Khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase từ 3 chủng nấm Trichoderma sp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***OOO*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE TỪ 3 CHỦNG TRICHODERMA NGÀNH HỌC: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2002-2006 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN NHƢ HIẾN Thành phố Hồ Chí Minh tháng 8/2006 2 LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm tạ:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng.  Ths. Vƣơng thị Việt Hoa đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  Cô Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận và thực hiện đề tài.  Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nhiệm, Thầy Cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm.  Các Anh Chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực tập tốt nghiệp.  Các bạn bè của lớp công nghệ sinh học khóa 28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.  Các bạn bè ngoài lớp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp. Sinh viên thực hiện Nguyễn nhƣ Hiến 3 TÓM TẮT  Đề tài “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE TỪ 3 CHỦNG TRICHODERMA” thực hiện bởi sinh viên Nguyễn nhƣ Hiến, lớp DH02SH- Khoa CNSH-Trƣờng Đại Học Nông Lâm dƣới sự hƣớng dẫn bởi Th.s Vƣơng Thị Việt Hoa.  Thời gian và địa điểm: Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2006 đến tháng 6/2006, Tại Phòng Vi Sinh - khoa Công Nghệ Thực Phẩm - trƣờng Đại Học Nông Lâm.  Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng vi nấm Trichoderm. sp gồm 3 chủng D13, D14, D16. Chúng là vi nấm phân bố rộng rãi trong đất, có nhiều hệ enzyme (cellulase, amylase…). Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát và đánh giá hoạt lực hệ enzyme amylase của các chủng này (đƣợc cung cấp bởi phòng thí nghiệm trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên), để từ đó bổ sung vào các ứng dụng: công nghệ thực phẩm, công nghệ dệt, xử lý môi trƣờng…đáng chú ý là trong lĩnh vực bổ sung vào trong thức ăn gia súc và các dạng phân bón sinh học.  Những kết quả đạt đƣợc. Chọn ra đƣợc chủng Trichoderma có hoạt tính hệ enzyme amylase phân giải cao. Khảo sát đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến hệ enzyme amylase tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy (thời gian, nhiệt độ, pH). 4 MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ....................................................................................................................... 2 Tóm tắt ............................................................................................................................. 3 Mục lục ........................................................................................................................... 4 Danh sách các hình .......................................................................................................... 6 ........................................................................................................................................... Danh sách các bảng ........................................................................................................ 7 Danh sách các biểu đồ .................................................................................................... 8 I. MỞ ĐẦU. ..................................................................................................................... 9 II. Tổng quan tài liệu. .................................................................................................... 10 2.1. Giới thiệu về tinh bột .............................................................................................. 10 2.2. Quá trình thuỷ phân tinh bột. .................................................................................. 10 2.3. Giới thiệu về nấm Trichoderma.............................................................................. 17 2.3.1. Phân loại-Đặc điểm về hình thái. ........................................................................ 17 2.3.2. Đặc điểm về sinh lý, sinh hoá. ............................................................................. 18 III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................................... 19 3.1. Vật liệu ................................................................................................................... 19 3.2. Phƣơng pháp. .......................................................................................................... 21 3.2.1. Phƣơng pháp định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase bằng cách đo đƣờng kính vòng phân giải ...................................................................... 21 3.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma và tách chiết hệ enzyme amylase từ môi trƣờng nuôi cấy. ................................................................................................ 22 3.2.3. Phƣơng pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase ......................................... 22 3.2.4. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của pH đối vối enzyme amylase. .................. 23 3.2.5. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối vối enzyme amylase ........... 24 3.2.6. Phƣơng phàp xác định hoạt tính hệ enzyme amylase.( Phƣơng pháp Heinkel ). 24 5 IV. KẾT QUẢ................................................................................................................ 28 4.1. Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. ..................................... 28 4.2. Kết quả định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase bằng cách đo đƣờng kính vòng phân giải. ........................................................................................... 29 4.3. Kết quả khảo sát động học enzyme amylase. ......................................................... 31 4.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với enzyme amylase trên chủng D13 ................................................................................................................................ 39 4.5. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đối với enzyme amylase trên chủng D13. ... 41 V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................... 43 VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 45 6 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc bậc 3 của Enzyme Amylase. ............................................................ 14 Hình 2.2. Quá trình thủy phân Amylose........................................................................ 15 Hình 2.3. Quá trình thủy phân Amylopectin và Glycogen ............................................ 16 Hình 2.4. Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma. ...................................... 18 Hình 2.5. Trichoderma harzianum KRL – AG2 phát triển trên môi trƣờng PGA ........ 18 7 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1. Dung dịch đệm Mc Hvaice. .......................................................................... 23 Bảng 3.2. Các dung dịch đệm pH 3 – 6,5. ..................................................................... 23 Bảng 3.3. Bảng xác định hoạt tính enzyme amylase ..................................................... 26 Bảng 3.4. Nồng độ dung dịch tinh bột........................................................................... 26 Bảng 3.5. Các dung dịch của đồ thị tiêu chuẩn. ............................................................ 27 Bảng 4.1. Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu ............................. 28 Bảng 4.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 66 giờ. ...................................... 29 Bảng 4.3. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 84 giờ. ...................................... 30 Bảng 4.4. Kết quả đo OD của đồ thị tiêu chuẩn. ........................................................... 31 Bảng 4.5. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy.. ............. 32 Bảng 4.6. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy. .............. 34 Bảng 4.7. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy.. ............. 36 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với Enzyme Amylase của chủng D13 .............. 39 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của pH đối với Enzyme Amylase của chủng D13. ..................... 41 8 DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 66 giờ. ..................................... 29 Đồ thị 4.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 84 giờ. ..................................... 30 Đồ thị 4.3. Đƣờng chuẩn. .............................................................................................. 31 Đồ thị 4.4. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy. ............ 33 Đồ thị 4.5. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy. ............ 35 Đồ thị 4.6. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy. ............ 37 Đồ thị 4.7. Hoạt độ Enzyme Amylase của 3 chủng D13, D14, D16. ............................. 38 Đồ thị 4.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với Enzyme Amylase của chủng D13. ........... 40 Đồ thị 4.9. Ảnh hƣởng của pH đối với Enzyme Amylase của chủng D13. .................... 42 9 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Do áp lực kinh tế, việc tận dụng hiệu quả hơn nguồn thức ăn có hàm lƣợng dinh dƣỡng thấp cho gia cầm ngày càng gia tăng. Mặt khác, các quy định trong sản xuất thức ăn gia súc không cho phép sử dụng bất kỳ hoá chất hay thuốc khích thích nhằm tăng trƣởng gia súc, nâng cao năng suất vật nuôi. Một phƣơng pháp phổ biến đang đƣợc khuyến khích sử dụng rộng rãi để giải quyết vấn đề này là bổ sung các hệ enzyme thủy phân vào thức ăn gia súc nhằm tăng cƣờng sự tiêu hoá và hấp thu các chất dinh dƣỡng khó tiêu, hoặc loại bỏ các nhân tố kháng dinh dƣỡng . Một trong những nguồn enzyme đáng chú ý là hệ enzyme từ vi nấm Trichoderma. sp vi nấm này có nguồn enzyme phong phú, có hoạt lực mạnh và đƣợc sử dụng nhiều mục đích khác nhau, chúng đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, xử lý môi trƣờng… đáng chú ý là trong lĩnh vực bổ sung vào thức ăn gia súc và các dạng phân bón sinh học. Enzyme amylase là một enzym thủy phân tinh bột thông qua việc xúc tác thủy giải liên kết glucosid trong tinh bột. Enzyme amylase cũng đã đƣợc nghiên cứu và khảo sát một cách có hệ thống về các đặc điểm và cũng đƣợc phân lập và tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ: từ thực vật ( từ mầm mạch, mầm đậu tƣơng …), từ vi sinh vật (vi khuẩn Bacillus subtilis, nấm Aspegillus oryzae …). Góp phần vào định hƣớng nêu trên, đƣợc sự ủng hộ của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và khoa Công Nghệ Thực Phẩm chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase từ 3 chủng nấm Trichoderma. sp” 1.2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI. 1. Chọn chủng Trichoderma sp. có hoạt tính hệ enzym amylase phân giải cao 2. Khảo sát hoạt tính hệ enzym amylase tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma. 10 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về tinh bột Tinh bột là sản phẩm quang hợp của thực vật, là chất dự trữ quan trọng tích lũy trong cũ, quả, hạt( lúa: 60-80%; ngô: 65-75%; khoai tây: 12-20% …) Trong thực vật tinh bột tồn tại dƣới dạng hạt tinh bột, đƣờng kính 0,002-0,15 mm. Các loại thực vật khác nhau chứa các hạt tinh bột có hình dạng và kích thƣớc khác nhau. Tinh bột đƣợc tổng hợp ở thực vật gồm 2 thành phần chủ yếu:  Amylose - polysaccharide tan trong nƣớc, cho phản ứng màu xanh với Iod. Amylose có cấu tạo hoá học là chuỗi dài không phân nhánh của gốc α – D - glucopyranose nối với nhau bằng lien kết α -1,4 glycoside. Phân tử Amylose có trọng lƣợng khoảng 20000 - 50000, có dạng hình xoắn mỗi vòng chứa 6 phân tử glucose.  Amylopectin là polymer mạch nhánh chứa các đơn vị đƣờng đơn nối với nhau bằng lien kết α -1,4 glycoside và α -1,6 glycoside . Amylopectin cho màu tím đỏ với Iod. Trọng lƣợng phân tử thƣờng là vài triệu. Đa số các dạng tinh bột chứa từ 15 - 25% Amylose và 75 - 85% Amylopectin. 2.2. Quá trình thủy phân tinh bột 2.2.1. Giới thiệu về enzyme Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein. Nó cho phép các phản ứng cần thiết cho sự sống và sự sinh sản của tế bào diễn ra với tốc độ cao và với tính chất đặc thù là không tạo ra các sản phẩm phụ nhƣ ở các phản ứng thông thƣờng. Enzyme có trong tế bào của mọi sinh vật, không chỉ xúc tác cho các phản ứng trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào( invitro). a) Tính chất hóa - lý. do enzyme có bản chất là protein nên chúng cũng có những tính chất nhƣ các protein.  Khi hòa tan trong nƣớc, enzyme cho một dung dịch keo với những tính chất đặc trƣng nhƣ khuếch tán kém, áp suất thẩn thấu thấp, độ nhớt cao…  Enzyme có tính lƣỡng cực. 11  Mỗi enzyme có một điểm đẳng điện. tại điểm này, chúng có độ hòa tan thấp nhất.  Enzyme không chịu đƣợc nhiệt độ cao, dễ bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác.  Enzyme cũng bị phá hủy bởi các tác nhân phá hủy protein nhƣ các enzyme tiêu hóa( pepsin, tripsin…). b) Các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme.  Vận tốc ban đầu của phản ứng. Nếu khảo sát lƣợng cơ chất đƣợc biến đổi theo thời gian, ngƣời ta nhận thấy rằng đƣờng cong biểu diễn ban đầu là một đoạn thẳng với độ dốc không đổi, sau đó đƣờng biểu diễn bị uốn cong cho thấy lƣợng cơ chất bị biến đổi giảm đi, nghĩa là tốc độ phản ứng giảm đi và cuối cùng bị triệt tiêu khi tất cả các chất đều đƣợc biến đổi. Vo = tgαo Trong đó: Vo là vận tốc ban đầu. αo là góc hợp bởi đƣờng biểu diễn và đƣờng nằm ngang ở thời điểm to.  Nồng độ enzyme.. Tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ enzyme..  Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất Nếu nồng độ enzyme đƣợc giữ cố định và nồng độ cơ chất [S] thay đổi, ngƣời ta nhận thấy đầu tiên vận tốc phản ứng gia tăng nhanh chóng. Nhƣng khi [S] tiếp tục tăng, đƣờng biểu diễn uốn cong và với nồng độ [S] cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đƣờng biểu diễn tiệm cận với giá trị cực đại Vmax.  Ảnh hƣởng nhiệt độ Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), ngƣời ta thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tƣơng ứng hai hiện tƣợng khác nhau. + Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 40oC), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng (do nhiệt cung cấp năng lƣợng cho phản ứng). + Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme), vận tốc phản ứng giảm xuống do sự biến tính của protein. Đa số các enzyme mất hoạt tính 12 ở 80 – 100 oC. Khoảng nhiệt độ tối ƣu là khoảng nhiệt độ mà tại đó enzyme đạt hoạt tính cao nhất. Đa số các enzyme có nguồn gốc động vật nhiệt độ tối ƣu vào khoảng 40 – 50 oC, và các enzyme thực vật khoảng 50 – 60 oC.  Ảnh hƣởng của pH. Sự thay đổi pH gây nên: + Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptide của enzyme, làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức enzyme – cơ chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptide của enzyme. + Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn cản sự tạo thành phức enzyme – cơ chất trong trƣờng hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở dƣới dạng ion. Nhƣ vậy, hoạt tính của enzyme thay đổi theo pH của môi trƣờng và ngƣời ta có xác định giới hạn pH tối ƣu cho hoạt động của một enzyme. Ngoài pH tối ƣu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng và thông thƣờng ngoài giới hạn pH tối ƣu khoảng hai đơn vị thì vận tốc phản ứng không đáng kể (thấp hơn ít nhất 100 lần).  Tác nhân ức chế enzyme (inhibitor). - Ức chế thuận nghịch: + Ức chế cạnh tranh (compertitive inhibitor) tâm xúc tác enzyme với cơ chất. Chất ức chế cạnh tranh có hình dạng giống cơ chất do vậy dễ dàng tạo phức EI ngăn cản tạo phức ES. Cách khắc phục: tăng nồng độ cơ chất. + Ức chế không cạnh tranh: Ức chế không cạnh tranh chung (noncompertitive inhibitor). Chất ức chế gắn lên vị trí sát tâm hoạt động enzyme, không ngăn cản cơ chất gắn lên tâm hoạt động. 13 Ức chế cạnh tranh riêng (uncompertitive inhibitor). Chất ức chế gắn lên vị trí tâm hoạt động enzyme trong phức ES tạo thành, mà không gắn lên enzyme tự do. - Ức chế không thuận nghịch: xảy ra khi chất ức chế tạo liên kết hóa trị khá bền vững với enzyme. Ngoài ra trong nhóm này còn có một số chất ức chế khá đặc biệt, bình thƣờng chúng không hoạt động và chỉ hoạt động khi đƣợc gắn hóa trị với tâm hoạt động và làm mất hoàn toàn hoạt tính enzyme do đó chúng đƣợc gọi là chất ức chế tự sát (suicide inhibitor). 2.2.2 Giới thiệu về Enzyme amylase Enzyme amylase là nhóm enzyme phân giải tinh bột (carbohydrate). Enzyme amylase bao gồm: α-amylase, β- amylase, R-Enzyme (α-1,6-glycosidase), Amyloglycosidase… Tùy theo nguồn gốc mà mỗi loại enzyme có trọng lƣợng phân tử, hoạt tính, điều kiện phản ứng khác nhau.  α –amylase từ vi khuẩn (chủ yếu từ Bacillus subtilis var amyloliquefaciens và var amylosacchariticus). MW : 49000 Da ( theo Fisher và Stein – 1960) Hoạt tính: 4x105 SKB/g protein enzyme Điều kiện phản ứng: Top : 65-70 o C pHop : 6,5-7,5  α –amylase từ nấm Aspergillus orizae MW : 51000 Da Hoạt tính: 50000 SKB/g protein enzyme Điều kiện phản ứng: Top : 50-60 o C pHop: 5  α –amylase từ mầm mạch. MW: 42000-54000 Da Điều kiện phản ứng: Top: 70 o C 14 pHop: 5,5 (đơn vị SKB là lƣợng amylase thủy phân 1g dextrin giới hạn dạng β đến điểm mất màu với Iod trong thời gian 1 giờ, điều kiện chuẩn). Hình 2.1: cấu trúc bậc 3 của α - amylase. 2.2.3 Quá trình thủy phân tinh bột Enzyme Amylase cắt tinh bột tạo Dextrin và đƣờng.  α –amylase cắt các liên kết glycoside nằm bên trong phân tử tinh bột.  β- amylase cắt từng cặp đƣờng đôi (maltose) từ phía đầu của mạch carbohydrate.  R-Enzime còn gọi là α-1,6-glycosidase cắt các liên kết α-1,6-glycoside tại điểm xuất pháp mạch nhánh.  Ngoài ra Enzyme Amyloglycosidase lại có khả năng cắt từng đơn vị đƣờng đơn (glucose) từ đầu của mạch carbohydrate. 15 Hình 2.2: Quá trình thủy phân Amylose. 16 Hình 2.3. Quá trình thủy phân Amylopectin và Glycogen. 17 2.3. Giới thiệu về Trichoderma Persoon ex Gray (1801) phân loại Trichoderma nhƣ sau: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Euascomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma Theo hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da Silva (1968 ), Trichoderma thuộc họ Hypocreaceae, lớp Nấm túi Ascomycetes; các loài Trichoderma đƣợc phân thành 5 nhóm: Trichoderma. Longibrachiatum. Saturnisporum. Pachybasium. Hypocreanum. Trong đó, 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum có giai đoạn teleomorph (hình thái ở giai đoạn sinh sản hữu tính) là Hypocrea; nhóm Hypocreanum hiếm khi gặp dƣới dạng teleomorph độc lập; nhóm Saturnisporum không tìm thấy hình thức teleomorph . 2.3.1. Đặc điểm hình thái Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn ty . Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các chủng của Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh, chúng có thể đạt đƣờng kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 20OC. 18 Hình 2.4: Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma. 2.3.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá. Các loài Trichoderma thƣờng xuất hiện ở đất acid. Trichoderma phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và có thể phát triển tốt ở đất kiềm nếu nhƣ ở đó có sự tập trung một lƣợng CO2 và bicarbonat . Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ carbonhydrat, amino acid đến ammonia. Hình 2.5. Trichoderma harzianum KRL-AG2 phát triển trên môi trƣờng PDA (Vùng màu xanhchứa bào tử). Hình 2.4. Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma 19 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Vật liệu 3.1.1. Thời gian và địa điểm Thí nghiệm đƣợc thực hiện từ tháng 3/2006 đến tháng 6/2006. Địa điểm thí nghiệm tại Phòng Vi Sinh khoa Công Nghệ Thực Phẩm trƣờng Đại Học Nông Lâm.. 3.1.2. Đối tƣợng thí nghiệm Các thí nghiệm đƣợc thực hiện trên 3 chủng nấm Trichoderma : D13, D14, D16 đƣợc cung cấp từ phòng thí nghiệm trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. 3.1.3. Dụng cụ và hóa chất 3.1.3.1. Dụng cụ -Ống nghiệm : 100 ống. -Đĩa Petri: 15 cái. -Becher: 1000 ml, 500 ml, 250 ml, 100 ml -Phễu thủy tinh: -Pipet bầu : 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml -Pipet thẳng: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml -Bình định mức : 100 ml -Buret: 1 cái. -Erlen: 100 ml ,250 ml -Nồi hấp. -Và các dụng cụ thông thƣờng trong phòng thí nghiệm. 3.1.3.2. Hóa chất – Môi trƣờng  Môi trƣờng PGA ( môi trƣờng phân lập nấm mốc Trichoderma) Khoai tây 200 g Glucose 20 g Agar 20 g Nƣớc cất 1lit 20 Hấp khử trùng ở 121 oC trong 30 phút, pH=6,8  Môi trƣờng Zapeck ( môi trƣờng cảm ứng tổng hợp enzym amylase) NaNO3 2 g K2HPO4 1g MgSO4 0,5g KCl 0,5g FeSO4 0,01g Agar 20 g Nƣớc cất 1000 ml Tinh bột 10 g hấp khử trùng 121 0 C , 30 phút, pH 5.0 -5.5  Môi trƣờng bán rắn Môi trƣờng nuôi cấy ba chủng Trichoderma. sp để thu dịch chiết khảo sát hoạt tính enzym amylase Trấu 55 g Cám gạo 30 g Đƣờng thùng 4g Bã khoai mì 5 g Bột bắp 5 g (NH4)2HPO4 0,1g Ure 0,2g CaCl2 0,1g KCl 0,05g MgSO4 0,05g HCl 0,05g Nƣớc bổ sung Hấp khử trùng ở 121 oC trong 45 phút 21 3.2. Phƣơng pháp 3.2.1. Phƣơng pháp định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase bằng cách đo đƣờng kính vòng phân giải Chọn ra một chủng cho hoạt tính enzyme amylase cao để tiếp tục khảo sát động học và các yếu tố ảnh hƣởng. Cách tiến hành :  Chuẩn bị các môi trƣờng cảm ứng của các hệ enzym cần định hoạt tính và sơ bộ định lƣợng . +Chuẩn bị môi trƣờng Zapeck (0,5% tinh bột) cho 20 đĩa petri (400ml) NaNO3 0,8 g K2HPO4 0,4 g MgSO4 0,2 g KCl 0,2 g FeSO4 0,004 g Agar 8 g Nƣớc cất 400 ml Tinh bột 2 g hấp khử trùng 121 0 C , 30 phút, pH 5.0 -5.5  Cho vào ống nghiệm 20 ml môi trƣờng, hấp khử trùng 1210 C trong 30 phút  Sử dụng đĩa petri vô trùng, kích thƣớc bằng nhau. Cho 20 ml môi trƣờng trên từ ống nghiệm vào.  Cấy chấm mỗi chủng Trichoderma vào giữa đĩa Petri.  Ủ nhiệt độ phòng ( 25-30 0C ) trong 3 ngày  Cho thuốc thử và đo đƣờng kính vòng phân giải. Thuốc thử Lugol: 0,5g I2 và 5g KI trong nƣớc thành 200 ml. 22 3.2.2. Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma và tách chiết các hệ enzyme amylase từ môi trƣờng nuôi cấy - Chuẩn bị môi trƣờng Trichoderma đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng bán rắn theo phƣơng pháp nuôi cấy đƣợc cho vào các khay nhựa với hàm lƣợng 100 gam môi trƣờng/khay. Hấp khử trùng nhiệt độ 121 0 C, 1atm trong 40 -45 phút - Chuẩn bị nguồn giống Tạo huyền phù bào tử trong 10 ml nƣớc cất vô trùng, tiến hành đếm bào tử Trichoderma bằng phòng đếm hồng cầu , sao cho vào khay một thể tích dịch huyền phù đạt mật độ là 1 -1.5X105 bào tử /g môi trƣờng . - Nuôi cấy Ủ nhiệt độ phòng trong thời gian thích hợp, sau đó, enzym đƣợc tách chiết bằng cách:  Cân 10g canh trƣờng cho vào Erlen. Cho vào 100ml nƣớc cất và để trên máy lắc trong 1 giờ.  Sau 1 giờ, tiến hành lọc qua vải lọc.  Dịch lọc đƣợc đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút.  Thu lấy dịch ly tâm, định mức tới 100ml, sử dụng nhƣ dịch enzyme thô. 3.2.3. Phƣơng pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase:  Sử dụng chủng Trichoderma có hoạt tính cao, tiến hành nuôi cấy trong môi trƣờng bán rắn.  Khảo sát sự biến đổi hoạt tính của hệ enzyme amylase thủy phân chủ yếu theo thời gian nuôi cấy : 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h.. Tại mỗi thời điểm nuôi cấy, cho khoảng 10 g môi trƣờng hoà tan trong 100ml nƣớc cất, đem lọc thu dịch lọc. Dịch chiết đƣợc đem xác định họat tính hệ enzym amylase. 23 3.2.4. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính của enzyme  Chuẩn bị các dung dịch đệm ở các pH khác nhau Dung dịch đệm Mc Hvaine ( pH 2,2-8) A - Dung dịch acid citric 0,1M: 21,008 g acid citric trong 1 lit dung dịch. B - Dung dịch Na2HPO4 0,2M: 35,62 g Na2HPO4.2H2O (hoặc 71,7 g Na2HPO4.12H2O) trong 1 lit dung dịch. Bảng 3.1. dung dịch đệm Mc Hvaice (pH 2,2-8) X pH X pH X pH X pH 19,60 2,2 12,90 3,8 8,85 5,4 3,53 7,0 18,76 2,4 12,29 4,0 8,40 5,6 2,61 7,2 17,82 2,6 11,72 4,2 7,91 5,8 1,83 7,4 16,83 2,8 11,18 4,4 7,37 6,0 1,27 7,6 15,89 3,0 10,65 4,6 6,78 6,2 0,85 7,8 15,06 3,2 10,14 4,8 6,15 6,4 0,55 8,0 14,30 3,4 9,70 5,0 5,45 6,6 13,56 3,6 9,28 5,2 4,55 6,8 Bảng 3.2. Các dung dich đệm pH 3-6,5 ( theo Mc Hvaice) X 15,89 13,93 12,29 10,92 9,70 8,63 7,37 5,80 pH 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 Để nhận đƣợc các dung dịch có pH tƣơng ứng, cần thêm dung dịch “B” vào “X” ml dung dịch “A” để đạt thể tích cuối cùng là 20 ml. 24  Chuẩn bị canh trƣờng nuôi cấy Trichoderma, thời gian nuôi cấy là thời gian tối ƣu đã đƣợc xác định ở mục trên.  Sử dụng dịch chiết enzyme thô để khảo sát ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính enzyme.  Cân 10g canh trƣờng, thêm vào 100ml dung dịch đệm có pH cần khảo sát.  Dựng đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hoạt tính enzyme đối với pH. Suy ra pH tối ƣu (pHop) của enzyme . 3.2.5. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với họat tính của enzyme  Chuẩn bị canh trƣờng nuôi cấy Trichoderma, thời gian nuôi cấy là thời gian tối ƣu đã đƣợc xác định .  Sử dụng dịch chiết enzyme thô để khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với họat tính của enzyme : cân 10g canh trƣờng, thêm vào 100ml dung dịch đệm có pH tối ƣu đã đƣợc xác định .  Xác định hoạt tính của enzyme ở các nhiệt độ : 30 oC, 40 oC, 50 oC, 60 oC, 70 oC, 80oC.  Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hoạt tính enzyme đối với nhiệt độ nuôi cấy, suy ra nhiệt độ tối ƣu ( top ) của enzyme. 3.2.6. Phƣơng pháp xác định hoạt tính của hệ enzym amylase Phƣơng pháp HEINKEL (1956) 3.2.6.1 Nguyên tắc  Xác định lƣợng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iod.  Đơn vị hoạt động của enzyme là lƣợng enzyme có khả năng phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút ở 30oC. 25 3.2.6.2 Hóa chất -Dung dịch NaCl 0,1%: hòa tan 0,1g NaCl trong nƣớc thành 100ml. -Dung dịch Sulfosalicylic acid 20%: hòa tan 20g Sulfosalicylic acid trong nƣớc thành 100ml. -Dung dịch Iod (I2): hòa tan 1g Iod vào 5ml dung dịch có chứa 2g KI, thêm nƣớc cất đến 100ml. Khi dùng pha loãng dung dịch này 450 lần. -Dung dịch NaH2PO4 0,05M: hòa tan 1,9502 g NaH2PO4.2H2O trong nƣớc thành 250ml. -Dung dịch Na2HPO4 0,05M: hòa tan 0,8962 g Na2HPO4.12H2O trong nƣớc thành 50ml. -Dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0: trộn chung 87,7 ml dung dịch NaH2PO4 0,05M, 12,3 ml dung dịch Na2HPO4 0,05M và 100 ml nƣớc cất. -Dung dịch tinh bột 1%: hòa tan 1g tinh bột trong dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0 thành 100 ml. -Dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1%: hòa tan 1g tinh bột trong nƣớc cất thành 100 ml. Từ dung dịch này , chuẩn bị các dung dịch có chứa 2, 4, 6, 8, và 10 mg tinh bột trong 1 ml. + Lập đồ thị tiêu chuẩn: lấy 0,1 ml dung dịch đã chuẩn bị nhƣ trên, thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 0,1%, 0,2 ml dung dịch đệm phosphate, 0,1 ml nƣớc cất và 0,5 ml dung dịch Sulfosalicylic acid 20%, lắc đều rồi thêm 9 ml dung dịch Iod đã pha loãng 450 lần. So màu ở bƣớc sóng 560 nm. + Vẽ đồ thị tiêu chuẩn, trên trục hoành ghi số mg tinh bột , trục tung ghi hiệu số đọc đƣợc của mẫu có tinh bột so với mẫu không có tinh bột . 3.2.6.3 Cách tiến hành  Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch tinh bột 1%, 1 ml dung dịch NaCl 0,1% và 2 sml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0. Lắc đều, để ở 30oC trong 15 – 20 phút để dung dịch đạt đến 30oC, thêm vào hỗn hợp 1ml dung dịch enzyme đã đạt đến 30oC. Lắc đều và tiếp tục giữ ở 30oC trong 30 phút. Lấy ống nghiệm ra khỏi và cho ngay vào 5ml dung dịch Sulfosalicylic acid 20% để làm ngừng phản ứng.  Song song với mẫu thí nghiệm, làm mẫu kiểm tra cũng tƣơng tự nhƣ trên nhƣng cho dung dịch Sulfosalicylic acid 20% vào trƣớc, rồi mới cho enzyme vào sau. 26 DD Lô kiểm tra Lô đối chứng A A A B B B DD tinh bột 1 1 1 1 1 1 DD NaCl 1 1 1 1 1 1 DD đệm phosphate 2 2 2 2 2 2 30 o C( 15-20 phút) DD Enzyme 1 1 1 0 0 0 30 oC( 30 phút) DD acid sulfosalicylic 5 5 5 5 5 5 DD Enzyme 0 0 0 1 1 1 Tổng thể tích 10 10 10 10 10 10 Bảng 3.3. bảng xác định hoạt tính Enzyme Amylase  Lấy 1 ml của mẫu thí nghiệm,cũng nhƣ của mẫu kiểm tra cho vào ống nghiệm, thêm vào 9 ml dung dịch Iod đã pha loãng 450 lần. Lắc đều rồi so màu ở bƣớc song 560 nm. Lấy hiệu số đọc đƣợc trên máy giữa mẫu kiểm tra và thí nghiệm, đối chiếu với đƣờng cong tiêu chuẩn, tính số mg tinh bột đã bị phân giải. Hđ A = Số mg tinh bột bị phân giải * độ pha loãng * 10 (đơn vị UI) + Với 10 là độ pha loãng của enzyme khi thực hiện phản ứng phân giải tinh bột ( tổng thể tích 10 ml) 3.2.6.4 Dựng đƣờng chuẩn - Chuẩn bị dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1%. Hoà tan 1g tinh bột trong nƣớc cất thành 100ml. Từ dung dịch này, chuẩn bị các dung dịch có chứa 2, 4, 6, 8, 10 mg tinh bột trong 1ml. Bảng 3.4. Nồng độ dung dịch tinh bột DD Tinh bột 1% 0 2 4 6 8 10 DD Đệm 10 8 6 4 2 0 Nồng Độ (mg/ml) 0 2 4 6 8 10 27 - Lập đồ thị tiêu chuẩn từ các dung dịch trên Bảng 3.5. Các dung dịch đồ thị tiêu chuẩn DD tinh bột tiêu chuẩn 1% (ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 DD NaCl (ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 DD đệm phosphate (ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Nƣớc cất (ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 Sulfosalicylic Acid (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 DD Iod (ml) 9 9 9 9 9 9 Tổng thể tích (ml) 10 10 10 10 10 10 Đem so màu ở bƣớc sóng 560 nm 3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu Các số liệu thu đƣợc, đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Stapraphic 7.0 28 PHẦN IV. KẾT QUẢ 4.1. Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Các chủng sau khi đƣợc cấy vào trong môi trƣờng nuôi cấy bán rắn, sau thời gian 6 ngày đã hình thành bào tử, và chúng tôi tiến hành đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu để khảo sát quá trình phát triển và hình thành bào tử của 3 chủng Trichoderma sp. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 4.1. Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng đếm hồng cầu Chủng D13 D14 D16 Số lƣợng bào tử đếm đƣợc ( trong 80 ô lớn) 67 c 30 b 11 a Kết quả 3,35*108 1,50*108 0,55*108 Nhận xét: Qua bảng trên chúng tôi nhận thấy chủng D13 là chủng có quá trình hình thành bào tử nhiều nhất, cùng với quá trình sinh trƣởng lan tơ nhanh, nhiều và mạnh, chứng tỏ chủng D13 là chủng có tốc độ sinh trƣởng mạnh và hoạt lực enzyme cao. 29 4.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải 4.2.1. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 66 giờ Bảng 4.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 66 giờ CHỦNG ĐƢỜNG KÍNH TRONG (cm) ĐƢỜNG KÍNH NGOÀI (cm) ΔR (cm) D13 2 3,7 1,7 c D14 2,1 3,4 1,3 b D16 1,73 2,9 1,17 a 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 D13 D14 D16 CHỦNG ΔR (c m ) Đồ thị 4.1. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 66 giờ Nhận xét: qua bảng 1 và đồ thị 1 chúng tôi nhận thấy chủng D13 là chủng có đƣờng kính vòng phân giải lớn hơn hai chủng D14 và D16. Mặt khác, qua quan sát chúng tôi nhận thấy chủng D13 có tốc độ sinh trƣởng mạnh hơn, khuẩn ty mọc nhanh và đều hơn hai chủng D14 và D16. 30 4.2.2 Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 84 giờ Bảng 4.3. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 84 giờ CHỦNG ĐƢỜNG KÍNH TRONG (cm) ĐƢỜNG KÍNH NGOÀI (cm) ΔR (cm) D13 3,06 4,27 1,21 c D14 2,96 4,13 1,17 b D16 2,63 3,63 1 a 0 0,2 0, 0,6 0,8 1 1,2 1,4 D13 D14 D16 CHỦNG ΔR (c m ) Đồ thị 4.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 84 giờ Nhận xét: qua 2 lần khảo sát ở 66 giờ và 84 giờ ta thấy chủng Trichoderma D13 cho đƣờng kính vòng phân giải lớn hơn, chứng tỏ chủng D13 có hoạt lực enzyme amylase mạnh hơn hai chủng D14 và D16. 31 4.3. Kết quả khảo sát động học enzyme amylase  Dựng đƣờng chuẩn Đem so màu ở bƣớc sóng 560 nm thu đƣợc Bảng 4.4. Kết quả đo OD của đồ thị tiêu chuẩn Nồng độ tinh bột 1% OD 0 0,0052 2 0,1119 4 0,2111 6 0,3154 8 0,4147 10 0,5142 Đƣờng chuẩn y = 0,0508x + 0,0028 R 2 = 0,9999 0 0, 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 2 4 6 8 10 12 Tinh bột 1% O D Đồ thị 4.3. Đƣờng chuẩn 32  Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong 84 giờ. Trong quá trình nuôi cấy, thu dịch enzyme thô theo thời gian 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, và 84h. tiến hành xác định hoạt tính enzyme theo phƣơng pháp ở mục III.4. kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 4.3.1. Hoạt độ enzyme amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy Bảng 4.5. Hoạt độ enzyme amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy THỜI GIAN (giờ) THỂ TÍCH DỊCH ENZYME ΔOD SỐ mg TINH BỘT BỊ PHÂN GIẢI ĐỘ PHA LOÃNG HOẠT ĐỘ (UI/mg) HOẠT ĐỘ (UI/g) 24 100 0,028 0,55 10 55 55000 a 36 100 0,143 2,81 10 281 281000 b 48 100 0,325 6,4 10 640 640000 c 60 100 0,07 1,38 100 1380 1380000 f 72 100 0,0654 1,29 100 1290 1290000 e 84 100 0,065 1,28 100 1280 1280000 d Ghi chú: Các ký tự ( a, b, c…) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê học 33 Hoạt độ 24 36 48 60 72 84 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 0 20 40 60 80 100 Thời gian (giờ) H oạ t đ ộ (U I/ g) Hoạt độ Đồ thị 4.4. Hoạt độ enzyme amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy Nhận xét: qua bảng 7 và đồ thị 4. chúng tôi nhận thấy quá trình sinh tổng hợp tỉ lệ thuận với quá trình lan tơ, phát triển của chủng D13. Từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến 40 giờ, hoạt tính enzyme tăng chậm. Từ 48 giờ, hoạt tính enzyme tăng nhanh và đạt cực đại vào 60 giờ. Sau đó hoạt tính enzyme bắt đầu giảm. Giải thích: Từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến 40 giờ, hoạt tính enzyme tăng chậm là do vi nấm sử các chất dinh dƣỡng hòa tan, dễ hấp thụ có sẵn trong môi trƣờng. Sau khi các chất dinh dƣỡng dần cạn kiệt thì buộc vi nấm phải sản xuất hệ enzyme ( tƣơng ứng trên môi trƣờng cảm ứng) để thủy phân các hợp chất phức tạp, khó tiêu hóa thành những chất đơn giản, tiêu hóa đƣợc do đó làm cho hoạt tính enzyme tăng lên. Sau khi các chất dinh dƣỡng trong môi trƣớng bị thủy phân dần dần cạn kiệt dẫn đến hoạt tính enzyme giảm. 34 4.3.2. Hoạt độ enzyme amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy Bảng 4.6. Hoạt độ enzyme amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy THỜI GIAN (giờ) THỂ TÍCH DỊCH ENZYME ΔOD SỐ mg TINH BỘT BỊ PHÂN GIẢI ĐỘ PHA LOÃNG HOẠT ĐỘ (UI/mg) HOẠT ĐỘ (UI/g) 24 100 0,04 0,79 10 79 79000 a 36 100 0,056 1,1 10 110 110000 b 48 100 0,086 1,69 10 169 169000 c 60 100 0,053 1,04 20 208 208000 e 72 100 0,113 2,22 10 222 222000 f 84 100 0,092 1,81 10 181 181000 d Ghi chú: Các ký tự ( a, b, c…) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê học 35 Hoạt độ 24 36 48 60 72 84 0 50000 100000 150000 200000 250000 0 20 40 60 80 100 Thời gian (giờ) H oạ t đ ộ (U I/ g) Hoạt độ Đồ thị 4.5. Hoạt độ enzyme amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy. Nhận xét. : qua bảng 8 và đồ thị 5. chúng tôi nhận thấy quá trình sinh tổng hợp tỉ lệ thuận với quá trình lan tơ, phát triển của chủng D14. Từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến 40 giờ, hoạt tính enzyme tăng chậm. Từ 48 giờ, hoạt tính enzyme tăng nhanh và đạt cực đại vào 72 giờ. Sau đó hoạt tính enzyme bắt đầu giảm. 36 4.3.3. Hoạt độ enzyme amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy Bảng 4.7. Hoạt độ enzyme amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy THỜI GIAN (giờ) THỂ TÍCH DỊCH ENZYME ΔOD SỐ mg TINH BỘT BỊ PHÂN GIẢI ĐỘ PHA LOÃNG HOẠT ĐỘ (UI/mg) HOẠT ĐỘ (UI/g) 24 100 0,022 0,43 10 43 43000 a 36 100 0,026 0,51 10 51 51000 b 48 100 0,044 0,87 10 87 87000 d 60 100 0,044 0,87 20 174 174000 f 72 100 0,05 0,98 10 98 98000 e 84 100 0,04 0,79 10 79 79000 c Ghi chú: Các ký tự ( a, b, c…) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê học 37 Hoạt độ 24 36 48 60 72 84 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000 200000 0 20 40 60 80 100 Thời gian (giờ) H oạ t đ ộ ( U I/ g) Hoạt độ Đồ thị 4.6. Hoạt độ enzyme amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy Nhận xét. : qua bảng 9 và đồ thị 6. chúng tôi nhận thấy quá trình sinh tổng hợp tỉ lệ thuận với quá trình lan tơ, phát triển của chủng D16. Từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến 40 giờ, hoạt tính enzyme tăng chậm. Từ 48 giờ, hoạt tính enzyme tăng nhanh và đạt cực đại vào 60 giờ. Sau đó hoạt tính enzyme bắt đầu giảm. 38 4.3.4. Kết quả tổng hợp từ 3 chủng D13, D14, D16 về hoạt tính enzyme amylase theo thời gian nuôi cấy. 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 24 36 48 60 72 84 Thời gian (giờ) H oạ t đ ộ (U I/ g) D13 D14 D16 Đồ thị 4.7. Hoạt tính enzyme amylase của 3 chủng Trichoderma D13, D14, D16. Nhận xét: qua đồ thị 7 chúng tôi nhận thấy, hoạt tính enzyme amylase của cả 3 chủng Trichoderma tỉ lệ thuận với quá trình phát triển, lan tơ. Khoảng thời gian nuôi cấy tối ƣu của cả 3 chủng là từ 60-72 giờ, trong đó:  Thời gian tối ƣu của chủng D13 là 60 giờ.  Thời gian tối ƣu của chủng D14 là 72 giờ.  Thời gian tối ƣu của chủng D16 là 60 giờ. Kết quả tổng hợp từ: Đồ thị 1, Đồ thị 2, và Đồ thị 7, và Bảng 5 chúng tôi chọn ra chủng Trichoderma D13 là chủng cho hoạt tính enzyme amylase cao nhất, và tiếp tục đƣợc chọn để tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng. 39 4.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với enzyme amylase của chủng D13 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với enzyme amylase trên chủng D13 NHIỆT ĐỘ (oC) CHỦNG D13 SỐ mg TINH BỘT BỊ PHÂN GIẢI ĐỘ PHA LOÃNG HOẠT ĐỘ (UI/mg) HOẠT ĐỘ (UI/g) 30 0,15395 3,03 50 1515 1515000 c 40 0,21765 4,28 50 2140 2140000 d 50 0,2358 4,64 50 2320 2320000 e 60 0,2621 5,16 50 2580 2580000 f 70 0,1165 2,29 50 1145 1145000 b 80 0,07955 1,57 50 785 785000 a Ghi chú: Các ký tự ( a, b, c…) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê học 40 D13 30 40 50 60 70 80 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 0 20 40 60 80 100 Nhiệt độ (oC) H oạ t đ ộ (U I/ g) D13 Đồ thị 4.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với enzyme amylase trên chủng D13 Nhận xét. Theo bảng 10 và đồ thị 8 ta thấy: Khoảng nhiệt độ tối ƣu của enzyme amylase trên chủng Trichoderma D13 là 50-60oC. Nhiệt độ tối ƣu là 60oC. Ngoài khoảng nhiệt độ này, hoạt tính của enzyme amylase đều giảm. Giải thích: Mỗi loại enzyme đều có một khoảng nhiệt độ xác định mà tại đó enzyme đạt hoạt tính cao nhất gọi là khoảng nhiệt độ tối ƣu vá enzyme amylase cũng vậy. + Từ 0 – 40 oC enzyme vẫn hoạt động nhƣng hoạt động yếu. + Từ 50 – 60 oC là khoảng nhiệt độ tối ƣu nên enzyme hoạt động mạnh và đạt hoạt tính cao nhất tại 56 oC. + Trên 60 oC, hầu hết các enzyme đều bị biến tính bởi nhiệt nên hoạt tính enzyme giảm. 41 4.5. Kết quả khỏa sát ảnh huởng của pH đối với enzyme amylase trên chủng D13 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của pH đối với enzyme amylase trên chủng Trichoderma D13 pH THỂ TÍCH DỊCH ENZYME ΔOD SỐ mg TINH BỘT BỊ PHÂN GIẢI ĐỘ PHA LOÃNG HOẠT ĐỘ (UI/mg) HOẠT ĐỘ (UI/g) 3 100 0,0112 0,22 100 220 220000 a 3,5 100 0,0119 0,23 100 230 230000 b 4 100 0,0224 0,44 100 440 440000 c 4,5 100 0,0289 0,57 100 570 570000 d 5 100 0,039 0,77 100 770 770000 e 5,5 100 0,0415 0,82 100 820 820000 f 6 100 0,0482 0,95 100 950 950000 h 6,5 100 0,0446 0,88 100 880 880000 g Ghi chú: Các ký tự ( a, b, c…) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê học 42 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 1000000 0 2 4 6 8 pH H oạ t đ ộ (U I/ g) Hoạt độ Đồ thị 4.9. Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme amylase. Nhận xét. Qua bảng 11 và đồ thị 9 ta thấy: Hoạt tính của enzyme amylase tăng dần theo pH. PH từ 0-5, hoạt tính của enzyme tăng dần. Khoảng pH tối ƣu là 5,5-6,5. pH tối ƣu là 6. PH >6, hoạt tính của enzyme dảm dần. Giải thích: Hầu hết các enzyme đều có một khoảng pH xác định, mà tại đó enzyme ổn định và đạt hoạt tính cao nhất gọi là khoảng pH tối ƣu. enzyme amylase cũng vậy. + Từ pH< 4,5 là pH trong vùng acid nên enzyme bị giảm hoạt tính (do bất hoạt hoặc bị thủy phân bởi acid). + Từ 5,5-6,5 là khoảng pH tối ƣu và enzyme đạt hoạt tính cao nhất tại pH 6. + Từ pH> 6,5 môi trƣờng chuyển sang kiềm tính nên enzyme cũng bị giảm hoạt tính ( bị bất hoạt hoặc bị thủy phân) 43 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận Sau quá trình thực hiện thí nghiệm, chúng tôi đã thu đƣợc những kết quả sau.  Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu: Chủng D13 có tốc độ sinh trƣởng( lan tơ) và hình thành bào tử mạnh nhất.  Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải: Chủng D13 có đƣờng kính vòng phân giải cao nhất( cho hoạt tính enzyme amylase cao nhất).  Kết quả khảo sát động học:  Khoảng thời gian nuôi cấy tối ƣu của 3 chủng: 60-72 giờ.  Thời gian nuôi cấy tối ƣu của chủng D13: 60 giờ.  Thời gian nuôi cấy tối ƣu của chủng D14: 72 giờ.  Thời gian nuôi cấy tối ƣu của chủng D16: 60 giờ.  Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đối với hệ enzyme amylase của chủng D13:  Khoảng thời gian nuôi cấy tối ƣu: 60-72 giờ.  Thời gian nuôi cấy tối ƣu: 60 giờ.  Khoảng nhiệt độ thủy phân tối ƣu: 50-60 oC.  Nhiệt độ thủy phân tối ƣu: 56 oC.  Khoảng pH tối ƣu: pH 5,5-6,5.  pH tối ƣu: pH 6 2. Đề nghị Mặc dù đã cố gắng hoàn thành tốt đề tài, song do điều kiện về thời gian và các yếu tố khách quan nên không thể tránh khỏi những thiếu sót, vì lý do đó tôi đề nghi. Mở rộng nghiên cứu theo hƣớng:  Khảo sát ảnh hƣởng của cơ chất đối với hoạt tính enzyme.  Ứng dụng của enzyme trong một số lĩnh vực, đặc biệt là trong lĩnh vực chế biến thức ăn gia súc.  Khảo sát độc lực của nấm Trichoderma. sp đối với vật nuôi.  Khảo sát một số hệ enzyme khác nhƣ cellulase, pectinase, chitinase…từ Trichoderma. sp 44 PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu trong nƣớc. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đoàn Xuân Mƣợu, Phạm Văn Ty ( 1978) – “ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT HỌC TẬP III” ( p 134-136; 158) - Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội Gs.Ts Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Cƣờng (2003) – “ THÍ NGHIỆM HÓA SINH HỌC” ( p 104-107) - Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Tp.HCM Pgs.Ts Nguyễn Phƣớc Thuận, Th.s Phan Thế Đồng, Th.s Lê Thị Phƣơng Hồng, Th.s Đỗ Hiếu Liêm, Th.s Đinh Ngọc Loan (2003) - “ GIÁO TRÌNH SINH HÓA HỌC” ( p 10-30; 100-135) - Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Tp.HCM Gs.Ts Nguyễn Đức Lƣợng (2004) - “ CÔNG NGHỆ ENZYME” ( p 2; 8-31; 58) - Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP.HCM 2. Địa chỉ Websites.  Explorer/Key/Carbohydrate-Analysis.html   tml  Species.html  45 PHỤ LỤC Chủng D13 sau khi nhỏ dung dịch Lugol Chủng D13 46 Chủng D14 sau khi nhỏ dung dịch Lugol Chủng D14 47 Chủng D16 sau khi nhỏ dung dịch Lugol Chủng D16 48 KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU PHÂN TÍCH SỐ LIỆU VỀ KẾT QUẢ ĐO ĐƢỜNG KÍNH VÒNG PHÂN GIẢI SAU 66 GIỜ Multiple range analysis for DK66.DK by DK66.CHUNG -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- D16 3 1.1710000 X D14 3 1.3100000 X D13 3 1.7100000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits D13 - D14 0.40000 0.01636 * D13 - D16 0.53900 0.01636 * D14 - D16 0.13900 0.01636 * SAU 84 GIO Multiple range analysis for DK84.DK84 by DK84.CHUNG -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- D16 3 1.0100000 X D14 3 1.1710000 X D13 3 1.2110000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits D13 - D14 0.04000 0.01165 * D13 - D16 0.20100 0.01165 * D14 - D16 0.16100 0.01165 * 49 PHÂN TÍCH SỐ LIỆU CỦA CHỦNG D13 VỀ HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE THEO THỜI GIAN NUÔI CẤY Multiple range analysis for HODOD13.HODOD13 by HODOD13.GIO -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 24 3 5501.00 X 36 3 28101.00 X 48 3 64001.00 X 84 3 128001.00 X 72 3 129001.00 X 60 3 138001.00 X Analysis of variance ( HOAT DO D13 ) -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 4.9627E0010 5 9.9254E0009 999999.999 .0000 Within groups 1.2000E0001 12 1.0000E0000 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 4.9627E0010 17 PHÂN TÍCH SỐ LIỆU CỦA CHỦNG D14 VỀ HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE THEO THỜI GIAN NUÔI CẤY Multiple range analysis for HODOD14.HODOD14 by HODOD14.GIO -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 24 3 7901.000 X 36 3 11001.000 X 48 3 16901.000 X 84 3 18101.000 X 60 3 20801.000 X 72 3 22201.000 X -------------------------------------------------------------------------------- Analysis of variance ( HOAT DO D14 ) -------------------------------------------------------------------------------- 50 Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 4.7153E0008 5 94305000 999999.999 .0000 Within groups 1.2000E0001 12 1 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 4.7153E0008 17 PHÂN TÍCH SỐ LIỆU CỦA CHỦNG D16 VỀ HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE THEO THỜI GIAN NUÔI CẤY Multiple range analysis for HODOD16.HODOD16 by HODOD16.GIO -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 24 3 4301.000 X 36 3 5101.000 X 84 3 7901.000 X 48 3 8701.000 X 72 3 9801.000 X 60 3 17401.000 X -------------------------------------------------------------------------------- Analysis of variance ( HOAT DO D16 ) -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 3.2908E0008 5 65816000 999999.999 .0000 Within groups 1.2000E0001 12 1 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 3.2908E0008 17 51 PHÂN TÍCH SỐ LIỆU CỦA CHỦNG D13 VỀ HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE THEO NHIỆT ĐỘ THỦY PHÂN Multiple range analysis for NHDOD13.HODOD13 by NHDOD13.NHIETDO -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 80 3 78501.00 X 70 3 114501.00 X 30 3 151501.00 X 40 3 214001.00 X 50 3 232001.00 X 60 3 258001.00 X -------------------------------------------------------------------------------- Analysis of variance ( HOAT DO D13 THEO ND ) PHÂN TÍCH SỐ LIỆU CỦA CHỦNG D13 VỀ HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE THEO pH Multiple range analysis for HODOD13.HODOD13 by HODOD13.PH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 3 22001.000 X 3.5 3 23001.000 X 4 3 44001.000 X 4.5 3 57001.000 X 5 3 77001.000 X 5.5 3 82001.000 X 6.5 3 88001.000 X -------------------------------------------------------------------------------- Analysis of variance ( HOAT DO D13 VE PH ) -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.7556E0010 7 2.5080E0009 999999.999 .0000 Within groups 1.6000E0001 16 1.0000E0000 --------------------------------------------------