Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập trên nem chua

ong nguyên liệu lên men cũng góp phần cải thiện những đặc tính trên (Holzapfel, 2000). Việc sử dụng giống khởi động vào việc sản xuất các sản phẩm lên men ngày càng được áp dụng rộng rãi như một phương pháp để rút ngắn thời gian sản xuất, nâng cấp sản phẩm lên men về mặt chất lượng, tính ổn định cũng như tuổi thọ cho sản phẩm (Rolle và Satin, 2002). Một số vi sinh vật có lợi trong quá trình lên men được nghiên cứu như vi khuẩn lactic cho thấy rằng chúng có khả năng sản sinh ra các chất kháng - 14 - sinh có lợi cho sức khỏe, tạo tính an toàn và bảo quản lâu dài cho sản phẩm (Kalui và ctv, 2010). Thực phẩm lên men ngày nay rất đa dạng, chế biến từ các dạng nguyên liệu khác nhau như thịt, trái cây, rau quả, ngũ cốc,… Với những tiến bộ hiện nay về khoa học kĩ thuật, quá trình lên men không còn sản xuất ở qui mô thủ công và tiến hành tự nhiên như trước đây nữa mà đã phát triển ở qui mô công nghiệp với sự lên men chủ động nhờ việc sử dụng các giống khởi động để đáp ứng không chỉ về chất lượng mà còn về số lượng cho người tiêu dùng (Nguyễn Đức Lượng, 2006). 2.2 NEM CHUA - SẢN PHẨM THỊT LÊN MEN CỦA VIỆT NAM Nem chua là một sản phẩm thịt lên men truyền thống ở Việt Nam. Tùy theo từng vùng miền sản xuất mà nem chua gắn với những tên gọi nổi tiếng như nem Thủ Đức, nem Lai Vung, nem Bình Dương… Phần lớn sản phẩm được sản xuất thủ công, tùy theo kinh nghiệm của từng hộ gia đình mà chất lượng và khả năng bảo quản nem chua rất khác nhau. Bản chất của quá trình lên men là một quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ hoạt động của vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus và Micrococcus. Trong đó, đóng vai trò quan trọng là các Lactobacillus (Nguyễn Đức Lượng, 2006; Hồ Thị Nguyệt Thu và ctv, 2008). Theo kinh nghiệm của các nhà chế biến, thịt dùng trong sản xuất nem chua phải là thịt “nóng”, thịt có từ thú mới vừa giết mổ. Thịt được làm nhuyễn bằng cách xay hoặc giã; sau đó, trộn với da heo đã được luộc chín và cắt thành sợi nhuyễn, cùng các chất phụ gia và gia vị. Hỗn hợp thịt sẽ được tạo thành viên có trọng lượng khoảng 15 - 20 g, kế tiếp được gói bằng lá vông, lá chùm ruột hay lá ổi, và được bao phủ bên ngoài bằng nhiều lớp chuối dày (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008). Nhìn chung, quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ phòng (khoảng 28 - 30oC) trong thời gian từ 3 - 4 ngày. Trong thời gian này, các vi khuẩn lactic hoạt động mạnh và chuyển hóa đường thành acid lactic. Acid lactic được tạo thành sẽ làm giảm pH của bột thịt, làm thay đổi cấu trúc của bột thịt, bột thịt trở nên chặc hơn, tạo vị chua cần thiết cho sản phẩm và làm ức chế sự phát triển của những vi sinh vật gây thối. Nem chua được ăn tươi mà không cần nấu hay làm nóng. Với kiểu sử dụng này, người tiêu dùng tận hưởng được những - 15 - lợi ích cho sức khỏe do các vi khuẩn lactic còn sống trong sản phẩm mang lại (Nguyen và ctv, 2010). Sản phẩm nem được đánh giá là đạt chất lượng khi bề mặt sản phẩm không bị nhớt hoặc nấm mốc, bột thịt dai, không nhão, có vị chua ngọt vừa phải. Nem chua có thời hạn sử dụng ngắn, tối đa là 3 ngày khi bảo quản ở nhiệt độ môi trường. Nếu muốn kéo dài thời hạn sử dụng, sản phẩm cần được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (khoảng 1 tháng ở nhiệt độ từ 4 - 10oC). 2.3 QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường trong điều kiện kị khí (bắt buộc hay tùy nghi) thành acid lactic. Người ta tìm thấy các vi khuẩn (vi khuẩn lactic, Bacillus), các tảo (Chlorella), một vài loại nấm mốc thủy sinh, các protozoa, cũng như các cơ bắp của động vật đều có khả năng lên men lactic (Vương Thị Việt Hoa, 2006). Dựa vào sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm là lên men đồng hình và lên men dị hình.  Lên men đồng hình Phân giải glucose theo con đường EMP để chuyển thành pyruvat, sau đó khử trực tiếp hầu hết các pyruvat thành lactat nhờ vào enzyme lactat dehydrogenase. Sản phẩm chính là acid lactic chiếm 90%. Ngoài ra còn có các sản phẩm phụ chiếm tỉ lệ không đáng kể như acid acetic, ethanol, glycerin, CO2,… Các vi khuẩn tham gia như Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Lb. delbruikii, Lb. acidophilus,… (Vương Thị Việt Hoa, 2006).  Lên men dị hình Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con đường EMP. Chúng phân giải kị khí đường glucose chủ yếu theo con đường pentophosphat (PP). Ngoài sản phẩm là acid lactic (40%) còn tạo ra một lượng lớn các sản phẩm khác như acid succunic và ethanol (20%), acid acetic (10%), CO2 và H2 (20%). Các vi khuẩn tham gia bao gồm Bacterium pentoaceticum, Lactobacterium casei, Lb. plantarum, Lb. bifrementans, Leuconostoc casei, Le. cremoris. - 16 - 2.4 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN LACTIC Vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn Gram (+), có dạng trực khuẩn, cầu khuẩn hay cầu trực khuẩn, nhìn chung không di động, không sinh bao tử và các đặc tính sinh hóa âm tính khác như catalase, nitrate reductase và cytorome oxydase (Lý Ngọc Quí, 2006). Chúng có thể hô hấp kỵ khí hoặc kỵ khí tùy ý. Khoảng nhiệt độ thích hợp cho các vi khuẩn lactic hoạt động khá rộng. Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ tối thích từ 25 - 37oC, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích từ 50 - 65oC, nhóm ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ 5oC hoặc thấp hơn (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008). Vi khuẩn lactic được ứng dụng lâu đời trong nhiều loại thực phẩm lên men có nguồn gốc động hoặc thực vật vì các tác động có lợi của chúng về dinh dưỡng, cảm quan và cải thiện tuổi thọ sản phẩm. Vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra các hợp chất kháng khuẩn. Trong đó, việc sản sinh acid lactic và acid acetic là quan trọng nhất. Tuy nhiên một số chủng vi khuẩn lactic còn được biết đến bởi việc sản sinh các phân tử có hoạt tính sinh học như ethanol, acid formic, các acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, reutericyclin,… Nhiều giống cũng sản sinh các bacteriocin và những phân tử thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tương tự bacteriocin (De Vuyst và Leroy, 2007). 2.5 MỘT SỐ VI KHUẨN LACTIC THƯỜNG DÙNG TRONG THỰC PHẨM Một số giống vi khuẩn lactic nồng cốt liên quan đến quá trình lên men thực phẩm như Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus. 2.5.1 Lactobacillus Lactobacillus là giống lớn nhất trong LAB với hơn 80 loài và phân loài được công nhận (Limsowtin và ctv, 2002). Đây cũng là nhóm loài rất hỗn tạp với sự đa dạng về các đặc tính lý hóa, sinh hóa và kiểu hình nhưng chủ yếu là dạng que (Axelsson, 2004). Các Lactobacillus là những vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, thỉnh thoảng cặp đôi hoặc tạo thành chuỗi, không di dộng và catalsae âm tính. Phân bố rất nhiều trong tự nhiên và nhiều loài đã được ứng dụng trong thực phẩm, nhóm vi khuẩn này được ghi nhận là chịu acid cao nhất, có mặt trong cơ thể người (khoang miệng, đường tiêu hóa,...), và trong một số thực phẩm lên men như thịt, sữa, rau quả, ngũ cốc,... (Axelsson, 2004). Một số loài như Lb. casei, Lb. plantarum, - 17 - Lb. brevis,… tham gia trong quá trình làm chín phô mai; Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus là một trong hai loài vi khuẩn cho phép sử dụng trong lên men yogurt (Limsowtin và ctv, 2002). 2.5.2 Lactococcus Lactococcus có dạng hình cầu hoặc hình trứng, thường bắt cặp hoặc thành chuỗi. Có 5 loài Lactococcus (Lactococcus lactis, Lc. garvieae, Lc. plantarum, Lc. piscium và Lc. raffinolactis) hiện đang được công nhận. Tuy nhiên, chỉ có Lc. lactis subsp. lactis và Lc. lactis subsp. cremoris mới được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm (Limsowtin và ctv, 2002). Lactococcus lactis được phân lập từ sữa và các sản phẩm chế biến từ sữa. Có khả năng vi khuẩn này nhiễm vào sữa trong quá trình vắt sữa và cho ăn. Lc. raffinolactis được phân lập từ sữa chưa tiệt trùng, từ đường ruột động vật và từ các môi trường trang trại nuôi bò. Lc. garvieae và Lc. piscium gây bệnh ở các loài cá, Lc. garvieae cũng liên quan tới bệnh viêm vú bò và nhiễm trùng ở người. Một số chủng Lc. lactis. subsp. lactis có khả năng chuyển hóa citrate, sản sinh CO2, diacetyl và các chất trung gian khác tạo hương thơm cho sản phẩm (ví dụ như bơ và phô mai Gouda). Nisin, một bacteriocin peptide sản sinh bởi các giống Lactococcus có sẵn trong thương mại được coi như là một phụ gia bền acid, được sử dụng để kéo dài thời gian bảo quản thông qua việc ức chế hệ vi sinh vật Gram dương trong thực phẩm (Limsowtin và ctv, 2002). 2.5.3 Leuconostoc Leuconostoc có dạng hình cầu xếp chuỗi hoặc bắt cặp, lên men dị hình. Chúng thường được tìm thấy trên lá, ngũ cốc, nho và các cụm hoa. Những vi khuẩn này phát triển ở 20 - 30oC và không phát triển ở 45oC. Leuconostoc (đặc biệt là Ln. lactis và Ln. mesenteroides) có vai trò quan trọng trong việc lên men sữa do chúng có khả năng sinh CO2 và một lượng đáng kể diacetyl từ citrate trong sữa (Axelsson, 2004). Diacetyl là hợp chất chính tạo hương cho bơ chua, kem chua và phô mai tươi, còn CO2 thì đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành mắt phô mai. Ngoài ra, nhóm vi khuẩn này còn đóng vai trò chủng khởi động trong việc lên men tự nhiên của rau quả (ví dụ như dưa cải). - 18 - 2.5.4 Streptococcus Nhóm vi khuẩn này có dạng hình cầu hoặc hình trứng, kết đôi hay dạng chuỗi, lên men đồng hình. Hiện đã có trên 50 loài Streptococus được nhận biết, những vi khuẩn này phân bố chủ yếu trong xoang miệng và ở đường hô hấp. Một số Streptococcus như Sp. mutans là tác nhân gây bệnh sâu răng và viêm màng tim (Axelsson, 2004). Về cơ bản, chỉ có Sp. thermophilus là được sử dụng trong sản xuất yogurt (cùng với Lb. delbrueckii. subsp. bulgaricus) và phô mai. Vi khuẩn này được sử dụng như một tác nhân acid hóa để đông tụ lactic. 2.5.5 Pediococcus Pediococcus có dạng tứ cầu, vi hiếu khí, phát triển từ 20 - 30oC và không phát triển ở 45oC, ưa acid và lên men đồng hình. Hiện có 7 loài Pediococcus được nhận biết. Những vi khuẩn này thường được tìm thấy với một lượng lớn trên lá nho, dưa bắp cải lên men, trái oliu và bia. Pediococcus quan trọng trong thực phẩm về cả hai mặt tiêu cực và tích cực. Pe. damnosus là vi sinh vật gây hư hỏng chính trong sản xuất bia, vì sự sinh trưởng của chúng có thể dẫn đến việc hình thành diacetyl/acetoin tạo ra vị bơ. Pe. acidilactici và Pe. pentosaceus được sử dụng như các chủng khởi động cho việc làm xúc xích lên men. Pediococcus cũng tham gia vào quá trình làm chín phô mai góp phần làm tăng hương vị cho phô mai (Axelsson, 2004). 2.6 BACTERIOCIN 2.6.1 Khái niệm chung Bacteriocin là các peptide được sản sinh tự nhiên bởi một vài vi khuẩn để ức chế sự phát triển của các vi sinh vật cạnh tranh khác, chúng có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu là ức chế các loài gần với các chủng sản sinh bacteriocin (Parada và ctv, 2007). Những hợp chất này được tìm thấy trong hầu hết các loại vi khuẩn nhưng chỉ có một số loài trong chúng được nghiên cứu kĩ. Hiện nay các bacteriocin sản sinh bởi LAB được quan tâm nhiều nhất vì LAB được coi là vi khuẩn an toàn cho người tiêu dùng do chúng và các chất chuyển hóa của chúng không tạo nên những tác dụng phụ khi được sử dụng trong các thực phẩm lên men (Ruiz-Larrea và ctv, 2005). Các - 19 - bacteriocin sản sinh bởi LAB có những ứng dụng quan trọng trong bảo quản thực phẩm. Những vi khuẩn lactic này tạo ra các protein miễn dịch đặc hiệu để tự bảo vệ, chống lại tác động kháng khuẩn của bacteriocin của chúng (Cintas và ctv, 2001). Có thể nói nghiên cứu đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình nghiên cứu của Gratia và ctv vào năm 1925 về khả năng kháng khuẩn của Escherichia coli (colicin V) (Desriac và ctv, 2010; Ruiz-Larrea và ctv, 2005). Thuật ngữ bacteriocin không xuất hiện cho đến những năm 1950. Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin, đó là một chất sinh tổng hợp gây tử vong, phổ hoạt động hẹp bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất. Ba chủng vi khuẩn Gram (+) được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.; Listeria sp. và Staphylococcus sp. Các nghiên cứu trong những năm 1980 đã cho thấy có sự gia tăng đáng kể về số lượng các công bố trên bacteriocin. Từ thời điểm này bắt đầu bùng nổ những nghiên cứu về bacteriocin, định hướng như một chất kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm (Desriac và ctv, 2010). 2.6.2 Phân loại Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang là vấn đề tranh cãi. Các bacteriocin thường được phân loại kết hợp với các tiêu chí khác nhau. Những tiêu chí chính là họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và cuối cùng là trình tự chuỗi amino acid (Desriac và ctv, 2010). Một cách tổng quát, bacteriocin được chia thành 3 lớp: lớp I, lớp II và lớp III. 2.6.2.1 Lớp I Bacteriocin lớp I hay còn được gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa), bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Một thành viên nổi tiếng của nhóm này là nisin (Parada và ctv, 2007). Các Lanbiotic được chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên sự tương đồng cấu trúc. a) Phân lớp Ia Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thuôn dài, linh hoạt và tích điện dương, chúng hoạt động bằng cách hình thành các lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi khuẩn nhắm đến (Ouwehand và Vesterlund, 2004). - 20 - Nisin thuộc nhóm này. Đây là một peptide được hình thành bởi 34 amino acid. Có 2 biến thể của nisin được ghi nhận là nisin A và nisin Z, chúng chỉ khác nhau bởi amino acid thứ 27: histidine trong nisin A được thay thế bởi asparagin trong nisin Z. Cấu trúc của nisin được thể hiện ở Hình 2.1. Hình 2.1: Cấu trúc của nisin (Nguồn: Ruiz-Larrea và ctv, 2005) Loại bacteriocin này, được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic, được sử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm. Nó có phổ kháng khuẩn Gram (+) rộng, E. coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng ngoài của chúng bị phá hỏng. Nisin được cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của Bacillus spp. và Clostridium spp. (Ouwehand và Vesterlund, 2004). Chúng được sử dụng chủ yếu trong các thực phẩm đóng hộp và các sản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô mai, nhằm chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium (Deegan và ctv, 2006; trích dẫn bởi Parada và ctv, 2007). Nisin cũng được ghi nhận có hiệu quả chống lại các bệnh viêm vú do vi khuẩn Gram (+) gây ra (Broadbent và ctv, 1989; trích dẫn bởi Parada và ctv, 2007). b) Phân lớp Ib Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linh động, tích điện âm hoặc không tích điện. Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây nhiễu với các phân tử enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm (Parada và ctv, 2007). 2.6.2.2 Lớp II Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine. Các bacteriocin nhóm II có thể chia thành 3 phân lớp, bao gồm IIa, IIb và IIc. - 21 - a) Lớp IIa Lớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide hoạt động chống Listeria, đại diện đặc trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 và sakacin P. Các bacteriocin nhóm này hứa hẹn cho nhiều ứng dụng công nghiệp nhờ vào hoạt động kháng Listeria mạnh của chúng. Thậm chí chúng còn là các tác nhân kháng Listeria được chú ý nhiều hơn là bacteriocin lớp I (nisin) vì chúng không có phổ ức chế rộng và vì vậy, chúng không tiêu diệt các giống khởi động (Ouwehand và Vesterlund, 2004). b) Lớp IIb Lớp IIb hình thành bởi một phức hợp của 2 peptide riêng biệt, những peptide này ít hoặc không hoạt động. Các bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là lactococcin G, plantaricin EF và plantaricin JK (Parada và ctv, 2007). c) Lớp IIc Lớp IIc là những peptide nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacteriocin không đồng nhất nên phương thức hoạt động của chúng cũng khác nhau. Trong phân lớp này chỉ tìm thấy các bacteriocin như divergicin A và acidocin B (Parada và ctv, 2007). 2.6.2.3 Lớp III Lớp này bao gồm những peptide lớn, có trọng lượng phân tử lớn hơn 30 kDa, không bền nhiệt. Nhóm này có thể bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi khuẩn có thể bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin. Các bacteriocin lớp III cho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên của giống Lactobacillus (Ouwehand và Vesterlund, 2004). 2.6.3 Cơ chế hoạt động Các bacteriocin thường có hiệu quả chống lại các vi khuẩn Gram (+) như Bacillus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium. Các bacteriocin của LAB có thể không hiệu quả khi ức chế vi khuẩn Gram (-) vì màng ngoài của chúng gây trở ngại cho hoạt động của bacteriocin. Những màng này ngăn cản các phân tử như chất kháng sinh, chất tẩy rửa và thuốc nhuộm xâm nhập tế bào chất (De Martinis và ctv, 2001). Tuy nhiên, có một vài nghiên cứu đã công bố hoạt động của bacteriocin chống lại các vi khuẩn nhóm này, ví dụ như plantaricin 35d sản xuất bởi Lactobacillus plantarum chống lại Aeromonas hydrophila (Messi và ctv, 2001), thermophylin sản - 22 - xuất bởi Streptococcus thermophillus hoạt động chống lại E. coli và Yersinia enterocolitica (Ivanova và ctv, 1998). Các cơ chế hoạt động khác nhau đã được đề ra cho các bacteriocin như thay đổi hoạt động enzyme, ức chế sự nảy mầm của bào tử và ngừng hoạt động của các chất mang anion thông qua sự hình thành của các lỗ (Abee, 1995). Các bacteriocin từ LAB có thể hoạt động thông qua các cơ chế khác nhau để phát huy tác dụng kháng khuẩn nhưng màng tế bào thường là đích được nhắm đến. Sự tương tác tĩnh điện ban đầu giữa màng tế bào và peptide của bacteriocin được cho là động lực cho các chuyển biến tiếp theo (Deegan, 2006) Các bacteriocin có thể có tính diệt khuẩn hoặc định khuẩn, tác động này chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi một số yếu tố như lượng bacteriocin và độ tinh khiết của nó, tình trạng sinh lý của các tế bào chỉ thị và các điều kiện thí nghiệm (Cintas, 2001) Có khả năng là lớp I và II sử dụng cùng các cơ chế hoạt động giống nhau. Các peptide liên kết màng huyết tương thông qua các tương tác tĩnh điện với các phospholipid tích điện âm. Vì vậy, việc thâm nhập của bacteriocin ngang qua màng tế bào phụ thuộc vào điện thế màng, được điều khiển bởi pH và phospholipid. Các đơn phân tử của bacteriocin hình thành các khối proteic dẫn đến việc hình thành lỗ kết quả là dẫn đến sự thất thoát của các ion (chủ yếu là K và Mg), tổn thất lượng proton trong tế bào chất, thất thoát ATP và acid amin. Lượng proton trong tế bào chất có vai trò cơ bản trong sự tổng hợp ATP và trong sự di chuyển của vi khuẩn; vì vậy, việc tổng hợp của các phân tử lớn cũng như sản xuất năng lượng bị ức chế, dẫn đến chết tế bào đích (Bruno và Montville, 1993). Phương thức hoạt động của các bacteriocin nhóm III không được biết đến. Do đó, đòi hỏi phải nghiên cứu nhiều hơn để làm sáng tỏ nó (Parada và ctv, 2007). 2.6.4 Lợi ích và hạn chế của bacteriocin 2.6.4.1 Lợi ích của bacteriocin Ngày nay, áp dụng rộng rãi các bacteriocin trong lĩnh vực thực phẩm đã mang đến những lợi ích nhất định so với việc sử dụng những chất bảo quản hóa học truyền thống như: - 23 -  Bacteriocin chứng minh tính an toàn của chúng trong chuỗi thực phẩm dành cho người. Chúng có ít hạn chế hơn so với những chất bảo quản hóa học vì là các phân tử được sản sinh tự nhiên bởi vi sinh vật lên men trong thực phẩm lên men truyền thống (Ruiz-Larrea, 2005).  Không gây tác động đến môi trường vì chúng bị thoái biến nhanh chóng.  Các bacteriocin được sử dụng như nguồn thức ăn chủ yếu đối với các tác nhân gây bệnh mà không làm ảnh hưởng đến vi khuẩn có lợi (Ouwehand và Vesterlund, 2004).  Bacteriocin không làm thay đổi các tính chất cảm quan của thực phẩm (Ruiz-Larrea, 2005).  Chúng có phổ hoạt động rõ ràng.  Có tác dụng bổ sung cho các tác nhân kháng khuẩn. 2.6.4.2 Hạn chế của bacteriocin Với những lợi ích trên bacteriocin ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp như một loại kháng sinh an toàn. Tuy nhiên, chúng cũng có một số mặt bất lợi sau:  Ít được biết đến hơn so với các chất bảo quản hóa học.  Bị thoái biến nhanh chóng bởi các enzyme phân giải protein.  Chi phí cao trong việc đáp ứng các tính năng kỹ thuật.  Chỉ có hiệu quả chống lại một số loại vi khuẩn nào đó. Trên thực tế, có những rào cản pháp lý yêu cầu sự công nhận và chấp thuận cụ thể đối với việc sử dụng chúng ở dạng tinh khiết và bán tinh khiết (Ruiz-Larrea, 2005). - 24 - Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Đề tài được thực hiện từ 5/4/2010 đến 10/7/2010 tại phòng thí nghiệm Vi sinh và Hóa sinh thuộc khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Môi trường và thiết bị phân tích  Môi trường và thuốc thử: - Thạch và canh MRS (Merck, pH= 5,7± 0,2) để phân lập, tăng sinh và giữ giống vi sinh vật. - Môi trường NB (Difco) để tăng sinh và giữ giống vi sinh vật gây bệnh. - Môi trường MRD dùng để pha loãng. - Môi trường TSA (Difco) dùng để thực hiện thí nghiệm khuếch tán trên đĩa thạch. - Môi trường carbohydrat dùng khảo sát khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn lactic phân lập. - Thuốc thử Uphenmen dùng khảo sát sự hiện diện của acid lactic. - Thuốc thử peroxyde hydrogene 10% để thử phản ứng catalase. - Thuốc nhuộm Gram: gential violet, lugol và fuschine.  Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, pipet, micropipet, que cấy, đèn cồn…  Thiết bị: Máy dập mẫu (Seward, Anh), máy li tâm (MSE Mistral 1000, Anh), autoclave (Sanyo, Nhật), cân điện tử (Ohaus, Mĩ), vortex (Velp, Ý), máy đo pH (Metrohm, Mỹ), tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi,… 3.2.2 Nguyên vật liệu thí nghiệm Nem khảo sát được lấy sau 4 ngày lên men của 5 cơ sở: Bà Chín (Thủ Đức, tp. Hồ Chí Minh), Ninh Hòa (Nha Trang, Khánh Hòa), Giáo Thơ (Lai Vung, Đồng Tháp), - 25 - Vissan (tp. Hồ Chí Minh) và Năm Thu (Bình Định). Trong đó, nem Bà Chín, nem Ninh Hòa và nem Năm Thu là sản phẩm của quá trình lên men tự nhiên còn quá trình lên men của nem Giáo Thơ và nem Vissan là có sử dụng giống khởi động. Năm chủng gây bệnh được bảo quản đông lạnh (-20oC) được sử dụng làm chủng chỉ thị, bao gồm:  Staphylococcus aureus ssp. aureus CIP 20256  E. coli ATCC 25922  Bacillus cereus CIP 6624T  Listeria monocytogenes CIP 82110 T  Salmonella indiana LMBA Thuốc kháng sinh Ofloxacin 200 mg được bán trên thị trường được sử dụng làm mẫu đối chứng cho thí nghiệm khuếch tán trên thạch. 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chúng tôi đã thực hiện các công việc như sau:  Khảo sát hệ vi khuẩn lactic của nem sau 4 ngày lên men của năm cơ sở.  Thực hiện các phản ứng sinh hóa tiền định danh vi khuẩn lactic.  Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được. 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các thao tác tiến hành nghiên cứu được tóm lược trong Hình 3.1. - 23 - Hình 3.1: Tiến trình thực hiện các khảo sát Lấy mẫu Đồng nhất mẫu Huyền phù mẹ Đo pH Pha loãng mẫu ở các nồng độ từ 10-2 đến 10-7 Cấy lên môi trường thạch MRS Ủ 30oC / 48 giờ - Đếm số lượng khuẩn lạc - Tính phần trăm dạng khuẩn lạc - Giữ giống. - Cấy chuyền. Kiểm tra các phản ứng sinh hóa - Nhuộm Gram - Catalase - Di động - Kiểu lên men - Khả năng sinh acid lactic Khảo sát khả năng kháng khuẩn Khảo sát sơ bộ Khuếch tán trên thạch - 24 - 3.4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên nem ngày bốn của năm cơ sở khảo sát 3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu Đối với mỗi cơ sở chế biến nem khảo sát, chúng tôi tiến hành lấy mẫu lặp lại 3 lần ở những lô sản xuất khác nhau. Các mẫu nem chua được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để tiến hành phân tích trong thời gian sớm nhất. 3.4.1.2 Đồng nhất mẫu Sau khi tiệt trùng dao kĩ bằng cồn, dao được hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho bay hết hơi cồn và để nguội. Dùng dao cắt nhỏ mẫu nem và lấy khoảng 10 g mẫu nem cho vào bao PE vô trùng. Sau đó cho thêm dung dịch MRD vào bao theo tỉ lệ 9 MRD:1 nem. Việc đồng nhất mẫu được thực hiện với máy Stomacher trong 2 phút. Sau khi đồng nhất, thu được dung dịch huyền phù mẹ (S1). 3.4.1.3 Kỹ thuật đo pH Dung dịch S1 sẽ được đem đi đo pH. Trước khi đo, đầu pH kế được lau sạch; sau đó, được cắm vào dung dịch mẫu sao cho dung dịch ngập qua đầu dò của pH kế. Mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần và giá trị pH ghi nhận cho mỗi mẫu là trung bình của 3 lần đo lặp lại. 3.4.1.4 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic  Pha loãng mẫu và cấy đĩa Tiến hành pha loãng thập phân dung dịch S1 đến nồng độ 10-7 bằng dung dịch MRD. Dùng micropipet hút 0,1 mL dung dịch ở các nồng độ 10-5, 10-6 và 10-7 cho vào đĩa petri. Dùng que cấy trang đã khử trùng trang đều lên bề mặt thạch cho đến khi thấy bề mặt thạch khô. Ở mỗi nồng độ pha loãng chúng tôi tiến hành lặp lại 2 lần. Trình tự các thao tác được trình bày qua Hình 3.2. Hình 3.2: Trình tự pha loãng cho việc đếm vi khuẩn lactic - 25 -  Phương pháp ủ Các đĩa petri sau khi cấy xong sẽ được ủ kị khí ở 30oC trong 48 giờ. Việc ủ kị khí được tiến hành bằng cách để các đĩa petri vào trong các bình hút ẩm, đặt vào đó ngọn đèn cồn đã được thắp sáng, đậy chặt nắp, khi ngọn lửa đèn cồn tắt đồng nghĩa với việc oxy trong bình đã được tiêu thụ hết. 3.4.1.5 Đếm khuẩn lạc và cấy chuyền Sau khi ủ ở 30oC trong 48 giờ, việc đếm khuẩn lạc được thực hiện trên các đĩa có số lượng khuẩn lạc từ 15 đến 300. Số lượng khuẩn lạc đếm được trong hai đĩa ở hai nồng độ liên tiếp được tính bởi công thức sau: ).1,0.(. 21 nndV C N    (CFU/g) Trong đó: N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g mẫu. C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n1: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ 1 n2: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ 2 V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa d: nồng độ pha loãng đầu tiên được nuôi cấy. Số lượng trung bình của khuẩn lạc được đếm cho 3 lần lặp lại của 1 mẫu thí nghiệm: 3 321 NNNN  (CFU/g) Với N1, N2, N3 là tổng số khuẩn lạc được tính trong lần lặp lại thứ nhất, thứ hai và thứ ba. Sau khi đếm khuẩn lạc, với quan sát bằng mắt thường, các dạng khuẩn lạc hiện diện được ghi nhận dựa trên hình dạng và kích thước của chúng. Đối với mỗi dạng khuẩn lạc chúng tôi tiến hành cấy chuyền và giữ giống bằng cách lấy khuẩn lạc cho vào ống eppendorf vô trùng có chứa 1 mL canh MRS và ủ ở 37oC trong 24 giờ trong tủ ấm. Sau đó, cấy chuyền lên môi trường thạch MRS và ủ ở 37oC trong 48 giờ để tiến hành các phản ứng sinh hóa tiếp theo. Những ống eppendorf được bổ sung glycerol tiệt trùng hai lần với thể tích 10% thể tích dịch khuẩn, sau đó được bảo quản đông lạnh để giữ giống. - 26 - 3.4.2 Định danh sơ bộ vi khuẩn lactic phân lập 3.4.2.1 Nhuộm Gram Sau khi ủ ở 37oC trong 48 giờ, các chủng vi khuẩn phân lập, đại diện cho các dạng khuẩn lạc được nhuộm Gram. Việc quan sát dưới kính hiển vi sau đó cho chúng tôi khái niệm ban đầu về hình thái tế bào vi sinh vật như khả năng bắt màu (Gram (+) hay Gram (-)); dạng vi khuẩn (hình que, cầu hay hình trứng) cũng như cách sắp xếp của chúng (xếp chuỗi, bắt cặp hay riêng lẻ). 3.4.2.2 Phản ứng catalase Lấy khuẩn lạc cho lên trên miếng lame sạch, sau đó nhỏ một giọt H202 10% lên. Nếu thấy xuất hiện bọt trắng thì phản ứng là dương tính còn không xuất hiện bọt trắng thì phản ứng là âm tính. 3.4.2.3 Khảo sát khả năng di động Dùng que cấy vô trùng để lấy khuẩn lạc và cấy sâu vào trong ống nghiệm có chứa 10 mL môi trường thạch mềm MRS (4 g agar/L môi trường) và đem ủ ở 37oC trong 48 giờ trong điều kiện kị khí, tính di động của vi sinh vật được quan sát bởi sự phân tán vi sinh vật trong môi trường so với đường cấy: nếu vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động, nếu vi khuẩn mọc theo đường cấy thì chúng không có khả năng di động. 3.4.2.4 Kiểm tra kiểu lên men Cho khuẩn lạc vào trong ống nghiệm có chứa môi trường carbohydrat đã thêm bromocresol tía. Ủ các ống nghiệm này ở 37oC trong 24 giờ. Tiến hành kiểm tra khả năng sinh khí của vi sinh vật bằng cách dùng que cấy đã hơ thật nóng trên ngọn lửa đèn cồn rồi nhúng nhanh vào trong ống nghiệm. Nếu thấy xuất hiện những bọt khí nhỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh khí; ngược lại, vi khuẩn không có khả năng sinh khí. 3.4.2.5 Khảo sát khả năng sinh acid lactic Môi trường carbohydrat sau khảo sát khả năng lên men (phần 3.4.2.4) được trung hòa bằng dung dịch NaOH 0,1N để môi trường chuyển lại thành màu tím. Thêm vào 2 mL dung dịch Uphenmen, sự tồn tại của acid lactic sẽ được thể hiện bởi sự chuyển màu chất chỉ thị từ tía sang vàng. 3.4.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập 3.4.3.1 Thu hoạch dịch ly tâm - 27 - Sau khi tiến hành các phản ứng sinh hóa, chúng tôi chọn lọc ra những chủng vi khuẩn được cho là vi khuẩn lactic để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc cho vào trong ống ly tâm vô trùng chứa 10 mL MRS bổ sung 2% cao nấm men (Elmoualdi và ctv, 2008). Ủ các ống ly tâm này ở 37oC trong 16 - 18 giờ (Cheikhyoussef và ctv, 2008). Sau đó, các ống ly tâm này sẽ được đem ly tâm ở 6000 vòng trong 15 phút để tách cặn khuẩn. Nhằm tránh ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm bởi sự ức chế gây ra từ các acid hữu cơ có mặt trong môi trường, sau khi ly tâm xong chúng tôi điều chỉnh pH của dịch khuẩn bằng dung dịch NaOH 10N để đạt đến pH = 6,5 (Poncea và ctv, 2007). Sau đó lọc lấy phần dịch nổi trên bề mặt bằng cách bơm dịch qua màng lọc Minisart (đường kính lỗ lọc là 0,2 µm) để tách cặn khuẩn còn sót lại. Phần dịch lỏng thu được sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.4.3.2 Khảo sát sơ bộ khả năng sinh bateriocin của các chủng vi khuẩn phân lập Tiến hành tăng sinh năm chủng chỉ thị gây bệnh trong 10 mL môi trường NB (37oC / 24 giờ). Sau đó tiến hành pha loãng năm chủng chỉ thị đến nồng độ 10-4 bằng dung dịch MRD. Dùng micropipet hút 0,5 mL dịch ly tâm cho vào ống eppendorf vô trùng, sau đó cho tiếp 0,5 mL dịch khuẩn chỉ thị ở nồng độ 10-4. Mỗi dịch ly tâm đều được khảo sát với năm chủng gây bệnh nghiên cứu. Ủ các ống eppendorf ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó so sánh bằng mắt thường độ trong, đục của chúng với ống đối chứng (không cho dịch khuẩn). Nếu ống trong và không có sinh khối điều này chứng tỏ dịch ly tâm trong ống có khả năng kháng lại chủng chỉ thị gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng. Ngược lại, nếu ống đục và có sinh khối, điều này đồng nghĩa với việc vi khuẩn gây bệnh vẫn tiếp tục phát triển trong dịch ly tâm và như vậy, dịch ly tâm không có chứa chất kháng khuẩn. Việc khảo sát sơ bộ này cho phép chúng tôi tuyển lược các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn cho khảo sát với phương pháp khuếch tán trên thạch tiếp theo. 3.4.3.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng lactic phân lập bằng phương pháp khuếch tán trên thạch Trong khảo sát này, chúng tôi cấy vi khuẩn theo hai cách: trên bề mặt thạch và cấy sâu trong thạch: 0,1 mL dịch canh khuẩn chỉ thị ở nồng độ 10-4 được trang đều lên - 28 - bề mặt thạch TSA hoặc được trộn đều với 30 mL môi trường TSA và sau đó đổ ra đĩa petri. Sau khi thạch khô, đục 6 - 7 lỗ, với đường kính lỗ khoảng 8mm trên bề mặt đĩa thạch (Hata và ctv, 2009). Các lỗ được đục cách thành đĩa petri khoảng 1cm để có thể quan sát được vòng kháng khuẩn sau này. Kế đến, nhỏ khoảng một giọt môi trường TSA vào lỗ để bịt kín đáy lỗ. Dùng micropipet hút 150 µL dịch kháng khuẩn cho vào mỗi lỗ. Bên cạnh đó cũng tiến hành thí nghiệm với dịch kháng sinh pha loãng ở 10-4 để làm mẫu đối chứng. Tiếp theo, bảo quản các đĩa ở nhiệt độ 2 - 4oC trong 2 giờ với mục đích ngăn cản sự phát triển của chủng chỉ thị và tạo điều kiện cho bacteriocin có thời gian thẩm thấu vào bên trong thạch. Sau đó, các đĩa petri được ủ ở 37oC. Việc đọc kết quả được thực hiện sau 16 giờ ủ. Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn được xác định bằng sự hiện diện của vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ. Nếu đường kính vùng kháng khuẩn lớn hơn hoặc bằng 6 mm (Cheikhyoussef và ctv, 2008) thì được xem là có khả năng ức chế tích cực. Đường kính vùng kháng khuẩn được tính như sau: dkk = d – dlỗ Trong đó: dkk: đường kính vùng kháng khuẩn xung quanh lỗ d: đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính lỗ) dlỗ: đường kính lỗ. Hình 3.3: Vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri - 29 - 3.5 XỬ LÝ THỐNG KÊ SỐ LIỆU THU THẬP Việc tính các giá trị trung bình ( pH , N ), tổng lượng khuẩn lạc và phần trăm các dạng khuẩn lạc được thực hiện với phần mềm Excel 2003. Việc tính toán SD, sự khác biệt giữa các lô thí nghiệm được tính với trắc nghiệm Fisher bằng phần mềm Minitab 12.21. - 30 - Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN LACTIC CỦA NEM CHUA SAU 4 NGÀY LÊN MEN Ở NĂM CƠ SỞ KHẢO SÁT 4.1.1 Giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua lên men ngày 4 ở 5 cơ sở khảo sát Kết quả theo dõi về giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua sau 4 ngày lên men ở 5 cơ sở khảo sát được trình bày ở Bảng 4.1 Bảng 4.1: Giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua ngày 4 ở 5 cơ sở khảo sát Kiểu lên men Cơ sở Tham số thống kê (n=3) pH  SD N  SD (CFU/g) Lên men tự nhiên Bà Chín 4,39  0,03 1,43.108  7.106 Ninh Hòa 4,41  0,03 1,29.108  1,2.107 Năm Thu 4,34  0,03 1,62.108  1,5.107 Lên men có định hướng Vissan 4,15  0,03 1,15.109  8,5.107 Giáo Thơ 4,23  0,03 3,08.108  7.106 (n: tổng số mẫu khảo sát, pH : giá trị pH trung bình của mẫu, N : số lượng vi khuẩn trung bình của mẫu, SD: độ lệch chuẩn) Theo nghiên cứu trên nem chua lên men ngày 4 ở các cơ sở sản xuất theo kiểu lên men tự nhiên, kết quả phân tích thống kê chỉ ra rằng không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa pH của các mẫu nem ở 3 cơ sở khảo sát với độ tin cậy 95% (phụ lục 3). Qua Bảng 4.1, nem ở cơ sở Năm Thu có giá trị pH thấp nhất (vào khoảng 4,34  0,03) so với 2 cơ sở còn lại là Bà Chín (pH = 4,39  0,03) và Ninh Hòa (pH = 4,41  0,03). Sự khác biệt này là không đáng kể về mặt thống kê (p > 0,05). Theo nghiên cứu của Lý Ngọc Quí (2006) trên sản phẩm nem chua ở cơ sở Út Thẳng, pH của nem chua trong ngày lên men đầu tiên là 6,33 và ngày thứ 4 là 3,99. Sở dĩ có sự sụt giảm pH là do quá trình - 31 - chuyển hóa đường trong nguyên liệu thành các acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic làm giảm pH của nguyên liệu. Ở các cơ sở sản xuất nem theo kiểu lên men có định hướng, phân tích thống kê chỉ ra rằng pH của nem chua ở hai cơ sở Vissan và Giáo Thơ khác biệt nhau có ý nghĩa (p ≤ 0,05) (phụ lục 3). Giá trị pH của nem chua Giáo Thơ là 4,23  0,03 cao hơn so với nem Vissan (pH = 4,15  0,03). Giá trị pH ở 2 cơ sở này thấp hơn so với 3 cơ sở lên men tự nhiên. Điều này có lẽ là do quá trình lên men nem có định hướng tại các cơ sở này. Ở cơ sở Giáo Thơ người ta sử dụng một phần thịt đã lên men ngày hôm trước cho việc sản xuất nem chua ngày hôm sau (80 g bột thịt ngày 2 và 10 kg bột thịt ngày hôm trước được cho thêm vào 40 kg thịt xay của ngày sản xuất) (Lý Ngọc Quí, 2006). Khi lên men có định hướng, vi khuẩn lactic chiếm ưu thế về lượng ngay ở giai đoạn đầu phát triển và sản sinh nhiều aicd hơn so với sản phẩm lên men tự nhiên (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008). Trong lên men xúc xích khô, việc sử dụng men vi sinh với những vi khuẩn phân lập từ chính sản phẩm (men vi sinh nội tại) dẫn đến sự hình thành nhanh chóng acid lactic ngay từ ban đầu của tiến trình lên men làm giảm nhanh pH của quá trình lên men (Ammor, 2007; trích dẫn bởi Hồ Thị Nguyệt Thu, 2008). Bên cạnh đó, pH của sản phẩm thịt phụ thuộc vào pH ban đầu của bột thịt, vào lượng và loại gia vị và phụ gia sử dụng, vào hệ vi khuẩn ban đầu và vào những yếu tố có liên quan đến sự tăng trưởng của chúng như nhiệt độ, hoạt tính nước, thế năng oxy hóa - khử... (Hồ Thị Nguyệt Thu, 2008). Trong sản xuất nem chua, các acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic, sinh ra trong quá trình lên men đã làm giảm giá trị pH, tạo vị chua tự nhiên cho sản phẩm và làm cho cấu trúc thịt săn chắc, tạo nên kết cấu dai chắc đặc trưng cho sản phẩm. Bên cạnh đó, pH thấp còn có tác dụng cản trở sự phát triển của một số vi sinh vật không mong muốn trong sản phẩm, giúp cho việc bảo quản sản phẩm tốt hơn. Kết quả xử lý thống kê về tổng lượng vi khuẩn lactic cho thấy sự khác biệt giữa các mẫu nem ở 3 cơ sở lên men tự nhiên là có ý nghĩa (p ≤ 0,05). Tổng lượng vi khuẩn lactic của nem Năm Thu 1,62.108 CFU/g là cao nhất, kế đến là nem cơ sở Bà Chín với tổng lượng vi khuẩn lactic là 1,43.108 CFU/g (thấp hơn 1,9.107 CFU/g) và nem Ninh Hòa có tổng lượng vi khuẩn thấp nhất (1,29.108 CFU/g thấp hơn 3,3.107 CFU/g so với nem Năm Thu). Điều này phù hợp với các giá trị pH mà chúng tôi đã đo lường, tổng - 32 - lượng vi khuẩn lactic càng nhiều sẽ sản sinh ra nhiều acid hơn và làm giảm pH sản phẩm. Sự khác nhau về tổng lượng vi khuẩn giữa 3 cơ sở lên men tự nhiên có thể là do hệ vi sinh vật trong bột thịt ban đầu, lá gói, các nguyên phụ liệu, điều kiện môi trường như nhiệt độ, độ ẩm… của các cơ sở khảo sát. Đối với 2 cơ sở Vissan và Giáo Thơ, tổng lượng vi khuẩn cao hơn rất nhiều so với 3 cơ sở lên men tự nhiên, tổng lượng vi khuẩn lactic của nem Giáo Thơ là 3,08.108 CFU/g và Vissan là 1,15.109 CFU/g (lần lượt cao hơn 1,46.108 CFU/g và 9,88.108 CFU/g so với Năm Thu). Sự khác biệt này có lẽ là do các cơ sở Giáo Thơ và Vissan sử dụng phương pháp lên men định hướng, bổ sung vi sinh vật chủ động, bằng cách sử dụng men khô (Vissan) hoặc bột thịt đã được lên men của những ngày trước (Giáo Thơ), khiến chúng phát triển chiếm ưu thế, ức chế các vi khuẩn cạnh tranh khác, tạo điều kiện cho chúng phát triển mạnh. Phân tích thống kê cho thấy tổng lượng vi khuẩn lactic của 2 cơ sở này khác nhau rất có ý nghĩa (p ≤ 0,001). Sự khác biệt này có thể là do phương pháp định hướng lên men của 2 cơ sở. Cơ sở Vissan sản xuất nem theo qui mô công nghiệp lớn và sử dụng men với các giống thuần, các chủng vi khuẩn lactic khởi động tốt và có khả năng phát triển mạnh, làm xúc tiến nhanh quá trình lên men. 4.1.2 Phần trăm các dạng khuẩn lạc của nem chua lên men ngày 4 ở năm sơ sở khảo sát Kết quả ghi nhận về các dạng khuẩn lạc hiện diện trên nem chua ngày 4 ở năm cơ sở cho thấy tổng cộng có 7 dạng khuẩn lạc được ghi nhận trong các mẫu nem khảo sát. Việc phân loại các dạng khuẩn lạc được dựa vào màu sắc, hình dạng và kích thước của khuẩn lạc. Các dạng khuẩn lạc bao gồm:  Dạng I: khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng sữa, có viền sáng xung quanh, rìa gọn, kích thước thay đổi từ 1- 2 mm.  Dạng II: khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng sữa, kích thước thay đổi từ 1- 2 mm.  Dạng III: khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng sữa, viền sáng, rìa không gọn, kích thước thay đổi từ 1- 2 mm.  Dạng IV: khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng đục, trong, kích thước 2 mm.  Dạng V: khuẩn lạc tròn, vun cao, màu trắng sữa, kích thước 1 mm.  Dạng VI: khu 2 mm.  Dạng VII: khuẩn lạc tr b) Nấm men Hình 4.1: a) Khuẩn lạc dạng II b) Nấm men c) Trực khuẩn Hình 4.2: - 33 - ẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng đục, r òn, vun cao, màu trắng hơi vàng, kích thư a) Khuẩn lạc dạng I c) Trực khuẩn Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng I Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng II ìa sáng, kích thước ớc 2 mm. b) Trực khuẩn c) Nấm men Hình 4.3: a) Khuẩn lạc dạng IV b) Trực khuẩn Hình 4.4: - 34 - a) Khuẩn lạc dạng III Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng III Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng IV a) Khuẩn lạc dạng V b) Cầu trực Hình 4.5: a) Khuẩn lạc dạng VI b) Trực khuẩn Hình 4.6: a) Khuẩn lạc dạng VII Hình 4.7: D Phần trăm mỗi dạng khuẩn lạc của các mẫu nem l trình bày ở Bảng 4.2 - 35 - Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng V Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng VI b) Trực khuẩn ạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng VII ên men ngày 4 ở 5 cơ sở được - 29 - Bảng 4.2: Phần trăm các dạng khuẩn lạc của nem chua ngày 4 ở 5 sơ sở khảo sát Kiểu lên men Cơ sở Σ (%) Dạng khuẩn lạc ( X  SD) (%) I II III IV V VI VII Lên men tự nhiên (n = 3) Bà Chín 100 55,08 ± 6,62 35,99 ± 8,95 8,93 ± 7,79 Ninh Hòa 100 28,76 ± 9,53 11,14 ± 3,51 2,05 ± 3,56 47,46 ± 5,36 10,59 ± 9,53 Năm Thu 100 32,40 ± 6,49 16,26 ± 8,87 51,34 ± 6,64 Lên men có định hướng (n = 3) Vissan 100 25,19 ± 9,51 24,08 ± 2,96 50,73 ± 6,66 Giáo Thơ 100 63,8 ± 9,29 36,16 ± 9,29 (n: tổng số mẫu khảo sát, X : phần trăm khuẩn lạc, SD: độ lệch chuẩn) - 30 - Ở cơ sở Bà Chín, có 3 dạng khuẩn lạc được ghi nhận trong đó, dạng I và II có tần số xuất hiện cao hơn nhiều so với dạng VII. Đối với cơ sở nem Ninh Hòa, chúng tôi ghi nhận được 5 dạng khuẩn lạc, trong đó dạng IV có tần số xuất hiện cao nhất (47,46%) và kế đến là dạng I (28,76%). Cơ sở Năm Thu có 3 dạng khuẩn lạc, tần số xuất hiện của dạng V và dạng I là cao nhất (lần lượt là 51,34% và 32,40%). Ở cơ sở Vissan, chúng tôi ghi nhận được 3 dạng khuẩn lạc, trong đó dạng VI có tần số xuất hiện cao nhất (50,73%). Đối với cơ sở Giáo Thơ có 2 dạng khuẩn lạc được ghi nhận, trong đó dạng I có tần số xuất hiện cao hơn dạng V (lần lượt chiếm tỉ lệ là 63,84% và 36,16%). Trong 7 dạng khuẩn lạc được ghi nhận, chúng tôi quan sát thấy có 2 dạng giống với khuẩn lạc được nhận định của Lý Ngọc Quí (2006): Khuẩn lạc dạng I và dạng II mà chúng tôi ghi nhận được giống với mô tả khuẩn lạc dạng VI và dạng I.2 trong nghiên cứu của tác giả này. Theo ghi nhận của chúng tôi, dạng I xuất hiện ở tất cả các mẫu nem ở 5 cơ sở với tần số khá cao (25,19% - 63,8%). Còn các dạng còn lại chỉ xuất hiện ở một số cơ sở, ví dụ như cơ sở Vissan và Giáo Thơ không có dạng II, III và VII; cơ sở Bà Chín và Ninh Hòa không có dạng V và VI. Riêng dạng VI chỉ xuất hiện ở cơ sở Vissan. Sự khác biệt về những dạng khuẩn lạc ở các cơ sở có thể là do hệ vi sinh vật trong thịt ban đầu, các nguyên phụ liệu (đường, lá gói,…), các thao tác trong quá trình sản xuất, điều kiện môi trường chế biến, phương pháp lên men… Theo Hồ Thị Nguyệt Thu (2008), lá gói cũng tham gia vào quá trình lên men, do khi khảo sát hệ vi khuẩn lactic của lá chùm ruột tác giả đã ghi nhận các vi khuẩn lactic hiện diện với lượng không ít. Ngoài ra, đường mía sử dụng cũng bổ sung các khoáng chất, tạo thuận lợi cho sự phát triển vi khuẩn lactic của nem chua (Trương Thanh Long, 2004; trích dẫn bởi Hồ Thị Nguyệt Thu, 2008) Ở các cơ sở lên men theo kiểu định hướng, dạng khuẩn lạc có xu hướng ít hơn so với các cơ sở lên men tự nhiên do khi lên men định hướng bổ sung các các sinh vật mong muốn làm chúng phát triển chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật ngay từ lúc đầu, tạo điều kiện cho chúng phát triển mạnh cạnh tranh với các hệ vi sinh vật khác trong bột thịt. - 31 - 4.2 TÍNH CHẤT SINH HÓA CỦA NHỮNG DẠNG KHUẨN LẠC PHÂN LẬP Kết quả nghiên cứu về các đặc tính sinh hóa của những dạng khuẩn lạc phân lập trên các mẫu nem ở 5 cơ sở được trình bày ở Bảng 4.3. - 32 - Bảng 4.3 Tính chất sinh hóa của những dạng khuẩn lạc phân lập. Lên men tự nhiên (%) Lên men định hướng (%) Tổng (%) Bà Chín Ninh Hòa Năm Thu Vissan Giáo Thơ I II VII I II III IV VII I III V I IV VI I V Vi thể (n= 132) Gram (-) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (+) 6,82 6,82 4,55 6,82 6,82 2,27 6,82 4,55 6,82 6,82 6,82 6,82 6,82 6,82 6,82 6,82 100 Hình thái vi khuẩn Nấm men (n = 6) 0,76 0,76 0 0,76 0 0,76 0 0 0,76 0,76 0 0 0 0 0 0 4,55 Trực khuẩn (n = 108) 6,06 6,06 4,55 6,06 6,82 1,52 6,82 4,55 6,06 6,06 0 6,82 6,82 6,82 6,82 0 81,82 Cầu trực (n = 18) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6,82 0 0 0 0 6,82 13,63 Phản ứng sinh hóa (n= 126) Catalase (-) 6,35 6,35 4,76 6,35 7,14 1,59 7,14 4,76 6,35 6,35 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 100 (+) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Di động (-) 6,35 6,35 4,76 6,35 7,14 1,59 7,14 4,76 6,35 6,35 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 100 (+) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Dạng lên men Đồng hình 0 6,35 4,76 0 7,14 1,59 7,14 4,76 0 6,35 7,14 0 7,14 0 0 7,14 59,52 Dị hình 6,35 0 0 6,35 0 0 0 0 6,35 0 0 7,14 0 7,14 7,14 0 40,48 Sinh acid lactic (-) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (+) 6,35 6,35 4,76 6,35 7,14 1,59 7,14 4,76 6,35 6,35 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 100 (n: tổng số mẫu khảo sát) Nghiên cứu Dạng khuẩn lạc Kiểu lên men Cơ sở - 36 - Theo kết quả được trình bày ở Bảng 4.3, trong 132 khuẩn lạc khảo sát về hình thái vi khuẩn, kết quả cho thấy đa số các khuẩn lạc có dạng trực khuẩn (81,82%), kế đến là dạng cầu trực (13,63%) tập trung chủ yếu ở dạng V. Chỉ có một số ít là nấm men (4,55%), với tần số xuất hiện thấp ở các dạng I, II và III. Sau khi kiểm tra và loại bỏ các chủng vi khuẩn là nấm men, chúng tôi thực hiện các phản ứng sinh hóa với 126 chủng vi khuẩn phân lập để xác định vi khuẩn lactic. Kết quả các phản ứng catalase, khảo sát khả năng di động và sinh acid lactic cho thấy 100% các chủng phân lập thỏa mãn yêu cầu về đặc tính sinh hóa của vi khuẩn lactic. Theo khảo sát về dạng lên men, ở các sản xuất nem chua theo kiểu lên men tự nhiên, 70% vi khuẩn kiểm tra có khả năng lên men đồng hình; trong khi ở các cơ sở sản xuất theo phương pháp lên men có định hướng thì 60% các chủng vi khuẩn khảo sát có đặc tính lên men dị hình. Hình 4.8: Sự chuyển màu của dung dịch trong khảo sát khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn. 4.3 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP Khảo sát sơ bộ đối với 126 chủng vi khuẩn, được xem là vi khuẩn lactic, về khả năng kháng khuẩn của chúng đối với 5 chủng gây bệnh (Staphylococcus aureus ssp. - 37 - aureus CIP 20256, E. coli ATCC 25922, Bacillus cereus CIP 6624T, Listeria monocytogenes CIP 82110 T và Salmonella indiana LMBA) chothấy có 28 chủng có khả năng kháng cả 5 chủng gây bệnh nói trên chiếm 22,22% tổng số chủng vi khuẩn khảo sát. Trong đó, có 5 chủng dạng I ở nem Bà Chín, Ninh Hòa (3,97%); 6 chủng dạng III ở nem Năm Thu (4,76%); 5 chủng dạng V ở nem Giáo Thơ (3,97%); 5 chủng dạng VI ở nem Vissan (3,97%) và 7 chủng dạng VII ở nem Bà Chín và Ninh Hòa (5,55%). Kết quả khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên thạch của 28 chủng này cho thấy chỉ có 01 chủng dạng VII ở nem Ninh Hòa có khả năng kháng lại Staphylococcus aureus ssp. aureus CIP 20256 và 01 chủng dạng I của nem Ninh Hòa kháng lại Salmonella indiana LMBA. Điều này có thể là do các chủng vi khuẩn còn lại tạo ra lượng bacteriocin với nồng độ thấp nên không thể hiện được khả năng kháng khuẩn của chúng. Đường kính kháng khuẩn của chủng vi khuẩn dạng VII là 15mm trong khi ở dạng I là 7mm. Như vậy khả năng kháng Staphylococcus aureus ssp. aureus CIP của chủng vi khuẩn dạng VII mạnh hơn so với chủng dạng I kháng Salmonella indiana LMBA. Có vẻ như đối với vi khuẩn lactic, các bacteriocin thường có hiệu quả chống lại các vi khuẩn Gram (+) nhưng có thể không hiệu quả khi ức chế vi khuẩn Gram (-). Điều này có lẽ là do màng ngoài của vi khuẩn Gram (-) khá dày, gây trở ngại cho hoạt động của bacteriocin. Những màng này ngăn cản các phân tử như chất kháng sinh, chất tẩy rửa và thuốc nhuộm xâm nhập tế bào chất (De Martinis và ctv, 2001). Theo nghiên cứu của Nguyen (2010) trong 44 chủng vi khuẩn lactic kiểm tra, chỉ có một vài chủng thể hiện khả năng kháng khuẩn yếu đối với Staphylococcus aureus 1976 (Sa 1976) và không có chủng nào có khả năng kháng lại Salmonella typhimurium 1826 (St 1826). Vùng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic dạng VII đối với Staphylococcus aureus ssp. aureus CIP và dạng I đối với Salmonella indiana LMBA được trình bày ở Hình 4.9 và Hình 4.10. - 38 - Hình 4.9: Vùng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn dạng VII đối với Staphylococcus aureus ssp. aureus CIP. Hình 4.10: Vùng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn dạng I đối với Salmonella indiana LMBA. - 39 - Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN  Đối với các mẫu nem ngày 4 của 3 cơ sở lên men tự nhiên, sự khác biệt về pH sản phẩm là có ý nghĩa với độ tin cậy 95%. Đối với các mẫu nem ở 2 cơ sở lên men có định hướng, pH của chúng khác nhau có ý nghĩa (p ≤ 0,05) và thấp hơn so với các giá trị pH của các mẫu nem ở 3 cơ sở lên men tự nhiên.Tổng lượng vi khuẩn lactic giữa các mẫu nem khảo sát ở 3 cơ sở lên men tự nhiên khác nhau có ý nghĩa (p ≤ 0,05). Tổng lượng vi khuẩn lactic ở cơ sở Năm Thu (1,62.108 CFU/g) cao hơn tổng lượng vi khuẩn của hai cơ sở Bà Chín (1,43.108 CFU/g) và Ninh Hòa (1,29.108 CFU/g). Đối với 2 cơ sở lên men có định hướng là Vissan và Giáo Thơ, tổng lượng vi khuẩn cao hơn rất nhiều so với 3 cơ sở lên men tự nhiên. Tổng lượng vi khuẩn lactic ở cơ sở Vissan (1,15.109 CFU/g) cao hơn ở Giáo Thơ (3,08.108 CFU/g) và sự khác biệt này là rất có ý nghĩa về mặt thống kê (p ≤ 0,001).  Có 7 dạng khuẩn lạc được ghi nhận trong các mẫu nem ở 5 cơ sở. Kiểm tra vi thể cho thấy 81,82% vi khuẩn có dạng trực khuẩn, 13,63% vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn và 4,55% vi khuẩn có dạng nấm men. Sau khi kiểm tra các phản ứng sinh hóa, có 126 chủng vi khuẩn được xem là vi khuẩn lactic (chiếm 95,45 % tổng số chủng vi khuẩn phân lập).  Kiểm tra khả năng kháng khuẩn cho thấy chỉ có 01 chủng dạng VII (chiếm 0,79% vi khuẩn kiểm tra) ở nem Ninh Hòa có khả năng kháng lại Staphylococcus aureus ssp. aureus CIP 20256 và 01 chủng dạng I (chiếm 0,79% vi khuẩn kiểm tra) của nem Ninh Hòa kháng lại Salmonella indiana LMBA. Trong đó, chủng vi khuẩn dạng VII có khả năng kháng khuẩn mạnh hơn. - 33 - 5.2 ĐỀ NGHỊ  Lặp lại nghiên cứu trên các mẫu nem khác nhau với những thời điểm lên men khác nhau để tìm các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin.  Định danh các vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin.  Chuẩn hóa và tìm ra các phương pháp thích hợp nhằm thu được bacteriocin tốt nhất.  Ứng dụng các chủng lactic có khả năng sinh bacteriocin vào trong sản phẩm nem chua nhằm phát triển nem chua thành thực phẩm chức năng.