Triazole là kìm hãm quá trình sinh tổng hợp ergosterol (thông thƣờng sự phá hoại của vật gây bệnh tăng khi có hàm lƣợng ergosterol tăng), ngăn cản sự hình thành rễ bám hay giác mút, sự sinh trƣởng của tản nấm và sự hình thành bào tử. Các thuốc này xâm nhập và dịch chuyển trong cây rất nhanh (Nguyễn Trần Oánh, 1997). Công thức cấu tạo của gốc Triazole nhƣ sau: Các thuốc nhóm Triazole có tính nội hấp, thuốc nhanh chóng thấm qua bề mặt và phân bố đều trong lá, lƣu dẫn mạnh trực tiếp đến các vết bệnh nơi nấm xâm 14 nhập. Hiệu quả của thuốc kéo dài nhờ vào đặc tính phòng bệnh (ngăn chặn sự xâm nhập của nấm bệnh), trị bệnh (chặn đứng sự tiến triển của nấm bệnh) và diệt triệt để (nấm đã xâm nhập và các bào tử mới). Thuốc đạt hiệu quả phòng trị cao, giảm chi phí công lao động và số lần phun. Ví dụ thuốc Opus 75EC là thuốc trừ nấm thế hệ mới với hoạt chất Epoxiconazole, sản phẩm của Công ty BASF (Cộng hòa Liên bang Đức). Opus 75EC còn kích thích cơ chế tự kháng bệnh của cây, giúp dƣỡng cây xanh lá. Thuốc Sumi-Eight 12 là thuốc trừ nấm phổ rộng với hoạt chất Diniconazole còn có tác dụng dƣỡng cây, cây khỏe, bộ lá xanh hơn, tăng khả năng chống chịu sâu bệnh. ( 2.4.3. Tình hình sử dụng hóa chất trong kiểm soát bệnh rụng lá Corynespora Sử dụng hóa chất là chiến lƣợc quản lý bệnh có hiệu quả nhanh nhất, nó đƣợc áp dụng trong hầu hết các lĩnh vực trồng trọt, đƣợc nông dân áp dụng phổ biến và có khả năng đem lại kết quả tốt. Mặc dù đã có những báo cáo liên quan đến giá trị và ảnh hƣởng xấu của hóa chất bảo vệ thực vật tới môi trƣờng, nông dân vẫn tiếp nhận nó. Các phƣơng pháp sinh học trong kiểm soát bệnh, bao gồm cả thao tác di truyền, đã đƣợc ủng hộ trong vài thập kỷ qua, nhƣng thuốc hóa học vẫn chƣa bị loại bỏ trong chƣơng trình quản lý bệnh thực vật. Phƣơng pháp kết hợp cả sinh học lẫn hóa học trong quản lý bệnh đang đƣợc áp dụng rộng rãi. Để kiểm soát bệnh cho những cây trồng giá trị cao, cung cấp cho các ngành công nghiệp vật liệu nhƣ cao su thì hóa chất bảo vệ thực vật vẫn có thể còn đƣợc sử dụng trong thời kỳ lâu dài, bởi vì các hóa chất hầu nhƣ không nhiễm vào sản phẩm của cây cao su, do đó không ảnh hƣởng trực tiếp đến ngƣời tiêu dùng. Trong các vùng trồng cao su nhƣ Ấn Độ, việc sử dụng hóa chất để kiểm soát bệnh đã đƣợc thực hiện gần một thế kỷ. Bệnh nấm hồng gây bởi Corticium salmonicolor và bệnh rụng lá mùa mƣa gây bởi Phytophthora spp đƣợc kiểm soát bởi thuốc trừ nấm đã đƣợc đề ra và áp dụng rộng rãi ngay từ năm 1910 ở Ấn Độ và Sri Lanka. 15 Kiểm soát bằng thuốc hóa học với bệnh rụng lá Corynespora đã đƣợc giới thiệu khi bệnh xuất hiện lần đầu tiên trên vƣờn ƣơm ở Ấn Độ khoảng năm 1958. Việc phun hỗn hợp Bordeaux (1%) hay Zineb (0,24%) với lƣợng phun 2 lần trong 3 tuần, trong suốt khoảng thời gian của mùa bệnh đã đƣợc đề ra để kiểm soát bệnh. Cả 2 loại thuốc trừ nấm tiếp xúc và lƣu dẫn đều đƣợc thử nghiệm rộng rãi trong phòng thí nghiệm và ngoài vƣờn ƣơm. Trong các thử nghiệm in vitro chỉ ra rằng Carbendazim ức chế mầm bệnh phát triển hoàn toàn ở nồng độ 25 ppm a.i.. Trong thí nghiệm trên vƣờn ƣơm Mancozeb (0,2%), Carbendazim (0,5%) và tổ hợp Metalaxyl + Mancozeb (0,2%) đều có hiệu quả phòng trị bệnh. (Manju, 2006) Các loại thuốc đã đƣợc báo cáo có hiệu quả phòng trị nấm C. cassiicola là: Nhóm thuốc tiếp xúc nhƣ: Bordeaux, Mancozeb, Captafol, Chlorothalonil. Nhóm thuốc lƣu dẫn nhƣ: Carbendazim, Tridemorph, Hexaconazole. Các thuốc hỗn hợp nhƣ: Metalaxyl + Mancozeb (0,2%), Benomyl và Thiram, Copperoxychloride (21%) + Mancozeb (20%), Propineb (56%) + Oxadixyl (10%), Mancozeb (63%) + Carbendazim (12%), Hexaconazole + Captan, Difenoconazole cũng đƣợc báo cáo có hiệu quả phòng trị bệnh. (Srinivas và Idicula, 2006) 16 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành Thí nghiệm đƣợc thực hiện từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007 Địa điểm tiến hành tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật (BVTV), Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam (VNCCSVN). 3.2. Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nấm C. cassiicola đƣợc phân lập từ lá cao su thuộc dvt RRIV 4 có biểu hiện các triệu chứng đặc trƣng của bệnh rụng lá Corynespora. 3.3. Phƣơng pháp cơ bản 3.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu Mẫu nấm đƣợc lấy trên dvt RRIV 4 có vết bệnh đặc trƣng. Mẫu đƣợc lấy vào buổi sáng sớm khi độ ẩm không khí còn cao, bào tử còn nằm trên lá và chƣa phát tán vào không khí. Mẫu đƣợc ghi rõ tên dvt lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, lá non hay lá già, vết bệnh đặc trƣng hay không đặc trƣng. Mẫu lá bệnh đƣợc đặt vào hộp có đặt giấy thấm nƣớc để giữ ẩm. 17 3.3.2. Phân lập Hóa chất và dụng cụ Dụng cụ: bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri (9 cm đƣờng kính), que cấy, đèn cồn, pence, lame, lamelle, giá đỡ ống nghiệm, becher, kính hiển vi quang học, nồi hấp Tommy, tủ sấy, hộp đựng mẫu, giấy thấm nƣớc, bút lông. Hóa chất: Bảng 3.1 Thành phần môi trƣờng PSA, PDA Thành phần Môi trƣờng PSA (g/l) Môi trƣờng PDA(g/l) Khoai Tây 100 200 Đƣờng 10 (sucrose) 20 (dextrose) Agar 15 15 Nƣớc cất Nƣớc cất vừa đủ 1lít Nƣớc cất vừa đủ 1lít Cách chuẩn bị môi trƣờng PSA: Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 100 g, thái nhỏ hạt lựu, thêm 500 ml nƣớc cất 2 lần, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nƣớc trong. Thêm 15 g agar, 10 g đƣờng sucrose và nƣớc cất vừa đủ 1 lít vào dung dịch đã lọc. Đun sôi trong 3 phút, khuấy đều trong lúc nấu. Sau đó môi trƣờng đƣợc phân vào các bình tam giác đem hấp khử trùng ở 121 C/15 phút. Môi trƣờng PDA đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ môi trƣờng PSA. 18 Phƣơng pháp phân lập Lá có triệu chứng bệnh đặc trƣng đƣợc đƣa về phòng thí nghiệm, rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần, dùng que cấy nấm đã khử trùng ƣớt và khô, sau đó đốt trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy trực tiếp bào tử ngay trên vết bệnh cấy vào đĩa môi trƣờng (5 điểm/đĩa). Sau hai ngày những khuẩn lạc nghi ngờ là nấm C. cassiicola đƣợc cấy sang đĩa môi trƣờng mới (môi trƣờng PDA) và đặt dƣới ánh sáng đèn huỳnh quang 12 giờ/ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng (26 - 30ºC). Khi nấm phát triển, tiến hành kiểm tra và cấy chuyền sang môi trƣờng mới cho đến khi thu đƣợc nguồn nấm thuần chủng. Với phƣơng pháp phân lập nhƣ trên, sau khi phân lập các mẫu nấm cần phải đƣợc kiểm tra lại bằng cách quan sát hình thái sợi nấm và bào tử của nấm C. cassiicola dƣới kính hiển vi. 3.3.3. Phƣơng pháp nhân số lƣợng bào tử Nấm C. cassiicola rất khó tạo bào tử trên môi trƣờng nhân tạo, để tạo đƣợc nhiều bào tử có thể áp dụng theo phƣơng pháp sau: (Chee, 1988) Nuôi cấy nấm trên môi trƣờng PSA trong điều kiện tối liên tục 24/24 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 5 ngày. Sau đó sử dụng một tấm lame vô trùng cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử. Tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng hoàn toàn 24/24 giờ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau thời gian trên tiến hành kiểm tra lại nguồn nấm bằng cách soi bào tử dƣới kính hiển vi (đặt bào tử trong giọt nƣớc cất hoặc giọt dung dịch methylene blue). Hình dạng bào tử đƣợc so sánh với những mô tả của Ellis và Holiday (1971). Các nguồn nấm đƣợc xác định chính xác là nấm C. cassiicola sẽ đƣợc sử dụng vào những phân tích tiếp theo. 19 Các đĩa nấm có bào tử đƣợc cho thêm 20 ml nƣớc cất vô trùng, lắc đều để hoà tan bào tử vào nƣớc. Sau đó đổ dịch bào tử vào bình tam giác qua lƣới lọc, lắc đều sẽ đƣợc dịch bào tử sử dụng cho các thí nghiệm sau (Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005). 3.4. Khảo sát hiệu quả sử dụng hóa chất 3.4.1. Hoá chất Các thí nghiệm khảo sát đƣợc thực hiện với 9 hóa chất bảo vệ thực vật thuộc nhóm Triazole nhƣ sau: Bảng 3.2. Các loại thuốc sử dụng trong thí nghiệm Ký hiệu chữ Tên hoạt chất Tên thƣơng mại Cy Cyproconazole Bonanza 100SL Di Difenoconazole Score 250EC Fl Flusilazole Nustar 40EC He Hexaconazole Anvil 5SC Ta Triadimenol Bayfidan 250EC Te Tebuconazole Forlicur 250EW Ty Triacyclazole Flash 75WP Pr Propiconazole TilUSA super 250EC Tf Triadimefon Encoleton 25WP DC Đối chứng không xử lý thuốc Cách qui đổi từ nồng độ hoạt chất cần dùng ra nồng độ thƣơng phẩm: Nồng độ hoạt chất cần dùng (% a.i) * 100 % hoạt chất trong thuốc thƣơng phẩm Nồng độ thƣơng phẩm = 20 3.4.2. Khảo sát hiệu quả thuốc trên đĩa petri Bố trí thí nghiệm: Kiểu thí nghiệm: Khối đầy đủ ngẫu nhiên 2 yếu tố (Two Factor Randomized Complete Block Design). Số nghiệm thức: 9 hoá chất với 5 nồng độ là: 0,1; 0,5; 2,5; 12,5; 25. Cộng với 1 đối chứng có tổng số 46 nghiệm thức. Số đĩa thực hiện: Mỗi nghiệm thức thực hiện trên 4 đĩa, tổng số 184 đĩa/1 lần lặp lại Số lần lặp lại: 3 lần Thời gian thực hiện: từ ngày 22/05/07 đến ngày 22/06/07 Cách thực hiện: Sử dụng phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng nhƣ sau: Môi trƣờng PDA đƣợc chuẩn bị và khử trùng bằng phƣơng pháp nhiệt ƣớt (autoclave) ở nhiệt độ 121ºC trong 15 phút. Lƣợng thuốc đƣợc thêm vào môi trƣờng ở nhiệt độ 40 – 50ºC để có nồng độ tƣơng ứng (đổ 9 ml môi trƣờng sau đó thêm 1 ml thuốc). Lắc đều và để nguội. Cấy mẫu nấm có đƣờng kính 0,8 cm lấy từ khuẩn lạc đang phát triển (5 ngày tuổi) vào giữa đĩa. Đánh giá kết quả: Chỉ tiêu theo dõi: Đo đƣờng kính khuẩn lạc với khoảng cách 1 ngày 1 lần kể từ ngày cấy nấm. Cách đo đƣờng kính khuẩn lạc: d = (d1+d2)/2 Trong đó: d1, d2 là độ dài 2 đƣờng chéo phần khuẩn lạc phân bố. 21 Đánh giá hiệu lực của thuốc theo phƣơng pháp Finney (1968): Dựa vào chỉ số LD50 (Lethal Dose) là liều lƣợng làm chết 50% cá thể trong quần thể. Từ các nồng độ thí nghiệm và phần trăm ức chế đƣờng kính khuẩn lạc (% giảm so với đối chứng) lập phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính từ đó suy ra chỉ số LD50 của mỗi loại thuốc để đánh giá. LD50 < 10 mg a.i/l : Rất có hiệu lực. LD50 = 10 – 50 mg a.i/l : Hiệu lực trung bình LD50 = 51 – 125 mg a.i/l : Hiệu lực rất ít LD50 > 125 mg a.i/l : Không có hiệu lực Khảo sát ảnh hƣởng của hóa chất đến mật độ bào tử, kích thƣớc bào tử và sự nảy mầm của bào tử: Tính diện tích khuẩn lạc, tiếp theo cho nƣớc cất vào đĩa Petri theo tỷ lệ 1 ml/1cm2 dùng muỗng sắt cào đều trên bề mặt khuẩn lạc để tách bào tử, sau đó lấy 3 giọt dung dịch (mỗi giọt 10 µl) trên 1 đĩa, nhỏ lên lame và đếm số lƣợng bào tử. Từ đó tính ra mật độ bào tử trên cm2 diện tích khuẩn lạc. Dùng dung dịch trên đo kích thƣớc (dài, rộng) số vách ngăn của bào tử. Đo ngẫu nhiên 10 bào tử trên 1 đĩa Petri (40 bào tử/nghiệm thức/lần lặp lại). Dùng 0,1 ml dung dịch bào tử nhỏ trên lame, ủ 12 giờ sau đó cho thêm 1 giọt methylene blue (có bổ sung formon để ức chế sự nảy mầm tiếp tục của nấm nhằm thuận tiện trong việc theo dõi), đếm tỷ lệ bào tử nảy mầm và đo chiều dài của ống mầm (germtube) của 20 bào tử trên 1 nghiệm thức. 3.4.3. Khảo sát hiệu quả thuốc trên lá bệnh cắt rời Bố trí thí nghiệm: Kiểu thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 2 yếu tố (Two Factor Completety Randomized Design). 22 Số nghiệm thức: chọn 6 thuốc có hiệu quả tốt nhất trong thí nghiệm trên đĩa, mỗi thuốc chọn 3 nồng độ dựa vào chỉ số LD50*100 và LD99. Cộng với 1 đối chứng có tổng số 19 nghiệm thức. Số hộp thực hiện: Mỗi nghiệm thức thực hiện trên 1 hộp plastic có nắp đậy trong suốt (mỗi hộp có 6 lá cao su cắt rời), suy ra tổng số 19 hộp/1lần Số lần lặp lại: 2 lần trong cùng 1 đợt. Thời gian thực hiện: từ ngày 23/06/07 đến ngày 08/07/07 Cách thực hiện: Thu hái lá ở giai đoạn mới ổn định (lá mới chuyển từ màu nâu đỏ sang màu xanh lá mạ) của cùng 1 dvt, không có các triệu chứng nhiễm bệnh, giữ ẩm và đem về phòng thí nghiệm ngay. Rửa sạch lá bằng nƣớc cất, để ráo rồi đặt úp trên lƣới sắt trong hộp plastic, dƣới có lót sẵn giấy thấm ƣớt để giữ ẩm. Phun ƣớt đều dung dịch thuốc tƣơng ứng lên các lá. Để lá ráo nƣớc khoảng 1 giờ. Dùng bình phun nhỏ phun ƣớt đều dịch bào tử (đã đƣợc kiểm tra số lƣợng bào tử/ml dung dịch) lên các lá. Đậy nắp hộp và đặt dƣới ánh sáng đèn huỳnh quang trong 12 giờ/ngày, nhiệt độ phòng 28 ± 2ºC. Ghi nhận cấp bệnh vào ngày thứ 1, 3, 5, 7 ngày sau khi lây bệnh dựa theo bảng phân cấp bệnh của Bộ môn BVTV/VNCCSVN nhƣ sau: Cấp 0: Không bệnh. Cấp 1: Một vài vết bệnh hoặc đốm nhỏ nhìn kỹ mới thấy. Cấp 2: Các vết bệnh chiếm 1/8 diện tích mẫu lá. Cấp 3: Các vết bệnh chiếm 1/4 diện tích mẫu lá. 23 Cấp 4: Các vết bệnh chiếm 1/2 diện tích mẫu lá. Cấp 5: Các vết bệnh chiếm trên 3/4 diện tích mẫu lá. Đánh giá kết quả: Từ cấp bệnh tính ra tỉ lệ bệnh (TLB) và chỉ số bệnh (CSB) theo công thức. CSB (%) = (a x b) x 100/(n x 5) Với a: Số cây bị bệnh của mỗi cấp bệnh b: Cấp bệnh tƣơng ứng 5: Cấp bệnh cao nhất trong bảng phân cấp n: Tổng số cây điều tra TLB (%) = m x 100/n Với m: Số cây bị bệnh n: Tổng số cây điều tra 3.4.4. Khảo sát hiệu quả thuốc trên vƣờn gỗ ghép Bố trí thí nghiệm: Kiểu thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD: Completety Randomized Design). Số nghiệm thức: Từ kết