Khảo sát mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước và vi khuẩn coliforms trong cơ cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nuôi ao

a học, các mối nguy này tác động và ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng và an toàn vệ sinh sản phẩm (nguyên liệu) thủy sản (Bộ Thủy Sản, 2003). Mối nguy sinh học: là các vi khuẩn, virus gây ra các bệnh nguy hiểm cho người tiêu dùng. Vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) gây bệnh tả chết người có khả năng phát tán rộng. Vi khuẩn thương hàn (Salmonella) gây sốt thương hàn, ngộ độc, tiêu chảy...Vi khuẩn kiết lỵ (Shigella) gây bệnh kiết lỵ, là thủ phạm của nhiều trận dịch bệnh, làm chết hàng chục ngàn người. Trực trùng đường ruột (Escherichia coli) gây tiêu chảy, rối loạn tiêu hoá. Tụ cầu vàng (Staphyloccus aureus) gây tiêu chảy, đau bụng, sốt, nôn mửa và độc tố do chúng sinh ra có khả năng chịu nhiệt rất cao và hầu như không bị phân hủy trong quá trình chế biến. Vi khuẩn gây ngộ độc thịt (Clostridium botulinum) gây ngộ độc, nôn mửa, suy giảm chức năng thần kinh, có khả năng hình thành bào tử với sức chống chịu rất cao trước tác động của môi trường (Bộ thủy sản, Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 15 2003). Trong nuôi trồng thủy sản, việc nuôi cá ở mật độ cao trong điều kiện vùng nuôi chưa được qui hoạch hoàn chỉnh gây ra ô nhiễm nguồn nước. Mặt khác, các vi khuẩn gây bệnh trong sản phẩm thủy sản tồn tại khá phổ biến trong môi trường, trong không khí, đất, nước, đặc biệt là các nguồn nước bị ô nhiễm. Do đó, nguyên liệu thủy sản rất dễ bị nhiễm một trong các vi khuẩn nói trên và nếu không có biện pháp loại bỏ thì chúng sẽ lây lan rất nhanh, có cơ hội để gây bệnh cho người tiêu dùng khi ăn phải các sản phẩm được chế biến từ những nguyên liệu đó (Lê Đình Hùng và Lê Văn Chiêu, 2001). Mối nguy hóa học: đây là mối nguy có thể xuất hiện trong sản phẩm nuôi trồng thủy sản thông qua sự có mặt của các thành phần nào đó được sử dụng trong bản thân hệ thống nuôi trồng thủy sản hoặc từ nguồn nước sử dụng. Bao gồm: kháng sinh, hóa chất, kim loại nặng, độc tố nấm, thuốc trừ sâu, chất kích thích sinh sản và sinh trưởng. Các tác nhân này có thể gây bệnh thần kinh, ung thư hoặc rối loạn tiêu hóa, đặc biệt quan trọng là các tác nhân này một khi đã nhiễm vào trong thực phẩm thì rất khó loại bỏ bằng một số biện pháp thông thường như rửa hay gia nhiệt. Mối nguy này hiện đang là một vấn đề lớn cho ngành thủy sản Việt Nam do tâm lý người dân thường hay dùng để xử lý, phòng trị bệnh cũng như kích thích sinh sản, sinh trưởng. Hình 2.1: Sơ đồ các mối nguy tác động và ảnh hưởng đến chất lượng và an toàn vệ sinh sản phẩm (nguyên liệu) trong nuôi trồng thủy sản. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 16 Bảng 2.5: Phân tích các mối nguy trong công đoạn nuôi trồng thủy sản TT Nguồn lây nhiễm (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) Tổng số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Con giống Chất đáy Nguồn nước Thuốc thú y Phân bón hữu cơ Phân bón vô cơ Hóa chất xử lý Chế phẩm sinh học Thức ăn công nghiệp Thức ăn tự chế Cấu trúc ao đầm Vật chủ trung gian (cả con người) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 5 6 6 3 7 1 2 1 3 6 3 3 Tổng số 8 7 7 4 3 5 2 2 3 5 46 Nguồn: NAFIQUAVED (2004) Ghi chú: (1): Vi khuẩn (6): kháng sinh có hại (2): Virút (7): độc tố nấm (3): Ký sinh trùng (8): kích thích sinh sản (4): kim loại nặng (9): kích thích sinh trưởng (5): thuốc trừ sâu (10): hóa chất có hại Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 17 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1.Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2008 đến tháng 30/5/2008 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu Thu mẫu: mẫu nước và mẫu cá tra được thu tại một số doanh nghiệp và hộ gia đình trên địa bàn các tỉnh An Giang, Cần Thơ và Hậu Giang. Ngoài ra, cá tra còn được thu mua tại một số chợ của Tp Cần Thơ. Phân tích mẫu: phòng thí nghiệm Bệnh học Thủy sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. Hình 3.1: Sơ đồ các địa điểm thu mẫu nước và mẫu cá tra theo dự án SFP Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 18 3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Dụng cụ thu, trữ và phân tích mẫu - Thùng giữ lạnh có nắp đậy - Cân điện tử - Chai chịu nhiệt 250ml, 500ml - Tủ sấy, tủ ấm, tủ mát - Chai nút mài 100ml - Tủ cấy vô trùng - Khay và thớt nhựa - Máy trộn mẫu (vortex) - Cối, chày nghiền mẫu - Máy khuấy từ - Túi PE tiệt trùng - Nồi tiệt trùng áp suất - Bộ đồ tiểu phẫu - Micropipet 1ml, 5ml - Đĩa petri - Đầu ống pipet 1ml, 5ml - Ống nghiệm, ống Durham - Que cấy vi khuẩn - Cốc đốt, đèn cồn - Que trải thủy tinh - Bình xịt cồn, hộp quẹt - Giá đựng ống nghiệm - Giấy bạc, túi nylon, dây thun - Bút lông dầu, bút chì - Giấy bóng mờ, giấy vệ sinh - Găng tay, khẩu trang 3.2.2. Hóa chất - Cồn tuyệt đối, cồn 70o. - Môi trường Tryptic Soya Agar (TSA), Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB) - Môi trường Violet Red Bile (VRB) - Môi trường canh Brilliant Green Bile Lactose (BGBL) - Môi trường Eosin Methylene Blue Lactose (EMB) - Môi trường Simmon Citrate Agar - Môi trường canh MR-VP - Dung dịch Saline Peptone Water (SPW) - Dung dịch nước muối sinh lý 0,85%. - Đường Lactose - Thuốc thử Kovac’s, thuốc thử Methyl Red 0,2% - Thuốc thử α-napthol 5% và dung dịch KOH 40%. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 19 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Phương pháp phân tích mẫu nước Dựa theo phương pháp định lượng vi khuẩn tổng số và Aeromonas trong nước (Geert Huys, 2002. Trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005) 3.3.1.1. Cách thu và bảo quản mẫu nước. Cần phải kiểm tra các dụng cụ cần thiết như chai nút mài (đã được tiệt trùng), thùng giữ lạnh, găng tay…. trước khi đi đến địa điểm thu mẫu. Khi đến điểm thu mẫu phải ghi nhận các thông số cần thiết như: thời gian, địa điểm, …lên nhãn chai. Cách thu mẫu: Do chủng loại và mật độ vi sinh vật trong nước thay đổi rất nhiều theo bề mặt, độ sâu và chất lượng nước nên cần phải thu mẫu sao cho mẫu thu được có tính đại diện cho khối nước cần kiểm nghiệm. Tùy theo kích thước của ao, khi thu mẫu ta chọn nhiều điểm thu mẫu khác nhau trong ao như nơi nước chảy, độ sâu 20-30cm, đáy ao…và cách nhau những khoảng thích hợp. Sau đó trộn đều lượng nước thu được tại các điểm lại với nhau và chứa mẫu trong chai nút mài trắng 100 ml đã tiệt trùng. Cách bảo quản, vận chuyển: Chai chứa mẫu nước được bao xung quanh một lớp giấy bóng mờ, đựng trong túi nilon và được bảo quản ở nhiệt độ 4-5oC bằng nước đá trong thời gian vận chuyển về phòng thí nghiệm và được phân tích ngay trong vòng khoảng 3-5 giờ sau khi thu. 3.3.1.2. Phương pháp phân tích mẫu - Lắc trộn đều mẫu nước bằng máy trộn mẫu (Vortex) khoảng 7 giây. - Dùng pipet hút 1ml mẫu nước cho vào ống nghiệm chứa 9ml NaCl 0,85% thứ nhất (nồng độ 10-1). Lắc đều ống nghiệm. - Thay đầu col trên pipet, chuyển 1ml dung dịch từ ống nghiệm thứ nhất sang ống nghiệm thứ hai (nồng độ 10-2). Lắc đều ống nghiệm - Thay đầu col trên pipet, chuyển 1ml dung dịch từ ống nghiệm thứ hai sang ống nghiệm thứ ba (nồng độ 10-3). Lắc đều ống nghiệm. - Dùng pipet vô trùng lấy 0,1ml mẫu nước ở mỗi nồng độ pha loãng cho vào đĩa chứa môi trường TSA và lập lại 2 lần. - Dùng que trải thủy tinh vô trùng trải đều dung dịch trên bề mặt môi trường và đánh dấu độ pha loãng trên đĩa - Để mẫu phân tích trong tủ ấm khoảng 18-24 giờ ở 30oC và đọc kết quả. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 20 3.3.1.3. Cách tính và ghi nhận kết quả. Sau 18-24 giờ đếm số khuẩn lạc trên đĩa. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 20-200 khuẩn lạc/đĩa để đếm. Nếu số khuẩn lạc quá nhiều thì chia đĩa ra làm 4 phần bằng nhau, đếm số lượng khuẩn lạc trên 1 phần sau đó nhân với 4 thì được tổng số khuẩn lạc trên 1 đĩa. Kết quả được tính theo công thức: Số khuẩn lạc (CFU/ml) = Số khuẩn lạc x độ pha loãng x 10 3.3.2. Phương pháp xác định Coliforms Tiến hành định lượng Coliforms theo phương pháp đếm khuẩn lạc (dựa theo phương pháp xác định Coliforms (TCVN 4883:1993). 3.3.2.1. Phạm vi áp dụng Coliforms được định lượng bằng phương pháp NMKL 96/1994. Phương pháp này dùng để định lượng tổng số Coliforms trong sản phẩm thủy sản tươi và đông lạnh. Trong phương pháp này, Coliforms được hiểu là những vi sinh vật sinh hơi trong môi trường Brilliant Green Bile Salt Lactose nuôi ủ ở 37  1oC trong 48 giờ. 3.3.2.2. Nguyên tắc xác định - Số lượng Coliform được xác định bằng cách lấy một lượng mẫu xác định vào một môi trường rắn chọn lọc thích hợp (môi trường thạch Violet Red Bile) có chứa 1% lactose và một chất chỉ thị pH như Neutral red hay Crystal violet. - Thực hiện ủ sơ bộ trên môi trường dinh dưỡng không chọn lọc nếu vi khuẩn bị tổn thương trong quá trình chế biến (vì có khả năng chúng không tăng trưởng được trong môi trường chọn lọc). Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau khi ủ môi trường ở 37oC trong 24 giờ. - Lấy các khuẩn lạc điển hình và khẳng định lại trong môi trường Brilliant Green Bile Salt Lactose. Coliforms sẽ sinh khí trong môi trường này ở 37oC trong 24 giờ. Kết quả được biểu thị bằng số Coliforms trên 1g hoặc 1ml mẫu chưa pha loãng. 3.3.2.3. Quy trình Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu - Mẫu phải còn sống, mỗi ao thu khoảng 3-10 con tùy theo kích cỡ cá. Sử dụng các dụng cụ vô trùng để cắt chọn mẫu, cắt từ 4-5 điểm khác nhau/mẫu cá hoặc phile nguyên con (đối với mẫu còn nhỏ), sau đó trộn Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 21 chung lại với nhau. Lượng mẫu ban đầu cần lấy khoảng 30-100g, cho vào cối sứ vô trùng hoặc bọc PE vô trùng để nghiền nát mẫu. - Cân 10g mẫu đã được nghiền nát cho vào chai 100ml có chứa 90ml dung dịch Saline Peptone Water (SPW) đã tiệt trùng, lắc đều. Dung dịch này được coi là có độ pha loãng 10-1. - Tùy theo mức độ nghi vấn cá bị nhiễm bẩn hay không mà có thể tiếp tục pha loãng đến 10-2, 10-3,…Mục đích pha loãng nhằm làm thế nào khi nuôi cấy ở mỗi đĩa petri chỉ mọc khoảng 30-300 khuẩn lạc. - Lắc đều các mẫu pha loãng để chuẩn bị nuôi cấy vi sinh vật. Nuôi cấy - Dùng pipet vô trùng lấy 1ml mẫu đã pha loãng cho vào giữa đĩa petri đã tiệt trùng. Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri. Đổ vào mỗi đĩa khoảng 15ml môi trường VRB ở 45oC. Thời gian từ khi cho dung dịch mẫu vào đĩa cho đến khi đổ môi trường không được quá 15 phút. - Lắc tròn đĩa xuôi, ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5 lần và để đĩa trên mặt phẳng mát để môi trường đông lại. - Sau khi môi trường đông oàn toàn đổ thêm khoảng 4ml môi trường VRB tráng kín bề mặt đĩa và để đông đặc như trên. - Đổ thêm một đĩa để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường cũng bằng 15ml môi trường VRB và thao tác tương tự nhưng không có dịch cấy. - Lật úp đĩa và ủ trong tủ ấm ở 37,0  1,0oC trong 24  3 giờ. Đọc kết quả - Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 100 sau 24 giờ nuôi cấy. - Khuẩn lạc Coliforms đặc trưng trên môi trường chọn lọc VRBL có màu đỏ tía, đường kính khoảng 0,5 mm, đôi khi được bao quanh bởi một vùng hơi đỏ xung quanh khuẩn lạc. - Đếm các khuẩn lạc Coliforms đặc trưng trên những đĩa có số đếm phù hợp. - Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng để qui về số Coliforms trong 1g mẫu. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 22 Khẳng định - Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa môi trường canh Brilliant Green Bile Lactose. Sau đó, ủ các ống BGBL ở 37  1oC trong 24  3 giờ. - Phản ứng được xem là dương tính khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham. Tính tỉ lệ khẳng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng định. Báo cáo kết quả - Chọn các đĩa có số khuẩn lạc ít hơn 100 để đếm. Kết quả định lượng Coliforms trong 1g mẫu được tính theo công thức sau: A (CFU/g) = xR vfnvfn N ii ...11 N: tổng số khuẩn lạc đếm được. n1: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng. v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa. f1: độ pha loãng có số khuẩn lạc được họn tại các đĩa đếm. R: tỉ lệ khẳng định - Trong trường hợp không có khuẩn lạc điển hình hay số ống khẳng định bằng 0 thì kết quả được báo cáo là <10 CFU/g. 3.3.3. Tách dòng và phân loại các giống thuộc nhóm Coliforms - Chọn các loại khuẩn lạc nghi ngờ trên các đĩa nuôi cấy ban đầu, tiến hành phân lập trên môi trường chọn lọc VRBL, ủ ở nhiệt độ 37oC. Sau 18-24 giờ, quan sát và ghi nhận đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc. - Cho 1 khuẩn lạc ở đĩa cấy ròng nuôi tăng sinh trong môi trường NB ở 37oC từ 18 - 24 giờ. - Cho 1,5ml dung dịch vi khuẩn và 200µl dung dịch glycerol 50% vào ống eppendorf dung tích 2ml. Lắc đều và giữ ở - 800C. - Tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa theo thử nghiệm IMViC để phân loại các giống vi khuẩn trong nhóm Coliforms (Kết quả phân loại dựa theo bảng 2.1) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 23 Hình 3.2: Quy trình định lượng Coliforms theo phương pháp đếm khuẩn lạc 3.4. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Excel để tính toán và xử lý các số liệu thu được. Đếm các khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa muối mật, đường kính ≥ 0,5mm. Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ. Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3... Hút 1ml dung dịch mẫu vào đĩa petri tiệt trùng, đổ 10-15ml môi trường VRBL ở 45oC và lắc đều, để đông khoảng 20-30 phút Đổ thêm 5-7ml môi trường VRBL tráng kín bề mặt, để đông. Đem ủ ở 37oC trong 24-48 giờ. Cấy vào ống môi trường BGBL, ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ Đếm số ống BGBL sinh hơi (+). Tính tỉ lệ khẳng định Coliforms Xác định mật độ Coliforms Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 24 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả khảo sát mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước Khảo sát mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước là một phần trong việc đánh giá chất lượng nước, nó cho biết mức độ nhiễm khuẩn trong nước từ đó có thể đánh giá khả năng phát sinh và lây lan dịch bệnh cho cá nuôi. Vi khuẩn tổng cộng bao gồm nhiều giống loài khác nhau, chúng vừa có lợi cũng vừa có hại. Nhóm vi khuẩn có lợi tham gia vào quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ, vô cơ làm sạch môi trường nước. Nhóm vi khuẩn gây hại có khả năng gây bệnh cho các loài cá nuôi như một số loài thuộc 2 giống Aeromonas sp và Pseudomonas sp luôn là tác nhân gây ra những bệnh nguy hiểm cho các loài thủy sản nuôi. Qua khảo sát 9 điểm nuôi cá tra thâm canh của một số doanh nghiệp và các hộ dân tại Phụng Hiệp (Hậu Giang), Thốt Nốt (Cần Thơ) và Châu Phú (An Giang) nhận thấy tất cả các điểm nuôi đều sử dụng ao lắng - kênh dẫn trong hệ thống nuôi của mình và chỉ có 3 điểm có bố trí ao thải đó là: 1.2 ở Hậu Giang, 1.3 ở Cần Thơ và 1.1 ở An Giang. Tuy nhiên, ao thải ở 3 điểm trên chỉ là một kênh dẫn với diện tích vào k oảng 5-7% diện tíc ao nuôi mà lượng nước trong ao nuôi cần phải thường xuyên thay đổi 20-30%/ngày và phải mất 1 ngày để xử lý trước khi thải ra ngoài. Do đó có thể nói các ao thải này chưa đạt được yêu cầu và nhiệm vụ cần thiết của một ao xử lý nước thải, điều này phản ánh được ý thức của người nuôi là chưa thực sự coi trọng khâu xử lý nguồn nước nuôi trước khi thải ra ngoài gây ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường nuôi chung. 4.1.1. Phụng Hiệp - Hậu Giang Trong 2 đợt khảo sát thu mẫu nước, có 3/9 điểm thu ở Phụng Hiệp-Hậu Giang. Bảng 4.1: Mật độ vi khuẩn tổng cộng (CFU/ml) trong hệ thống nuôi tại Phụng Hiệp-Hậu Giang. Đợt 1 Đợt 2 Điểm thu Ao lắng Ao nuôi Ao thải Ao lắng Ao nuôi Ao thải 1.2 18,4 x103 16,3 x103 7,8 x103 4,35 x103 5,45 x103 1,05 x103 2.3 43,5 x103 56,0 x103 - 2,2 x103 35,5 x103 - 3.4 17,0 x103 24,1 x103 - 39 x103 11,7 x103 - Trung bình 26,3 x103 32,1 x103 7,8 x103 15,2 x103 17,6 x103 1,05 x103 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 25 Theo bảng 4.1 ta thấy có sự biến động khá lớn giữa hai đợt thu mẫu, trong đó mẫu nước thu tại ao lắng của điểm 2.3 có sự biến động lớn nhất trong khoảng 2,2 - 43,5x103 (CFU/ml), còn lại chủ yếu có sự chênh lệch nhau từ 2-4 lần. Nhìn chung, mật độ vi khuẩn tổng cộng trong các mẫu phân tích của đợt 1 thường lớn hơn đợt 2, chỉ có mẫu nước trong ao lắng của điểm thu 3.4 có mật độ vi khuẩn thu đợt 2 lớn hơn đợt 1. Theo ghi nhận tại hiện trường, ở đợt 2 các hộ nuôi phần lớn đều có rải vôi xung quanh ao để xử lý nguồn nước và hạn chế sự nhiễm khuẩn trong ao, hơn nữa thời gian thu mẫu của đợt 2 là vào cuối mùa khô nên hàm lượng chất hữu cơ trong nước tương đối thấp do đó mới có sự chênh lệch khá lớn giữa 2 đợt thu. 0 10 20 30 40 50 60 M ật đ ộ vi k hu ẩn ( 10 3 cf u/ m l) L-1.2 L-2.3 L-3.4 N-1.2 N-2.3 N-3.4 T-1.2 Ao Ghi chú: L: Ao lắng N: Ao nuôi T: Ao thải Hình 4.1: Sự biến động mật độ vi khuẩn tổng cộng trong hệ thống nuôi tại Phụng Hiệp - Hậu Giang Đợt 1 Đợt 2 Nếu so sánh mật độ vi khuẩn tại các điểm thu ta thấy, các ao trong hệ thống nuôi của điểm 1.2 có mật độ vi khuẩn tương đối thấp (<20x103 CFU/ml) và khá ổn định giữa hai đợt thu. Các ao của điểm thu 2.3 có mật độ vi khuẩn cao nhất (>35x103 CFU/ml) và không ổn định. Qua đó cho thấy nguồn nước nuôi tại điểm 1.2 được quản lý tốt hơn. Nếu xét trung bình trên từng loại ao thì sự chênh lệch giữa đợt 1 với đợt 2 khoảng 2 lần (đối với ao lắng và ao nuôi), ở ao lắng đợt 1 là 26,3 x 103 CFU/ml so với 15,2 x 103 CFU/ml (đợt 2) và ao nuôi là 32,1 x 103 CFU/ml (đợt 1) so với 17,6 x 103 CFU/ml (đợt 2). Riêng ao thải do chỉ có một điểm có bố trí ao thải trong hệ thống nuôi nên không tính trung bình, mật độ vi khuẩn tổng cộng tương đối thấp nhưng lại có sự chênh lệch khá lớn giữa 2 đợt (khoảng 7 lần). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 26 Từ kết quả phân tích cho thấy, giá trị cao nhất của mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước của hệ thống nuôi cá tra ở Phụng Hiệp - Hậu Giang chỉ đạt 5,6x104 CFU/ml thấp hơn nhiều so với mức độ cho phép theo tiêu chuẩn ngành của Bộ Thủy Sản (số 28 TCN 101:1997) về mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước nuôi thủy sản (≤106 CFU/ml). Điều này chứng tỏ nguồn nước nuôi cá tra tại Phụng Hiệp - Hậu Giang tương đối sạch và khả năng lây lan dịch bệnh là rất ít. 4.1.2. Thốt Nốt - Cần Thơ Trong số 3 vùng nuôi cá tra được chọn để thu mẫu, Thốt Nốt - Cần Thơ là vùng có số điểm thu nhiều nhất với 4 điểm. Trong số 4 điểm thu có một điểm có bố trí ao thải trong hệ thống nuôi của mình. Bảng 4.2: Mật độ vi khuẩn tổng cộng (CFU/ml) trong hệ thống ao nuôi tại Thốt Nốt - Cần Thơ. Đợt 1 Đợt 2 Điểm thu Ao lắng Ao nuôi Ao thải Ao lắng Ao nuôi Ao thải 2.2 12,1 x 103 15,4 x 103 - 12,2 x 103 3,2 x 103 - 3.3 8,3 x 103 14 x 103 - 4,15 x 103 4,35 x 103 - 1.3 7,85 x 103 2,25 x 103 1,6 x 103 1,85 x 103 1,5 x 103 1,3 x 103 2.1 1,5 x 103 10,5 x 103 - 1,9 x 103 5,5 x 103 - Trung bình 7,42 x 103 10,54 x 103 1,6 x 103 5 x 103 4,85 x 103 1,3 x 103 Tương tự như kết quả phân tích các mẫu nước thu tại Phụng Hiệp – Hậu Giang, kết quả phân tích mẫu nước tại Thốt Nốt – Cần Thơ cũng cho thấy ở đợt 1 thường lớn hơn đợt 2 nhưng sự biến động về mật độ vi khuẩn là không đáng kể. Lớn nhất cũng chỉ dao động trong khoảng 3,2 – 15,4x103 CFU/ml (tại ao nuôi của điểm 2.2), còn lại phần lớn là tương đương nhau hoặc chênh lệch nhau khoảng 2 lần. Nếu so sánh mật độ vi khuẩn giữa các điểm thu ta thấy, các ao trong hệ thống nuôi của điểm 2.1 có mật độ vi khuẩn tương đối thấp (<10x103 CFU/ml) và ổn định qua hai đợt thu. Ao nuôi của các điểm thu 2.2 và 3.3 có mật độ vi khuẩn cao hơn (>15x103 CFU/ml) và không ổn định. Tuy nhiên, nếu xét trung bình trên từng loại ao thì sự chênh lệch giữa đợt 1 với đợt 2 là tương đối ổn định chỉ chênh lệch từ 1,5 - 2 lần. Khi so sánh với mật độ vi khuẩn tổng cộng cho phép trong nước nuôi thủy sản theo tiêu chuẩn ngành của Bộ Thủy Sản (số 28 TCN 101: 1997) ≤106 CFU/ml và kết quả khảo sát mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước ao nuôi cá tra tại những tháng mùa lũ ở Cần Thơ của Tô Công Tâm, 2002 (mật độ vi khuẩn Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 27 tổng cộng phân tích được tại các tháng 8, 10, 11 và 12 tương ứng là: 42,75x103, 44,9x103, 896,3x103, 136x103 (CFU/ml) thì mật độ vi khuẩn trong nguồn nước nuôi của các điểm thu tại thời điểm khảo sát là nhỏ hơn rất nhiều. Từ đó có thể kết luận nguồn nước nuôi cá tra của một số doanh nghiệp và hộ nuôi tại Thốt Nốt – Cần Thơ là tương đối sạch và khả năng lây lan dịch bệnh rất ít. Thực tế cho thấy tại thời điểm thu mẫu nước, cá nuôi đều trong tình trạng khỏe mạnh và không có dấu hiệu mắc các bệnh do vi khuẩn gây ra, tỷ lệ hao hụt không cao do các doanh nghiệp và các hộ nuôi thường xuyên theo dõi xử lý nguồn nước kịp thời, đặc biệt có sự điều chỉnh hợp lý lượng thức ăn hằng ngày nên đã hạn chế rất nhiều sự nhiễm khuẩn trong ao nuôi. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 M ật đ ộ vi k h uẩ n (1 03 c fu /m l) L-2.2 L-3.3 L-1.3 L-2.1 N-2.2 N-3.3 N-1.3 N-2.1 T-1.3 Ao Ghi chú: L: Ao lắng N: Ao nuôi T: Ao thải Hình 4.2: Sự biến động mật độ vi khuẩn tổng cộng trong hệ thống nuôi tại Thốt Nốt - Cần Thơ Đợt 1 Đợt 2 4.1.3. Châu Phú - An Giang An Giang là tỉnh có số lượng điểm thu mẫu ít nhất so với Hậu Giang, Cần Thơ (chỉ có 2 trong số 9 điểm thu). Châu Phú là huyện được chọn để thu mẫu tại An Giang. Trong số 2 điểm thu cũng chỉ có một điểm có bố trí ao thải trong hệ thống nuôi của mình. Kết quả phân tích cho thấy có sự khác biệt tương đối lớn giữa 2 điểm thu. Tại điểm 3.2, mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước khá thấp và ổn định qua 2 đợt thu. Tại điểm thu 1.1, mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước cao hơn đặc biệt là mẫu nước phân tích được trong ao lắng 19,1x103 CFU/ml (đợt 1) và 32,5x103 CFU/ml (đợt 2) trong khi mật độ vi khuẩn tổng cộng trong ao nuôi lại nhỏ khá nhiều ở mức 17,1x103 CFU/ml (đợt 1) và 4,1x103 CFU/ml (đợt 2). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 28 Mặt khác, mật độ vi khuẩn trong cả ao nuôi và ao thải đều nhỏ hơn nhiều so với nguồn nước trước khi lấy vào ao nuôi (đợt 2). Điều này cho thấy nước trong ao nuôi được quản lý tốt hơn do hộ nuôi thường xuyên bón vôi và có sự điều chỉnh hợp lý lượng thức ăn hằng ngày nên đã hạn chế được sự nhiễm khuẩn trong ao nuôi. Bảng 4.3: Mật độ vi khuẩn tổng cộng (CFU/ml) trong hệ thống ao nuôi tại Châu Phú - An Giang Đợt 1 Đợt 2 Điểm thu Ao lắng Ao nuôi Ao thải Ao lắng Ao nuôi Ao thải 1.1 19,1 x 103 17,1 x 103 23,5 x 103 32,5 x 103 4,1 x 103 6,25 x 103 3.2 4,25 x 103 14,7 x 103 - 1,9 x 103 8,5 x 103 - Trung bình 11,7 x 103 15,8 x 103 23,5 x 103 17,2 x 103 6,3 x 103 6,25 x 103 0 5 10 15 20 25 30 35 M ật đ ộ vi k hu ẩn ( 10 3 c fu /m l) L-1.1 L-3.2 N-1.1 N-3.2 T-1.1 Ao Ghi chú: L: Ao lắng N: Ao nuôi T: Ao thải Hình 4.3: Sự biến động mật độ vi khuẩn tổng cộng trong hệ thống nuôi tại Châu Phú - An Giang Đợt 1 Đợt 2 Khi so sánh với kết quả khảo sát của Trần Anh Dũng (2005) về mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước ao nuôi cá tra thâm canh tại tỉnh An Giang (dao động từ 7,7 – 98,5x103 CFU/ml) và của Tô Công Tâm (2002) về mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước ao nuôi cá tra ở những tháng mùa lũ tại An Giang (trung bình khoảng 360x103 CFU/ml) thì mật độ vi khuẩn trong nguồn nước Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 29 nuôi của 2 điểm thu ở Châu Phú - An Giang tại thời điểm khảo sát là nhỏ hơn rất nhiều và nằm trong giới hạn cho phép của Bộ Thủy Sản về mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nguồn nước nuôi thủy sản (≤106 CFU/ml). Bảng 4.4: Mật độ vi khuẩn tổng cộng (CFU/ml) trong hệ thống nuôi ở Phụng Hiệp, Thốt Nốt và Châu Phú Đợt 1 Đợt 2 Vùng nuôi Ao lắng Ao nuôi Ao thải Ao lắng Ao nuôi Ao thải Phụng Hiệp 26,3x103 32,1x103 7,8x103 15,2x103 17,6x103 1,05x103 Thốt Nốt 7,42x103 10,54x103 1,6x103 5x103 4,85x103 1,3x103 Châu Phú 11,7x103 15,8x103 23,5x103 17,2x103 6,3x103 6,25x103 Tóm lại, nguồn nước nuôi cá tra của cả 3 vùng là Phụng Hiệp (Hậu Giang), Thốt Nốt (Cần Thơ) và Châu Phú (An Giang) đều có mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước nằm trong khoảng cho phép của Bộ Thủy Sản và chưa tới mức nguy hiểm để làm phát sinh, lây lan dịch bệnh. Trong đó Thốt Nốt (Cần Thơ) là vùng có mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nguồn nước nuôi thấp nhất (dao động từ 1,3x103 - 15,4x103 CFU/ml), còn Phụng Hiệp (Hậu Giang) là cao nhất (dao động từ 1,05x103 - 56x103 CFU/ml). Tuy nhiên, qua khảo sát lại thấy có sự trái ngược nhau về mật độ vi khuẩn giữa các ao trong hệ thống nuôi, thông thường thì mật độ vi khuẩn trong mẫu nước của ao thải là lớn nhất, kế đến là ao nuôi và ít nhất là ao lắng. Kết quả phân tích mẫu nước tại các điểm thu lại cho thấy phần lớn trong ao nuôi có mật độ vi khuẩn lớn nhất, kế đến là ao lắng và nhỏ nhất lại là ao thải. 4.2. Kết quả phân tích mật độ Coliforms trong cơ cá tra nuôi ao 4.2.1. Kết quả phân tích Coliforms của các mẫu cá thu tại ao nuôi Trong quá trình thực hiện đề tài đã thu tổng cộng là 43 mẫu để phân tích mật độ Coliforms trong cơ cá. Trong đó, có 19 mẫu thu tại các ao nuôi (được chia ra làm 2 đợt: đợt 1 có 10 mẫu và đợt 2 có 9 mẫu), còn lại 24 mẫu được thu mua ở một số chợ của thành phố Cần Thơ. 4.2.1.1. Đợt 1 Kết quả phân tích Coliforms trên 10 mẫu cá tra đều không thấy xuất hiện khuẩn lạc Coliforms trên môi trường đặc trưng VRBL (bảng 4.5). Điều này là do có sự sai sót trong quá trình thu mẫu cũng như phân tích mẫu ở đợt 1. Trong quá trình thu mẫu đã không ghi nhận lại kích cỡ để xác định mẫu cá thu được thuộc giai đoạn nuôi nào và mẫu cá thu về không được phân tích ngay mà đem trữ lạnh trong thời gian khá lâu. Điều này không đúng với các yêu cầu Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 30 kỹ thuật khi phân tích chỉ tiêu Coliforms trong cơ cá theo TCVN 4883:1993. Mặt khác, khi phân tích phải trải qua quá trình rã đông làm ảnh hưởng tới chất lượng cơ thịt cá và khả năng bị nhiễm từ nước rất lớn. Do đó kết quả phân tích được là không chính xác và không có ý nghĩa trong việc so sánh, đánh giá mức độ nhiễm Coliforms trong cơ cá. Bảng 4.5: Kết quả phân tích Coliforms trong đợt 1 Ghi chú: M: Mẫu Dấu (-): Không xác định Dấu (*): Chỉ kết quả ước định 4.2.1.2. Đợt 2 Sau khi phân tích Coliforms trong cơ cá của các mẫu thu tại 9 ao ở đợt 2, kết quả thu được như sau: Bảng 4.6: Kết quả phân tích Coliforms trong đợt 2 Ghi chú: M: Mẫu Dấu (*): Chỉ kết quả ước định Điểm thu Mẫu Kích cỡ cá (g/con) Mật độ vi khuẩn (CFU/g) 2.3 M 2 - <10* 3.4 M 3 - <10* 3.1 M 4 - <10* 1.1 M 5 - <10* 3.2 M 6 - <10* 2.2 M 7 - <10* 3.2 M 8 - <10* 1.3 M 9 - <10* 2.1 M 10 - <10* Điểm thu Mẫu Kích cỡ cá (g/con) Mật độ vi khuẩn (CFU/g) 3.3 M 11 250 <10* 1.3 M 12 300 135 2.2 M 13 150 105 1.1 M 14 300 235 3.4 M 15 1000 <10* 1.2 M 16 200 255 2.3 M 17 250 135 2.1 M 18 250 312 3.2 M 19 300 182 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 31 Theo bảng 4.6 ta thấy các mẫu cá thu ở đợt 2 khi phân tích đều bị nhiễm Coliforms, nhưng ở những mức độ khác nhau, thấp nhất là <10 CFU/g và cao nhất là 312 CFU/g. Mẫu cá thu ở các điểm 1.1, 1.2 và 2.1 có tổng số Coliforms trong cơ cá vượt mức cho phép của tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5289 – 1992 là ≤200 CFU/g, mẫu tại các điểm còn lại đều đạt tiêu chuẩn. Bảng 4.7: Biến động Coliforms trong cơ cá tra thu ở 3 tỉnh Hậu Giang, Cần Thơ và An Giang Địa điểm Mật độ vi khuẩn (cfu/g) Phụng Hiệp - Hậu Giang 133 ± 122 Thốt Nốt - Cần Thơ 140 ± 126 Châu Phú - An Giang 208 ± 37,5 Khi so sánh mật độ Coliforms trong cơ cá của các mẫu thu ở đợt 2 ta thấy các mẫu thu tại Hậu Giang và Cần Thơ có sự biến động rất lớn tương ứng trong khoảng 133 ± 122 CFU/g và 140 ± 126 CFU/g, trong khi ở An Giang chỉ biến động trong khoảng 208 ± 37,5 CFU/g (Bảng 4.7). Như vậy có thể thấy sự biến động về chỉ tiêu Coliforms trong cơ cá tra ở Cần Thơ là lớn nhất còn tại An Giang là thấp nhất. Do đó, cá nuôi tại An Giang có chất lượng về chỉ tiêu Coliforms ổn định hơn so với Cần Thơ và Hậu Giang. Tuy nhiên nếu xét về mức độ nhiễm Coliforms trong cơ cá thì An Giang lại là tỉnh bị nhiễm với mật số cao hơn so với Hậu Giang và Cần Thơ. Hình 4.5: Khuẩn lạc Coliforms phát triển trên môi trường VRBL Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 32 Trong thời gian thu mẫu đợt 2, cá tại các điểm thu mẫu được nuôi ở nhiều giai đoạn khác nhau do vậy phần lớn các mẫu cá thu được không đồng đều về kích cỡ. Có thể chia kích cỡ cá trong đợt thu mẫu này ra các khoảng khác nhau: nhiều nhất là ở khoảng 200-500 g/con (6/9 điểm), có 2 điểm nuôi cá mới chỉ đạt trọng lượng 800 g/con. Bảng 4.8: Biến động Coliforms theo kích cỡ cá thu tại đợt 2 Kích cỡ cá (g/con) Mật độ vi khuẩn (cfu/g) ≤ 200 180 ± 106 200 - 500 199 ± 75 > 800 <10 Theo bảng 4.8 cho thấy có sự biến động về mật số Coliforms trong cơ cá ở những kích cỡ khác nhau. Lớn nhất là ở giai đoạn cá <200 g/con với sự biến động trong khoảng 180 ± 106 CFU/g, kế đến là cá ở giai đoạn từ 200-500 g/con có khoảng biến động là 199 ± 75 CFU/g, ở giai đoạn cá >800 g/con do chỉ thu được 1 mẫu nên không xác định được sự biến động. Như vậy nếu xét các mẫu cá theo từng giai đoạn khác nhau khi phân tích mật số Coliforms trong cơ thịt thì chúng đều đạt tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5289-1992 và cá nuôi trong giai đoạn 200-500 g/con bị nhiễm Coliforms với mật số cao và ổn đinh hơn so với các giai đoạn khác. 4.2.2. Kết quả phân tích Coliforms trong các mẫu thu mua ở chợ Số lượng mẫu thu ở chợ là 24 mẫu, sau khi phân tích cho kết quả như sau: Bảng 4.9: Kết quả phân tích Coliforms trong các mẫu thu mua ở chợ Mẫu Kích cỡ cá (g/con) Mật độ vi khuẩn (cfu/g) M 20 850 65 M 21 930 55 M 22 800 145 M 23 200 45 M 24 400 70 M 25 550 747 M 26 550 762 M 27 600 505 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 33 M 28 600 520 M 29 650 620 M 30 750 110 M 31 700 170 M 32 700 207 M 33 650 120 M 34 650 220 M 35 300 315 M 36 350 120 M 37 300 45 M 38 650 770 M 39 550 190 M 40 550 230 M 41 800 105 M 42 350 <10* M 43 200 30 Ghi chú: M: Mẫu Dấu (*): Chỉ kết quả ước định Theo bảng 4.9 ta thấy tất cả các mẫu thu ở chợ khi phân tích Coliforms đều thấy bị nhiễm. Mức độ nhiễm giữa các mẫu chênh lệch nhau rất lớn, thấp nhất là <10 CFU/ml và cao nhất là 770 CFU/ml. Số mẫu có mật độ nhiễm Coliforms dưới 200 CFU/ml chiếm 58,3%, 16,6% số mẫu nhiễm dao động trong khoảng (210-315 CFU/ml), các mẫu còn lại nhiễm với mật độ khá cao (>500 CFU/ml). Qua đó cho thấy mức độ an toàn vệ sinh của cá bán ở chợ là rất nguy hiểm. Do các mẫu cá thu mua ở chợ cũng không đồng đều về kích cỡ nên cần phải chia số mẫu phân tích theo những khoảng trọng lượng khác nhau để so sánh với các mẫu thu tại các điểm của dự án SFP. Theo bảng 4.10, mẫu cá thu được có trọng lượng trong khoảng 500-800 g/con chiếm 62,5% và đây là những mẫu cá có sự biến động về mật số Coliforms lớn nhất trong khoảng 361 ± 260 CFU/g, vượt quá tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5289-1992 gần 2 lần. Số mẫu có trọng lượng từ 200-500 g/con chiếm 20,8%, sự biến động về mật số Coliforms là tương đối lớn trong khoảng 137,5 ± 122 CFU/g, nếu so với các mẫu thu ở Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 34 đợt 2 của dự án thì sự biến động này lớn hơn rất nhiều nhưng mật số Coliforms lại nhỏ hơn và đều đạt tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5289-1992. Bảng 4.10: Biến động Coliforms theo kích cỡ cá thu ở đợt 2 và tại các chợ Mật độ vi khuẩn (cfu/g) Kích cỡ cá (g/con) Dự án (đợt 2) Tại các chợ ≤ 200 180 ± 106 37,5 ± 10.6 200 - 500 199 ± 75 137,5 ± 122 500 – 800 361 ± 260 > 800 <10 60 ± 7 Số mẫu cá thu được có trọng lượng > 800 g/con và ≤ 200 g/con chiếm tỷ lệ rất thấp ở chợ cũng như ở đợt 2, do đó nếu so sánh sự biến động về mật số Coliforms trong những khoảng trọng lượng này là không có ý nghĩa. 4.3. Kết quả thử nghiệm IMViC các dòng Coliforms phân lập được Coliforms được phát hiện trên môi trường VRBL bằng phương pháp đổ đĩa nhằm xác định mật số của chúng trên mẫu phân tích. Nếu trên một đĩa cấy nghi ngờ có nhiều loại khuẩn lạc Coliforms phát triển dựa vào sự khác biệt về kích thước, hình dạng hay màu sắc thì ta chọn một khuẩn đại diện cho mỗ loại và tiến hành phân lập trên môi trường đặc trưng VRBL (Hình 4.6). Hình 4.6: Đĩa tách ròng Coliforms trên môi trường thạch VRBL Hình 4.7: Chủng chuẩn E. coli LMG 8223 nuôi cấy trên môi trường thạch VRBL Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 35 Cùng với việc phân lập, ta tiến hành khẳng định qua môi trường BGBL để xác định chính xác các loại khuẩn lạc nghi ngờ là Coliforms (Hình 4.8). Kết quả đã tách ròng được 5 chủng Coliforms trên các mẫu thu tại đợt 2 và 18 chủng trên các mẫu thu tại chợ. Sau khi có được các ròng thuần chủng, tiến hành thử nghiệm IMViC bao gồm các chỉ tiêu: Khả năng sinh Indol, Phản ứng Voges-Proskauer (VP), Phản ứng Methyl Red (MR), Khả năng sử dụng Citrate (iC) nhằm phân loại các chủng trên thuộc giống nào trong nhóm vi khuẩn Coliforms dựa vào bảng 1. Bảng 4.11: Kết quả thử nghiệm IMViC và phân loại các chủng Coliforms phân lập được từ các mẫu thu ở đợt 2 Stt Chủng I MR VP iC Giống 1 M 16.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 2 M 16.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 3 M 17 - - + + Klebsiella / Enterobacter 4 M 19.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 5 M 19.2 + + - - Escherichia sp. Qua bảng 4.11 ta thấy, trong 5 chủng tách được từ đợt 2 thì chỉ có chủng M 19.2 thuộc giống Escherichia, còn lại 4 chủng đều thuộc một trong hai giống Klebsiella hoặc Enterobacter. Qua bảng 4.12 ta cũng thấy, trong 18 Hình 4.8: Coliforms cho phản ứng dương tính trong môi truờng canh BGBL Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 36 chủng tách được từ các mẫu thu ở chợ chỉ có 1 chủng M 39.1 thuộc giống Citrobacter còn lại đều thuộc một trong hai giống Klebsiella hoặc Enterobacter. Từ kết quả trên cho thấy Coliforms nhiễm trên cơ cá tra nuôi ao chủ yếu là một trong hai giống Klebsiella hoặc Enterobacter. Tuy nhiên dù thuộc giống nào trong nhóm Coliforms khi nhiễm với mật độ cao đều gây ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm cũng như sức khỏe của người tiêu dùng khi sử dụng các sản phẩm được chế biến từ những nguyên liệu bị nhiễm đó. Bảng 4.12: Kết quả thử nghiệm IMViC và phân loại các chủng Coliforms phân lập được từ các mẫu thu tại chợ Stt Chủng I MR VP iC Giống 1 M 22 - - + + Klebsiella / Enterobacter 2 M 24.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 3 M 24.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 4 M 25.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 5 M 25.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 6 M 26.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 7 M 27.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 8 M 27.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 9 M 29 - - + + Klebsiella / Enterobacter 10 M 30 - - + + Klebsiella / Enterobacter 11 M 31.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 12 M 33 - - + + Klebsiella / Enterobacter 13 M 34.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 14 M 35 - - + + Klebsiella / Enterobacter 15 M 36.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 16 M 36.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 17 M 39.1 - + - + Citrobacter 18 M 40 - - + + Klebsiella / Enterobacter Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 37 Một số hình ảnh kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa trong thử nghiệm IMViC đối với các chủng Coliforms tách ròng được Âm tính Dương tính Đối chứng Dương tính Âm tính Hình 4.11: Thử nghiệm khả năng sử dụng Citrate Hình 4.12: Thử nghiệm Methyl Red Hình 4.9: Thử nghiệm khả năng sinh Indol Hình 4.10: Thử nghiệm Voges - Proskauer Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Đối chứng Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 38 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1. Kết luận  Phần lớn trong ao nuôi có mật độ vi khuẩn tổng cộng lớn nhất (dao động từ 1,5x103 - 56x103 CFU/ml), kế đến là ao lắng (dao động từ 1,5x103 - 43,5x103 CFU/ml) và nhỏ nhất lại là ao thải (dao động từ 1,05x103- 23,5x103 CFU/ml).  Mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nguồn nước nuôi cá tra ở các điểm khảo sát đều nhiễm ở mức thấp và nằm trong khoảng cho phép của Bộ Thủy Sản. Trong đó, nguồn nước nuôi tại Thốt Nốt (Cần Thơ) nhiễm thấp nhất (dao động từ 1,3x103 - 15,4x103 CFU/ml) và tại Phụng Hiệp (Hậu Giang) nhiễm cao hơn (dao động từ 1,05x103 - 56x103 CFU/ml).  Các mẫu cá tra thu tại ao có mật độ Coliforms trong cơ dao động trong khoảng 10-312 CFU/g nhỏ hơn nhiều so với các mẫu thu mua ở chợ (10- 770 CFU/g). Nhìn chung cá tra ở giai đoạn từ 500-800 g/con bị nhiễm Coliforms với mật độ rất cao (biến động ở mức 361±260 CFU/g, kế đến là ở giai đoạn 200-500 g/con biến động ở mức 199±75 CFU/g (mẫu cá tra ở dự án SFP) và 137,5±122 CFU/g (mẫu cá tra mua ở chợ).  Các chủng Coliforms phân lập được trên cá tra chủ yếu thuộc 2 giống Klebsiella và Enterobacter (có 21/23 chủng). Đối với Escherichia và Citrobacter, mỗi giống chỉ có 1 chủng. 5.2. Đề xuất  Cần phải tăng thêm số lượng mẫu thu để kết quả phân tích có ý nghĩa hơn trong việc so sánh, đánh giá mức độ nhiễm khuẩn nguồn nước cũng như mật độ Coliforms trong cơ cá.  Kiểm tra kháng sinh đồ đối với các chủng Coliforms nhiễm trên cá tra nhằm xác định một số loại kháng sinh có khả năng tiêu diệt và ức chế sự phát triển của nhóm vi khuẩn Coliforms. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ahmed H Al-Harbi, 2003. Faecal coliforms in pond water, sediments and hybrid tilapia Oreochromis niloticus, Oreochromis aureus in Saudi Arabia. Aquaculture Research, Volume 34 Issue 7 Page 517-524. 2. Anderson, I. 1993. The veterinary approach to matine prawns. In: Aquaculture for veterinarians: fish husbandry and medicine, 278-282. 3. Bộ thủy sản, 2003. Đảm bảo chất lượng sản phẩm thủy sản. NXB Hà Nội. 4. Boyd, C.E. and C.S. Tucker, 1998. Pond Aquaculture Water Quality Management. Kluwer Academic Publishing, Boston, USA. 5. Claude E. Boyd and Margaret Tanner, 1998. Coliform Organisms in Waters of Channel Catfish Ponds. Journal of the World Aquaculture Society Volume 29 Issue 1 Page 74-78. 6. Dương Nhựt Long, 2003. Giáo trình kỹ thuật nuôi thuỷ sản nước ngọt. Khoa Thuỷ Sản, trường Đại Học Cần Thơ. 7. G. Ibarrow, R.K.A Feltham, 1987. Cowan and Steel’s manual for indentification of medical bacteria, international journal of systematic bacteriology Vol.37.No4: 110-111, 132-133. 8. G. Rombaut, G. Suantika and ctv, 2001. Monitoring of the evolving diversity of the microbial community present in rotifer culture. In Aquaculture 198: 242-248. 9. 10. 11. Iyer TSG, Shrivastava KP. On the pattern of Salmonella serotypes in fishery products, frogs’ legs and processing environments. Fisheries technology, 1989, 26:131-136. 12. James M.Jay and Bijamin Pub, 1997. Modern food Microbiology. 13. Lê Đình Hùng, Lê Văn Chiêu, 2001. Thương mại thủy sản. Tháng 3/2001 14. NAFIQUAVED, 2004. Phát triển nuôi thủy sản gắn liền với đảm bảo an toàn dịch bệnh, an toàn thực phẩm và bảo vệ môi trường. Tài liệu tuyên truyền về GAP. 15. Ngô Minh Dung, 2007. Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophyla trên cá tra. Luận văn tốt nghiệp đại học, Khoa thủy sản, Trường Đại Học Cần Thơ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 40 16. Nguyễn Đình Xuân Quý, 2003. Đánh giá mức độ an toàn vệ sinh và thú y của tôm nuôi tại Trà Vinh và Kiên Giang. Luận văn thạc sĩ nuôi trồng thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ. 17. Nguyễn Đức Hùng và ctv, 2004. Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản. NXB Nông Nghiệp Hà Nội. 18. Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm, 1999. Vệ sinh và an toàn thực phẩm. NXB Đại Học Kỹ Thuật Tp. Hồ Chí Minh. 19. Nguyễn Hoàng Nam Kha, 2006. Phân lập hệ vi khuẩn cộng sinh trên cá tra và tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ, Tạp Chí KHKT Nông Lâm Nghiệp Số 1/2006, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. 20. Phạm Đình Đôn, 2006. Bảo vệ môi trường trong nuôi trồng thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long. ( truy cập ngày 2/6/2008) 21. Phạm Thị Tuyết Ngân và ctv, 2005. Biến động mật độ vi khuẩn trong ao nuôi tôm sú ghép với cá rô phi đỏ ở Sóc Trăng. 22. Phạm Thị Tuyết Ngân, 2006. Bài giảng vi sinh vật học ứng dụng trong thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ. 23. Phạm Văn Khánh, 2000. Kỹ Thuật Nuôi Một Số Loài Cá Xuất Khẩu. NXB Nông Nghiệp. 24. Phạm Văn Tuấn, 2008. Khảo sát một số chỉ tiêu vi sinh vật của nước ao nuôi cá tra tại quận Ô Môn, thành phố Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp bác sĩ thú y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ. 25. Prevention and control of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infections. Report of a WHO consultation, Geneva, Switzerland, 28 April- 1 May 1997. Ginebra, World Health Oganization, 1997. 26. R Ravikumar, 1994. Dealing with Fishery Harbour Pollution - the Phuket experience. BAY OF BENGAL PROGRAMME. Madras, India. Report of the Si,steenth Meeting of the Advisory Committee, Phuket, Thailand, 20-23 January 1992. 27. R. Kozlov, O. Stetsiouk and ctv, 1999. Antimicrobial resistance in nosocomial strains of Enterobacter spp isolated in intensive care units in Russia: results of multicentre study, 9th European Congress Of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 21-25 March, 1999, Berlin, Germany. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 41 28. R. Suhalim and Y. W. Huang, 2002. Presence of Escherichia coli O157:H7 in raw channel catfish and processed fish products at farmer's markets. Department of Food Science and Technology. 29. Reilly (1992), Safety of Food Products from Aquaculture, the Environmenttal Health Division, 2004. Coliform bacteria and drinking water. Truy cập ngày 28/05/2008. 30. Rocco Cipriano, 2001. Aeromonas hydrophyla and motile aeromonad Septicememilas of fish. United States Derartment of the Interior: 3-5. 31. Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn Bệnh Học Thủy Sản, 2007. Khoa Thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ. 32. Tạp chí thủy sản, 2004. 33. Tô Công Tâm, 2002. Khảo sát sự biến động các yếu tố thủy lý hóa của nước và các nhóm vi khuẩn gây bệnh trong ao nuôi cá tra mùa lũ. Luận văn tốt nghiệp đại học, Khoa thủy sản, Trường Đại Học Cần Thơ. 34. Trần Anh Dũng, 2005. Khảo sát tác nhân gây bệnh trong nuôi cá tra thâm canh ở tỉnh An Giang. Luận văn thạc sĩ ngành nuôi trồng thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ. 35. Trần Linh Thước, 2006. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo Dục. 36. World health organization, Geneva 1999. Food safety issues associated with products from aquacutre. 37. Một số tiêu chuẩn, thông tư, quyết định có liên quan đến chỉ tiêu Coliforms như:  Tiêu chuẩn ngành của Bộ Thủy Sản (số 28 TCN 101: 1997)  Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5289-1992  Phương pháp xác định Coliforms (TCVN 4883:1993)  Thông tư số 01/2000/TT-BTS ngày 28/04/2000 của Bộ Thủy Sản  Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31/08/2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 42 Phụ lục 1: Bảng kết quả phân tích vi khuẩn tổng cộng trong nước (Đợt 1) Số khuẩn lạc đếm được ở nồng độ Ngày Địa điểm Ao Mẫu 1:10 1:100 1:1000 CFU/ml 1.2.1 195 174 N 42 10 0 18450 1.2.2 161 164 30 24 0 0 16250 19/01/08 Phụng Hiệp-Hậu Giang Ao 1 1.2.3 95 61 9 4 1 1 7800 2.3.1 95 N 41 46 1 2 43500 Ao 2 2.3.2 N N 54 58 1 0 56000 3.4.1 67 N 20 14 3 0 17000 22/01/08 Phụng Hiệp-Hậu Giang Ao 3 3.4.2 247 234 37 28 0 0 24050 1.1.1 195 187 90 79 6 4 19100 1.1.2 176 165 23 17 3 2 17050 Ao 4 1.1.3 297 N 25 22 3 1 23500 3.2.1 55 30 6 11 2 0 4250 25/01/08 Châu Phú-An Giang Ao 5 3.2.2 153 141 85 47 3 1 14700 2.2.1 143 98 47 53 4 1 12050 Ao 6 2.2.2 127 181 65 49 3 2 15400 3.3.1 95 71 46 35 1 0 8300 28/01/08 Tân Lộc-Thốt Nốt (Cần Thơ) Ao 7 3.3.2 112 168 27 19 3 0 14000 1.3.1 86 71 25 21 1 3 7850 1.3.2 18 27 5 4 0 0 2250 Ao 8 1.3.3 18 14 1 2 0 0 1600 2.1.1 12 18 2 2 0 0 1500 30/01/08 Thới Thuận-Thốt Nốt (Cần Thơ) Ao 9 2.1.2 103 98 16 19 0 1 10500 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 43 Phụ lục 2: Bảng kết quả phân tích vi khuẩn tổng cộng trong nước (Đợt 2) Số khuẩn lạc đếm được ở nồng độ Ngày Địa điểm Ao Mẫu 1:10 1:100 1:1000 CFU/ml 3.3.1 40 43 19 17 8 3 4150 21/03/08 Tân Lộc - Thốt Nốt Cần Thơ Ao 1 3.3.2 47 40 22 25 5 2 4350 1.3.1 15 22 8 5 3 4 1850 1.3.2 13 17 6 3 2 0 1500 Thới Thuận - Thốt Nốt Cần Thơ Ao 2 1.3.3 11 15 5 8 2 4 1300 2.2.1 128 116 17 15 1 2 12200 22/03/08 Tân Lộc - Thốt Nốt Ao 3 2.2.2 33 31 2 1 0 0 3200 1.1.1 352 289 29 36 4 7 32500 1.1.2 39 43 8 5 1 0 4100 23/03/08 Châu Phú - An Giang Ao 4 1.1.3 70 55 11 17 2 5 6250 3.4.1 215 N 34 45 6 11 39000 8/4/2008 Phụng Hiệp - Hậu Giang Ao 5 3.4.2 121 113 19 23 1 1 11700 1.2.1 42 45 6 3 1 1 4350 1.2.2 58 51 13 7 2 0 5450 Phụng Hiệp - Hậu Giang Ao 6 1.2.3 12 9 2 3 0 0 1050 2.3.1 25 19 2 7 0 2 2200 20/04/08 Phụng Hiệp - Hậu Giang Ao 7 2.3.2 N 114 38 33 0 2 35500 2.1.1 18 20 8 9 3 1 1900 22/04/08 Thới Thuận - Thốt Nốt Cần Thơ Ao 8 2.1.2 63 47 7 5 2 0 5500 3.2.1 18 20 6 2 1 0 1900 23/04/08 Châu Phú - An Giang Ao 9 3.2.2 82 88 38 42 2 4 8500 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 44 Phụ lục 3: Bảng phân tích kết quả Coliforms tổng số trong mẫu cá thu đợt 1 VRB agar Địa điểm Ao Mẫu Kích cỡ cá (g/con) 1: 10 Tỉ lệ khẳng định BGBL (%) Mật độ Vi khuẩn (cfu/g) Phụng Hiệp - Hậu Giang 1.2 M 1 - 0 0 - <10 2.3 M 2 - 0 0 - <10 Phụng Hiệp - Hậu Giang 3.4 M 3 - 0 0 - <10 Cồn Khương - Cần Thơ 3.1 M 4 - 0 0 - <10 1.1 M 5 - 0 0 - <10 Châu Phú - An Giang 3.2 M 6 - 0 0 - <10 2.2 M 7 - 0 0 - <10 Tân Lộc - Thốt Nốt (Cần Thơ) 3.2 M 8 - 0 0 - <10 1.3 M 9 - 0 0 - <10 Thới Thuận - Thốt Nốt (Cần Thơ) 2.1 M 10 - 0 0 - <10 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 45 Phụ lục 4: Bảng phân tích kết quả Coliforms tổng số trong mẫu cá thu đợt 2 VRBL agar Ngày Địa điểm Ao Mẫu Kích cỡ cá (g/con) 1:10 Tỉ lệ khẳng định BGBL (%) Mật độ vi khuẩn (cfu/g) 21/03/08 Thới Thuận - Thốt Nốt Cần Thơ 3.3 M 11 250 0 0 0 < 10 Tân Lộc - Thốt Nốt 1.3 M 12 300 12 15 100 135 22/03/08 Tân Lộc - Thốt Nốt 2.2 M 13 150 13 8 100 105 23/03/08 Châu Phú - An Giang 1.1 M 14 300 21 26 100 235 8/4/2008 Phụng Hiệp - Hậu Giang 3.4 M 15 1000 0 0 0 < 10 Phụng Hiệp - Hậu Giang 1.2 M 16 200 24 27 100 255 20/04/08 Phụng Hiệp - Hậu Giang 2.3 M 17 250 13 14 100 135 22/04/08 Thới Thuận - Thốt Nốt Cần Thơ 2.1 M 18 250 67 58 50 312 23/04/08 Châu Phú - An Giang 3.2 M 19 300 39 34 50 182 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 46 Phụ lục 5: Bảng phân tích kết quả Coliforms tổng số trong mẫu cá thu tại một số chợ của Tp Cần Thơ VRBL agar Ngày Chợ Mẫu KCC (g/con) 1:10 TLKĐ BGBL (%) MĐVK (cfu/g) M 20 850 5 7 100 65 17/4/2008 Cái Khế M 21 930 7 4 100 55 M 22 800 13 16 100 145 M 23 200 4 5 100 45 20/4/2008 An Thới M 24 400 6 8 100 70 M 25 550 146 153 50 747 M 26 550 138 167 50 762 M 27 600 43 58 100 505 27/4/2008 Xuân Khánh M 28 600 72 31 100 520 M 29 650 89 96 67 620 M 30 750 19 24 50 110 30/4/2008 Hưng Lợi M 31 700 32 36 50 170 M 32 700 28 34 67 207 M 33 650 23 25 50 120 3/5/2008 An Hòa M 34 650 20 24 100 220 M 35 300 35 28 100 315 M 36 350 14 10 100 120 8/5/2008 Xuân Khánh M 37 300 5 4 100 45 M 38 650 162 147 50 770 M 39 550 36 40 50 190 11/5/2008 Bình Thủy M 40 550 27 19 100 230 M 41 800 8 13 100 105 M 42 350 0 0 0 < 10 14/5/2008 Cồn Khương M 43 200 2 4 100 30 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 47 Phụ lục 6: Bảng kết quả test thử nghiệm IMViC các chủng Coliforms phân lập được Phân loại Stt Chủng I MR VP iC Giống 1 LMG8223 + + - - Escherichia (Chủng chuẩn) 2 M 16.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 3 M 16.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 4 M 17 - - + + Klebsiella / Enterobacter 5 M 19.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter Các chủng Colifomrs phân lập được từ các mẫu thu ở đợt 2 6 M 19.2 + + - - Escherichia 7 M 22 - - + + Klebsiella / Enterobacter 8 M 24.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 9 M 24.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 10 M 25.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 11 M 25.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 12 M 26.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 13 M 27.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 14 M 27.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 15 M 29 - - + + Klebsiella / Enterobacter 16 M 30 - - + + Klebsiella / Enterobacter 17 M 31.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 18 M 33 - - + + Klebsiella / Enterobacter 19 M 34.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 20 M 35 - - + + Klebsiella / Enterobacter 21 M 36.1 - - + + Klebsiella / Enterobacter 22 M 36.2 - - + + Klebsiella / Enterobacter 23 M 39.1 - + - + Citrobacter Các chủng Colifomrs phân lập được từ các mẫu thu ở các chợ của Tp Cần Thơ 24 M 40 - - + + Klebsiella / Enterobacter Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 48