Khảo sát mầm bệnh ký sinh trùng và vi khuẩn trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) bệnh trắng gan, trắng mang

eria 10 Họ Enterobacteriaceae Giống Edwardsiella Đây là nhóm vi khuẩn Gram âm, hình que mảnh, không sinh bào tử và di động nhờ vành tiêm mao. Theo một số tài liệu nghiên cứu cho thấy họ Enterobacteriaceae thường không gây bệnh cho động vật thủy sản, tuy nhiên có 3 loài: Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri và Yersinia ruckeri là gây bệnh trên cá nước ngọt. Ở Việt Nam đã phân lập được E. tarda trên cá trê giống, E. ictaluri trên cá tra, cá basa, cá nheo giống và thịt. Cá nhiễm bệnh gầy yếu, bỏ ăn, bơi lội lờ đờ, tỷ lệ chết cao, giải phẩu nội tạng thấy xuất hiện nhiều đốm trắng đục kích cỡ 1-3 mm trên gan, thận và tỳ tạng. Bệnh gây thiệt hại trong các ao nuôi cá hương đến 5-6 tháng tuổi, tỷ lệ tử vong 60-70% có khi đến 100% (Bùi Quang Tề, 2003). Theo Trần Anh Dũng (2005) đây là loài vi khuẩn gây thiệt hại nặng nề nhất trong nghề nuôi bên cạnh loài vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Bệnh xuất hiện nhiều vào mùa xuân, mùa thu và trong ao nuôi với mật độ cao, nuôi cá lồng bè. Trước đây người ta sử dụng 3 loại kháng sinh: Enrofloxacin, Ciprofloxacin và Norfroloxacin để trị bệnh này, nhưng hiện nay 3 loại thuốc này đã bị cấm sử dụng do tính độc hại của thuốc ảnh hưởng đến sức khỏe con người (Từ Thanh Dung, 2005). 2.3.3. Bệnh do vi khuẩn Streptococcus Ngành Firmicutes Lớp Bacilli Bộ Lactobacillales Họ Streptococceae Giống Streptococcus Đây là nhóm vi khuẩn Gram dương, hình cầu hoặc hình oval, kỵ khí không bắt buộc, không di động, không tạo bào tử và phát triển tốt trong môi trường máu. Theo Bùi Quang Tề (2005) khi cá bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus thì gan, thận, tỳ tạng bị hoại tử. Bệnh thường xuất hiện vào mùa mưa, gây tỷ lệ chết cao. Để phòng bệnh này áp dụng biện pháp phòng bệnh tổng hợp là chính, có thể sử dụng kháng sinh Erythromycine để trị bệnh cho cá, hiện nay đã có vaccine phòng bệnh do vi khuẩn Streptococcus. 2.4.4. Bệnh do vi khuẩn Mycobacterium Ngành Actinobacteria Lớp Actinobacteria 11 Bộ Actinomycetales Họ Mycobacteriaceae Giống Mycobacterium Nhóm vi khuẩn Mycobacteriaceae hiếu khí, không di động, không sinh bào tử, hình que, Gram dương và ưa acid. Gây bệnh chủ yếu ở cá nước ngọt và nước mặn nhiệt đới gồm 2 loài: Mycobacterium marinum, Mycobacterium fortuitum. Vi khuẩn M.marinum được phát hiện ở hồ bơi, bãi biển, trong các dòng chảy tự nhiên, hồ cá cảnh và cả trong nước máy. Chúng thường gây bệnh trên cá La Hán, ngoài ra một số loài thuộc giống Mycobacterium còn gây bệnh cho cả con người, tuy nhiên chưa tìm thấy tài liệu nào về loài vi khuẩn này gây bệnh trên cá Tra. Khi cá mắc bệnh da cá bị lở loét màu xám trắng, vẩy tróc, đuôi bị hoại tử, khối u xuất hiện trong mô và nội tạng dẫn tới sưng phù, gan thận teo (www.Thuvienkhoahoc.com/tusach/Đa_dạng_VSV/ Đa_dạng_vi_khuẩn_và_các_nghiên_cứu_ở_Việt_Nam). Cách phòng trị: dùng Chloramin T hoặc B khử trùng nước trước khi thả nuôi với nồng độ 10 ppm trong 24 giờ. Dùng kháng sinh để trị (www.Thuvienkhoahoc.com/tusach/Đa_dạng_VSV/Đa_dạng_vi_khuẩn_và_cá c_nghiên_cứu_ở_Việt_Nam). 12 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian Đề tài được tiến hành từ tháng 01/08 đến tháng 05/08. Địa điểm Nơi thu mẫu: thu mẫu tại các huyện: Vĩnh Thạnh-Cần Thơ, Thốt Nốt-Cần Thơ, Trà Ôn-Vĩnh Long, Long Hồ-Vĩnh Long, Phụng Hiệp-Hậu Giang, Kế Sách-Sóc Trăng, Long Phú-Sóc Trăng. Sau đó mẫu được đưa về phòng thí nghiệm của Bộ Môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản–Khoa Thủy Sản–Trường Đại Học Cần Thơ để phân tích. 3.2. Vật liệu nghiên cứu Mẫu vật: Cá Tra có dấu hiệu bị bệnh trắng mang, trắng gan, hai chủng vi khuẩn chuẩn (Edwardsiella ictaluri E223 và Aeromonas hydrophila A2) có nguồn gốc tại Bộ Môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản – Khoa Thủy Sản – Đại Học Cần Thơ. 3.2.1. Vật liệu thu và trữ mẫu Thùng mướp, máy sục khí mini, nước đá, bọc nylon, viết lông dầu. 3.2.2. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu Hóa chất Cồn 70o, nước cất, nước muối sinh lý 0,85%, formaline 10%, cồn 96o. Dung dịch nhuộm Gram, Vaseline, H2O2, Oxidase, Parafin, thuốc thử Kovac’s, thuốc thử VP, thuốc thử Nitrate, HgCl2, Lugol’s Iodine. Môi trường Nutrient Agar, Nutrient Broth, Aeromonas, TSI, Citrate, O/F, Nitrate, VP, Mannitol, Mantose, Salicin, Xylose, Trypton, môi trường Decarbocylase với các acidamin là: Arginine, Lysine. Dụng cụ: Bộ đồ tiểu phẩu, lame, lamen, kính hiển vi, ống nhỏ giọt nhựa, khay nhựa, cân, thước đo chiều dài cá, chén thủy tinh, kính mặt đồng hồ, bình xịt nước, ống nghiệm, đĩa Petri, đèn cồn, ống chích, que trãi thủy tinh, bình xịt cồn, cốc đốt 100-250 ml, hộp đầu col pipet 0,5 và 1ml, pipet tự động 100- 13 1000µl, giấy vệ sinh, giấy nhôm, viết lông dầu, bọc nylon, dây thun, hột quẹt, tủ sấy, tủ ấm, tủ đông, tủ cấy vô trùng, nồi autoclave. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Phương pháp thu mẫu Tiến hành thu mẫu trên 12 ao nuôi cá tra, trong đó có 3 ao cá khỏe và 9 ao cá có xuất hiện bệnh trắng mang, trắng gan. Đối với ao cá bệnh, thu mẫu cá còn sống (cá bệnh sắp chết), thu từ 3-5 con/ao (thu 3 cá bệnh, 2 cá khỏe), còn đối với ao cá khỏe thu ngẫu nhiên 3-5 con/ao, sau đó vận chuyển cá về phòng thí nghiệm bằng thùng mướp chứa không quá 1/3 nước có bơm oxy phân tích trong vòng 24 giờ (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). Trường hợp không thể vận chuyển sống thì ướp đá đem về phân tích trong vòng 24 giờ. Trong quá trình thu mẫu có kết hợp thu thập thông tin liên quan đến quá trình bộc phát bệnh từ người nuôi dựa theo phiếu phỏng vấn được thiết kế sẵn (phụ lục 1). 3.3.2. Phương pháp phân tích mẫu 3.3.2.1. Phương pháp giải phẩu cá Dùng kéo chọc thủng phần da mềm ở hậu môn, cắt đường 1 vòng lên phía lưng dọc theo đường bên tới dưới mang, đường cắt 2 cắt từ lổ hậu môn dọc theo bụng tới dưới mang, rồi tiếp tục cắt đường 3 giáp với đường 1 rồi lấy hẳn miếng da ra sẽ thấy rõ phần nội quan, tránh làm thủng các cơ quan bên trong. 3.3.2.2. Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng trên cá Áp dụng phương pháp kiểm tra ký sinh trùng theo “Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn bệnh học thủy sản” (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2007).  Kiểm tra ngoại ký sinh trùng Quan sát các dấu hiệu bên ngoài: màu sắc, vây, vẩy,…và ghi nhận tình trạng cá trước khi mổ. Da: Dùng dao cạo nhẹ nhàng lớp nhớt trên da, cho lên lame sạch rồi nhỏ 1 giọt nước lên. Đậy lamen lại và quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 4-10X để tìm ký sinh trùng. 14 Vây: Dùng kéo cắt tất cả các vây của cá cho vào đĩa lồng và quan sát dưới kính soi nổi. Mang: Cắt rời cung mang, cạo nhớt trên cung mang rồi ép tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10-40X để tìm ký sinh trùng.  Kiểm tra nội ký sinh Quan sát xoang bụng: Mổ cá và quan sát kỹ xoang bụng tìm bào tử và bào nang của ký sinh trùng trong xoang bụng và trên màng treo ruột. Túi mật: Cạo nhớt thành túi mật và phết mẫu mật lên lame rồi quan sát dưới kính hiển vi để tìm ký sinh trùng. Dạ dày: Mổ dạ dày, cạo nhớt thành dạ dày và quan sát dưới kính hiển vi. Ruột: Mổ ruột tìm ký sinh trùng có kích thước lớn (giun tròn, sán dây,…). Phết mẫu nhớt ruột và quan sát dưới kính hiển vi quang học.  Xác định tỷ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm (theo Nguyễn Thị Thu Hằng, 2007) Xác định tỷ lệ cảm nhiễm theo công thức: TLCN (%) = Số cá nhiễm ký sinh trùng / Tổng số cá kiểm tra x 100 Xác định cường độ cảm nhiễm: CĐCN = Số trùng / con cá (trùng lớn và ít) CĐCN = Số trùng / cơ quan (trùng lớn và nhiều) CĐCN = Số trùng / lame (trùng nhỏ và ít) CĐCN = Số trùng / thị trường (trùng nhỏ và rất nhiều) 3.3.2.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn Áp dụng phương pháp phân lập vi khuẩn theo “Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn bệnh học thủy sản” (Đặng Thị Hoàng Oanh ,2007). Áp dụng các nguyên tắc vô trùng trong quá trình giải phẩu cá và phân lập vi khuẩn nhằm tránh tạp nhiễm. Phân lập vi khuẩn trên gan, thận, tỳ tạng cấy lên đĩa TSA hoặc NA. Ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 30oC. Sau 18-24 giờ quan sát và ghi nhận đặc điểm hình thái của khuẩn lạc. Tách ròng bằng cách lấy 1 khuẩn lạc cấy sang đĩa TSA khác theo 4 bước cấy tiêu chuẩn. Sau đó tiến hành kiểm tra tính thuần bằng cách nhuộm Gram, kiểm tra tính di động. Khi được dòng vi khuẩn thuần nuôi 15 tăng sinh trong môi trường NB rồi kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và được tiến hành kiểm tra song song với chủng chuẩn được chọn.  Các chỉ tiêu sinh lý: phản ứng Oxidase, Catalase  Các chỉ tiêu về sinh hóa: khả năng lên men và oxi hóa đường glucose, khả năng tạo acid từ các loại đường (glucose, sucrose, lactose, mannitol, maltose, salicine, xylose), khả năng sinh khí từ glucose, khả năng sinh khí H2S, khả năng thủy phân esculin, TSI, khả năng sử dụng citrate, khả năng sinh Indol, khả năng tạo nitrit từ nitrate, phản ứng VP (Voges-proskaner), khả năng sử dụng aminoacid (arginine và lysine). 3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel, soạn thảo văn bản bằng chương trình Microsoft Word. 16 Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1. Thu thập thông tin Trong quá trình thu mẫu có kết hợp với việc thu thập thông tin từ hộ nuôi. Đây là một trong những yếu tố quan trọng để tìm ra nguyên nhân gây bệnh được chính xác hơn. Tất cả mẫu thu trong đợt này đều từ loại hình nuôi ao với tổng số mẫu thu là 54 mẫu cá tra, trong đó có 10 mẫu cá khỏe và 44 mẫu cá bệnh. 4.1.1. Thông tin về cải tạo ao, con giống và mật độ nuôi Một số thuốc và hóa chất được sử dụng để cải tạo ao trước khi thả cá vào ương nuôi như: Vôi, chlorine, BKC, chloramine_T, Iodine, Thiosulfat Natri, EDTA nhằm diệt mầm bệnh và xử lý nước, đây là khâu quan trọng để tạo một môi trường tốt nhất cho việc ương nuôi. Bước khởi đầu này đã được đa phần các hộ nuôi thực hiện rất tốt, từ việc sên vét bùn đáy ao, phơi đáy, ngâm ao, dùng hóa chất diệt tạp, mầm bệnh và xử lý nước trước khi thả cá. Tuy nhiên, hiện nay do ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khách quan và chủ quan mà chất lượng con giống chưa đảm bảo, nên trong đợt thu mẫu này đã thu được những cá tra bị bệnh chủ yếu ở giai đoạn cá từ 12g-50g/con. Cá bệnh thường có những biểu hiện bất thường như: bơi lội lờ đờ, dạt bờ,… và những biến đổi trên cơ thể như: xuất huyết, đốm mủ trên gan và thận, mang trắng, gan trắng hoặc tái nhợt. Tình trạng bệnh kéo dài từ vài ngày đến vài chục ngày và làm hao hụt từ 20con – 10.000con/ngày gây thiệt hại đáng kể cho các hộ nuôi. Qua kết quả điều tra cho thấy mật độ nuôi biến động tùy theo kích cỡ cá và kinh nghiệm của người nuôi, cá giống từ 20-50 g/con mật độ nuôi khoảng 45- 75 con/m2. Theo Dương Nhựt Long (2003) mật độ thả cá giống nuôi thích hợp 20-30 con/m2, tuy nhiên do tận dụng triệt để khối nước trong ao mà người dân thả cá với mật độ khá dầy đặc. Với mật độ nuôi cao đòi hỏi người nuôi phải quản lý môi trường ao nuôi thật tốt, nếu không cá sẽ dễ mắc bệnh và lây lan nhanh chóng. 4.1.2. Vấn đề sử dụng thuốc, hóa chất trong phòng và trị bệnh Một số loại hóa chất thường được sử dụng để diệt ngoại ký sinh trùng và nấm trên cá như: NaCl, KMnO4, CuSO4, formol, Xanh Methylen, Peroxide và các hóa chất này cũng được các hộ nuôi dùng để phòng và xử lý định kỳ cho ao nuôi. Theo kinh nghiệm của người nuôi cho biết CuSO4 diệt trùng mặt trời rất hiệu quả, đối với sán lá thì sử dụng NaCl, KMnO4 hoặc formol,… 17 Qua đợt thu mẫu từ ngày 11/04-15/05 thống kê được 6/9 ao cá bệnh chuyển sang trắng mang, trắng gan sau khi cá bị mủ gan, xuất huyết, phù đầu và có 3/9 ao cá xuất hiện bệnh trắng mang, trắng gan sau cơn mưa đầu mùa (phụ lục 4). Đồng thời cũng ghi nhận được một số loại thuốc kháng sinh mà người nuôi đã sử dụng trước khi cá bị bệnh này: Norfloxacin, Flofenicol, Doxycyline, Cefalexin, Enrofloxacin, Amoxycilin, Ciprofloxacin,… trong đó Norfloxacine, Ciprofloxacin, Enrofloxacine thuộc nhóm Quinolon đã bị cấm sử dụng do thời gian tồn lưu của ba loại thuốc này khá lâu và tính độc hại của nó đối với sức khỏe con người. Mặc dù vậy, người nuôi vẫn sử dụng vì nhóm này dùng xử lý bệnh do vi khuẩn rất có hiệu quả, trong khi các loại kháng sinh: Oxytetracyline, Tetracyline, … điều trị không hiệu quả do vi khuẩn đã kháng thuốc (Nguyễn Thanh Phương, 2007). Bảng 4.1: Một số loại kháng sinh được dùng trước khi cá bị bệnh trắng mang, trắng gan STT Ao Tên thuốc Liều lượng Thời gian điều trị 1 Ao 1 Flofenicol Enrofloxacin Osamet Fish 2mg/1kg thức ăn 2mg/1kg thức ăn 1 kg/200 kg thức ăn 5 ngày 5 ngày 2 Ao 2 Chưa xử lý 3 Ao 3 Enrofloxacin Ciprofloxacin Cefalexin 1kg/12 tấn cá 1kg/12 tấn cán 1kg/12 tấn cá 7 ngày 7 ngày 7 ngày 4 Ao 4 Amoxycillin Doxycylin Enrofloxacin 750g/12 tấn cá 750g/12 tấn cá 750g/12 tấn cá 3 ngày 3 ngày 3 ngày 5 Ao 5 Ampicilin + sulfamid Norfloxacin 1 kg/12 tấn cá 1 kg/12 tấn cá 7 ngày 7 ngày 6 Ao 8 Flofenicol Doxycyclin Enrofloxacin Amoxycillin 0,04g/1 kg cá 0,04g/1 kg cá 2 g/1 kg thức ăn 2 g/1 kg thức ăn 3 ngày 3 ngày 3 ngày 3 ngày Đối với ao 1 thông tin thu được từ hộ nuôi là trước khi chuyển sang trắng mang, trắng gan cá đã có triệu chứng bệnh mủ gan và xuất huyết, biện pháp xử lý là sử dụng kháng sinh Flofenicol liều lượng 2mg/1 kg thức ăn trong 5 ngày, 18 sau đó dùng Enrofloxacin kết hợp với Osamet Fish với tỷ lệ 1kg/200 kg thức ăn trong 5 ngày. Kết quả là bệnh mủ gan đã khỏi hẳn, cá đang ở trong tình trạng còn xuất huyết và chuyển sang trắng mang và gan. Dựa vào bảng 4.1 ta thấy người nuôi sử dụng kháng sinh với nồng độ rất cao, với tâm lý nghỉ rằng diệt tận gốc và triệt để vi khuẩn để cá khỏi bệnh hoàn toàn mà không kéo dài dây dưa. Điều này đã làm sai một trong những nguyên tắc sử dụng kháng sinh là: “phải sử dụng kháng sinh đúng liều và đúng thời gian quy định”. Do đó, khi lượng kháng sinh được đưa vào cơ thể với hàm lượng cao và thời gian kéo dài dẫn đến tổn thương gan và thận gây độc cho cơ thể bằng cách giữ lại những chất không cần thiết, chất độc hại, một phần các chất này sẽ được thận bài tiết ra ngoài. Có thể chính những cơ chế sinh học bên trong cơ thể cá đã thực hiện các chu trình chuyển hóa thuốc kháng sinh điều hòa hàm lượng thuốc thích hợp mà cơ thể cá có thể chịu được, giúp cá không bị ngộ độc và một khi bộ máy này làm việc quá mức sẽ gây nên những biến đổi bất thường: “gan trắng, thận nhạt màu thậm chí chuyển sang màu trắng”. Như vậy, vấn đề đặt ra là: Bệnh trắng mang, trắng gan xuất hiện trên cá tra nuôi ao là do: ký sinh trùng, vi khuẩn, thuốc kháng sinh, thời tiết thay đổi đột ngột hay do một nguyên nhân nào khác. 4.2. Kết quả kiểm tra ký sinh trùng Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên các mẫu cá tra thu tại 12 ao ở các huyện thuộc 4 tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long, Sóc Trăng và Hậu Giang khá phong phú và đã phát hiện được 11 giống loài ký sinh trùng: Dactylogyrus sp., Trichodina sp., Myxobolus sp., Ichthyonyctus sp., Balantidium sp., sán lá song chủ, Metaceraria, Epistylis sp., Henneguya sp., trùng miệng lệch Chilodonella sp. và Gyrodactylus sp. Các loài ký sinh trùng này được phát hiện chủ yếu ở da, vây, mang, ruột và không tìm thấy trong mật và xoang bụng (Bảng 4.2). Dựa vào bảng 4.2 cho thấy trong tổng số 54 mẫu cá được phân tích thì sự xuất hiện của sán lá 16 móc Dactylogyrus sp là chiếm tỷ lệ cao nhất (64,81%), kế đến là sự xuất hiện của Trichodina sp và Myxobolus sp (51,85%) và các thành phần giống loài ký sinh trùng còn lại xuất hiện với tỷ lệ tương đối thấp. 19 Bảng 4.2: Thành phần giống loài ký sinh trùng trên tổng số cá tra quan sát (n=54 mẫu) Xét trên phạm vi từng ao nuôi, tùy theo từng địa điểm, kích cỡ cá và mật độ nuôi của từng ao mà có cường độ và tỷ lệ cảm nhiễm các loài ký sinh trùng khác nhau, nhưng nhìn chung khả năng cảm nhiễm Dactylogyrus sp. chiếm tỉ lệ cao nhất ở hầu hết các ao (10/12 ao), kế đến là Myxobolus sp. (9/12 ao), Trichodina sp. (8/12 ao) và các loài ký sinh trùng còn lại có xuất hiện rải rác ở một số ao nuôi với cường độ và TLCN không đáng kể (phụ lục 2). Mật độ nuôi tại những ao được khảo sát khá cao dao động từ 35-120 con/m2 ở kích cỡ cá từ 5-50 g và 50-65 con/m2 ở kích cỡ cá từ 150-500 g, theo đánh giá chung thì mật độ nuôi này khá cao dẫn tới môi trường ao nuôi xấu đi do lượng thức ăn dư thừa, lượng phân cá thải ra,…tạo điều kiện thuận lợi cho sự gia tăng mật độ mầm bệnh, đặc biệt là mầm bệnh ký sinh trùng và khả năng cá bị nhiễm ký sinh trùng càng dễ xảy ra hơn. STT Thành phần loài ký sinh trùng Cơ quan ký sinh CĐCN TLCN 1 Dactylogyrus sp. Mang 1-83 con/cung mang 64,81% 2 Trichodina sp. Da, vây, mang 1-50 trùng/10x10 51,85% 3 Myxobolus sp. Mang 2-34 bào nang/lame 51,85% 4 Sán lá song chủ Ruột, dạ dày 1-7 sán/lame 20,37% 5 Henneguya sp. Mang 3 bào nang/lame 1,85% 6 Chilodonella sp. Mang 1 trùng/lame 3,7% 7 Epistylis sp. Da 1-5 tế bào/10x10 7,4% 8 Ichthyonyctus pangasia Ruột ++ 14,81% 9 Balantidium sp. Ruột +++ 11,11% 10 Metacercaria Mang 1 ấu trùng/lame 3,7% 11 Gyrodactylus sp. Da 1 sán/lame 1,85% 20 Bảng 4.3: Tỉ lệ cảm nhiễm ký sinh trùng ở mức trên 60% tại các ao khảo sát Ao Kích cỡ (g/con) Mật độ (con/m2) TLCN  60% 1 400-500 50 Dactylogyrus, Trichodina 2 150-300 65 Dactylogyrus, Trichodina, Myxobolus, Epistylis, Ichthionyctus 3 10-20 120 Dactylogyrus, Myxobolus 4 5-15 60 Trichodina 5 15-30 60 Dactylogyrus 6 160-240 50 Dactylogyrus 7 1-5 120 Trichodina 8 15-20 75 Myxobolus 9 30-50 50 Dactylogyrus, Trichodina, Myxobolus, Balantidium 10 300-400 55 Dactylogyrus, Myxobolus 11 200-250 65 Dactylogyrus, Myxobolus 12 5-15 35 Trichodina, Myxobolus Tỉ lệ cảm nhiễm các loài ký sinh trùng  60% ở hầu hết các giai đoạn của cá từ giai đoạn cá hương, giống đến cỡ cá thương phẩm nhất là Dactylogyrus sp 8/12 ao, kế đến là Myxobolus sp 7/12 ao, Trichodina sp 6/12 ao. Tuy nhiên, cá ở giai đoạn nhỏ khi bị cảm nhiễm các loài ký sinh trùng này sẽ rất nguy hiểm do sức chịu đựng và chống chọi với mầm bệnh của cá còn yếu. Trong 12 ao được thống kê ở trên có 2 ao là không bị cảm nhiễm sán lá 16 móc do ao thu mẫu đang được xử lý thuốc và hóa chất diệt mầm bệnh. Tóm lại, trong môi trường nước ao nuôi luôn tồn tại mầm bệnh trong đó có cả mầm bệnh ký sinh trùng, do đó khi điều kiện thuận lợi cho chúng phát triển đủ lớn để có thể xâm nhiễm vào đàn cá nuôi, đặc biệt với mật độ nuôi dày đặc mầm bệnh sẽ rất dễ lây lan không những cho đàn cá trong cùng một ao mà có thể lây lan cho những ao lân cận. Kết quả ký sinh trùng trên cá tra bị bệnh trắng mang, trắng gan Thành phần ký sinh trùng xuất hiện trên cá tra bị bệnh trắng mang, trắng gan khá phong phú với 11 giống loài ký sinh trùng được phát hiện như kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên tổng số cá được phân tích bao gồm cả cá bệnh và cá khỏe. Đặc biệt khả năng cảm nhiễm các giống loài ký sinh trùng: Dactylogyrus sp., Trichodina sp., Myxobolus sp. Là rất cao với cường độ cảm nhiễm cao nhất tương ứng là 83 sán/cung mang; 50 trùng/10x10; 34 bào nang/lame (phụ lục 3). 21 Trong đó, khả năng cá bị cảm nhiễm Dactylogyrus sp là cao nhất (67,44%), kế đến là Trichodina sp (46,51%), Myxobolus sp (44,19%), và cường độ cảm nhiễm, tỷ lệ cảm nhiễm các giống loài: Gyrodactylus sp, Metacercaria, Balantidium sp, Ichthionyctus pangasia, Epistylis sp, trùng miệng lệch Chilodonella sp Chilodonella sp, Henneguya sp, sán lá song chủ là không cao và khả năng gây bệnh của những nhóm giống loài ký sinh này đối với các mẫu cá thu được là không nhiều. Theo một số tài liệu nghiên cứu ký sinh trùng trên cá tra, trong đó có kết quả nghiên cứu của Lê Thành Cường (2006) trên cá tra bị bệnh vàng da cũng có sự xuất hiện của sán lá song chủ, kết quả nghiên cứu ký sinh trùng của Nguyễn Thị Thu Hằng và ctv (2006-2007) cũng phát hiện được loài Bucephalosis gracilescens dạng trưởng thành ký sinh trong ruột cá, kết quả phân tích ký sinh trùng ở đợt thu mẫu này cũng phát hiện được loài sán này với tần số bắt gặp là 4/9 ao cá bệnh và cường độ cảm nhiễm: 1-11 cá thể/lame; tỷ lệ cảm nhiễm: 40-80% (Hình 4.1) (phụ lục 3). Sự hiện diện của nhóm trùng lông nội ký sinh: Ichthionyctus pangasia và Balantidium sp trên hầu hết các đoạn ruột của cá khi kiểm tra mẫu nhưng tập trung nhiều ở đoạn ruột có thức ăn (Hình 4.2). Tần số xuất hiện của Ichthionyctus pangasia là 6/9 ao cá bệnh và Balantidium sp là 4/9 ao cá bệnh, tuy nhiên theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) mặc dù chúng ký sinh với lượng lớn nhưng hai loài này không gây hại cho ký chủ, chúng chỉ làm bệnh nặng thêm khi vật chủ bị bệnh viêm ruột (trích dẫn bởi Lê Thành Cường, 2006). Điểm nổi bật và đáng chú ý nhất là sự xuất hiện của 3 giống loài ký sinh trùng: Dactylogyrus sp, Myxobolus sp và Trichodina sp. Tần số xuất hiện của Dactylogyrus sp là cao nhất 8/9 ao cá bệnh với cường độ cảm nhiễm cao nhất 83 cá thể/cung mang và tỷ lệ cảm nhiễm cao nhất 100%. Trong đó tỷ lệ cảm nhiễm loài sán này  60% có 6/9 ao cá bệnh và một ao không có loài sán này ký sinh do đang được xử lý trong lúc thu mẫu, kế đến là tần số xuất hiện của Trichodina sp với 6/9 ao cá bệnh với cường độ cảm nhiễm cao nhất: 50 trùng/10x10, tỷ lệ cảm nhiễm cao nhất:100% và Myxobolus sp 6/9 ao cá bệnh với cường độ cảm nhiễm cao nhất: 34 bào nang/lame, tỷ lệ cảm nhiễm cao nhất: 100%, trong đó tỷ lệ cảm nhiễm  60% đối với Trichodina sp bắt gặp 5/9 ao bệnh và Myxobolus sp bắt gặp 4/9 ao bệnh (phụ lục 3). Sán lá 16 móc Dactylogyrus là mầm bệnh nguy hiểm, chúng có khả năng gây chết hàng loạt khi bị nhiễm nặng, đặc biệt gây hại lớn nhất ở giai đoạn cá hương và giống (Bùi Quang Tề, 2006). Phá hoại cấu trúc mang làm mang tái nhạt, tiết nhiều nhớt gây cản trở hoạt động hô hấp của cá (hình 4.3). Chúng tấn 22 công và dùng móc bám vào sợi mang sơ cấp, điều này sẽ làm ảnh hưởng đến các mạch máu ở mang làm ngưng trệ quá trình trao đổi khí oxy hòa tan giữa nước và máu cá, cá bị thiếu máu cục bộ làm mang bị tái nhạt. Theo kết quả phân tích ký sinh trùng của Nguyễn Thị Thu Hằng (2005-2006) cho thấy loài Myxobolus sp xuất hiện ở tháng 9-12/2005 và tháng 01/2006 với tỷ lệ cảm nhiễm 80% và cường độ cảm nhiễm cao nhất 14 bào nang/lame thấp hơn sự xuất hiện của Myxobolus sp ở đợt thu mẫu này (tháng 3-5/2008) với cường độ cảm nhiễm cao nhất 34 bào nang/lame và tỷ lệ cảm nhiễm 100%. Tuy vậy, vẫn chưa tìm thấy tài liệu nào công bố về mật độ gây thành dịch bệnh của chúng đối với cá tra nuôi thâm canh. Cấu tạo của Myxobolus được bao bọc bởi lớp vỏ dày khá chắc chắn nên rất khó tiêu diệt chúng bằng thuốc và hóa chất (Hình 4.4). Theo Robert (1978) khi nhóm Myxozoa ký sinh trên tỳ tạng sẽ làm tỳ tạng giảm chức năng tạo kháng thể chống lại các tác nhân gây bệnh, mất khả năng tiêu hủy hồng cầu già và không thể tái tạo hồng cầu mới cho cơ thể ( trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Hằng và ctv, 2005-2006). Điều này sẽ làm cho lượng hồng cầu trong máu giảm thiểu trầm trọng, máu cá sẽ không đỏ tươi bình thường và chuyển sang màu vàng nâu thậm chí vàng nhạt, làm khả năng vận chuyển oxy đến các tổ chức bị chậm đi ảnh hưởng đến hoạt động bình thường của cơ thể cá. Bên cạnh đó, sự nguy hại của trùng bánh xe đối với ao nuôi cũng không kém phần quan trọng, khi bị trùng ký sinh cá bị ngứa ngáy, ký sinh trên mang làm phá hủy cấu trúc mang, mang tiết nhiều nhớt làm cá ngạt thở, đây cũng là một trong những tác nhân gây bệnh làm cá giống chết hàng loạt. Chúng xuất hiện với cường độ cảm nhiễm dao động từ 1-50 trùng/ 10x10 và tỷ lệ cảm nhiễm 46,51%, theo Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám (2000) thì ở cường độ cảm nhiễm 50-100 trùng/9x10 là nguy hiểm cho cá giống, và với cường độ cảm nhiễm trùng bánh xe ở đợt thu mẫu này là cần phải xử lý kịp thời. Tóm lại, những mẫu cá thu có dấu hiệu mang trắng, gan trắng khả năng cảm nhiễm các loài ký sinh trùng: Dactylogyrus sp, Trichodina sp và Myxobolus sp rất cao, chủ yếu chúng ký sinh ở mang gây cản trở hoạt động hô hấp của cá, góp phần làm rối loạn toàn bộ hoạt động bình thường của cá, cá yếu dần thậm chí chết hàng loạt nếu không có biện pháp xử lý kịp thời và thích hợp. 23 Hình 4.3: Dactylogyrus sp Hình 4.4: Myxobolus sp Hình 4.2: Ichthionyctus pangasia Hình 4.1: Sán lá song chủ Hình 4.6: Bào tử myxozoa Hình 4.5: Trichodina sp 25 4.3. Kết quả phân tích vi sinh Phân lập vi khuẩn từ 3 cơ quan gan, thận và tỳ tạng nuôi dưỡng trên môi trường TSA/NA ủ ở 28-30oC thấy khuẩn lạc phát triển tương ứng với khoảng thời gian cụ thể đặc trưng của từng loài vi khuẩn. Sau đó, tiến hành test các chỉ tiêu cơ bản để phân nhóm giống loài vi khuẩn rồi mới test các chỉ tiêu sinh hóa để định danh loài vi khuẩn cụ thể và các phản ứng này được test song song với chủng chuẩn được chọn. Tùy theo bản chất của từng phản ứng mà thời gian đọc kết quả sẽ khác nhau dao động từ 1-7 ngày, và sự khác biệt về màu sắc so với đối chứng hoặc màu sắc ban đầu sẽ cho kết quả dương tính và ngược lại. % Loài vi khuẩn Hình 4.7: Tỷ lệ xuất hiện của các nhóm vi khuẩn Kết quả phân lập vi sinh trên tổng số 54 mẫu cá tra, trong đó có 44 mẫu cá bệnh và 10 mẫu cá khỏe dựa trên các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn đã định danh được tổng số 25 chủng vi khuẩn, trong đó có 16 chủng Edwardsiella ictaluri chiếm tỷ lệ cao nhất 64%, kế đến là Aeromonas hydrophila chiếm 24% (6 chủng), 1 chủng Aeromonas sp chiếm 4% và 2 chủng Pseudomonas sp chiếm 8% (Hình 4.7). 64 24 4 8 0 10 20 30 40 50 60 70 1 E.ictaluri A.hydrophila Aeromonas sp Pseudomonas sp 26 % Loại bệnh Hình 4.8: Sự xuất hiện dấu hiệu bệnh lý của cá Vi khuẩn phân lập được trên 44 mẫu cá thuộc 9 ao cá bệnh tại các địa điểm được liệt kê ở phụ lục 4. Đa số cá bệnh đều có những biểu hiện bệnh lý như: bơi lội lờ đờ, dạt bờ nhưng cá không bỏ ăn. Trong số đó có 9/44 mẫu có biểu hiện bên ngoài trắng mang kết hợp với xuất huyết, giải phẩu nội tạng có dịch vàng, gan trắng và ruột đầy thức ăn chiếm 20,40%. Đặc biệt, có tới 25/44 mẫu có biểu hiện trắng mang, trắng gan kết hợp với mủ gan chiếm 52,86% và 10/44 mẫu là bị trắng mang, trắng gan đơn thuần chiếm 22,73%. Phần lớn cá bị bệnh ở giai đoạn còn nhỏ kích cỡ 1-50g/con (6/9 ao bệnh), chỉ có 3/9 ao bệnh là cá có kích cỡ lớn 150-500g/con (phụ lục 4). Nhóm vi khuẩn Aeromonas Phân lập vi khuẩn trên 3 cơ quan gan, thận và tỳ tạng của các mẫu cá bị trắng mang, trắng gan kèm theo hiện tượng xuất huyết ở các gốc vây và quanh miệng, sau 18-24h khuẩn lạc phát triển trên môi trường TSA/NA có dạng hình tròn, hơi lồi, màu vàng nhạt, kết quả kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản: vi khuẩn có hình que ngắn, gram âm, di động, phản ứng oxidase và catalase dương tính, có khả năng lên men và oxi hóa đường glucose, âm tính với O/129, kết quả TSI chỉ lên men glucose và vi khuẩn lên men đường glucose và galactose hoặc sucrose (phụ lục 5). Kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa định danh loài vi khuẩn được tiến hành cùng lúc với việc kiểm tra chủng chuẩn A. hydrophila (A2), kết quả có 7 chủng được định danh là Aeromonas sp cho các phản ứng đều dương tính ngoại trừ các phản ứng: Lysine, H2S, Urê, Indole và Inositol, sai khác một chỉ tiêu so với chủng A2 là Inositol (-) (phụ lục 5). Kết quả định danh này cũng trùng hợp với kết quả của Ngô Minh Dung (2007) là cho phản ứng âm tính với H2S và Urê. TM: Trắng mang TG: Trắng gan MG: Mủ gan XH: Xuất huyết 56.82 22.73 20.45 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 TM, TG, MG TM, TG TM, TG, XH 27 Riêng đối với các chủng TNG303b, TNL503b và STL303 cho phản ứng dương tính với Indol, âm tính với Aesculin. Trong đó, có 1 chủng Aeromonas sp được định danh là với sự khác biệt về các phản ứng so với chủng chuẩn là H2S (-), VP (-) và Salicin (-). Theo Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám (2003) bệnh nhiễm khuẩn máu hay bệnh xuất huyết xuất hiện bắt đầu từ tháng 2, có thể kéo dài đến tháng 9-10 lại ngay vào đợt thu mẫu này và chủ yếu phân lập được từ những mẫu cá có trọng luợng từ 150-500g (phụ lục 4). A. hydrophila được xem là chủng vi khuẩn gây bệnh cho cá quan trọng nhất ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên như: cá tra, basa, trê, cá chép, cá bống tượng (Lewis và Plumb, 1979 trích dẫn bởi Trần Anh Dũng, 2005), chúng gây thiệt hại lớn 30-70% đối với cá nuôi thịt. Nhóm vi khuẩn Pseudomonas sp Bệnh xuất huyết ngoài việc phân lập ra vi khuẩn A. hydrophila và A. sobria còn bắt gặp một số trường hợp phân lập được Pseudomonas sp (Từ Thanh Dung, 2005), và 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas sp cũng đã được phân lập từ những mẫu cá có biểu hiện trắng mang, trắng gan kết hợp với xuất huyết sau khi kiểm tra một số chỉ tiêu cơ bản: gram âm, hình que ngắn, di động, catalase dương tính, phản ứng oxidase âm tính, không lên men và không có khả năng oxi hóa glucose (phụ lục 5). Một thông tin nữa cũng trùng hợp với kết quả trên là bệnh xuất huyết nghiêm trọng ở cá bống tượng Oxyeleotris marmoratus 1984-1985 ở Thái Lan do 2 tác nhân chính chiếm 90% là A. hydrophila và Pseudomonas, 10% còn lại là sự xuất hiện của Edwardsiella tarda và Streptococcus sp (Chanchit, 1986 trích dẫn bởi Trần Anh Dũng, 2005). Nhóm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Tiến hành phân lập vi khuẩn trên 3 cơ quan gan, thận và tỳ tạng của tổng số 54 mẫu cá bệnh và cá khỏe đã phát hiện được 16 chủng Edwardsiella sp trên 20 mẫu cá bệnh với một số biểu hiện bệnh lý bên ngoài của cá: bơi lội lờ đờ trên mặt nước, ăn mạnh, mang trắng, có xuất huyết nhẹ ở các gốc vi, giải phẩu nội tạng thấy gan trắng, thận sưng nhũng có mủ, tỳ tạng có đốm mủ. Nhìn chung đợt thu mẫu từ tháng 3-5/2008 cá bị nhiễm bệnh mủ gan phần lớn ở giai đoạn cá còn nhỏ (5-30g). Vi khuẩn được cấy lên môi trường thạch NA/TSA sau 48h khuẩn lạc phát triển li ti, không nhân, màu trắng đục, rìa dạng không đồng nhất, kiểm tra các phản ứng cơ bản cho thấy đây là vi khuẩn Gram âm, hình que, không di động, lên men và oxi hóa đường Glucose, phản ứng dương tính với Catalase và âm tính với Oxidase. Kiểm tra sinh hóa đều âm tính chỉ cho phản ứng dương tính với Lysine và Glucose. Chủng chuẩn 28 được chọn kiểm tra song song với các chủng được phân lập là E. ictaluri (E223) (phụ lục 6), các chủng E. ictaluri phân lập được đều có kết quả kiểm tra sinh hóa giống với chủng chuẩn E223 chỉ sai khác chỉ tiêu sinh gas từ Glucose (-). Ngoài A. hydrophila thì vi khuẩn E. ictaluri là một trong hai loài vi khuẩn gây thiệt hại nhiều nhất cho nghề nuôi, chủng vi khẩn này gây bệnh mủ gan trên cá tra được phát hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh. Chúng tấn công lên gan, thận và tỳ tạng hình thành những đốm mủ trắng đục đường kính 1-3 mm, làm hủy hoại cấu trúc bình thường và mất chức năng của các cơ quan này làm rối loạn hoạt động sinh lý, sinh hóa bình thường của cá dẫn đến cá chết hàng loạt. Ngoài ra, có phát hiện thấy chúng xuất hiện ở các cơ quan khác: não, cơ, tim, mang, bóng hơi và máu (Lương Trần Thục Đoan, 2006). Như vậy, các giống loài vi khuẩn: Edwardsiella ictaluri, Aeromonas sp và Pseudomonas sp phân lập được từ những mẫu cá có biểu hiện bệnh, tuy nhiên trên một số mẫu cá cũng có biểu hiện trắng mang, trắng gan rõ rệt vẫn không phân lập được chủng vi khuẩn nào (3 ao) (phụ lục 4), do đó có thể nói vi khuẩn không phải là tác nhân gây ra bệnh trắng mang, trắng gan trên cá tra. 4.4. Sự ảnh hưởng của thuốc kháng sinh lên cơ thể cá Tất cả các chủng vi khuẩn đều phân lập được từ gan, thận và tỳ tạng của các mẫu cá có dấu hiệu bị bệnh. Trong số 25 chủng vi khuẩn phân lập được có 11/25 chủng được phân lập từ gan chiếm 44%, ở thận và tỳ tạng phân lập được số vi khuẩn bằng nhau 7/44 chủng chiếm 28%. Trong 9 ao cá bị bệnh chỉ có ao số 6 là cá đã và đang bị bệnh vàng da đồng thời có xuất hiện trắng mang, trắng gan còn 5 ao còn lại hầu hết trước đó cá bị Hình 4.9: cá bị trắng mang, trắng gan 29 bệnh xuất huyết phù đầu và mủ gan dây dưa kéo dài, sau khi sử dụng kháng sinh thì cá chuyển sang trắng mang, trắng gan (phụ lục 4). Trong các loại kháng sinh được nêu ở bảng 4.1 chỉ có Enrofloxacin, Cefalexin, Doxycillin và Norfloxacin là trị bệnh mủ gan có hiệu quả, tuy nhiên phải dùng với liều lượng cao chẳng hạn: Cefalexin (30g), Doxycillin (30g), Enrofloxacin (16g/ml), Norfloxacin ( 10g) (Huỳnh Chí Thanh, 2007). Đó chỉ là những kết quả kháng sinh đồ về khả năng nhạy cảm của E. ictaluri được gây cảm nhiễm trên cá tra với thuốc kháng sinh, nhưng trong thực tế, người dân sử dụng kháng sinh với liều lượng rất cao nhằm diệt được vi khuẩn nhanh chóng, cụ thể đối với loại kháng sinh Enrofloxacin liều lượng được dùng là 1 kg thuốc/12 tấn cá qui ra 1g cá sử dụng 83g thuốc. Mặc dù vậy, không đơn thuần các hộ nuôi sử dụng một loại thuốc để điều trị mà kết hợp nhiều loại kháng sinh cùng một lúc. Do trình độ hiểu biết về kháng sinh của người dân chưa vững có thể đã phối hợp kháng sinh sai nguyên tắc, điều này rất nguy hại cho ao nuôi dẫn tới: tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc, biến đổi hệ vi sinh vật trong ao nuôi, tích lũy kháng sinh trong thịt cá, lờn thuốc,… Thuốc được trộn vào thức ăn cho cá ăn, như vậy thuốc sẽ đi vào cơ thể qua đường tiêu hóa, gan sẽ chuyển hóa thuốc để tiết qua mật, một số sẽ được thải trừ qua thận. Như vậy, khi nồng độ thuốc quá cao sẽ gây ngộ độc cho cá, do đó chức năng của gan và thận được tận dụng triệt để thậm chí quá mức gây suy thoái chức năng của 2 cơ quan này. Gan bị giảm hoặc không còn khả năng chuyển hóa thuốc và thuốc sẽ bị tồn lưu ở gan, thận bị suy thoái chức năng, thuốc tích lũy lại ở thận lúc này thận làm thuốc lâu bán rã hơn. Ví dụ: Tetracylin sau 8h sẽ bị bán rã đối với thận bình thường, khi thận bị suy thoái thời gian bán rã tới 3 ngày (Bùi Thị Tho, 2003). Ngoài ra, bệnh trắng mang, trắng gan còn xảy ra ngay sau cơn mưa mà trước đó cá chưa từng bị bệnh, đồng thời không phân lập được loài vi khuẩn nào trên những mẫu cá này (1 ao). Dù vậy, nhưng rất có khả năng là trong quá trình quản lý ao nuôi người dân cũng có sử dụng kháng sinh trong phòng bệnh cho cá, đã vô tình gây ra những biến đổi tiềm ẩn bên trong cá và khi điều kiện ngoại cảnh thay đổi đột ngột đã biểu hiện bệnh lý rõ. Tóm lại, trong 9 ao cá có biểu hiện bệnh trắng mang, trắng gan đã phân lập được vi khuẩn trên các mẫu cá của 6 ao, còn lại 3 ao không phân lập được vi khuẩn, nhưng nhìn chung những ao có sử dụng kháng sinh trong điều trị và phòng bệnh cho cá thì khả năng bị trắng mang, trắng gan rất cao. 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. Kết luận  Kết quả phân tích ký sinh trùng phát hiện 11 giống loài ký sinh trùng xuất hiện trên cá tra bệnh trắng gan, trắng mang: Dactylogyrus sp, Trichodina sp, Myxobolus sp, sán lá song chủ Trematoda/Digenea, Henneguya sp, Chilodonella sp, Metacercaria, Ichthyonyctus pangasia, Balantidium sp, Gyrodactylus sp và Epistylis sp.  Kết quả phân lập vi khuẩn đã định danh được 3 giống loài vi khuẩn gồm: 16 chủng Edwardsiella ictaluri, 7 chủng Aeromonas sp và 2 chủng Pseudomonas sp.  Những cá bị bệnh trắng mang, trắng gan rất mẫn cảm với các giống loài ký sinh trùng: Dactylogyrus sp, Trichodina sp và Myxobolus sp, đồng thời tiền sử của những ao này đã sử dụng rất nhiều loại kháng sinh với liều lượng cao. 2. Đề xuất  Tiến hành phân tích với số lượng mẫu lớn hơn nhằm tìm ra được kết quả có độ tin cậy cao hơn.  Phân tích huyết học xem xét sự thay đổi số lượng hồng cầu trong máu cá bệnh.  Phân tích các chỉ tiêu thủy lý-hóa trong ao nuôi như: NH3, NO2,… 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Quang Tề, 2006. Ký sinh trùng của một số loài cá nước ngọt ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và giải pháp phòng trị chúng. Nhà xuất bản nông nghiệp. 2. Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học thủy sản. Phần 2_Bệnh truyền nhiễm của động vật thủy sản. Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I. 3. Bùi Thị Tho, 2003. Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi thú y. Nhà xuất bản nông nghiệp. 4. Cao Tuấn Anh, 2005. Thành phần giống loài vi khuẩn và ký sinh trùng trên cá tra giống (Pangasius hypophthalmus) tại huyện Tân Châu-An Giang. LVTN - Khoa Thủy Sản - ĐHCT. 5. Danh Thu Phương, 2000. Xác định mức độ cảm nhiễm ký sinh trùng trên cá tra giống (Pangasius hypophthalmus). LVTN – Khoa Thủy Sản – ĐHCT. 6. Dương Nhựt Long, 2003. Giáo trình kỹ thuật nuôi thủy sản nước ngọt. Bộ môn nước ngọt - Khoa thủy sản - ĐHCT. 7. Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007. Giáo trình nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản. Khoa Thủy Sản – ĐHCT. 8. Đặng Thị Hoàng Oanh và nguyễn Thị Thu Hằng, 2007. Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn bệnh học thủy sản. Khoa Thủy Sản – ĐHCT. 9. Hiệp Kỳ Dương, 2001. Xác định một số hóa chất trị bệnh ngoại ký sinh trùng trên cá tra giống. LVTN – Khoa Thủy Sản – ĐHCT. 10. Huỳnh Cẩm Tú, 2006. Khảo sát thành phần và mức độ cảm nhiễm ký sinh trùng trên cá Tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa thủy sản, trường ĐHCT. 11. Huỳnh Chí Thanh, 2007. Xác định đặc điểm sinh hóa và bước đầu thử nghiệm điều trị bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng thuốc kháng sinh. LVTN – Khoa Thủy Sản – ĐHCT. 12. Lê Thị Bé Năm, 2002. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng ở nội tạng cá Tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa thủy sản, trường ĐHCT. 13. Lương Thị Bảo Thanh, 2002. Xác định tỷ lệ cảm nhiễm ký sinh trùng và tìm hiểu bệnh vi khuẩn trên một số loài cá nuôi mùa lũ ở ĐBSCL. LVTN – Khoa Thủy Sản – ĐHCT. 14. Lương Trần Thục Đoan, 2006. Khảo sát sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) trên các cơ quan khác nhau của cá tra (Pangasius hypophthalmus). LVTN – Khoa Thủy Sản – ĐHCT. 32 15. Lê Thành Cường, 2006. Khảo sát nội ký sinh trùng trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bệnh vàng da trong ao nuôi thâm canh. LVTN – Khoa Thủy Sản – ĐHCT. 16. Meyer. P. F. The pathology of the major disease of catfish. Khoa Thủy sản – ĐHCT. 17. Nguyễn Thanh Phương, 2007. Quan trắc môi trường và xác định tác nhân gây bệnh trên cá da trơn (Tra-Pangasius hypophthalmus và Basa- P. bocourti) và tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ở tỉnh An Giang. Khoa Thủy Sản – ĐHCT, trang 67-91. 18. Những bệnh thường gặp của tôm cá – Biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 19. Ngô Minh Dung, 2007. Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). LVTN - Khoa Thủy Sản - ĐHCT. 20. Phạm Hoàng Sanh, 1998. Điều tra nghiên cứu một số bệnh phổ biến trên cá Basa (Pangasius bocourti) và cá Tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa thủy sản, trường ĐHCT. 21. Quản lý chất lượng nước trong ao nuôi cá nước ngọt. Nhà xuất bản nông nghiệp. Tp Hồ Chí Minh, 2003. 22. Quách Thị Thanh Tùng, 1999. Xác định nguyên nhân xuất hiện bệnh ký sinh trùng trên cá tra con và cách phòng trị. LVTN – Khoa Thủy Sản – ĐHCT. 23. Từ Thanh Dung, 2005. Giáo trình bệnh thủy sản. Bộ môn bệnh học khoa thủy sản, trường ĐHCT. 24. Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí khoa học, ĐHCT trang 137-142. 25. Từ Thanh Dung, 2005. Bệnh học thủy sản đại cương. Bộ môn bệnh học – Khoa Thủy Sản – ĐHCT. 26. Trần Anh Dũng, 2005. Khảo sát tác nhân gây bệnh trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở tỉnh An Giang. Luận văn tốt nghiệp cao học, khoa thủy sản, trường ĐHCT. 27. www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Đa_dạng_VSV/Đa_dạng_vi_khuẩn_ và_các_nghiên_cứu_ở_Việt_Nam. 28. www.diendancacanh.com/forum/archive/index.php/t-2003.html. truy cập ngày 20/07/2007. 29. www.hcmbiotech.com.vn truy cập ngày 12/01/2008. 30. www.mekongfish.net.vn truy cập ngày 28/06/2008. 33 Phụ lục 1: PHIẾU THU THẬP THÔNG TIN Họ và tên hộ nuôi ......................................................................................... Địa chỉ.......................................................................................................... Ngày thu mẫu ............................................................................................... Điện thoại..................................................................................................... Giai đoạn nuôi.............................................................................................. Nguồn giống................................................................................................. Mật độ cá thả (con/m2) ................................................................................. Vệ sinh hay cải tạo ao bè .............................................................................. Hóa chất sử dụng cải tạo ao, liều lượng ........................................................ ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... Thời tiết ....................................................................................................... Loại thức ăn ................................................................................................. Cách cho ăn.................................................................................................. Nguồn nước....................................... Màu nước.......................................... pH .......................................................Nhiệt độ ........................................... Chế độ thay nước .......................Thời gian thay nước .................................. Ngày xuất hiện bệnh..................................................................................... Số cá chết hằng ngày........................ Tăng/Giảm .........................................  Dấu hiệu bệnh lý  Bên ngoài Hoạt động bơi lội....................................... .................................................. Màu sắc cơ thể .......................................... .................................................. Vết thương trên da..................................... .................................................. Tập tính bắt mồi (bình thường, giảm ăn, bỏ ăn) (%) ..................................... Màu sắc và các biểu hiện của mang ........... .................................................. Những triệu chứng khác ............................ .................................................. .................................................................. .................................................. 34  Bên trong Dịch nhầy trong xoang cơ thể (có/không) .. .................................................. .................................................................. Dịch nhầy trong ruột (có/không)................ .................................................. Màu sắc và hình dạng của gan ................... .................................................. Màu sắc và hình dạng của các cơ quan khác (tỳ tạng, thận, …) .................... Những triệu chứng khác ............................ .................................................. .................................................................. .................................................. .................................................................. .................................................. Ngày bắt đầu sử dụng thuốc, hóa chất ....... .................................................. Các loại thuốc hóa chất đã sử dụng, liều lượng............................................. .................................................................. .................................................. .................................................................. .................................................. Hiệu quả phòng trị..................................... .................................................. 36 Phụ lục 2: Thành phần giống loài ký sinh trùng A o Địa điểm Kích cỡ (g/con) Mật độ Dactylogy rus sp Trichodin a sp Myxobolu s sp Sán lá song chủ Hennegu ya sp Chilodon ella sp Episty lis sp Ichthyonyctu s pangasia Balantidiu m sp Metacer caria Gyroda ctylus sp 1 Cần Thơ 400-500 50 10- 62 100 1-4 60 5-7 40 3 20 1 20 2 Sóc Trăng 150-300 65 36- 83 100 7- 50 100 7-9 100 1 25 + 100 +++ 75 3 Sóc Trăng 10-20 120 9- 25 100 1- 32 40 4- 24 60 1-2 40 2 20 4 Vĩnh Long 5-15 60 1- 8 40 4-6 100 1 20 +++ 20 5 Hậu Giang 15-30 60 3- 5 60 4 20 1-2 40 1-2 20 +++ 20 6 Cần Thơ 160-240 50 9- 29 80 3 20 1 20 7 Hậu Giang 1-5 120 1 20 2- 10 80 1 20 8 Sóc Trăng 15-20 75 1- 10 100 80 +++ 20 9 Vĩnh Long 30-50 50 7- 47 100 1-6 60 3- 34 80 1- 11 3-5 20 +++ 80 1 20 10 Sóc Trăng 300-400 55 3- 11 100 3-5 33, 33 1- 20 100 66, 67 11 Sóc Trăng 200-250 65 2- 15 100 1 66, 67 1-3 1 33, 33 12 Vĩnh Long 5-15 35 15- 35 100 1-8 80 37 Phụ lục 3: Thành phần ký sinh trùng trên cá tra bị bệnh trắng gan, trắng mang (CĐ: cường độ; TL: tỷ lệ) KST A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 CĐ TL CĐ TL CĐ TL CĐ TL CĐ TL CĐ TL CĐ TL CĐ TL CĐ TL Dactylogyrus 10- 62 100 36- 83 100 9- 25 100 1-8 40 3-5 60 9- 29 80 1 20 7- 47 100 Myxobolus 5-7 40 7-9 100 4- 24 60 4 20 1- 10 100 3- 34 80 Trichodina 1-4 60 7- 50 100 1- 32 40 4-6 100 2- 10 80 1-6 60 Sán lá song chủ 1-2 40 1 20 1-2 40 1- 11 80 Henneguya 3 20 Chilodonella sp 1 20 1 25 Epistylis + 100 Ichthionyctus +++ 75 2 20 1-2 20 3 20 1 20 3-5 20 Balantidium +++ 20 +++ 20 +++ 20 +++ 80 Metacercaria 1 20 Gyrodactylus 1 20 38 Phụ lục 4: Dấu hiệu bệnh lý, phân lập vi sinh trên cá bệnh STT ao Số mẫu Địa điểm Dấu hiệu bệnh lý Kích cỡ Tên vi khuẩn 1 5 Vĩnh Thạnh-CT Mang trắng, gan vàng nâu,gốc vi xuất huyết 400-500 Aeromonas sp, A. hydrophila, Pseudomonas sp 2 4 Kế Sách-ST Mang trắng, gan trắng, xuất huyết gốc vây 150-300 A. hydrophila, Pseudomonas sp 3 5 Kế Sách-ST Mang-gan tr ắng, gan c ó đ ốm m ủ li ti, th ận s ưng nh ũng c ó m ủ 10-20 Edwardsiella ictaluri 4 5 Trà Ôn-VL Mang-gan trắng, tỳ tạng trắngnhạt, thận sưng nhũng có đốm mủ 5-15 E. ictaluri 5 5 Phụng Hiệp-HG Toàn than trắng, cóchấm đỏ quanh nắp mang, mang trắng, gan trắng,thận nhũng có mủ 15-30 E. ictaluri 6 5 Thốt Nốt-CT Da vàngmang trắng,thận có mủ, một vài con mang đỏ quanh nắpmang có chấm đỏ li ti 160-240 E.ictaluri 7 5 Phụng Hiệp-HG Mang-gan trắng, gốc vi xuất huyết 1-5 8 5 Kế Sách-ST Thân trắng, mang-gan trắng, tỳtạng và thận trắng 15-20 9 5 Long Hồ-VL Thân trắng, mang-gan trắng, tỳ tạng và thận trắng 30-50 39 Phụ lục 5: Kiểm tra định danh vi khuẩn Aeromonas và Pseudomonas STT Chỉ tiêu A2 TN T103 TN G203 TN G303b TN L503 a TN L503b ST G103 ST L303 ST T103 TN G303a 1 G - - - - - - - - - - 2 Hìnhdạng Qn qn qn qn qn qn qn qn qn qn 3 Diđộng + + + + + + + + - + 4 Oxidase + + + + + + + + - - 5 Catalase + + + + + + + + + + 6 O/129 - - - - - - - - 7 TSI đ/v v/v v/v v/v đ/v đ/v v/v đ/v v/v đ/v 8 O/F O/F O/F O/F O/F O/F O/F O/F O/F - - 9 Arginine + + + + + + + + + + 10 Lysine - - - - + - - - - - 11 Citrate + + - - - + + + + + 12 H2S - - - - - - - - - - 13 Urê - - - - - - - - - - 14 Indole - - - + + + - + 15 VP + + + + - + + + 16 Aesculin + + + - - - + - 17 Arabiose + + + + + + + + 18 Glucose + + + + + + + + 19 Inositol + - - - + - - - 20 Salicin + + + + - + + + 21 Sorbitol + + + + + + + + 22 Sucrose + + + + + + + + 23 Nitrate + - 40 Phụ lục 6: Kiểm tra định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri STT Chỉ ti êu E223 TL Sp103 TL Sp503 TL K103 PH L103 PH K103 PH L503 PH K503 PH L303 KS K303 KS Sp503 KS L203 KS L103 KS Sp403 TO K403 TO L203a TO L203b 1 Gram - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 Hinhdạng q q Q q q q q q q q q q q q q q q 3 Diđộng + + + + + + + + + + + + + + + + + 4 Oxidase - - - - - - - - - - - - - - - - - 5 Catalase + + + + + + + + + + + + + + + + + 6 O/F + + + + + + + + + + + + + + + + + 7 TSI đ/v v/v v/v v/v đ/v đ/v đ/v v/v v/v đ/v đ/v đ/v v/v v/v v/v đ/v v/v 8 Arginine - - - - + - - - - - - - - - - - - 9 Lysine + + + + + + + + + + + + + + + + + 10 Citrate - - - - - - - - - - - - - - - - - 11 H2S - - - - - - - - - - - - - - - - - 12 Ur ê - - - - - - - - - - - - - - - - - 13 Indole - - - - - - - - - - - - - - - - - 14 VP - - - - - - - - - - - - - - - - - 15 Gas glucose + - - - - - - - - - - - - - - - - 16 Arabiose - - - - - - - - - - - - - - - - - 17 Glucose + + + + + + + + + + + + + + + + + 18 Inositol - - - - - - - - - - - - - - - - - 19 Mannitol - - - - - - - - - - - - - - - - - 20 Rhamnose - - - - - - - - - - - - - - - - - 21 Sorbitol - - - - - - - - - - - - - - - - - 22 Sucrose - - - - - - - - - - - - - - - - - 23 Trehalose - - - - - - - - - - - - - - - - - 41 Phụ lục 7: Ký hiệu các chủng vi khuẩn STT ao Địa điểm Tên vi khuẩn Ký hiệu vi khuẩn 1 Vĩnh Thạnh – CầnThơ Aeromonas sp A. hydrophila Pseudomonas sp TNL503a TNT103, TNG203, TNG303b, TNL503b TNG303a 2 Kế Sách – Sóc Trăng A. hydrophila Pseudomonas sp STL303, STG103 STT103 3 Kế Sách – Sóc Trăng E. ictaluri KSK303, KSSp503, KSL103, KSSp403, KSL203 4 Trà Ôn – Vĩnh Long E. ictaluri TOK403, TOL203a, TOL203b 5 Phụng Hiệp – Hậu Giang E. ictaluri PHL103, PHL503, PHK103, PHK503, PHL303 6 Thốt Nốt – Cần Thơ E. ictaluri TLSp103, TLSp503, TLK103