Khảo sát hoạt tính và tinh sạch protease từ hai chủng nấm mốc aspergillus oryzae và aspergillus kawasaki trên môi trường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ĐẬU THỊ KIM DUNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN Luận văn kỹ sƣ Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện : TS. NGUYỄN NGỌC HẢI ĐẬU THỊ KIM DUNG PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG Khóa : 2002 - 2006 CN. ĐỖ THỊ TUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY SURVEYING ACTIVITY OF PROTEASE AND PURIFYING PROTEASE EXTRACTING FROM TWO FUNGAL SPECIES ASPERGILLUS ORYZAE AND ASPERGILLUS KAWASAKI ON SEMI SOLID MEDIUM Graduation thesis Major : Biotechnology Professors : Student : PhD. NGUYEN NGOC HAI ĐAU THI KIM DUNG Vice Professor-PhD. NGUYEN TIEN THANG Term : 2002 - 2006 BA. ĐO THI TUYEN HCMC, 09/2006 iv LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến : * Ban Giám hiệu trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. * Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn, giải đáp mọi thắc mắc của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. * Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn tất khóa luận này. * Anh Nguyễn Diên Sanh, anh Nguyễn Duy Long là những cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã hỗ trợ cũng nhƣ cung cấp cho em nhiều kiến thức xung quanh đề tài. * Các bạn lớp CNSH K28 đã động viên, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn cũng nhƣ chia xẻ những vui buồn trong suốt thời gian học tập. * Các bạn phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. * Cuối cùng con xin cảm ơn bố mẹ đã, đang và mãi mãi là chỗ dựa vững chắc cả về tinh thần lẫn vật chất cho con niềm tin và động lực bƣớc vào đời. TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đậu Thị Kim Dung, Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Tháng 9/2006. “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC v ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN”. Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10/2/2006 đến ngày 1/6/2006 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM. Hội đồng hƣớng dẫn : PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG TS. NGUYỄN NGOC HẢI CN. ĐỖ THỊ TUYẾN Chế phẩm enzyme thô dạng bột của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki đƣợc chiết bằng nƣớc cất, thu đƣợc dịch chiết enzyme thô. Dịch chiết thô này đƣợc tủa với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60, 65, 70, 75 và cồn 960 ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 Cặn tủa thu đƣợc hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính protease nhằm tìm ra nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease. Từ đó khảo sát điều kiện tối ƣu cho hoạt động của protease từ dịch tủa enzyme thu đƣợc từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm đƣợc chạy qua sắc ký lọc gel và xác định trọng lƣợng phân tử protease bằng điện di. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau :  Ở cả hai chủng, nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1 : 4 là tối ƣu để tủa protease.  Protease của cả hai chủng hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 470C.  Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae cao hơn hoạt tính của Aspegillus kawasaki. MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa ..................................................................................................................................... i Trang tựa .......................................................................................................................... ii vi Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii Tóm tắt khóa luận ........................................................................................................... iv Mục lục ............................................................................................................................ v Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix Danh sách các hình và đồ thị .......................................................................................... xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2 1.3 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2 2.1 Khái quát chung về enzyme ...................................................................................... 3 2.1.1 Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme ........................................................... 3 2.1.2 Định nghĩa về enzyme ............................................................................................ 5 2.1.3 Phân loại enzyme .................................................................................................... 6 2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme ........................ 7 2.1.4.1 Hoạt tính enzyme ................................................................................................. 7 2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme ......................................... 7 2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống .......................................... 9 2.1.5.1 Nguồn thu nhận ................................................................................................... 9 2.1.5.2 Vai trò ................................................................................................................ 11 2.2 Khái quát chung về enzyme protease ...................................................................... 11 2.2.1 Định nghĩa enzyme protease ................................................................................ 11 2.2.2 Lƣợc sử phát triển các enzyme protease .............................................................. 12 2.2.2.1 Protease từ động vật .......................................................................................... 12 2.2.2.2 Protease từ thực vật ........................................................................................... 12 2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật ........................................................................................ 13 2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease......................................................................... 13 2.2.3.1 Từ động vật ........................................................................................................ 13 2.2.3.2 Từ thực vật ......................................................................................................... 13 2.2.3.3 Từ vi sinh vật ..................................................................................................... 14 2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease ............................................................................ 14 2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ...................................... 15 2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................... 15 2.3.1.1 Phân loại ........................................................................................................... 15 2.3.1.2 Đặc điểm ............................................................................................................ 15 2.4 Thu nhận enzyme protease từ phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt ................................ 16 2.5 Tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease ................................. 18 2.5.1 Trích ly enzyme .................................................................................................... 19 2.5.2 Quá trình tủa ........................................................................................................ 20 2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký ....................................................... 22 2.5.4 Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di SDS – PAGE ............................................................................................................................. 27 PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 29 3.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................................. 29 3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 29 3.2.1 Chế phẩm enzyme thô .......................................................................................... 29 3.2.2 Hóa chất ................................................................................................................ 29 vii 3.2.3 Thiết bị .................................................................................................................. 29 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .......................................................................................... 30 3.3.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 30 3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lƣợng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme thô .................................................................................................................................. 30 3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa enzyme protease ............................................................................................................ 36 3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động của protease .... 37 3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel...................................... 37 3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme bằng phƣơng pháp điện di SDS – PAGE ............................................................................................................. 41 3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 44 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................................................... 45 4.1 Hàm lƣợng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô ................................................ 45 4.2 Nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ƣu cho việc tủa protease .......................................... 45 4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 46 4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 48 4.3 Tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease ..................................................................... 49 4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 49 4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 51 4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960 và tủa bằng muối (NH4)2SO4 .................... 53 4.5 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease...................... 54 4.5.1 pH tối ƣu ............................................................................................................... 54 4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae ........................................................ 54 4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki .................................................... 54 4.5.2 Nhiệt độ tối ƣu ...................................................................................................... 55 4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ..................................................................... 55 4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................ 56 4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel ................................................................................... 56 4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae ................................................................................... 57 4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki .............................................................................. 59 4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki ................................................................. 62 4.7.1 Tủa protease bằng muối ........................................................................................ 62 4.7.2 Tủa protease bằng cồn .......................................................................................... 62 4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di trên gel SDS – PAGE ............................................................................................................................. 63 PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 67 5.1 Kết luận.................................................................................................................... 67 5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................................... 67 5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki ................................................................ 67 5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki .......................... 68 5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 69 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 70 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC THUẬT NGỮ Asp.oryzae : Aspergillus oryzae Asp.kawasaki : Aspergillus kawasaki CP : Chế phẩm (Chế phẩm enzyme dạng bột thô do phòng vi sinh ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp). ix CBB : Coomasie Brilliant Blue. ĐVHT : Đơn vị hoạt tính. HT : Hoạt tính HTR : Hoạt tính riêng. TCA : Trichloacetic acid A.U : Độ hấp thụ. mS/cm : Milisiemens/cm (đơn vị đo lƣờng độ dẫn điện). UI : Đơn vị hoạt tính enzyme. DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính của protein .......................................... 22 Bảng 3.1 Đƣờng chuẩn Albumin ................................................................................... 32 x Bảng 3.2 Đƣờng chuẩn Tyrosine ................................................................................... 34 Bảng 3.3 Khối lƣợng (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng độ ...................................... 36 Bảng 3.4 Thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ. ............................................................ 36 Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein của dịch chiết enzyme thô của hai chủng Asp.oryzae và Asp. kawasaki ................................................................. 45 Bảng 4.2 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối ................................................ 46 Bảng 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối ............................................................ 46 Bảng 4.4 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối .................................................. 48 Bảng 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối ....................................................... 48 Bảng 4.6 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn .................................................. 50 Bảng 4.7 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn .............................................................. 50 Bảng 4.8 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn .................................................... 51 Bảng 4.9 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1 g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn .......................................................... 52 Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki. ................................................................ 53 Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH ................ 54 Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH ............ 55 Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ ......... 55 Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ .... 56 Bảng 4.15 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel ....... 59 Bảng 4.16 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel .... 61 Bảng 4.17 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng muối ...................................................................................................................... 62 xi Bảng 4.18 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng cồn ......................................................................................................................... 62 Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của những protein trong thang. ............. 65 Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae .......... 66 Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki ..... 66 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ HÌNH TRANG Hình 2.1 Đƣờng biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến tốc độ xii phản ứng ......................................................................................................................... 8 Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất ......................................................................................................................... 8 Hình 2.3 Công thức cấu tạo enzyme protease ............................................................... 11 Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi ............................................... 16 Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi trƣờng CBS – MEA2%. ................................................................................................. 16 Hình 2.6 Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký ......................... 23 Hình 2.7 Quá trình lọc gel ............................................................................................. 26 Hình 3.1 Máy quang phổ UV-Vis ................................................................................. 31 Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ .................................... 38 Hình 4.1 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P-100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus oryzae ........................................................................... 58 Hình 4.2 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng cồn đối với nấm Aspergillus oryzae .............................................................................. 58 Hình 4.3 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus kawasaki........................................................................ 60 Hình 4.4 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease bằng cồn đối với Aspergillus kawasaki .................................................................................. 60 ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease trong dịch chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki ..................... 45 Đồ thị 4.2 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối................................................................... 47 Đồ thị 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối ............................................................. 49 Đồ thị 4.4 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn ..................................................................... 51 Đồ thị 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn ................................................................. 52 xiii Đồ thị 4.6 Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.oryzae. ....... 54 Đồ thị 4.7 Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.kawasaki ..... 55 Đồ thị 4.8 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.oryzae ............. 55 Đồ thị 4.9 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.kawasaki. ....... 56 Đồ thị 4.10 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa protein bằng muối. ......................................................................................................... 62 Đồ thị 4.11 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa protease bằng cồn. ......................................................................................................... 63 Đồ thị 4.12 Sự tƣơng quan giữa Lg của trọng lƣợng phân tử và giá trị Rf. .................. 65 1 PHẦN 1 : MỞ ĐẦU 1.2 Đặt vấn đề Để duy trì sự sống, cơ thể mỗi sinh vật phải thực hiện rất nhiều phản ứng hóa sinh. Nhƣ vậy điều gì đã giúp các phản ứng này đƣợc tiến hành mau lẹ phi thƣờng mà vẫn nhịp nhàng cân đối. Đó là nhờ khả năng xúc tác và điều hòa to lớn của enzyme. Có bản chất là một protein, enzyme không chỉ có thể thực hiện khả năng xúc tác sinh học bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện các xúc tác bên ngoài cơ thể khi tạo cho chúng một điều kiện thích hợp để hoạt động. Bởi lẽ đó, trong vòng vài chục năm gần đây việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme trên thế giới đã phát triển với tốc độ rất mạnh mẽ. Nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy cho sự phát triển của nền công nghiệp sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo enzyme. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra một lƣợng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme. Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và phổ biến trong đời sống. Protease đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học…Hoạt tính của enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố. Điều kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau. Do đó, để sử dụng enzyme hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ƣu cho hoạt động của enzyme đó. Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki trên môi trƣờng bán rắn”. Aspergillus oryzae từ lâu đã đƣợc dùng nhƣ là nguồn vi sinh vật đƣợc nuôi cấy để thu nhận enzyme protease. Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì ngƣời ta 2 chỉ biết đến nhƣ là nguồn vi sinh vật để thu nhận amylase. Do đó, qua đề tài, chúng ta có thể đánh giá đƣợc hiệu quả sử dụng protease của chủng Aspergillus kawasaki. 1.2 Mục đích nghiên cứu.  Xác định các điều kiện thu nhận và đặc tính của enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspgillus kawasaki.  So sánh hoạt tính enzyme protease giữa hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki. 1.3 Yêu cầu.  Thu nhận enzyme , xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa và tỷ lệ cồn tối ƣu trong việc tủa enzyme - bƣớc đầu trong quá trình tinh sạch enzyme.  Xác định pH và nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme protease.  Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.  Xác định trọng lƣợng phân tử của enzyme protease bằng kỹ thuật điện di SDS – PAGE. 3 PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát chung về enzyme 2.1.1 Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme Từ trƣớc thế kỷ 17, khi loài ngƣời hoàn toàn chƣa hiểu biết gì về ezyme, ngƣời ta đã biết sử dụng rộng rãi các quá trình enzyme trong hoạt động thực tế nhƣ làm bánh mì, làm bia, rƣợu,…Việc ứng dụng enzyme trong giai đoạn này hoàn toàn có tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống của tế bào vi sinh vật. Ngay từ thế kỷ 17, các nhà khoa học đã quen dùng từ “ferment” do nhà khoa học ngƣời Hà Lan Van Heltmon đề xƣớng. Theo nghĩa tiếng La Tinh thì “fermentatio” nghĩa là sự lên men, đó cũng là nguồn gốc của từ “ferment”. Theo ý kiến của ông, yếu tố tham gia tích cực vào quá trình lên men rƣợu là “ferment”. Yếu tố đó là gì thì còn là điều bí ẩn. Các nhà khoa học đã không vừa lòng với hiểu biết này và đã đi sâu vào thực nghiệm, quan sát, mô tả. Đến nửa cuối thế kỷ 18 bắt đầu có những thí nghiệm đầu tiên thô sơ và đơn giản chứng minh tác dụng của men tiêu hóa đƣợc nhà tự nhiên học ngƣời Pháp Réaunur tiến hành vào năm 1713 và đƣợc Spallanzani ngƣời Ý khẳng định lại một cách chặt chẽ hơn vào năm 1783 với tác dụng của dịch dạ dày phân hủy thịt. Năm 1814, viện sĩ viện hàn lâm khoa học Petecbua là Kirchov ngƣời Nga làm thí nghiệm chứng minh nƣớc chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đƣờng ở nhiệt độ 40 – 600C . Năm 1817 hai nhà khoa học Manaxenia (Nga) và Buchner (Đức) đã làm thí nghiệm thành công quá trình lên men bằng chất dịch vô bào từ nấm men. Nhà sinh lý học thực vật K.Tinniriazev đã viết “Không còn nghi ngờ gì nữa, lần đầu tiên ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng hiện tƣợng lên men chung quy chỉ là một quá trình hóa học, nó có thể dễ dàng lập lại ngoài cơ thể sống nhờ những enzyme hòa tan chiết xuất từ những tế bào đã bị phá hủy cấu trúc”. Năm 1833, hai nhà khoa học ngƣời Pháp là A.Payen và J.Person thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme amylase ở dạng kết tủa bằng cách thêm cồn vào dịch chiết từ hạt lúa nảy mầm. Kết tủa này có khả năng phân giải tinh bột thành đƣờng và đƣợc gọi 4 là diastase. Đây là thực nghiệm đặt nền móng cho các tiến bộ trong lĩnh vực enzyme vào nửa sau thế kỷ 19. Năm 1835, Berzelius lần đầu tiên đã đề ra khả năng giải thích tác dụng của enzyme trên cơ sở hóa học. Ông gọi hiện tƣợng làm tăng quá trình phản ứng là sự xúc tác và chất gây ra hiện tƣợng này là chất xúc tác. Năm 1856, Pasteur đã tiến hành nghiên cứu bản chất của quá trình lên men rƣợu. Theo ông, chính nấm men hay vi khuẩn lên men mà ta nhìn thấy dƣới kính hiển vi là nguyên nhân gây ra hiện tƣợng lên men rƣợu . Ông cho rằng chỉ có nấm men hay vi khuẩn còn sống mới có thể thực hiện quá trình lên men. Từ đó dẫn đến hai khái niệm mâu thuẫn nhau : men hữu hình (ferment hữu hình ) và men không nhìn đƣợc (ferment hòa tan). Năm 1862, nhà khoa học ngƣời Nga Danilevxki đã sử dụng một kỹ thuật đặc biệt để tách chiết trypsine ra khỏi hỗn hợp với amylase trong dịch tụy bằng kỹ thuật “phƣơng pháp hấp thụ chọn lọc enzyme” (tức là gắn enzyme lên bề mặt chất đỡ) và “phản hấp thụ” (nghĩa là giải phóng enzyme ra khỏi bề mặt chất đỡ) rồi kết tinh. Hiện nay chúng ta gọi đó là một dạng của “kỹ thuật sắc ký ”. Năm 1894, nhà khoa học ngƣời Pháp G.Bertrand phát hiện ra một loại enzyme mới là enzyme oxy hóa với việc phát hiện ra enzyme lacasae trong nhựa mủ cây sơn ta Rhus succedanea. Từ những thành tựu ban đầu đó, enzyme bắt đầu đƣợc chú ý nghiên cứu nhiều hơn vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20. Liên tiếp trong những năm 1930, 1931 hai nhà khoa học D.Northop và M.Kunitz đã tách đƣợc pepsine và trypsine dƣới dạng tinh thể. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982). Năm 1913, hai nhà khoa học L.Michalis và Menten đã nghiên cứu cơ chế xúc tác nhờ enzyme có sử dụng chất đồng vị, sử dụng phƣơng pháp quang học và phƣơng pháp hóa học nghiên cứu các nhóm hoạt động của enzyme đã đem lại cho chúng ta “phƣơng trình Michalis-Menten” nổi tiếng trong nghiên cứu động học của enzyme. (Nguyễn Hữu Chấn, 1984). Hiện nay enzyme đã trở thành một ngành khoa học mũi nhọn phát triển rất nhanh trên thế giới phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt chẽ tới các ngành nhƣ hóa lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học,…Hàng năm trên thế giới xuất bản hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzyme, các phƣơng 5 pháp tách chiết và tinh chế, sự điều hòa về rối loạn hoạt động của cơ thể ở trạng thái sinh lý và bệnh lý. 2.1.2 Định nghĩa về enzyme Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có hoạt tính xúc tác sinh học, do tế bào sống tiết ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. (Nguyễn Tiến Thắng, 2004) Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hƣớng xác định. Pavlôv đã nói : “Hoạt động đầu tiên của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Không có sự sống nào lại không có quá trình enzyme”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của Anghen : “Sự sống, đó là phƣơng thức tồn tại của thể protein”. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982). Enzyme có trong mọi tế bào, mọi mô của mọi sinh vật nhƣng mỗi loại mô, mỗi loại tế bào thƣờng có những hệ thống enzyme đặc biệt. Các enzyme không chỉ tham gia xúc tác các phản ứng sinh học trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (in vitro). (Nguyễn Hữu Chấn, 1984). Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp suất thấp và nhiệt độ bình thƣờng của cơ thể. Trong khi đó các chất xúc tác hóa học cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Hơn nữa, các enzyme có khả năng chọn lựa cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng nhƣ đối với chất mà nó tác dụng. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982). Các loại enzyme trong cơ thể đƣợc tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để sao cho các chất ban đầu đƣợc chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt xích hoàn chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở một trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm rối loạn cho cả hệ thống. Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzyme lại do gen. Mỗi một gen chịu trách nhiệm điều khiển tổng hợp một enzyme. (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Ƣu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh học có thể tóm tắt nhƣ sau :  Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lƣợng hóa học có trong vật chất. 6  Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao.  Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.  Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lƣợng thƣờng rất ít.  Enzyme luôn luôn đƣợc tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lƣợng enzyme đƣợc tổng hợp rất lớn và luôn luôn tƣơng ứng với số lƣợng các phản ứng xảy ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme.  Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay các nhà khoa học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lƣợng này là rất nhỏ so với số lƣợng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã biết, loài ngƣời mới thu nhận và kết tinh đƣợc khoảng 200 loại. (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). 2.1.3 Phân loại enzyme Khi số lƣợng enzyme đƣợc phát hiện còn ít, ngƣời ta đặt tên enzyme theo ý thích từng ngƣời tìm ra nó. Dần dần theo thời gian, số lƣợng enzyme tìm ra ngày càng nhiều nên cần có một hệ thống phân loại theo quy ƣớc quốc tế. Enzyme đƣợc phân loại theo tính chất của nó, đƣợc xếp vào từng nhóm nhỏ tƣơng ứng với các enzyme có bản chất tƣơng tự nhau, làm cho việc tìm hiểu và nghiên cứu trở nên dễ dàng hơn. Theo quy ƣớc quốc tế, tên gọi của enzyme thƣờng đƣợc đặt theo cơ chất đặc hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên enzyme thƣờng có hai phần. Phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân các phản ứng. Tuy nhiên, có nhiều enzyme theo thói quen vẫn đƣợc gọi theo tên cũ, không theo hệ thống nhƣ trypsine, pepsine. Năm 1930, Hiệp Hội Hóa Sinh Quốc Tế (IOB) đã thống nhất phân loại enzyme ra làm 6 lớp và đƣợc đánh số thứ tự từ một đến sáu. Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, mỗi tổ có nhiều nhóm. Chính vì thế theo hệ thống phân loại, mỗi enzyme thƣờng có bốn số : số thứ tự một chỉ lớp, số thứ tự hai chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tƣ chỉ enzyme. Tên của các lớp, tổ và nhóm nhƣ sau : 7 I. Oxydoreductase a. Dehydrogenase b. Oxydase c. Oxygenase d. Peroxydase II. Transferase a. Acyltransferase b. Glucosyltransferase c. Aminotransferase d. Phosphotransferase III. Hydrolase a. Peptide hydrolase b. Lipase IV. Liase a. Pyruvate decarboxylase b. Fumarate hydrolase V. Isomerase VI. Ligase 2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme 2.1.4.1 Hoạt tính enzyme Hoạt tính xúc tác của enzyme là do cấu trúc không gian ba chiều của các phân tử protein quyết định. Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm, hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác. Tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau nhƣ nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ của các chất phản ứng (cơ chất), nhiệt độ, pH môi trƣờng, nồng độ ion trong môi trƣờng, nồng độ các chất kìm hãm, các chất hoạt hóa enzyme. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982). 2.1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme. a) Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc bậc nhất vào nồng độ enzyme. Đƣờng biểu diễn có dạng nhƣ ở hình 2.1 8 Hình 2.1 : Đƣờng biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng b) Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ enzyme đƣợc giữ cố định và nồng độ cơ chất thay đổi, ngƣời ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ cơ chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục gia tăng, đƣờng biểu diễn uốn cong và với nồng độ cơ chất cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đƣờng biểu diễn tiệm cận với giá trị vmax. Km : Hằng số Michalis, là nồng độ cơ chất ứng với vận tốc bằng 1/2 vận tốc vmax. Hình 2.2 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất c) Ảnh hƣởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vƣợt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu. Nếu đƣa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. V [E] V = k[E] Vmax [S] v 2 Km 0 9 Ngƣợc lại, ở nhiệt độ 00C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhƣng khi đƣa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối ƣu. Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), ngƣời ta thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tƣơng ứng với hai hiện tƣợng khác nhau :  Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 400C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lƣợng cho phản ứng.  Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme, ở vào khoảng 450C), vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80 – 1000C. Nhiệt độ tối ƣu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trƣờng. d) Ảnh hƣởng của pH Sự thay đổi pH gây nên :  Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptid của enzyme, do đó làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptid của enzyme.  Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn cản sự tạo thành enzyme – cơ chất trong trƣờng hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở dƣới dạng ion. Nhƣ vậy, hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trƣờng. Đó là vì pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm hoạt động của nó, phức chất enzyme – cơ chất và ảnh hƣởng đến độ bền của enzyme. Ngƣời ta có thể xác định một giới hạn pH tối ƣu cho hoạt động của một enzyme. Ngoài pH tối ƣu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng. Điều này cho thấy tầm quan trọng của môi trƣờng phản ứng trong quá trình nghiên cứu các phản ứng enzyme in vitro. Mỗi một enzyme có một pH tối ƣu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 -2), hoặc rất kiềm (9,5 – 10). pH tối ƣu của đa số các enzyme vào khoảng chung quanh giá trị trung tính (6 – 8). Tuy nhiên pH tối ƣu của một enzyme cũng không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau nhƣ bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ. 10 2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống 2.1.5.1 Nguồn thu nhận Enzyme đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : động vật (pepsin từ dạ dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ thơm…). Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzyme nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân. Nhƣ vậy trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có nhiều ƣu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vƣợt xa các enzyme từ động vật và thực vật :  Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với một lƣợng lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm cũng dễ dàng và có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công nghiệp khác nhau.  Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Do đó vi sinh vật có thể đồng hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên. Trong khi đó có nhiều chất mà thực vật và động vật không thể đồng hóa đƣợc.  Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vƣợt xa các sinh vật khác. Do vậy chỉ cần một lƣợng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lƣợng lớn cơ chất.  Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lƣợng lại nhỏ, kích thƣớc bé, nhƣng tỷ lệ enzyme trong tế bào tƣơng đối lớn nên quá trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao.  Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh vật cho enzyme thƣờng có khả năng phát triển trên môi trƣờng đơn giản, rẻ tiền nhƣ các phụ phế liệu, phế phẩm của các nghành sản xuất.  Ƣu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cƣờng sinh tổng hợp các enzym nhờ chọn giống khi tạo đƣợc những biến chủng có hoạt lực cao. Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trƣờng, có khả năng thích ứng với nguồn dinh dƣỡng. Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng nhƣ hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi 11 cấy. Điều đó cho phép ta có thể tạo đƣợc những enzym theo ý muốn, dễ dàng thu nhận đƣợc enzym có độ thuần khiết cao. 2.1.5.2 Vai trò Cùng với những thành tựu đạt đƣợc trong nghiên cứu lí thuyết về enzym, các nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng đƣợc mở rộng và đạt hiệu quả cao. Các chế phẩm enzym đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ trong hoá phân tích để định tính, định lƣợng các chất trong nông nghiệp, y học, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dƣợc liệu, công nghiệp nhẹ nhƣ công nghiệp dệt, công nghiệp da.  Trong y học có thể sử dụng enzym tinh chế để chữa bệnh, sản xuất các sinh tố và các chất kháng sinh.  Sử dụng chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm nông nghiệp sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt trƣớc khi gieo.  Trong công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzym đƣợc sử dụng khá rộng rãi trong nhiều ngành chế biến khác nhau : chế biến thịt, cá, sữa, công nghiệp sản xuất bánh mì và các thứ bánh kẹo khác. Sử dụng chế phẩm enzym thƣờng làm tăng nhanh quá trình chế biến, tăng hƣơng vị và giá trị dinh dƣỡng của sản phẩm. Ngoài ra, sử dụng enzym còn có thể tái tạo hƣơng vị của các loại rau quả tƣơi sau khi chế biến. Ngày nay, ngƣời ta cũng đã đạt đƣợc nhiều kết quả trong việc sử dụng một số enzyme trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác. 2.2 Khái quát chung về enzyme protease 2.2.1 Định nghĩa enzyme protease Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton. Hình 2.3 : Công thức cấu tạo enzyme protease 12 2.2.2 Lƣợc sử phát triển các enzyme protease 2.2.2.1 Protease từ động vật Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa đƣợc nghiên cứu sớm hơn cả. Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp là Reaunur đã làm thí nghiệm rất đơn giản và đã phát hiện đƣợc rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt. Năm 1836, Schwam đã quan sát đƣợc hoạt động phân giải protein của dịch vị. Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau ngƣời ta mới tách đƣợc enzyme này. Năm 1857, Corvisart tách đƣợc trypsine từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên thu nhận đƣợc ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein khác. Năm 1862, Danilevxki dùng phƣơng pháp hấp phụ trên colondion đã tách đƣợc trypsine với amylase tụy tạng. Phƣơng pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu tinh chế enzyme và protein. Năm 1872, Hommarsten đã tách đƣợc chế phẩm chymotrypsine (renin). Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu. Schidt đã nêu giả thiết rằng trong máu có enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá trình đông máu. Ông đã tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận đƣợc có tác dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng. 2.2.2.2 Các protease từ thực vật So với các protease từ động vật, các protease từ thực vật đƣợc phát hiện muộn hơn. Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận đƣợc protease từ hạt của một loại đậu. Họ cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động phân giải protein. Ý kiến này dựa trên cơ sở thực nghiệm là sau khi cho dịch chiết từ các nguyên liệu trên tác dụng với fibrin, nuớc lọc của hỗn hợp cho phản ứng màu Biure. Bằng chứng này không thật sự vững chắc nên Group – Besanez không tiếp tục nghiên cứu. Vì vậy Wurtz đƣợc xem nhƣ là ngƣời đầu tiên tách chiết thành công protease từ thực vật (1879). Ông nêu lên rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có 13 chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ thu nhận đƣợc một chế phẩm enzyme không tinh khiết (100g/1 cây) gọi là papain. 2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật Các protease của vi sinh vật mới đƣợc chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dầu từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện đƣợc khả năng phân giải protein của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực vật. Những kết quả đạt đƣợc trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế. Trong thời gian gần đây ngƣời ta cũng đã có những phƣơng pháp thích hợp để nhận chế phẩm không tan của protesae. Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong nghiên cứu và các ứng dụng của các protease. 2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease Các enzyme protesae nhƣ đã nói ở trên đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau. 2.2.3.1 Từ động vật Protesae động vật thƣờng có ở tụy tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ dày…  Pancreatin gồm : Trysin, chymotrypsin và một enzyme khác có ở tụy tạng, chúng đƣợc tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy.  Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, đƣợc tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị.  Renin chỉ có ở ngăn thứ tƣ ở dạ dày bê non dƣới 5 tháng tuổi, là enzyme đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage. 2.2.3.2 Từ thực vật Enzyme protease từ thực vật có ở các thanh phần khác nhau của cây nhƣ thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả . Ví dụ:  Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh  Bromelin có trong thân cây thơm xanh và quả thơm xanh.  Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả. 14 2.2.3.3 Từ vi sinh vật Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc đƣợc tiết vào trong môi trƣờng nuôi cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào đƣợc nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y dƣợc. Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các protease của vi sinh vật có nguồn gốc khác nhau thì cũng có những tính chất khác nhau về nhiều mặt. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động tối ƣu,…Hartley (1960) đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm cơ bản nhƣ sau :  Protease serine  Protease kim loại (metallo protease)  Protease acid  Protease tiol 2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease Các protease nói chung cũng nhƣ protease vi sinh vật nói riêng đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.  Trong sản xuất nƣớc chấm : Nƣớc mắm, tƣơng, chao,…  Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hƣơng vị thịt sau khi chế biến,…  Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…  Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ.  Trong hƣơng mỹ phẩm : Ngƣời ta trộn một lƣợng nhỏ protease vào kem xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già.  Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải.  Trong công nghiệp sữa, các protease nhƣ renine, pepsine đƣợc dùng trong sản xuất formate, sữa đông tụ.  Trong y học : 15 + Protease đƣợc dùng để sản xuất môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi vi sinh vật, sản xuất huyết thanh miễn dịch. + Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch… + Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trƣng. + Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những ngƣời bị tiêu hóa kém…  Trong nông nghiệp : Protease đƣợc dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.  Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn đƣợc dùng để tái sinh các nguyên liệu nhƣ phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tƣơng gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý. 2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. 2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 2.3.1.1 Phân loại Giới : Fungi Ngành : Ascomycota Ngành phụ : Pezizomycota Lớp : Ascomycetes Bộ : Plectascales Họ : Aspergillaceae Giống : Aspergillus Loài : Aspergillus oryzae 2.3.1.2 Đặc điểm  Hình thái Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty. 16 Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae