Khảo sát mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong các loại thực phẩm tại khu vực thành phố Phan Thiết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỨC ĐỘ Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG CÁC LOẠI THỰC PHẨM TẠI KHU VỰC THÀNH PHỐ PHAN THIẾT Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: ĐẶNG THỊ KIM THOẠI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************* KHẢO SÁT MỨC ĐỘ Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG CÁC LOẠI THỰC PHẨM TẠI KHU VỰC THÀNH PHỐ PHAN THIẾT Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: Ths. NGUYỄN TIẾN DŨNG ĐẶNG THỊ KIM THOẠI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM ƠN Để có điều kiện học tập và hoàn tất cuốn luận văn tốt nghiệp này tôi xin chân thành cảm ơn:  Con thành kính ghi ơn cha mẹ cùng gia đình đã không quãng khó khăn nuôi dƣỡng và dạy dỗ con nên ngƣời.  Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.  Thạc sĩ Nguyễn Tiến Dũng đã tận tình hƣớng dẫn và tạo điều kiện tốt để tôi hoàn thành luận văn này.  Ban lãnh đạo cùng toàn thể cô, chú, anh, chị trong Chi Cục – Tiêu Chuẩn – Đo lƣờng – Chất lƣợng tỉnh Bình thuận.  Chị Ngô Minh Toàn và anh Lƣơng Đình Quát đã hết lòng chỉ dẫn, giúp đỡ, truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm trong suốt thời gian làm đề tài ở Phòng Vi sinh của Chi Cục.  Cùng tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã chia sẽ những vui buồn, giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm học tại trƣờng. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả. Tp.Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2007 Sinh viên Đặng Thị Kim Thoại TÓM TẮT Đặng Thị Kim Thoại, Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, với đề tài “Khảo sát mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong các loại thực phẩm tại khu vực thành phố Phan Thiết”, dƣới sự hƣớng dẫn của Ths. Nguyễn Tiến Dũng. Đề tài đƣợc thực hiện tại Chi Cục Tiêu Chuẩn – Đo lƣờng – Chất lƣợng – tỉnh Bình Thuận. Thời gian thực hiện từ tháng 4/2007 đến tháng 7/2007. Đề tài khảo sát 5 chỉ tiêu vi sinh vật trên tổng số 80 mẫu ở 3 nhóm thực phẩm khác nhau: thực phẩm ăn liền, thực phẩm tƣơi sống, thực phẩm khô. Sau thời gian khảo sát, chúng tôi thu đƣợc các kết quả sau: + Trong tổng số 35 mẫu thực phẩm ăn liền, số mẫu có mật độ nhiễm tổng vi sinh vật hiếu khí không đạt 25/35 chiếm 71,43%, số mẫu có mật độ nhiễm Coliforms không đạt 15/35 chiếm 42,86%, số mẫu nhiễm E. coli 3/35 chiếm 8,57% và số mẫu có mật độ nhiễm S. aureus không đạt 9/35 chiếm 25,71%; các mẫu không đạt tập trung trong nhóm ăn vặt, nhóm nƣớc uống và nhóm bánh phở. + Trong tổng số 24 mẫu thực phẩm tƣơi sống, số mẫu có mật độ nhiễm tổng vi sinh vật hiếu khí không đạt 7/24 chiếm 29,2%, Coliforms không đạt 17/24 chiếm 70,83%, số mẫu nhiễm E. coli chiếm 5/24 chiếm 20,83% và số mẫu có mật độ nhiễm S. aureus không đạt 11/24 chiếm 45,83%; số mẫu không đạt tập trung trong nhóm rau, thịt và đậu phụ. + Trong tổng số 21 mẫu thực phẩm khô, số mẫu có mật độ nhiễm tổng vi sinh vật hiếu khí không đạt 6/21 chiếm 28,57%, Coliforms và E. coli không đạt cho phép 1/21 chiếm 4,76% và số mẫu có mật độ nhiễm S. aureus không đạt 9/21 chiếm 42,86%; các mẫu không đạt tập trung trong nhóm cá khô và hải sản khô. Không phát hiện Salmonella trong tổng 80 mẫu đã phân tích. SUMMARY DANG THI KIM THOAI, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, thesis: “Study on the density of harmful bacteria in foods at Phan Thiet city”. Supervisor: Nguyen Tien Dung, M.D The subject was studied from April 2007 to July 2007 at Standard and quality measurement Department of Binh Thuan province. We progress testing 5 targets are total aerobic bacteria (total plate count – TPC), total Coliforms, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Salmonella in the 80 samples of 3 group of food: ready to eat, ready to cook or material food and dried food. * The results of progress: - In the 35 samples of ready to eat food, such as to nosh, potable water, and rice noodle, the number of samples unfit for food standard No 3742/2001/QD-BYT of health ministry are: TPC 71,33%, Coliforms: 42,86%, E. coli: 8,57%, S. aureus: 25,71%. - In the 24 samples of fresh food, material or ready to cook food, such as vegetable, meats, and soya curd, the number of samples unfit for food standard No 3742/2001/QD-BYT of health ministry are: TPC: 29,2%, Coliforms: 70,83%, E. coli: 20,83%, S. aureus: 45,83%. - In the 21samples of dried food, such as salted dried fish, non salted dried seafood, the rate of samples unfit for food standard No 3742/2001/QD-BYT of health ministry are: TPC: 28,57%, Coliforms: 4,76%, E. coli : 4,76%, S. aureus: 42,86%. - Salmonella is not detected in all 80 tested samples. MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm ơn: .................................................................................................................. iii Tóm tắt: ........................................................................................................................ iv Summary: ...................................................................................................................... v Mục lục: ....................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt: ........................................................................................... ix Danh sách các hình: ...................................................................................................... x Danh sách các bảng : .................................................................................................... xi Danh sách các biểu đồ: ................................................................................................ xii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU: .................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề: .................................................................................................. 1 1.2. Mục đích: .................................................................................................... 1 1.3. Yêu cầu: ...................................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU: ....................................................................... 3 2.1. Tầm quan trọng của an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP): ..................... 3 2.2. Giới thiệu một vài vi khuẩn gây ô nhiễm thực phẩm: ................................ 3 2.2.1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí: ............................................................... 3 2.2.2. Coliforms: ......................................................................................... 3 2.2.3. Escherichia coli: ............................................................................... 4 2.2.4. Staphylococcus aureus: .................................................................... 8 2.2.5. Salmonella: ..................................................................................... 12 2.3. Giới hạn cho phép của các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm: ............. 16 2.4. Các con đƣờng vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm: .................................... 18 2.5. Tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm: ....................................................... 18 2.5.1. Tình hình ngoài nƣớc: .................................................................... 18 2.5.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm trong nƣớc: ..................................... 19 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP: ........................................................ 21 3.1. Địa điểm và thời gian thực hiện: ............................................................... 21 3.1.1. Địa điểm: ........................................................................................ 21 3.1.2. Thời gian: ........................................................................................ 21 3.2. Vật liệu – thiết bị:...................................................................................... 21 3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu: ........................ 21 3.2.1.1. Trang thiết bị: ..................................................................... 21 3.2.1.2. Dụng cụ: ............................................................................. 21 3.2.2. Các loại môi trƣờng và hoá chất dùng trong nghiên cứu: ............ 22 3.2.2.1. Các loại môi trƣờng dùng trong nuôi cấy và phân lập: ...... 22 3.2.2.2. Môi trƣờng dùng để thử sinh hoá: ..................................... 26 3.2.3. Vật liệu nghiên cứu: ....................................................................... 28 3.3. Phƣơng pháp: ............................................................................................ 29 3.3.1. Phƣơng pháp thu và bảo quản mẫu thực phẩm: ............................ 29 3.3.2. Phƣơng pháp pha loãng vi sinh vật: .............................................. 30 3.3.3. Phƣơng pháp phân tích tổng vi khuẩn hiếu khí: ............................ 30 3.3.4. Phƣơng pháp phân tích Coliforms tổng số: ................................... 31 3.3.5. Phƣơng pháp phân tích E. coli : .................................................... 32 3.3.6. Phƣơng pháp phân tích Staphylococcus aureus: ........................... 34 3.3.7. Phƣơng pháp phân tích Salmonella: .............................................. 35 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN: .............................................................. 37 4.1. Khảo sát mức độ ô nhiễm VSV chỉ thị chất lƣợng trong các loại thực phẩm: ................................................................................................................ 37 4.1.1. Mức độ ô nhiễm VSV chỉ thị chất lƣợng trong TP ăn liền: .......... 37 4.1.2. Mức độ ô nhiễm VSV chỉ chất lƣợng trong TP tƣơi sống: ........... 38 4.1.3. Mức độ ô nhiễm VSV chỉ thị chất lƣợng trong TP khô: .............. 40 4.2. Khảo sát mức độ ô nhiễm VSV chỉ thị an toàn trong các loại TP: ........... 41 4.2.1. Mức độ ô nhiễm VSV chỉ thị an toàn trong TP ăn liền: ............... 41 4.2.2. Mức độ ô nhiễm VSV chỉ thị an toàn trong TP tƣơi sống:............43 4.2.3. Mức độ ô nhiễm VSV chỉ thị an toàn trong TP khô: .................... 45 4.3. Khảo sát mức độ ô nhiễm VSV gây ngộ độc trong các loại TP: .............. 46 4.3.1. Mức độ ô nhiễm VSV gây ngộ độc trong TP ăn liền: ................... 46 4.3.2. Mức độ ô nhiễm VSV gây ngộ độc trong TP tƣơi sống: ............... 48 4.3.3. Mức độ ô nhiễm VSV gây ngộ độc trong TP khô: ........................ 49 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ: ................................................................... 51 5.1. Kết luận: .................................................................................................... 51 5.2. Đề nghị: ..................................................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO: ....................................................................................... 53 PHỤ LỤC: .................................................................................................................. 55 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VSV: Vi sinh vật TP: Thực phẩm ATVSTP: An toàn vệ sinh thực phẩm TPC: Total plate count SPW: Saline Pepton Water PCA: Plate Count Agar VRBA: Violet Red Bile Agar TSA: Trypton Soya Agar BGBL: Brilliant Green Bile Latose EMB: Eosin Methyl Blue BPA: Baird Parked Agar BPW: Buffered Pepton Water RV: Rappaport Vassiliadis XLD: Xylose Lysine Deoxycholate KIA: Kligler Iron Agar SC: Simmons Citrate LDC: Lysine Decarboxylase MR - VP: Methyl Red - Vosges Poskauer CDC: The Center for Desease Control E. coli: Escherichia coli S. aureus: Staphylococcus aureus DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Hình dạng vi khuẩn Coliforms nhìn dƣới kính hiển vi: ............................... 4 Hình 2.2: Hình dạng vi khuẩn E. coli nhìn dƣới kính hiển vi : .................................... 8 Hình 2.3: Hình dạng vi khuẩn S. aureus nhìn dƣới kính hiển vi: .............................. 12 Hình 2.4: Hình dạng vi khuẩn Salmonella nhìn dƣới kính hiển vi: ........................... 16 Hình 3.1: Sơ đồ pha loãng vi sinh vật: ....................................................................... 30 Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc Coliforms trên môi trƣờng VRB: ............................. 32 Hình 3.3: Hình dạng khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng EMB: .................................. 33 Hình 3.4: Các thử nghiệm sinh hóa IMViC: .............................................................. 34 Hình 3.5: Hình dạng khuẩn lạc S. aureus trên môi trƣờng BP: ................................ 34 DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Giới hạn cho phép vi sinh vật có mặt trong thực phẩm theo, Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT của Bộ Y tế: .................................................................. 17 Bảng 2.2: Số vụ mắc, ngộ độc và tử vong trong năm 2003-2004: ............................. 20 Bảng 2.3: Số vụ mắc, ngộ độc và tử vong trong năm 2006-2007: ............................. 20 Bảng 4.1: Các nhóm thực phẩm đƣợc sử dụng trong khảo sát: .................................. 29 Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí trong TP ăn liền: ........................ 37 Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí trong TP tƣơi sống: .................. 39 Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí trong TP khô:............................. 40 Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra VSV chỉ thị an toàn trong TP ăn liền: ............................ 42 Bảng 4.6: Kết quả kiểm tra VSV chỉ thị an toàn trong TP tƣơi sống: ....................... 44 Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra VSV chỉ thị an toàn trong TP khô: ................................. 45 Bảng 4.8: Kết quả kiểm tra VSV gây ngộ độc trong TP ăn liền: ............................... 47 Bảng 4.9: Kết quả kiểm tra VSV gây ngộ độc trong TP tƣơi sống: ........................... 48 Bảng 4.10: Kết quả kiểm tra VSV gây ngộ độc trong TP khô: .................................. 49 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỐ TRANG Biểu đồ 4.1: Mức độ nhiễm tổng số vi khuẩn hiếu khí trong TP ăn liền: .................. 38 Biểu đồ 4.2: Mức độ nhiễm tổng số vi khuẩn hiếu khí trong TP tƣơi sống: .............. 39 Biểu đồ 4.3: Mức độ nhiễm tổng số vi khuẩn hiếu khí trong TP khô: ....................... 41 Biểu đổ 4.4: Mức độ nhiễm Coliforms trong TP ăn liền: ........................................... 42 Biêu đồ 4.5: Tỷ lệ nhiễm E. coli trong các nhóm TP ăn liền: .................................... 43 Biểu đồ 4.6: Mức độ nhiễm Coliforms trong TP tƣơi sống: ....................................... 44 Biểu đồ 4.7: Tỷ lệ nhiễm E. coli trong TP tƣơi sống: ................................................ 45 Biểu đồ 4.8: Mức độ nhiễm Coliforms trong TP khô: ................................................ 46 Biểu đổ 4.9: Mức độ nhiễm S. aureus trong TP ăn liền: ............................................ 47 Biểu đổ 4.10: Mức độ nhiễm S. aureus trong TP tƣơi sống: ...................................... 48 Biểu đồ 4.11: Mức độ nhiễm S. aureus trong TP khô: ............................................... 50 Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay cùng với tốc độ phát triển của xã hội, đời sống của con ngƣời ngày càng đƣợc cải thiện, nhu cầu dinh dƣỡng trong bữa ăn hàng ngày cũng đƣợc chú trọng hơn. Việc đòi hỏi thực phẩm cung cấp vừa bảo đảm về chất lƣợng, vừa an toàn cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng là một điều vô cùng thiết yếu. Lƣơng thực thực phẩm đóng vai trò quan trọng trong bữa ăn hàng ngày của con ngƣời, cung cấp chất dinh dƣỡng cần thiết cho hoạt động của cơ thể. Tuy nhiên, ngoài việc chứa nhiều chất dinh dƣỡng, lƣơng thực thực phẩm còn là môi trƣờng thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, đây là tác nhân chính làm hƣ hỏng, biến chất thực phẩm cũng nhƣ gây ra tình trạng ngộ độc thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng. Theo thống kê của Bộ Y tế 8 tháng đầu năm 2002, nƣớc ta có khoảng 790.093 trƣờng hợp mắc các bệnh nhƣ: tả, thƣơng hàn, lỵ trực tràng, lỵ amíp và tiêu chảy; trong đó có 15 ca tử vong. Tất cả những vụ ngộ độc thực phẩm trên, ngoài nguyên nhân bắt nguồn từ những thực phẩm bị nhiễm thuốc trừ sâu, hoá chất, còn do phần lớn có hiện diện vi sinh vật gây ngộ độc. Do đó, vấn đề an toàn thực phẩm chẳng những đƣợc Việt Nam mà cả thế giới rất quan tâm. [11] Xuất phát từ tình hình trên, đƣợc sự chấp thuận của Bộ Môn công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM và dƣới sự hƣớng dẫn của thầy Nguyễn Tiến Dũng, kỹ sƣ Lƣơng Đình Quát, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong các loại thực phẩm tại khu vực thành phố Phan Thiết”. 1.2. Mục đích Đề tài nhằm góp phần tìm hiểu nguyên nhân làm biến chất và hƣ hỏng thực phẩm, đánh giá chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm tại cơ sở chế biến cũng nhƣ các thực phẩm đƣợc bày bán ở ven đƣờng và trong các quán ăn tại khu vực thành phố Phan Thiết hiện nay. 1.3. Yêu cầu Đề tài nhằm giải quyết 3 yêu cầu: - Khảo sát mức độ nhiễm tổng VSV hiếu khí, Coliforms, E. coli, S. aureus, Salmonella trong thực phẩm (TP) ăn liền, không qua chế biến hay gia nhiệt. - Khảo sát mức độ nhiễm tổng VSV hiếu khí, Coliforms, E. coli, S. aureus, Salmonella trong TP tƣơi sống, phải chế biến gia nhiệt trƣớc khi sử dụng. - Khảo sát mức độ nhiễm tổng VSV hiếu khí, Coliforms, E. coli, S. aureus, Salmonella trong TP khô, chế biến trƣớc khi sử dụng. Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tầm quan trọng của an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) [17] Chất lƣợng ATVSTP là một trong những mối quan tâm hàng đầu của toàn xã hội, là một trong những vấn đề quan trọng đặt ra trƣớc nhân loại và là nhu cầu cấp thiết nhất của con ngƣời. Do đó, chất lƣợng TP, đặc biệt là chất lƣợng ATVSTP, là một trong những vấn đề đƣợc ngƣời tiêu dùng hết sức quan tâm. Chất lƣợng TP nói chung và chất lƣợng vệ sinh an toàn TP nói riêng, không những có ảnh hƣởng trực tiếp đối với sức khoẻ con ngƣời, chẳng những là nguồn động lực quyết định sự phát triển của toàn nhân loại mà còn có liên quan mật thiết đối với sự phồn vinh của nền kinh tế và sự hƣng thịnh của các hoạt động thƣơng mại, văn hoá, an ninh chính trị xã hội và đối với sự trƣờng tồn của một quốc gia. Chính vì vậy, các loại TP có chất lƣợng cao, cân đối dinh dƣỡng, an toàn về mặt vệ sinh TP, sẽ là tiền đề vô cùng quan trọng trong việc tạo ra những thế hệ con cháu khoẻ mạnh, thông minh và đầy năng lực sáng tạo trong lao động sản xuất. 2.2. Giới thiệu một vài vi khuẩn gây ô nhiễm thực phẩm 2.2.1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí [1] Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trƣởng và hình thành trong điều kiện có sự hiện diện của ôxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của TP đó. Ngoài ra, chỉ tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí đƣợc dùng để đánh giá chất lƣợng của mẫu về sự ô nhiễm VSV, nguy cơ hƣ hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, vận chuyển và bảo quản TP. 2.2.2. Coliforms [1], [20] Coliforms là nhóm sinh vật chỉ thị mức độ an toàn vệ sinh TP vì số lƣợng nhất định hiện diện trong TP, trong nƣớc hay có trong các loại mẫu môi trƣờng đƣợc coi nhƣ dấu hiệu chỉ thị khả năng có mặt của các VSV gây bệnh khác. Coliforms luôn luôn hiện diện trong tự nhiên, tuỳ theo điều kiện nuôi cấy mà chúng ta có thể phân biệt Coliforms tổng số với các loại Coliforms phân và nhóm không phải là Coliforms. Coliforms tổng số là nhóm VSV hiếu khí tuỳ nghi, thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, có hình que, lên men lactose và sinh hơi trong khoảng 24 – 48 giờ ở nhiệt độ 37oC. Nhóm Coliforms gồm 4 giống: Escherichia với loài duy nhất là E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Nhóm này đƣợc sử dụng nhƣ yếu tố chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản và vận chuyển TP, nƣớc uống và môi trƣờng. Do là vi khuẩn hiếu khí nên khi nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng nhƣ canh Lauryl Sulphate, canh Brilliant Green Bile Lactose có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi trong khoảng thời gian 24 – 48 giờ. Trên môi trƣờng thạch đĩa Violet red bile agar (VRB), sau khi nuôi cấy ở 37oC trong 24 giờ, Coliforms tạo khuẩn lạc đặc trƣng có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, có đƣờng kính lớn hơn 0,5mm. Hình 2.1: Hình dạng vi khuẩn Coliforms dƣới kính hiển vi 2.2.3. Escherichia coli [4], [5], [16], [18], [19] 2.2.3.1. Lịch sử và phân loại  Lịch sử phát hiện Năm 1885, vi khuẩn do Theodor Escherich phát hiện từ trong tã lót trẻ em và đƣợc đặt tên đầu tiên là Bacterium coli commune. Năm 1889, vi khuẩn này đƣợc giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân ngƣời có công khám phá. Năm 1895, gọi là Bacillus. Năm 1896, gọi thành Bacterium coli. Sau nhiều tên gọi khác nhau, đến năm 1991, vi khuẩn này đƣợc định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli và đây cũng là tên khoa học của nó.  Phân loại  Ngành: Proteobacteria  Lớp: Gamma Proteobacteria  Bộ: Enterobacteriales  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Escherichia  Loài: E. coli 2.2.3.2. Sự phân bố Trong tự nhiên: có trong đƣờng ruột của các động vật nhai lại đặc biệt là trâu, bò, cừu. Trong thực phẩm: có trong rau cải, thịt, các sản phẩm từ sữa. 2.2.3.3. Đặc điểm hình thái E. coli là trực khuẩn hình que thẳng, kích thích dài ngắn khác nhau, trung bình khoảng 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm, đôi khi trong môi trƣờng nuôi cấy trực khuẩn dài 6 – 8 µm. Trực khuẩn có thể có vỏ, có lông, di động (một số chủng không di động), là trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử. 2.2.3.4. Đặc điểm nuôi cấy E. coli là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, phát triển đƣợc từ 5 – 44 oC, ở pH 7,2 - 7,4, sinh indol, sinh nhiều acid, không sử dụng citrate nhƣ nguồn carbon duy nhất. Trên môi trƣờng lỏng, sau 4 – 5 giờ E. coli đã làm đục môi trƣờng, càng để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể đóng ván mỏng trên bề mặt, để lâu lắng xuống đấy ống. Trên môi trƣờng thạch Eosin Methyl Blue, sau 18 – 24 giờ tạo khuẩn lạc dẹt, có màu tím ánh kim, đƣờng kính lớn hơn hay bằng 0,5 mm. Trên môi trƣờng phân lập Brilliant Green Bile Lactose agar, vi khuẩn thƣờng làm thay đổi màu môi trƣờng vì lên men đƣờng lactose. 2.2.3.5. Đặc tính sinh hoá E. coli có khả năng lên men và sinh hơi một số loại đƣờng thông thƣờng nhƣ: lactose, glucose, manitol, căn cứ vào khả năng đƣờng lactose mà ngƣời ta phân biệt E. coli với một số vi khuẩn đƣờng ruột khác. E. coli có phản ứng sinh hoá: Urea (-), H2S (-), indol (+), Methyl red (+), Vosges Proskauer (-), citrate (-). 2.2.3.6. Sức đề kháng E. coli có sức đề kháng kém, bị giết chết sau 60 phút ở nhiệt độ 55oC, ở nhiệt độ 60oC chúng bị giết chết sau 30 phút. 2.2.3.7. Cấu trúc kháng nguyên Cấu trúc kháng nguyên của E. coli rất phức tạp với 4 loại kháng nguyên O, H, K, F. Những vi khuẩn có cấu trúc kháng nguyên khác nhau thì đặc điểm gây bệnh cũng khác nhau. + Kháng nguyên O: là kháng nguyên thân, đến nay đã phát hiện đƣợc 157 loại, do đó dựa vào kháng nguyên O để chia E. coli thành 157 kiểu huyết thanh. + Kháng nguyên K: là kháng nguyên bề mặt, dựa vào sự nhạy cảm với nhiệt độ của loại kháng nguyên này, ngƣời ta chia kháng nguyên thành ba loại A, B, L. Kháng nguyên A thì bền vững với nhiệt độ, kháng nguyên L không bền vững với nhiệt độ, còn kháng nguyên B có tính trung gian giữa hai loại kháng nguyên trên. + Kháng nguyên H: là kháng nguyên lông, đƣợc ghi bằng các số 1, 2, 3, 4 và có 48 loại. E. coli gây ngộ độc TP bao gồm các serotype O26, O86, O111, O119, O125,O126, O157.H7 là kiểu huyết thanh gây ngộ độc TP mạnh nhất. 2.2.3.8. Các nhóm E. coli gây bệnh cho ngƣời + Nhóm sinh độc tố ruột (Enterotoxingenic E. coli viết tắt ETEC): gây ra những vụ tiêu chảy kiểu giống tả ở trẻ em và ngƣời lớn. + Nhóm E. coli gây bệnh (Enteropathogenic E. coli viết tắt EPEC): gây ra viêm ruột và tiêu chảy ở trẻ em và ngƣời lớn thành dịch hoặc lẻ tẻ. + Nhóm E. coli xâm nhập (Enteroinvarive E. coli viết tắt EIEC): gây ra những vụ tiêu chảy có nhiễm độc thức ăn kiểu giống lỵ. 2.2.3.9. Khả năng gây bệnh E. coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn sống ở đƣờng tiêu hoá. Tuy là vi khuẩn cộng sinh với ngƣời nhƣng E. coli có thể gây bệnh cơ hội. Các dòng E. coli gây bệnh khi chúng xâm nhiễm vào ngƣời qua con đƣờng TP, có thể gây nên các bệnh rối loạn đƣờng tiêu hoá, tiết niệu, sinh dục, đƣờng mật, đƣờng hô hấp và nhiễm khuẩn huyết, nhƣng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày ruột ở trẻ em. 2.2.3.10. Triệu chứng Tuỳ theo dòng nhiễm, thời gian ủ bệnh từ 8 – 44 giờ, trung bình từ 12 – 24 giờ, ngƣời trúng độc đau bụng dữ dội, ít nôn mửa, đi phân lỏng 1 – 15 lần trong ngày, nếu nặng thì sốt cao, các chi co giật, đỗ mồ hôi, thời gian khỏi bệnh tƣơng đối dài. 2.2.3.11. Phòng ngừa Để phòng ngừa các bệnh do E. coli gây ra cách tốt nhất là phải vệ sinh ăn uống, ăn chín uống sôi và có biện pháp phòng ngừa nhƣ các bệnh đƣờng ruột khác, đặc biệt chú ý khi có dịch viêm dạ dày ruột ở trẻ em. Hình 2.1: Hình dạng vi khuẩn E. coli nhìn dƣới kính hiển vi 2.2.4. Staphylococcus aureus [ 4], [5], [10], [13], [16], [21] 2.2.4.1. Lịch sử Staphylococcus đã đƣợc R.koch mô tả vào năm 1878, sau đó Pasteur (1880) và Ogston (1881) gọi vi khuẩn này là tụ cầu và xếp vào loài Staphylococcus aureus. Tụ cầu có nhiều loại: có loại gây bệnh, thƣờng gặp nhất là tụ cầu vàng (S. aureus) và có loại bình thƣờng sống trên da và niêm mạc, không gây bệnh, tuy nhiên trong một số điều kiện nhất định, loại không gây bệnh có thể trở thành gây bệnh. 2.2.4.2. Sự phân bố Trong tự nhiên: có khoảng 30 – 50% dân số mang Staphylococcus trong mũi và họng, nó đƣợc tìm thấy ngẫu nhiên trên da và tóc. Trong thực phẩm: có trong thịt sống và các sản phẩm TP từ sữa, các TP đóng hộp và các loại salad. 2.2.4.3. Đặc điểm hình thái S. aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, có tế bào hình cầu, đƣờng kính khoảng 0,8 – 1 µm, thƣờng tụ lại thành từng chùm hay từng đôi, không có vỏ, không có lông và không sinh bào tử. Nhuộm bằng phƣơng pháp Gram, vi khuẩn bắt màu Gram dƣơng. 2.2.4.4. Đặc điểm nuôi cấy S. aureus thuộc loại vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tuỳ ý nên mọc dễ dàng trên môi trƣờng nuôi cấy không chọn lọc. Phát triển đƣợc ở nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều, chúng có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 10 – 45oC. Trên môi trƣờng canh thang, sau 5 – 6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn đã làm đục môi trƣờng, sau 24 giờ môi trƣờng đục rõ, vi khuẩn phát triển nhiều. Trên môi trƣờng thạch không chọn lọc, sau 24 giờ vi khuẩn phát triển mạnh, khuẩn lạc dạng S (Smooth), tạo sắc tố vàng nhạt hoặc vàng thẩm. Trên môi trƣờng thạch máu, khuẩn lạc dạng S, thƣờng gây tan máu và tạo sắc tố vàng. Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trƣờng có nhiệt độ trên 15oC, độc tố sản sinh nhiều nhất khi chúng phát triển trong nhiệt độ 35 – 37oC, tất cả các dòng S. aureus đều có khả năng phát triển trong môi trƣờng chứa đến 15% NaCl, nhạy với novobiocine và có khả năng tan huyết (95%). 2.2.4.5. Đặc tính sinh hóa S. aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tuỳ nghi, có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose, phản ứng catalase dƣơng tính và có khả năng đông tụ huyết tƣơng, phản ứng oxydase âm tính. 2.2.4.6. Cấu trúc kháng nguyên Dựa vào hiện tƣợng liên kết với huyết thanh thỏ miễn dịch, ngƣời ta chia thành 18 kiểu huyết thanh của S. aureus, trong có 3 kiểu đầu (I, II, III của Cowan) phần lớn là các kiểu huyết thanh gây bệnh ở ngƣời. Dựa vào phƣơng pháp miễn dịch hóa học, ngƣời ta đã phân tích đƣợc S. aureus có các kháng nguyên sau: một kháng nguyên polysaccharide A có vách gồm một mucopeptid và một acid sibitol teichoic, một kháng nguyên protein ở ngoài vách. Ngoài ra, các chủng S. aureus đều có khả năng sản sinh đƣợc chất kết dính gian bào, nhờ chất kết dính này mà vi khuẩn tạo đƣợc một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc. 2.2.4.7. Sức đề kháng Tụ cầu nhiễm vào thức ăn sau 4 – 5 giờ sẽ sản sinh ra ngoại độc tố ruột (A, B, C, D, E) có khả năng chịu nhiệt cao, ngoại độc tố này chỉ bị phá huỷ ở nhiệt độ 100oC trong thời gian 1 – 2 giờ. Ở nhiệt độ thấp độc tố ruột có thể duy trì tính độc trên 60 ngày và nó không làm thay đổi mùi vị của thức ăn do đó rất khó phát hiện và dễ gây bệnh. 2.2.4.8. Các loại enzyme và độc tố  Các loại enzym + Men coagulase: men này có khả năng làm đông huyết tƣơng ngƣời và thỏ, nó là một protein bền nhiệt, nhƣng bị thuỷ phân và bất hoạt bởi protease, có tính chất kháng nguyên yếu, có thể gây thành huyết cục trong tĩnh mạch. + Men Fibrinolysin: là một men đặc trƣng cho các chủng gây bệnh ở ngƣời. Men này làm tan các cục máu, tạo nên sự rời chỗ và hình thành những vật tắc mạch nhỏ, tạo ra nhiễm khuẩn di căn. + Men Desoxylibonuclease: là men có thể thuỷ phân DNA, gây ra các tổn thƣơng tổ chức bên trong. + Men Hyaluronidase: men này gây tan vỡ chất cơ bản của mô liên kết bởi sự thuỷ phân của acid hyaluronic. + Men Penicillinase: hầu hết các tụ cầu đều sản xuất đƣợc loại men này (beta-lactamase), nó phá huỷ vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh nhƣ penicilline G, Ampicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng. + Men Exfoliatine: là men phá huỷ lớp thƣợng bì, gây tổn thƣơng da tạo các bọng nƣớc.  Các độc tố + Dung huyết tố (Hemolysin) có 3 loại - Dung huyết tố (α): gây tan hồng cầu thỏ ở nhiệt độ 37oC, huyết tố này cũng có thể gây hoại tử da và gây chết, nó là một ngoại độc tố, có tính kháng nguyên cao, có thể trở thành giải độc tố. - Dung huyết tố (β): có tác dụng làn tan hồng cầu cừu ở 4oC, ít độc hơn dung huyết tố α. - Dung huyết tố (δ): có tác dụng lên hồng cầu và gây ngoại tử da. + Nhân tố diệt bạch cầu (leucocidin): nhân tố này làm bạch cầu mất tính di động và bị phá huỷ nhân. + Các độc tố ruột: các độc tố này gây nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp, các độc tố ruột chỉ do một số chủng tụ cầu tiết ra. Có 5 loại độc tố ruột (enterotocine A, B, C, D, E) bền nhiệt, trong đó có 2 loại đƣợc biết rõ là: - Độc tố ruột A: đƣợc tạo ra do một chủng phân lập trong quá trình nhiễm độc thức ăn. - Độc tố ruột B: đƣợc tạo ra do một chủng phân lập từ bệnh nhân viêm ruột. 2.2.4.9. Khả năng gây bệnh Ngoại độc tố khi vào dạ dày, nhanh chóng thấm vào niêm mạc dạ dày, ruột và vào máu sau đó tác động lên hệ thần kinh thực vật làm cƣờng phó giao cảm gây tảng nhu mô động ruột làm dạ dày co bóp dẫn đến triệu chứng ngộ độc. 2.2.4.10. Triệu chứng Ngƣời ăn phải thức ăn bị nhiễm khuẩn sau 1 đến 5 giờ (trung bình 2 – 4 giờ) sẽ có các biểu hiện: đau bụng, nôn và buồn nôn, đi ngoài phân lỏng đôi khi có nhầy mũi nhiều lần trong ngày, bệnh cảnh diễn biến nhanh, mau bình phục, bệnh khỏi sau 1 đến 2 ngày, tỷ lệ tử vong thấp, thƣờng chỉ gặp tử vong ở trẻ nhỏ, ngƣời già bị suy kiệt do mất nƣớc và điện giải. Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: thƣờng xảy ra ở những ngƣời có sức khoẻ yếu hoặc trẻ em. Bệnh thƣờng nặng có thể gây chết ngƣời hoặc trở thành mãn tính gây nên viêm xƣơng, viêm khớp, viêm phổi, viêm cơ… 2.2.4.11. Phòng ngừa Để phòng ngừa ngộ độc TP thì cần bảo quản tốt các thức ăn đã chế biến, bánh ngọt, kem, sữa tƣơi. Đối với loại TP nghi ngờ bị nhiễm tụ cầu cần phải đun sôi 100oC liên tục trong 2 giờ trở lên. Hình 2.3: Hình dạng vi khuẩn S. aureus nhìn dƣới kính hiển vi 2.2.5. Salmonella [8], [9], [22] 2.2.5.1. Lịch sử và phân loại  Lịch sử Salmonella là một trong những loại vi khuẩn quan trọng nhất thuộc họ vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae. Năm 1885, Smith và Salmon D.E đã phân lập đƣợc vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở heo con đầu tiên từ một ca “dịch tả heo” và cho nó là nguyên nhân gây bệnh dịch tả nên đặt tên là Bacillus choleraesuis. Năm 1888, Gartner đã phân lập đƣợc nhóm vi khuẩn từ một ca tử vong do ăn thịt tƣơi của một con bò bị bệnh và đặt tên cho nhóm vi khuẩn này là Bacillus enteritidis. Năm 1892, Loeffer đã phân lập nhóm vi khuẩn Bacillus typhimurium từ chuột và đây cũng chính là Salmonella typhimurium sau này. Năm 1990, Lignieres đã chính thức đặt tên vi khuẩn này là Salmonella để tỏ lòng tôn kính Salmon D.E (Merchant, 1942).  Phân loại Vi khuẩn Salmonella thuộc:  Họ: Enterobacteriaceae  Tộc: Salmonellaea  Giống: Salmonella 2.2.5.2. Sự phân bố Trong tự nhiên: Salmonella hiện diện trong đƣờng ruột của động vật trong nƣớc, động vật có vú, các loài chim máu nóng, máu lạnh. Trứng cũng có thể bị ô nhiễm do tiếp xúc với phân. Trong thực phẩm: Salmonella hiện diện trong thịt gia súc và gia cầm, trứng, rau cải, xà lách, các sản phẩm bơ, sữa, cá và các loại tôm cua sò ốc. 2.2.5.3. Đặc điểm hình thái Salmonella là vi khuẩn hình gậy, ngắn mập, Gram âm, hai đầu tròn, kích thƣớc 0,4 – 0,6 x 1 – 3 m, không hình thành giáp mô và nha bào, có khả năng di động nhờ vào lông mao, có khoảng 7 – 12 lông mao chung quanh thân, ngoại trừ S.gallinarum và S.pollorum gây bệnh cho gia cầm. 2.2.5.4. Đặc điểm nuôi cấy Salmonella là vi khuẩn sống kị khí tùy nghi, phát triển dễ dàng ở điều kiện môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Nhiệt độ phát triển thích hợp là 37oC, pH 7,6, nhƣng cũng có thể phát triển ở nhiệt độ 5 – 45oC, pH 4 – 9. Khi nuôi cấy trên môi trƣờng canh thang sau 18 giờ làm đục đều môi trƣờng. Trên môi trƣờng thạch, khuẩn lạc Salmonella có dạng gọn, tròn, hơi lồi lên ở giữa, màu trắng trong, hơi sáng, mặt bóng, phẳng đều (dạng S), đƣờng kính khuẩn lạc 1 –2 mm, tuy nhiên cũng có thể thay đổi tùy mức độ phân bố của khuẩn lạc trên đĩa thạch. 2.2.5.5. Đặc điểm sinh hóa Salmonella có những đặc tính sinh hóa chủ yếu mà dựa vào đó ngƣời ta có thể định hƣớng phân loại với các vi khuẩn đƣờng ruột khác. + Phần lớn Salmonella sinh acid do lên men glucose, manitol, dulticol, maltose và mucate, nhƣng không lên men lactose (trừ S. arizona), sucrose và salicin, không có khả năng sinh amine từ tryptophan. + Không làm tan chảy Gelatin, không sinh indol hoặc acetoin và không phân giải urea, phần lớn sinh hydrogen sulfide (H2S) và tách carboxyl từ orthine và lysin. + Phản ứng VP âm tính. + Phản ứng MR dƣơng tính + Oxydase âm tính 2.2.5.6. Sức đề kháng Salmonella có thể phát triển tốt ở môi trƣờng bên ngoài khá lâu, trong xác chết sống đƣợc 100 ngày, trong đất khô từ 2 – 3 tháng, trong nƣớc sống từ 1 – 2 tháng, trong ruột bánh mì sống đƣợc 25 – 30 ngày, trong TP bảo quản lạnh ở nhiệt độ -18oC chúng có thể sống đƣợc vài tháng. Tuy nhiên chúng lại mẫn cảm với thuốc sát trùng và nhiệt độ, ở 60oC chỉ sống đƣợc trong khoảng 60 phút, ở 70 oC bị chết sau 10 phút, ở nhiệt độ sôi của nƣớc bị chết ngay lập tức. Trong 15 – 20 phút, Salmonella có thể bị chết bởi clorua thủy phân (HgCl2) 1%, formol 0,5%, acid fenic 3%. 2.2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên và độc tố  Cấu trúc kháng nguyên Salmonella có 3 loại kháng nguyên - Kháng nguyên O (kháng nguyên thân): có hơn 60 loại, đƣợc bao phủ bởi bề mặt vi khuẩn tạo thành một lớp không đồng đều, gồm chuỗi lipopolysaccharide – protein trên bề mặt tế bào. Loại kháng nguyên này đƣợc coi là độc tố của vi khuẩn, nó có đặc tính ổn định với nhiệt độ 100oC trong 2 giờ, không bị alcol và acid fenic phá hủy, rất độc, chỉ cần 1/20mg là đủ giết chết một con chuột sau vài giờ. Ngoài ra kháng nguyên này còn có tác dụng ngăn cản bạch huyết cầu đi qua mao mạch làm thay đổi tạm thời sự thẩm thấu của mao quản. - Kháng nguyên H (kháng nguyên tiêm mao): có bản chất là protein, là loại protein không bền nhiệt, bị giết chết ở 70oC hay dƣới tác dụng của cồn 50%. - Kháng nguyên Vi (kháng nguyên bề mặt): là kháng nguyên bao phủ kháng nguyên O và là nơi biểu hiện độc tố, đƣợc cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, nó thƣờng kết hợp với tính chuyên biệt của vật chủ, ức chế sự ngƣng kết của kháng nguyên O khi nó phát triển nhiều, nó bị phá hủy bởi sức nóng trong vòng 120 phút. Kháng nguyên Vi chỉ có ở các kiểu huyết thanh: S. typhi, S. paratyphi, S. dublin.  Độc tố Salmonella sản sinh hai loại độc tố: độc tố ruột gây xung huyết, mụn loét và độc tố thần kinh gây ra các triệu chứng thần kinh. 2.2.5.8. Cơ chế gây bệnh Ngộ độc do Salmonella là loại ngộ độc thƣờng gặp và có thể gây tử vong. Điều kiện cần thiết để gây ngộ độc là TP phải nhiễm với số lƣợng lớn, vi khuẩn vào cơ thể phải phóng ra một lƣợng độc tố lớn, sức đề kháng của cơ thể bị suy giảm. Ngƣời tiêu dùng sử dụng TP bị nhiễm vi khuẩn, từ đó vi khuẩn sẽ vào trong ruột và phát triển làm phá hỏng tế bào niêm mạc ruột sau đó vào máu và tiết ra độc tố gây viêm ruột. Độc tố thấm qua thành ruột vào máu gây nên các triệu chứng liên quan đến dạ dày nhƣ: đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy, sốt cao kéo dài đến vài ngày. Ngoài ra, vi khuẩn Salmonella còn có thể theo hệ thống bạch huyết và tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng máu. 2.2.5.9. Triệu chứng Ngƣời ăn phải TP bị nhiễm Salmonella sau 12 – 24 giờ sẽ bị nôn mửa, đau bụng, nhứt đầu, choáng váng và tiêu chảy. Bên cạnh còn có một số triệu chứng khác nhƣ: sốt nhẹ, nhức mỏi cơ bắp, cơ thể mệt mỏi, triệu chứng này có thể kéo dài từ 2 – 3 ngày. 2.2.5.10. Phòng ngừa Để phòng ngừa ngộ độc do Salmonella gây ra thì chúng ta phải tuân thủ triệt để quy trình vệ sinh TP và cải thiện vệ sinh môi trƣờng trong quá trình chế biến. Phải ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn trong TP bằng cách bảo quản lạnh ở nhiệt độ thích hợp hoặc bằng phƣơng pháp khác. Hình 2.4: Hình dạng vi khuẩn Salmonella nhìn dƣới kính hiển vi 2.3. Giới hạn cho phép của các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm [1] Theo Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT của Bộ Y tế vào ngày 31 tháng 8 năm 2001 thì quy định cho phép giới hạn VSV có mặt trong TP đƣợc tuân theo Bảng 2.1 ở dƣới đây. Bảng 2.1: Giới hạn cho phép vi sinh vật có mặt trong thực phẩm theo, Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT của Bộ Y tế Nhóm TP Giới hạn cho phép (CFU/g hoặc CFU/ml TP) TVKHK COL ECO SAU SAL/25g * Nhóm thịt - Thịt tƣơi, thịt đông lạnh, thịt nghiền, thịt chế biến -Sản phẩm chế biến từ thịt 10 6 0 10 2 10 2 0 3x10 5 50 3 10 0 * Nhóm cá và hải sản - Cá và thủy sản tƣơi sống - Sản phẩm chế biến từ tôm, cá, các loại giáp xác, nhuyễn thể luộc hấp - Thủy sản khô chế biến nhƣ cá khô 10 6 0 10 2 10 2 0 10 5 10 3 10 0 10 6 10 2 10 10 2 0 * Nhóm trứng - Trứng tƣơi, dịch trứng tƣơi đông lạnh - Sản phẩm chế biến từ trứng 10 5 10 2 3 10 0 10 3 10 0 3 0 * Nhóm sữa - Sữa khô, sữa bột - Sữa tƣơi tiệt trùng theo phƣơng pháp pasteur - Sữa tƣơi tiệt trùng theo phƣơng pháp U.H.T - Sản phẩm chế biến từ sữa (bơ, sữa chua, phomat) 5x10 4 10 0 0 0 5x10 4 10 3 0 10 0 0 0 0 10 4 10 0 0 0 * Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ: - Cần xử lý nhiệt trƣớc khi dùng:bột, miến, mì sợi - Dùng trực tiếp, không xử lý nhiệt: bánh bột 10 6 10 3 10 2 10 2 0 10 4 10 3 10 0 * Nhóm nƣớc khoáng và nƣớc giải khác đóng chai - Nƣớc giải khác có cồn - Nƣớc giải khác không cồn - Nƣớc khoáng đóng chai 10 0 0 0 0 10 2 0 0 0 Theo GMP 0 0 0 0 * Nhóm gia vị 104 102 3 102 0 * Nhóm nƣớc chấm - Nguồn động vật:nƣớc mắn - Nguồn thực vật 10 4 10 2 0 3 0 10 4 10 2 0 3 0 * Kem, nƣớc đá 5x104 10 0 3 0 * Nhóm đồ hộp 0 0 0 0 0 * Nhóm dầu mỡ 103 10 3 0 0 Ghi chú: TVKHK: tổng vi khuẩn hiếu khí; ECO: E. coli; SAU:Stphylococcus aureus; SAL: Salmonella; COL: Coliforms; G.M.P.: Good Manufacturing Practice: quy phạm sản xuất GMP 2.4. Các con đƣờng vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm [14] Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm theo 4 con đƣờng: + Do môi trƣờng không đảm bảo vệ sinh, VSV từ đất, nƣớc bẩn, không khí, dụng cụ và các vật dụng khác nhiễm vào TP. + Do thiếu vệ sinh trong quá trình chế biến, TP đƣợc nấu không chín kỹ, ăn thức ăn sống. + Do bảo quản TP không hợp vệ sinh, không che đậy để côn trùng vật nuôi… tiếp xúc vào TP mang theo vi khuẩn gây bệnh. + Do bản thân TP, gia súc, gia cầm bị bệnh từ trƣớc khi giết mổ vì vậy thịt của chúng mang các vi trùng gây bệnh hoặc trong quá trình giết mổ, vận chuyển, bảo quản chế biến, TP đã bị nhiễm vi khuẩn và các hoá chất độc hại khác. 2.5. Tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm 2.5.1. Tình hình ngoài nƣớc [17], [23] Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) lƣơng thực TP chính là nguyên nhân đã gây ra khoảng 50% các trƣờng hợp tử vong đối với con ngƣời trên toàn thế giới hiện nay, ngay đối với các nƣớc phát triển việc ngộ độc TP luôn luôn là vấn đề bức xúc và hết sức gây cấn. - Ở Nhật Bản, trung bình hàng năm có tới 2000 vụ ngộ độc với hơn 50.000 ngƣời bị ngộ độc cấp tính do lƣơng thực, TP gây ra. Tháng 7 năm 1996, tại Thành phố Osaka (Nhật Bản), một biến cố quan trọng về ngộ độc TP do vi khuẩn E. coli gây nên đã làm trên 8000 ngƣời bị bệnh, đa số là trẻ em học sinh. - Ở Mỹ, mỗi năm có tới hàng chục triệu ngƣời bị ngộ độc do lƣơng thực, TP gây ra. - Tháng 9 năm 2006 vừa qua một biến cố ngộ độc do ăn rau Spinach nhiễm vi khuẩn E. coli đã làm trên 100 ngƣời ngã bệnh và có một ngƣời chết tại Mỹ. - Tháng 5 năm 2000, thành phố WalKerton, Ontario Canada đã chấn động lên sau khi có trên 2000 cƣ dân bất thình lình ngã bệnh, đau bụng, tiêu chảy và nôn mửa, trong đó có 7 ngƣời tử vong. Sau khi ngƣời ta tiến hành kiểm tra thì phát hiện có sự hiện hiện E. coli trong nguồn nƣớc của thành phố. - Năm 1999, thành phố LaBaie, tỉnh bang Quebec Canada cũng đã ghi nhận một vụ ngộ độc tƣơng tự. Có tất cả 11 ngƣời đã mắc bệnh và một em bé tử vong vì ăn thịt bò xay mà ngƣời ta hay gọi là hamburger. - Trƣớc đó 1 năm, tại một số tiểu bang phía Tây Hoa Kỳ cũng đã xảy ra một vụ ngộ độc TP do E. coli nhiễm vào trong nƣớc pomme (applejuice) không đƣợc hấp tiệt trùng trƣớc khi bán ra ngoài. - Theo Trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa dịch bệnh Mỹ (CDC), hằng năm tại Mỹ có khoảng 20.000 ngƣời bị bệnh hamburger và trong số này có 500 ngƣời tử vong. Cơ quan Y tế của chính phủ Canada cũng ƣớc đoán mỗi năm có tới một triệu ca ngộ độc TP các loại đã xảy ra. 2.5.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm trong nƣớc [12], [15], [24] Theo Cục quản lý chất lƣợng ATVSTP, trong năm 2004 số vụ ngộ độc, số mắc và số vụ ngộ độc hàng loạt đều giảm đáng kể so với cùng kỳ năm 2003. Nguyên nhân thƣờng gặp hơn cả là do ăn phải TP bị nhiễm VSV chiếm 55% và TP nhiễm độc chiếm 22,8%. Cũng theo số liệu từ Cục ATVSTP-Bộ Y tế, trong 5 năm (2001 – 2005) cả nƣớc xảy ra gần 1000 vụ với hơn 23.000 ngƣời bị ngộ độc TP, trong đó có hơn 200 ngƣời chết. Năm 2005, xảy ra 150 vụ với hơn 4.300 ngƣời bị ngộ độc TP, làm chết hơn 50 ngƣời, tỷ lệ tử vong 2005 đƣợc xác nhận là tăng 90% so với năm 2004. Tuy nhiên đây là những số liệu thống kê chƣa đầy đủ. Riêng thành phố Hồ Chí Minh trong năm 2005 có 27 vụ ngộ độc với hơn 1536 ngƣời mắc, trong đó có 4 trƣờng hợp tử vong, chiếm một tử lệ khá cao về ngộ độc TP của cả nƣớc. Bảng 2.2: Số vụ mắc, ngộ độc và tử vong trong năm 2003 – 2004 Năm 2004 Năm 2003 Số vụ ngộ độc 145 238 Số ngƣời mắc 3584 6428 Số ngƣời tử vong 41 37 Số vụ ngộ độc TP hàng loạt (nhiều hơn 30 ngƣời) 29 42 Nguyên nhân ngộ độc thực phẩm Vi sinh vật 55,8% 49,2% Hoá chất 13,2% 19,3% Thực phẩm độc 22,8% 21,4% Không rõ nguyên nhân 8,2% 10,1% (Theo nguồn số liệu: Cục quản lý chất lượng ATVSTP) Tính từ 01/01/2007 đến 31/05/2007, số vụ ngộ độc so với 2003 – 2004 có giảm hơn nhiều. Bảng 2.3: Số vụ mắc, ngộ độc và tử vong trong năm 2006 – 2007 Năm 2007 Cùng kỳ 2006 Số vụ ngộ độc 89 68 Số ngƣời mắc 2337 2197 Số ngƣời tử vong 24 34 Nguyên nhân ngộ độc thực phẩm Vi sinh vật 35,9% 35,3% Hoá chất 4,5% 20,5% Thực phẩm độc 31,5% 22,1% Không rõ nguyên nhân 28,1% 22,1% Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Địa điểm và thời gian thực hiện 3.1.1. Địa điểm: Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Kiểm nghiệm, Chi Cục Tiêu Chuẩn – Đo lƣờng – Chất lƣợng – tỉnh Bình Thuận. 3.1.2. Thời gian: Thời gian thực hiện từ 4/2007 đến 7/2007. 3.2. Vật liệu – thiết bị 3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu 3.2.1.1. Trang thiết bị Micropipet 0.1 – 1 ml Nồi hấp Tủ cấy Tủ ủ các loại Cân điện tử Bể điều nhiệt Máy khuấy từ không gia nhiệt 3.2.1.2. Dụng cụ Đĩa petri Ống nghiệm Cốc thuỷ tinh Các loại chai đựng môi trƣờng Các loại ống đong Đầu típ Các loại que cấy: que cấy thẳng, cấy vòng, cấy trang Bao PE vô trùng Tất cả các loại dụng cụ này đều phải đƣợc hấp khử trùng trƣớc khi sử dụng. 3.2.2. Các loại môi trƣờng và hoá chất dùng trong nghiên cứu 3.2.2.1. Các loại môi trƣờng dùng trong nuôi cấy và phân lập  Saline Peptone Water (SPW) Đây là môi trƣờng dùng để pha loãng VSV trong quá trình định lƣợng. Tiến hành pha chế trong cốc thuỷ tinh, khuấy cho tan và phân phối vào mỗi ống nghiệm 9ml, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 1g NaCl 8,5g Nƣớc cất 1000ml  Plate Count Agar (PCA) Đây là môi trƣờng thạch dùng để định lƣợng tổng sinh vật hiếu khí, tiến hành pha trong chai, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, sau đó lắc đều. Thành phần gồm: Peptone 5,0g Cao nấm men 2,5g Glucose 1g Agar 14g Nƣớc cất 1000ml  Trypton Soya Agar (TSA) Đây là môi trƣờng thạch không chọn lọc đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, trƣớc khi hấp khử trùng phải đun để tan hết agar. Thành phần gồm: Trypticase peptone 15g Phytone peptone 5g NaCl 5g Agar 15g Nƣớc cất 1000ml  Violet Red Bile Agar (VRBA) Môi trƣờng này đƣợc dùng trong qui trình định lƣợng Coliforms tổng số. Đây là môi trƣờng thạch đĩa nhƣng không đƣợc hấp khử trùng. Vì vậy, phải đong trƣớc một thể tích xác định nƣớc cất vào chai, hấp ở 121oC trong 15phút. Sau đó, tiếp tục cân môi trƣờng khô vào và đun tan. Tất cả các thao tác này phải đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm: Cao nấm men 3g Peptone 7g NaCl 5g Muối mật 1,5g Lactose 10g Neutral red 0,03g Crystal violet 0,002g Agar 18g Nƣớc cất 1000ml  Brilliant Green Bile Lactose (BGBL) Đây là môi trƣờng lỏng nên đƣợc pha trong cốc thuỷ tinh, khuấy cho tan, sau đó bơm phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm rồi cho ống Durham ngƣợc vào, đậy nút bông, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi hấp xong quan sát xem các ống có sinh hơi không, nếu thấy sinh hơi thì không sử dụng. Thành phần gồm: Peptone 10g Lactose 10g Mật bò 20g Brilliant green 0,0133g Nƣớc cất 1000ml  Eosin Methyl Blue (EMB) Đây là môi trƣờng thạch dùng để phân lập E. coli và môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội ở 45oC rồi đỗ đĩa. EMB là môi trƣờng rất dễ bị nhiễm mốc, do đó phải đƣợc pha trƣớc một ngày. Thành phần gồm: Peptone 10g Lactose 5g Sucrose 5g K2PO4 (dikali phosphat) 2g Eosin 0,4g Methyl blue 0,065g Agar 13,5g Nƣớc cất 1000ml  Baird Parker Agar (BPA) Đây là môi trƣờng dùng để phân lập Staphylococcus aureus. Môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi hấp xong thì giữ ấm ở 45oC rồi bổ sung thêm EY (Egg yorlk tellurite), trộn đều tránh tạo bọt khí, đổ đĩa, phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm: Tryptone 10g Cao thịt 5g Cao nấm men 1g Sodium pyruvate 10g Glycine 10g Lithium chloride.6H2O 5g Agar 15g Egg yorlk tellurite 50ml Nƣớc cất 1000ml  Buffered Peptone Water (BPW) Đây là môi trƣờng tiền tăng sinh Salmonella, đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 10g NaCl 5g Na2HPO4.12H2O 9g KH2PO4 1,5g Nƣớc cất 1000ml  Rappaport Vassiliadis Soy Peptone (RV) Đây là môi trƣờng dùng để tăng sinh chọn lọc Salmonella, đƣợc hấp khử trùng ở 115oC trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 4,5g MgCl2.6H2O 28,6g NaCl 7,2g K2HPO4 0,18g KH2PO4 1,26g Malachite green oxalate 0,036g Nƣớc cất 1000ml  Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Đây là môi trƣờng thạch dùng để phân lập Salmonella, môi trƣờng này không đƣợc hấp khử trùng, do đó phải đong trƣớc một thể tích xác định nƣớc cất vào chai, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó, cân môi trƣờng khô vào, đun tan đổ đĩa, tất cả các thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm: Cao nấm men 3g NaCl 5g D(+)xylose 3,5g Lactose 7,5g Sucrose 7,5g L(+)lysine 5,0g Sodium desoxycholate 2,5g Sodium thiosulphate 6,8g Ammonium iron citrate 0,8g Phenol red 0,08g Agar 13,5g Nƣớc cất 1000ml 3.2.2.2. Môi trƣờng dùng để thử sinh hoá  Simmons Citrate Đây là môi trƣờng thạch nghiêng nên phải đƣợc pha trong cốc, đun cho tan hết agar, phân phối vào mỗi ống nghiệm khoảng 7ml, đậy nắp, hấp ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm: Sodium citrate 2g NaCl 5g K2HPO4 41g NH4H2PO4 41g MgSO4 0,2g Bromothymol blue 0,08g Agar 15g Nƣớc cất 1000ml  Huyết tƣơng tƣơi đông lạnh  Urea Broth Đây là môi trƣờng không đƣợc hấp khử trùng, nƣớc cất phải đong một thể tích chính xác vào chai, hấp ở 121oC trong 15 phút. Sau đó, cân môi trƣờng vào lắc cho tan hết, lọc qua màng lọc rồi phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm: Urea 20g Cao nấm men 0,1g Na2HPO4 49,5g K2HPO4 49,1g Phenol red 0,01g Nƣớc cất 1000ml  Canh Manitol Phenol Red Đây là môi tr