Khảo sát sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces sp trên môi trường cám gạo, rỉ đường và một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ SINH TRƢỞNG CỦA SACCHAROMYCES SP. TRÊN MÔI TRƢỜNG CÁM GẠO, RỈ ĐƢỜNG VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỨC SỐNG CỦA CHÚNG TRONG CHẾ PHẨM Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: VƢƠNG THỊ HỒNG VI Thành Phố Hồ Chí Minh -09/2007- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ SINH TRƢỞNG CỦA SACCHAROMYCES SP. TRÊN MÔI TRƢỜNG CÁM GẠO, RỈ ĐƢỜNG VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỨC SỐNG CỦA CHÚNG TRONG CHẾ PHẨM Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI VƢƠNG THỊ HỒNG VI Thành Phố Hồ Chí Minh -09/2007- LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng. Em xin chân thành cảm ơn Ts. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Ts. Lê Anh Phụng, BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Phòng Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi – Thú Y đã cho phép và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại phòng. Tôi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 29, Thú Y 28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sinh viên thực hiện Vƣơng Thị Hồng Vi TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trƣờng cám gạo, rỉ đƣờng và một số yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm” đƣợc tiến hành tại phòng Thực Tập Vi Sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM, thời gian từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007. Đề tài đƣợc thực hiện với mục đích tìm hiểu một số điều kiện trong quy trình sản xuất sinh khối của nấm men Saccharomyces sp. nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho gia súc, gia cầm. Kết quả chúng tôi ghi nhận đƣợc: Chúng tôi phân lập đƣợc từ dịch quả nho chủng nấm men thuộc loài S. cerevisiae và từ chế phẩm sinh học chủng nấm men thuộc loài S. boulardii. Cả 2 chủng đều có khả năng sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B và môi trƣờng cám gạo. Tuy nhiên, môi trƣờng cám gạo thích hợp cho sự sinh trƣởng của loài S. boulardii hơn môi trƣờng rỉ đƣờng 60B. Thu hoạch S. boulardii vào thời điểm 60 giờ sau khi nuôi cấy sẽ cho kết quả số lƣợng tế bào còn sống trong chế phẩm nhiều hơn ở 36 giờ và 48 giờ. Ngƣợc lại, loài S. cerevisiae sinh trƣởng trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B mạnh hơn trên môi trƣờng cám gạo. Và thời điểm thu hoạch S. cerevisiae thích hợp nhất là 36 giờ sau khi nuôi cấy. Vitamin C và chất nền (cám gạo, bột mì) không ảnh hƣởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm (sau 22 ngày sản xuất). Việc nuôi cấy chung vi khuẩn sB. subtilis không ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào nấm men S. cerevisiae. ABSTRACT The study on the growth of Saccharomyces sp. on rice bran medium, sugar cane molasses medium and some factors influence on their vitality power for the purpose of producing probiotic. Our topic is done from March to August, 2007 at Microbiology - Infectious Diseases Department, Husbandry and Veterinary Faculty, Nong Lam University, Ho Chi Minh city. S. boulardii was isolated from probiotic and S. cerevisiae was isolated from grapes. They grew well both on rice bran medium and sugar cane molasses medium. Experimental results showed S. boulardii grew better on rice bran than on sugar cane molasses medium. The best time for harvesting S. boulardii biomass was 60 hours after culturing. But, S. cerevisiae grew better on sugar cane molasses medium and the best time for harvesting their biomass was 36 hours after culturing. The rate acid ascorbic and background substance (wheat flour or rice bran) didn’t show the influence to yeast vitality. No considerable oscillations of S. cerevisiae biomass occurred in co-culture with Bacillus subtilis. MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Abstract v Mục lục vi Danh sách các hình ix Danh sách các bảng x Chƣơng 1. PHẦN MỞ ĐẦU ....................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2. Mục đích đề tài .................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu đề tài ...................................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3 2.1. Đặc điểm chung của nấm men ............................................................................. 3 2.2. Vai trò của nấm men ............................................................................................ 4 2.3. Các hình thức sinh sản của nấm men .................................................................. 5 2.3.1. Sinh sản vô tính ......................................................................................... 5 2.3.1.1. Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi .......................................... 5 2.3.1.2. Sinh sản vô tính bằng hình thức phân chia tế bào .............................. 5 2.3.2. Sinh sản hữu tính ....................................................................................... 6 2.3.2.1. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospore) ................................... 6 2.3.2.2. Sinh sản hữu tính bằng bào tử bắn (ballistospore) ............................. 6 2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men ............................................................ 7 2.5. Đặc điểm của giống Saccharomyces ................................................................... 9 2.5.1. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 10 2.5.2. Saccharomyces boulardii ........................................................................ 10 2.6. Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men ........................................................ 11 2.6.1. Giai đoạn thích nghi ................................................................................ 11 2.6.2. Giai đoạn logarit ...................................................................................... 11 2.6.3. Giai đoạn ổn định .................................................................................... 12 2.6.4. Giai đoạn thoái hóa ................................................................................. 12 2.7. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào .................................................................................... 12 2.7.1. Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................ 12 2.7.2. Nhiệt độ ................................................................................................... 14 2.7.3. pH của môi trƣờng .................................................................................. 14 2.7.4. Tốc độ sục khí và khuấy trộn .................................................................. 14 2.8. Cơ sở của việc sử dụng nấm men trong sản xuất và chế biến thức ăn .............. 15 2.9. Những nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi .............................. 18 2.9.1. Ở nƣớc ngoài ........................................................................................... 18 2.9.2. Ở trong nƣớc ........................................................................................... 19 Chƣơng 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 21 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .............................................................. 21 3.1.1. Thời gian ................................................................................................. 21 3.1.2. Địa điểm .................................................................................................. 21 3.2. Vật liệu thí nghiệm ............................................................................................ 21 3.2.1. Mẫu khảo sát ........................................................................................... 21 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 21 3.2.3. Hóa chất .................................................................................................. 21 3.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................ 21 3.3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 22 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................... 22 3.4.1. Phân lập nấm men ................................................................................... 22 3.4.1.1. Mẫu chế phẩm sinh học và men bánh mì ......................................... 22 3.4.1.2. Mẫu đu đủ và nho ............................................................................. 22 3.4.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập đƣợc trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B .......................................................................... 23 3.4.2.1. Mục đích ........................................................................................... 23 3.4.2.2. Thông số cố định .............................................................................. 23 3.4.2.3. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................... 23 3.4.2.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 23 3.4.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces ............. 24 3.4.3.1. Mục đích ........................................................................................... 24 3.4.3.2. Thông số cố định .............................................................................. 24 3.4.3.3. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................... 24 3.4.3.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 25 3.4.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên thời gian sống của nấm men trong chế phẩm .......................... 25 3.4.4.1. Mục đích ........................................................................................... 25 3.4.4.2. Thông số cố định .............................................................................. 25 3.4.4.3. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................... 26 3.4.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm ... 26 3.4.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung .................................................................................................. 26 3.4.6.1. Mục đích ........................................................................................... 26 3.4.6.2. Thông số cố định .............................................................................. 26 3.4.6.3. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................... 27 3.4.6.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 27 3.4.7. Phƣơng pháp đếm số tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu ......... 27 3.4.8. Phƣơng pháp đếm số tế bào sống ( số khuẩn lạc trên đĩa thạch) ............ 28 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 30 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự sinh trƣởng của các chủng đã phân lập trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B ........................................................................................... 30 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces .................................... 33 4.2.1. Saccharomyces boulardii ........................................................................ 33 4.2.2. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 35 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên sức sống của nấm men trong chế phẩm ................................................ 37 4.3.1. Saccharomyces boulardii ........................................................................ 38 4.3.2. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 38 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm .............................. 39 4.4.1. Saccharomyces boulardii ........................................................................ 39 4.4.2. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 42 4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung .......................................................................................................... 43 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 47 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 47 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 49 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 51 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 4.1: Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học Ultra Levure 31 Hình 4.2: Phân lập nấm men từ dịch quả nho 31 Hình 4.3: Hình thái S. boulardii 32 Hình 4.4: Hình thái S. cerevisiae 32 Hình 7.1: Bình nuôi cấy nấm men 51 Hình 7.2: Khuẩn lạc Saccharomyces sp. trên môi trƣờng Sabouraud 51 Hình 7.3: Chế phẩm sinh học chứa nấm men Saccharomyces 51 DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Thành phần hoá học của nấm men 17 Bảng 2.2: Thành phần acid amin của nấm men 17 Bảng 2.3: Thành phần khoáng của nấm men 18 Bảng 2.4: Thành phần vitamin của nấm men 18 Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy 30 Bảng 4.2: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy 33 Bảng 4.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 34 Bảng 4.4: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 35 Bảng 4.5: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 36 Bảng 4.6: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 38 Bảng 4.7: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 38 Bảng 4.8: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 41 Bảng 4.9: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 41 Bảng 4.10: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 43 Bảng 4.11: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 44 Bảng 7.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy 48 Bảng 7.2: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy 48 Bảng 7.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 48 Bảng 7.4: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 49 Bảng 7.5: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 49 Bảng 7.6: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 50 Bảng 7.7: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 50 Bảng 7.8: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 51 Bảng 7.9: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 51 Bảng ANOVA 7.1 51 Bảng ANOVA 7.2 51 Bảng ANOVA 7.3 52 Bảng ANOVA 7.4 52 Bảng ANOVA 7.5 52 Bảng ANOVA 7.6 52 Bảng ANOVA 7.7 52 Bảng ANOVA 7.8 53 Bảng ANOVA 7.9 53 Bảng ANOVA 7.10 53 Bảng ANOVA 7.11 53 1 Chƣơng 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong giới vi sinh vật, khi nhắc đến những ứng dụng của nấm men trong chế biến thực phẩm thì Saccharomyces đƣợc xem là một trong những ứng cử viên sáng giá nhất. Từ rất lâu, chúng đã đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm cho ngƣời nhƣ lên men rƣợu, bia, sản xuất men bánh mì, nƣớc giải khát có cồn… Và trong vài thập kỷ gần đây nó đã đƣợc sử dụng nhiều cho chăn nuôi nhƣ chế biến thức ăn giàu tinh bột từ các phế phụ phẩm công nông nghiệp, sản xuất sinh khối giàu protein và vitamin từ các nguồn nguyên liệu phong phú, rẻ tiền hoặc sử dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học dùng làm thức ăn bổ sung cho vật nuôi. Việc nghiên cứu sản xuất ở qui mô nhỏ và vừa các chế phẩm sinh học từ nấm men giúp phòng bệnh và kích thích sinh trƣởng cho gia súc, gia cầm phù hợp với thực tiễn nƣớc ta đã và đang đƣợc triển khai nghiên cứu ứng dụng. Với xu hƣớng đó, việc nghiên cứu khả năng sinh trƣởng và phát triển giống nấm men Saccharomyces trên các loại môi trƣờng khác nhau nhằm thu đƣợc lƣợng sinh khối cao với chi phí nuôi cấy thấp là công việc quan trọng và cần thiết. Tuy nhiên, chúng ta cũng cần quan tâm đến thời gian thu hoạch và phƣơng pháp bảo quản khả năng sống của chúng trong chế phẩm. Sở dĩ Saccharomyces đƣợc sử dụng phổ biến để bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi vì chúng thuộc loại nấm đơn bào, chứa nguồn protein phong phú, hàm lƣợng vitamin cao (đặc biệt là vitamin nhóm B) mà thời gian chúng sinh sản nhanh lại dễ nuôi cấy và thu hoạch. Đƣợc sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và sự giúp đỡ của Khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh cùng với sự hƣớng dẫn tận tình của Ts. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài 2 “Khảo sát sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trƣờng cám gạo, rỉ đƣờng và một số yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm”. 1.2. Mục đích đề tài Tìm hiểu một số điều kiện trong quy trình sản xuất sinh khối nấm men Saccharomyces sp. nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho gia súc, gia cầm. 1.3. Yêu cầu đề tài Phân lập các chủng nấm men từ 4 nguồn mẫu chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ và nho. Đánh giá khả năng sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trƣờng cám gạo và môi trƣờng rỉ đƣờng mía. Khảo sát, tìm hiểu thời gian thích hợp để thu hoạch nấm men. Đánh giá ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền (cám gạo, bột mì) lên sức sống của Saccharomyces sp. trong chế phẩm. Đánh giá ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1. Đặc điểm chung của nấm men Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sống riêng lẻ hoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính chủ yếu bằng hình thức nảy chồi. Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên nhƣ trong đất, nƣớc, lƣơng thực thực phẩm…, đặc biệt có nhiều trong các loại hoa quả chín, ngọt. Hình dạng và kích thƣớc nấm men thay đổi tùy theo loài, giống, điều kiện dinh dƣỡng và nhiều yếu tố khác. Nấm men thƣờng có dạng hình trứng, hình bầu dục (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus…), hình tròn (Candida utilis), hình ống dài (Pichia), hình quả dƣa chuột (Saccharomyces pastorianus), hình một đầu nhọn (Brettanomyces), hình tam giác (Trigonopsis) và một số hình đặc biệt khác. Một số nấm men có tế bào hình dài, nối tiếp nhau thành những dạng sợi gọi là khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium). Ở khuẩn ty giả, các tế bào không nối liền nhau một cách chặt chẽ nhƣ ở khuẩn ty. Khuẩn ty và khuẩn ty giả thƣờng quan sát thấy ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon…, nhiều loài nấm chỉ sinh khuẩn ty giả khi không đƣợc cung cấp đủ oxy. Hình dạng nấm men không ổn định, nó còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh. Ví dụ, Saccharomyces thƣờng có hình bầu dục trong môi trƣờng nuôi cấy giàu dinh dƣỡng. Trong điều kiện yếm khí thƣờng có hình tròn, trong điều kiện hiếu khí tế bào có hình dài hơn. Kích thƣớc tế bào nấm men thay đổi rất nhiều tùy theo giống, loài và từng giai đoạn phát triển. Nhìn chung, tế bào nấm men to hơn tế bào vi khuẩn một cách 4 rõ rệt, kích thƣớc trung bình 3 – 5 * 10 – 12 µm. Kích thƣớc chiều ngang tế bào nấm men giống Torulopsis là 5 – 8 µm, ở một số loại men rƣợu là 10 – 11 µm, men bia là 6 – 8 µm, nấm men gia súc thƣờng nhỏ hơn. Để quan sát hình thái và đo kích thƣớc tế bào nấm men, ngƣời ta thƣờng sử dụng môi trƣờng mạch nha dịch thể với nồng độ đƣờng khoảng 10 – 150B (độ Baumé, đơn vị thƣờng sử dụng để tính hàm lƣợng đƣờng) hoặc môi trƣờng thạch mạch nha, thời gian nuôi cấy là 3 ngày ở 25 – 300C. Nấm men là sinh vật có nhân thật, cấu tạo tế bào có màng tế bào, nguyên sinh chất, nhân, ty thể, ribosome, không bào, một số thể vùi (glycogen, lipit, volutin…). 2.2. Vai trò của nấm men Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng rất giàu protein, lipid và vitamin (đặc biệt là vitamin B). Chúng có khả năng lên men các loại đƣờng để tạo thành rƣợu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng có khả năng tăng nhanh lƣợng sinh khối tế bào. Trong quá trình trao đổi chất của hầu hết giống nấm men đều không sinh ra chất độc gây hại cho sức khoẻ của ngƣời và vật nuôi nên chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm nhƣ sản xuất rƣợu, bia, nƣớc giải khát có cồn, làm men bánh mì, chế biến các thực phẩm sữa lên men kefir, johur … cho ngƣời và thức ăn gia súc. Ngƣời ta còn sử dụng nấm men để sản xuất protein đơn bào, sản xuất vitamin, enzyme… và đặc biệt loài Saccharomyces cerevisiae đang đƣợc sử dụng nhƣ một công cụ đắc lực để mang các DNA tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của ngành công nghệ sinh học hiện đại. Tuy nhiên, cũng có một số nấm men gây bệnh cho ngƣời và gia súc nhƣ Candida albican, Cryptoccocus neoforman… và gây hƣ hỏng thực phẩm nhƣ Endomycopsis fiibuligera, Saccharomyces bisporus… 5 2.3. Các hình thức sinh sản của nấm men Nấm men sinh sản dƣới 2 hình thức sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. 2.3.1. Sinh sản vô tính 2.3.1.1. Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi Ở một giai đoạn nhất định nào đó, trên tế bào mẹ xuất hiện chồi và sau đó phát triển thành tế bào con. Tế bào con lớn dần, khi đã đạt đến kích thƣớc của tế bào mẹ thì nhờ sự chuyển động của chất lỏng trong môi trƣờng, nó tách khỏi tế bào mẹ. Trƣớc lúc tách ra, giữa 2 tế bào này có mối liên kết bên trong rất khắng khít. Tế bào mẹ và tế bào con khác nhau về phẩm chất, chức năng nên tốc độ sinh sản của chúng cũng không giống nhau. Nhƣng cũng có trƣờng hợp tế bào con không tách khỏi tế bào mẹ mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau ngay cả khi chúng trƣởng thành, do đó tạo thành chuỗi tế bào, gọi là khuẩn ty giả. Hình thức nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất ở nấm men, thƣờng gặp ở giống Saccharomyces, Candida, Torulopsis. 2.3.1.2. Sinh sản vô tính bằng hình thức phân chia tế bào Một số loài phân đôi tế bào tạo thành 2 tế bào con bằng nhau, giống nhƣ ở đa số các vi khuẩn. Lúc đầu chất nhân chia làm 2 phần, sau đó ở phần giữa tế bào xuất hiện vách tế bào, vách này lớn dần lên và chia tế bào mẹ thành 2 tế bào con. Mỗi tế bào con chứa nửa chất nhân và dần dần 2 tế bào tách khỏi nhau thành 2 tế bào độc lập. Hình thức sinh sản này thƣờng gặp ở nấm men có dạng sợi dài nhƣ giống Schizosaccharomyces, Endomyces. 6 2.3.2. Sinh sản hữu tính 2.3.2.1. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospore) Trong quá trình nuôi cấy nấm men chuyển đột ngột từ môi trƣờng giàu sang môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng, trong khi đó vẫn giữ nguyên độ ẩm, tích tụ các hợp chất trung gian, đủ oxy của không khí thì tế bào sẽ sinh bào tử nằm trong các túi, đƣợc gọi là bào tử túi. Bào tử túi bền với tác nhân bên ngoài nhƣ nhiệt độ cao, khô hạn, nhƣng kém bền nhiệt hơn so với bào tử vi khuẩn. Chúng thƣờng chết ở 600C, còn bào tử vi khuẩn chết ở 1200C. Bào tử túi thƣờng đƣợc sinh ra trong những cái túi nhỏ gọi là nang hay túi (ascus) mỗi túi chứa 1 – 8 bào tử túi (ascospore), thƣờng là 1 – 4. Bào tử túi có kích thƣớc và hình dạng khác nhau tùy từng loại nấm men; có thể hình bầu dục, bán cầu, hình thoi… Túi có thể đƣợc sinh ra theo 1 trong 3 phƣơng thức sau: Tiếp hợp đẳng giao (conjugation isogamic): do 2 tế bào nấm men có hình dạng và kích thƣớc giống nhau tiếp hợp với nhau tạo thành. Gặp ở nhiều loài trong giống Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Debaryomyces. Tiếp hợp dị giao (conjugation heterogamic): do 2 tế bào có hình dạng và kích thƣớc không giống nhau tiếp hợp với nhau tạo thành. Gặp ở 1 số loài trong giống Zygopichia, Nadsodia. Sinh sản đơn tính (pathenogenesis): đó là quá trình hình thành bào tử trực tiếp từ 1 tế bào riêng lẻ không thông qua tiếp hợp. Gặp ở nhiều loài trong giống Schiwanniomyces, Pichia. Các bào tử túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm men mới. Tế bào này lại sinh sản theo lối nảy chồi. 2.3.2.2. Sinh sản hữu tính bằng bào tử bắn (ballistospore) Là loại bào tử chỉ thấy ở các loài trong giống Brullera, Spodiobolus, Sporoliomyces, Aessaspora. Sau khi hình thành, bào tử này có thể bắn mạnh ra phía đối diện. 7 2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men Nấm men là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi, chúng hô hấp nhƣ một cơ thể hiếu khí bậc cao, khi môi trƣờng hết oxy phân tử chúng chuyển sang hô hấp kỵ khí, gọi là quá trình lên men. Khi phản ứng lên men bắt đầu phát triển, tốc độ sinh sản của tế bào nấm men bị kìm hãm và đến một giai đoạn nhất định hầu nhƣ không còn nữa. Về cơ chế sinh học, đây là một quá trình sử dụng không hết năng lƣợng những chất dinh dƣỡng của môi trƣờng. Vì quá trình phân hủy 1 phân tử gam đƣờng bằng cách lên men chỉ tiết ra khoảng 28 kcal, trong khi đó nếu oxy hóa hoàn toàn 1 phân tử gam đƣờng ta sẽ có 674 kcal. Quá trình lên men tạm gọi là quá trình phosphoryl hóa. Vì trong khi lên men, các hợp chất ATP, ADP tham gia vào 1 cách tích cực. Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đƣờng hấp thụ chọn lọc trên bề mặt của tế bào và sau đó khuếch tán vào bên trong. Màng và lớp bao bọc nguyên sinh chất của tế bào đóng vai trò màng bán thấm ngăn cách, điều hoà các chất dinh dƣỡng vào tế bào và thải các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài. Các chất dinh dƣỡng sau khi đƣợc hấp thụ vào trong tế bào sẽ xảy ra những phản ứng hóa học để chuyển hóa thành các hợp chất nhƣ protein, glucid, lipid… Dinh dƣỡng cacbon: Trƣớc hết phải kể đến các loại đƣờng, đƣờng glucose đƣợc tất cả các loài nấm men sử dụng. Các loài nấm men dùng sản xuất men gia súc thuộc giống Candida, Torulopsis có thể đồng hóa đƣợc đƣờng pentose. Vì vậy, các men này có thể nuôi cấy ở dịch thủy phân từ gỗ hoặc các nguồn giàu hemicellulose. Những disacarit (maltose và saccarose) trƣớc khi đƣợc nấm men sử dụng phải qua thủy phân sơ bộ thành đƣờng đơn nhờ enzyme tƣơng ứng của nấm men. Nhƣ là một qui luật, trong môi trƣờng có một hỗn hợp các nguồn cacbon dinh dƣỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trƣởng tốt sẽ đƣợc sử dụng trƣớc. Đƣờng glucose và fructose đƣợc sử dụng trƣớc hết, kế tiếp là các acid béo (phụ thuộc vào chủng loài nấm men và thành phần của acid này), những hợp chất có nhiều C trong phân tử đƣợc sử dụng sau cùng. 8 Các acid hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm men. Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trƣởng nấm men. Chúng có thể là nguồn dinh dƣỡng cacbon và năng lƣợng duy nhất. Sử dụng hydrocacbon từ dầu mỏ và khí đốt làm nguồn cacbon nuôi cấy nấm men rất đƣợc quan tâm trong vài thập kỷ gần đây. Trong đó, parafin có thể là nguồn cacbon dinh dƣỡng dễ dàng đối với một số chủng của giống Candida và Torulopsis. Dinh dƣỡng nitơ: Nấm men có khả năng tổng hợp đƣợc tất cả các acid amin, thành phần protein trực tiếp từ các hợp chất đạm vô cơ và cacbon hữu cơ. Đa số nấm men không đồng hóa đƣợc nitrate (trừ giống Hasenula và Pichia). Nguồn nitơ vô cơ đƣợc nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô cơ cũng nhƣ hữu cơ. Đó là amoni sulfate, phosphate rồi đến các muối acetate, lactate, malate… Trong môi trƣờng có muối amoni, đặc biệt là sulfate, thì nấm men sử dụng gốc amoni trƣớc, gốc acid còn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng và sẽ làm môi trƣờng acid hóa, giảm pH. Các nguồn nitơ hữu cơ thƣờng là hỗn hợp các acid amin, peptit, nucleotit… Trong thực tế, ngƣời ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân đậu tƣơng làm nguồn nitơ hữu cơ. nấm men tiêu hóa rất tốt các acid amin, còn peptone kém hơn và hoàn toàn không sử dụng đƣợc protein. Các muối amon đƣợc nấm men sử dụng tốt hơn các acid amin. Trong quá trình nuôi cấy nấm men, các acid amin vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon dinh dƣỡng. Tuy nhiên, nấm men chỉ sử dụng đƣợc acid amin ở dạng L-acid amin. Để thu sinh khối Saccharomyces đƣợc tốt, trong môi trƣờng nuôi cấy nên có mặt cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ. Dinh dƣỡng các nguyên tố vô cơ: Trong các nguyên tố vô cơ sử dụng nuôi cấy nấm men, phospho đƣợc quan tâm trƣớc hết, sau đó là kali, magiê, lƣu huỳnh… Phospho tham gia vào thành phần quan trọng của tế bào (nucleoproteit, acid nucleic, phospholipit…). Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các 9 phản ứng sinh hóa, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocacbon và vận chuyển năng lƣợng. Trong phòng thí nghiệm vi sinh, ngƣời ta thƣờng dùng muối KH2PO4 và K2HPO4 làm nguồn P và K. còn trong sản xuất, thƣờng dùng dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P. Dinh dƣỡng các chất kích thích sinh trƣởng: Để cho nấm men phát triển và lên men đƣợc bình thƣờng cần phải có các vitamin làm cofacto trong nhiều enzyme của tế bào nấm men. Nấm men có thể tổng hợp đƣợc tất cả các vitamin trong chừng mực nào đó, ngoại trừ biotin. Vì vậy, trong môi trƣờng nuôi cấy cần phải bổ sung vitamin này. Những nhân tố sinh trƣởng cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6 vitamin nhóm B: inozit (vit B8), biotin (vit B7), acid pantotenic (vit B3), tiamin (vit B1), pyridoxyn (vit B6), acid nicotinic (vit B5). Trong công nghiệp, thƣờng dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men, nƣớc chiết cám, dịch thủy phân đậu tƣơng, rỉ đƣờng. Trong các thí nghiệm nuôi cấy ở qui mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, rau cải, cà chua, cà rốt, khoai tây… làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trƣờng. 2.5. Đặc điểm của giống Saccharomyces Một số loài nấm men có khả năng lên men rƣợu và bia lần đầu tiên đã đƣợc Meyen gộp thành 1 giống gọi là Saccharomyces vào năm 1939. Đây là giống có bào tử túi, thƣờng có 1 – 4 bào tử, có khi đến 8 bào tử. Tế bào của chúng có hình cầu, dài, elip..., nảy chồi nhiều phía, không có khuẩn ty, không tạo bào tử bắn, không tạo váng, khuẩn lạc có dạng bột nhão, hơi bóng. Đây là một trong số những giống nấm men đƣợc ứng dụng rộng rãi, phổ biến nhất. 10 2.5.1. Saccharomyces cerevisiae Đƣợc Meyen mô tả vào năm 1938, tế bào có dạng hình trứng, bầu dục…, kích thƣớc trung bình 3 – 6 * 5 – 12 µm, sinh sản bằng hình thức nảy chồi không theo qui luật, có thể xuất hiện từng cái một, từng đôi hoặc một chuỗi. Khuẩn lạc có màu trắng nhạt, rìa tròn, lồi lên, bề mặt sáng lấp lánh, đƣờng kính 1 – 2 mm vào ngày thứ ba. Phát triển tối ƣu ở 33 – 350C trong môi trƣờng chứa 10 – 30% glucose. Nhiệt độ tối thiểu là 40C trong 10% glucose và 130C trong 50% glucose, nhiệt độ tối đa là 38 – 390C (Jermini and Schmidt-Lorenz, 1987, trích từ Lê Nguyễn Bảo Trân, 2005). Có khả năng phát triển ở pH = 1,6 trong HCl; pH = 1,7 trong H3PO4 và pH = 1,8 – 2 trong acid hữu cơ, có sức chịu đựng lớn nhất đối với acid benzoic 100 mg/kg ở pH = 2,5 – 4 và acid sorbic 200 mg/kg ở pH = 4 (Juven et al, 1978, trích từ Lê Nguyễn Bảo Trân, 2005). Có khả năng lên men đƣờng glucose, galactose, maltose, saccharose, rafinose và các dextrin đơn giản, không lên men lactose, manitol, không đồng hóa nitrate, không phân giải tinh bột. Là loài nấm men hay đƣợc sử dụng làm men bánh mì, lên men rƣợu, bia và hiện còn đƣợc sử dụng làm probiotic phục vụ cho chăn nuôi gia súc và nuôi trồng thủy sản nhờ có khả năng chịu đƣợc acid dạ dày và muối mật tốt, đề kháng tự nhiên với kháng sinh. 2.5.2. Saccharomyces boulardii Đƣợc Herry Boulard phát hiện vào năm 1923 trong vỏ trái cây chín, tế bào có dạng hình tròn, bầu dục, kích thƣớc 4 – 6 * 6 – 9 µm, sinh sản bằng hình thức nảy chồi và tạo bào tử túi, hô hấp hiếu khí tùy nghi. Có khả năng lên men đƣờng glucose, saccharose, rafinose, xylose; không lên men lactose, manitol, maltose…, không hình thành hợp chất phân giải tinh bột. 11 Là loài nấm men không mang mầm bệnh, đƣợc sử dụng nhƣ một chất biotherapeutic để ngăn cản bệnh tiêu chảy (Surawicz et al.,1989 and 2000, trích từ Lê Nguyễn Bảo Trân, 2005). Ngoài khả năng giúp cân bằng hệ vi khuẩn đƣờng ruột tƣơng tự vi khuẩn lactic, Saccharomyces boulardii còn có một ƣu điểm vƣợt trội là khả năng đề kháng với kháng sinh và sulfamide (trừ kháng sinh kháng nấm). Có khả năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridium difficile, vi khuẩn gây viêm ruột kết tràng giả cũng nhƣ trung hoà đƣợc nội độc tố của E. coli và Vibrio cholera nên có thể dùng trong dự phòng tiêu chảy cấp tính. 2.6. Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men diễn biến qua 4 giai đoạn. 2.6.1. Giai đoạn thích nghi Là giai đoạn từ lúc cấy nấm men vào môi trƣờng đến lúc chúng bắt đầu sinh sản. Ở giai đoạn này, chúng còn phải thích nghi với điều kiện môi trƣờng mới. Trong giai đoạn này, tế bào nấm men trải qua những biến đổi lớn về hình thái và sinh lý, kích thƣớc tăng lên đáng kể và chúng trở nên nhạy cảm với những tác động bên ngoài. Số lƣợng tế bào nấm men ở giai đoạn này là không tăng hoặc tăng không đáng kể. 2.6.2. Giai đoạn logarit Số lƣợng và sinh khối tế bào trong giai đoạn này tăng theo cấp số nhân. Khả năng thích ứng với những điều kiện không thuận lợi của môi trƣờng ngoài tăng lên rõ rệt, đồng thời xuất hiện chức năng lên men rƣợu. Giai đoạn này thuận tiện để xác định năng lƣợng sinh sản, thời gian nảy chồi, nhƣng không nên đánh giá kích thƣớc của tế bào cũng nhƣ những dấu hiệu khác của khuẩn lạc. Do trong thời kỳ đầu của giai đoạn này, tốc độ sinh sản của tế bào thƣờng nhanh hơn tốc độ tạo thành tế bào chất nên kích thƣớc của tế bào có phần nhỏ đi. 12 2.6.3. Giai đoạn ổn định Số lƣợng tế bào trong giai đoạn này không tăng nữa, có thể là do sự cân bằng giữa số sinh ra và chết đi. Song kích thƣớc tế bào tăng lên rõ rệt. Quá trình lên men rƣợu cũng bắt đầu. 2.6.4. Giai đoạn thoái hóa Số lƣợng tế bào giảm xuống do có hiện tƣợng tiêu hủy. Lƣợng protein và acid nucleic giảm xuống, glycogen và treganose hoàn toàn tiêu biến. Nhƣ vậy có thể thấy số lƣợng tế bào nấm men đạt cao nhất ở giai đoạn logarit, song sinh khối tế bào lại đạt cao nhất ở giai đoạn ổn định vì khối lƣợng tế bào ở giai đoạn này lớn. 2.7. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào 2.7.1. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn hydratcarbon, nguồn nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lƣợng nhƣ K, Na, Mg, Ca và vitamin. Dùng ngũ cốc làm nguồn nguyên liệu sản xuất sinh khối nấm men rất tốt. Bột hoặc tinh bột các loại dùng vào mục đích này trƣớc tiên phải thủy phân bằng acid hoặc enzyme của mầm mạ, của vi sinh vật để biến các polysacarit thành các dạng đƣờng mà nấm men đồng hóa đƣợc. Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trƣờng mà nguồn carbon duy nhất là tinh bột, phát triển dễ hơn trên môi trƣờng đƣờng với nguồn nguyên liệu đƣợc nấu chín thì tốt hơn. Một số giống nấm men phân lập từ men thuốc bắc có khả năng sử dụng cả môi trƣờng đƣờng và môi trƣờng tinh bột hoặc cấy trực tiếp vào thức ăn sống mà vẫn phát triển tốt. Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng cám, số lƣợng nấm men có thể đạt hàng chục triệu tế bào/ml dịch nuôi cấy (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970). 13 Môi trƣờng rỉ đƣờng hoặc dung dịch đƣờng đƣợc acid hóa với pH = 4, bổ sung thành phần dinh dƣỡng và duy trì nhiệt độ 25 – 300C, lƣợng sinh khối thu đƣợc khoảng 25 – 50 g/l (Trần Minh Tâm, 2002, trích từ Nguyễn Thị Hồng Phƣơng, 2006). Theo phòng vi sinh thuộc Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, từ 1 m3 nƣớc bã rƣợu nuôi nấm men có thể thu đƣợc 10 – 15 kg men khô. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu cũng đƣợc sử dụng để nuôi cấy nấm men do trong đậu chứa hàm lƣợng protein cao, là nguồn thức ăn tốt cho nấm men. Ngoài ra, còn có các vitamin A1, B1, B2, C, E, K và các chất kích thích tố tăng trƣởng khác. Tuy nhiên, vitamin C trong nƣớc chiết giá đậu có thể làm hạn chế sự phát triển của nấm men. Ngoài ra, môi trƣờng thủy phân từ cellulose thực vật (gỗ, vỏ bào, rơm rạ, lõi ngô, bã mía…), hay parafin từ dầu mỏ cũng có thể sử dụng để nuôi cấy nấm men. Đặc biệt, nấm men có khả năng sử dụng đƣợc môi trƣờng dịch kiềm sulfit (chất thải của nhà máy giấy), thành phần chủ yếu là đƣờng pentose. Ngƣời ta tính đƣợc rằng, khoảng 5 tấn bột cellulose dùng sản xuất giấy sẽ thải một lƣợng dịch kiềm sulfit chứa khoảng 180 kg đƣờng. Dịch này hấp thụ nhiều oxy nên khi nuôi cấy nấm men có thể giảm mức cung cấp oxy tới 60% so với bình thƣờng (Lƣơng Đức Phẩm, 2006). Hiện nay, môi trƣờng đƣợc sử dụng để nuôi cấy nấm men phổ biến nhất vẫn là môi trƣờng rỉ đƣờng. 90% lƣợng sinh khối nấm men dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi trên thế giới đƣợc sản xuất từ rỉ đƣờng mía và củ cải đƣờng. Thành phần chính của loại nguyên liệu này là saccharose, khoảng 35 – 40%. Trong đƣờng mía chứa các chất sinh trƣởng (biotin, acid pantotenic, inozit) với hàm lƣợng lớn, nhƣng lại nghèo chất khoáng và các acid amin. Vì vậy, khi sử dụng đƣờng mía làm nguồn carbon nuôi cấy nấm men cần phải loại bỏ một phần các chất sinh trƣởng, đồng thời bổ sung các muối khoáng cần thiết và có thể phải thêm hỗn hợp các acid amin dạng protein thủy phân vào giai đoạn nhân giống. Lƣợng đƣờng trong môi trƣờng khoảng 2 – 3%, không nên nhiều hơn hay ít hơn. Nếu lƣợng đƣờng cao sẽ vừa lãng phí và 14 vừa tạo ra những sản phẩm trao đổi chất khác, gây ức chế ngƣợc đến quá trình tạo sinh khối. Nếu lƣợng đƣờng quá nhỏ sẽ không đủ nguồn carbon cần thiết cho sự tạo sinh khối. Một điểm đáng lƣu ý là hệ keo và các chất màu có trong mật rỉ. Hệ keo có trong mật rỉ đƣợc hình thành bởi protein và pectin, nó thƣờng có độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào, gây ra hiện tƣợng thoái hóa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém, dẫn đến hiệu suất sinh khối thu đƣợc thấp. Các chất màu có trong rỉ đƣờng nhƣ hợp chất caramen, melanin…sẽ làm sinh khối nấm men có màu sẫm, ảnh hƣởng đến cảm quan. Vì thế, đặc biệt trong sản xuất men bánh mì ngƣời ta phải xử lý rỉ đƣờng trƣớc khi nuôi cấy. 2.7.2. Nhiệt độ Mỗi vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng và phát triển của chúng. Với Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ƣu là 28 – 300C, trên 43 0C và dƣới 280C thì sự sinh sản của nấm men chậm hoặc ngừng hẳn. Ở 300C, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn S. cerevisiae 2 – 3 lần, ở 35 – 380C chúng phát triển nhanh hơn 6 – 8 lần. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh; còn ở nhiệt độ thấp khoảng 20 – 230C, hạn chế đƣợc mức độ tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài hơn. 2.7.3. pH của môi trƣờng pH tối ƣu cho nấm men khoảng 4,5 – 5,6. Ở pH = 4, tốc độ tích luỹ sinh khối giảm, pH = 3 – 3,5 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại. Mức độ hấp thụ chất dinh dƣỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein đều bị ảnh hƣởng bởi pH nên chất lƣợng của nấm men sẽ giảm đi nếu pH môi trƣờng nằm ngoài khoảng 4,5 – 5,6. 2.7.4. Tốc độ sục khí và khuấy trộn Trong quá trình nuôi cấy, cần giữ cho dịch men liên tục bão hoà oxy hoà tan. Ngừng cung cấp oxy trong 15 giây sẽ gây nên tác động âm trên hoạt động sống của 15 tế bào nấm men. Oxy không khí di chuyển vào tế bào nấm men qua 2 giai đoạn: đầu tiên oxy đƣợc hoà tan vào môi trƣờng nuôi cấy sau đó nấm men mới hấp thụ oxy vào trong tế bào. Về lý thuyết, cần 1,066 kg (0,764 m3) oxy để oxy hóa 1 kg đƣờng, nhƣng thực tế chỉ 1 phần nhỏ oxy bơm vào là đƣợc nấm men sử dụng, phần còn lại bị mất đi do các quá trình tiếp xúc, nhiệt độ, nồng độ, độ nhớt của môi trƣờng (Lao Thị Nga, 1987). Khi nuôi cấy nấm men ở qui mô công nghiệp, kích thƣớc của thiết bị nuôi cấy nấm men là tiền đề cần thiết, ảnh hƣởng gián tiếp lên sự tăng trƣởng của nấm men. 2.8. Cơ sở của việc sử dụng nấm men trong sản xuất và chế biến thức ăn Nấm men có rất nhiều chủng loại khác nhau, đa dạng trong chuyển hóa và tổng hợp các chất hữu cơ, phạm vi phân bố và điều kiện sống nhƣ nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, không khí… rộng nên dễ dàng chọn đƣợc các chủng có khả năng thích hợp với qui trình sản xuất và đáp ứng đƣợc yêu cầu đòi hỏi của thị trƣờng. Có tốc độ phát triển nhanh, để tăng gấp đôi khối lƣợng cơ thể thì nấm men cần 1 – 2 giờ, vi khuẩn từ 20 – 60 phút, tảo từ 2 – 6 giờ, nấm sợi từ 4 – 12 giờ trong khi đó gà con cần 200 giờ, heo con cần 600 giờ, bê, nghé cần 1500 giờ (Nguyễn Lân Dũng, 1992). Có khả năng phát triển trên nhiều nguồn dinh dƣỡng khác nhau cho phép ngƣời ta sử dụng các nguồn dinh dƣỡng sẵn có, rẻ tiền để sản xuất nhằm tăng sản lƣợng và giảm giá thành sản phẩm (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Không nhƣ nấm mốc, hầu hết nấm men không sinh độc tố trong môi trƣờng tự nhiên và môi trƣờng nhân tạo, trừ 1 số loài gây bệnh nhƣ Candida albican (Nguyễn Văn Hƣng, 1990). Ngoài ra, khi lên men nấm men còn tạo mùi thơm đặc trƣng cho rƣợu, bia. 16 Nấm men cũng nhƣ vi sinh vật dễ gây đột biến bằng các tác nhân vật lý, hóa học, do đó có thể dùng kỹ thuật di truyền để biến đổi đặc điểm sinh học của nấm men theo hƣớng có lợi. Giá trị dinh dƣỡng của nấm men rất lớn, đặc biệt là hàm lƣợng protein, acid amin và vitamin nhóm B trong nấm men rất cao, dễ tiêu hóa và hấp thụ Với đặc điểm sinh lý của nấm men dễ dàng thiết lập dây chuyền công nghệ cao để khai thác các sản phẩm từ nấm men nhằm phục vụ nhu cầu thực tiễn. Trong 24 giờ 1 con bò nặng 300 kg đƣợc chăm sóc tốt cũng chỉ tăng trung bình khoảng 1,1 – 1,2 kg, trong đó có khoảng 120 g protein. Nếu lấy 300 kg nấm men giống nuôi trong hệ thống lên men trong 24 giờ thì tạo 25.000 – 30.000 kg sinh khối, trong đó có khoảng 11.000 – 13.000 kg protein. Rõ ràng ta thấy sự tích luỹ protein ở nấm men cao hơn nhiều so với ở heo, bò, gà vài nghìn lần và tƣơng tự gấp vài trăm lần ở cây đậu, ngũ cốc (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970). Trong nấm men có 1 số men tiêu hóa (amylase, protease…) và vitamin (đặc biệt là vitamin B) xúc tiến nhanh quá trình trao đổi chất, kích thích sự thèm ăn của gia súc. Nhờ đó, công tác chăn nuôi thu đƣợc lợi nhuận cao. Tuy nhiên, sinh khối tế bào nấm men có nhƣợc điểm là mặc dù hàm lƣợng protein cao khoảng 55 – 60%, nhƣng đồng thời nó cũng chứa lƣợng acid nucleic quá cao (10%), điều này ảnh hƣởng tới sức khoẻ con ngƣời. Do đó, cần có các biện pháp làm giảm lƣợng acid nucleic này. Ngoài ra, màng tế bào nấm men khá vững chắc nên cần có biện pháp thích hợp để phá vỡ màng khi thu protein. 17 Bảng 2.1: Thành phần hóa học của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970) Bảng 2.2: Thành phần acid amin của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970) Acid amin Tỷ lệ % Acid amin Tỷ lệ % Cystin 0,54 Tryptophan 0,68 Histidin 1,19 Frolin 1,59 Phenylalanin 2,01 Glycin 2,10 Serin 2,20 Arginin 2,33 Threonin 2,50 Tyrosin 2,77 Lysin 3,11 Valin 3,30 Isoleucin 3,70 Leucin 3,80 Acid asparaginic 3,97 Alanin 5,78 Acid glutamic 6,74 Methionin 0,60 Thành phần Tỷ lệ % Protid 44 – 45% Glucid 25 – 35% Lipid 1,5 – 5% Các chất chiết xuất vô đạm 22 – 40% Các chất khóang 6 – 12% 18 Bảng 2.3: Thành phần khóang của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970) Thành phần Tỷ lệ % Thành phần Tỷ lệ % K2O 28 – 48 Fe2O3 0,1 – 7,3 Na2O 0,06 – 1,9 P2O5 41 – 59 CaO 1 – 5,5 SO3 0,4 – 6 MgO 4 – 8,1 SiO2 1,6 Bảng 2.4: Thành phần vitamin của nấm men (mg/kg) Vitamin Hàm lƣợng (mg/kg) Vitamin Hàm lƣợng (mg/kg) D2 (calciferol) 250 B6 (pyridoxyn) 60 B1 (thiamin) 40 B9 (acid folic) 4,2 B2 (riboflavin) 50 H (biotin) 2,0 B5 (nicotinic) 21 – 100 2.9. Những nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi 2.9.1. Ở nƣớc ngoài Đã có nhiều công trình nghiên cứu trƣớc hết về bản chất sinh học, khả năng sinh hóa, phân loại của 1 số giống nấm men đƣợc sử dụng phổ biến trong sản xuất sinh khối tế bào nhƣ Saccharomyces, Torulopsis và Candida (Cainsnorth G et al, 1962, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Những nghiên cứu đầu tiên về sinh vật học trong bánh men rƣợu ở nƣớc ta đƣợc thực hiện vào cuối thế kỷ 19 bởi Calmette và học trò của ông vào 1948. Các nhà khoa học trên thế giới đang hƣớng đến nghiên cứu chọn giống cho quá trình nâng cao công nghệ lên men truyền thống trên môi trƣờng xốp để làm giàu protein cho các sản phẩm giàu tinh bột nhƣ sắn và các phụ phẩm nông nghiệp nhƣ bã dừa, vỏ chuối, bã mía…(Schoch JJ, 1982, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Trƣớc đây, ngƣời ta đã sử dụng nấm sợi để lên men song do vấn đề sinh độc tố 19 mycotoxin làm các nhà chăn nuôi e ngại. Do đó, họ chú ý đến nấm men và 1 số vi khuẩn lên men truyền thống nhƣ vi khuẩn lactic (Rose A.H, 1981, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Chế phẩm ezyme vi sinh vật ngày nay đƣợc sản xuất ở qui mô công nghiệp. các chế phẩm này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi, trong chăn nuôi ezyme đƣợc dùng để sơ chế thức ăn, phân hủy các hợp chất phức tạp, làm tăng khả năng tiêu hóa cho gia súc. Gần đây, hãng dƣợc Biocodex-Montronge (Pháp) cho ra sản phẩm men tiêu hóa có tên Bioflor 250 có chứa 250mg tế bào nấm men S. boulardii dùng để phòng trị tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa. 2.9.2. Ở trong nƣớc Công tác nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi ở nƣớc ta có thể nói đƣợc bắt đầu từ 1960 trở lại đây. Bao gồm các lĩnh vực sản xuất sinh khối tế bào, lên men thức ăn bột đƣờng và sản xuất chế phẩm sinh học. Năm 1975, Trần Đức Trân và Nguyễn Công Xuân đã sử dụng sinh khối nấm men đƣợc sản xuất từ rỉ đƣờng của nhà máy đƣờng Vạn Điểm để chăn nuôi heo với tỷ lệ bổ sung 3 – 4% trong khẩu phần của heo 2 – 5 tháng tuổi đạt kết quả tốt (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Để tạo ra giống nấm men vừa có khả năng đƣờng hóa cao vừa có khả năng tạo sinh khối lớn, Viện Kỹ Thuật Sinh Học thuộc Trung Tâm Khoa Học và Công Nghệ Quốc Gia Việt Nam đã nghiên cứu cấy chuyển gen amylase đƣợc tách từ chủng Endomycopsis fibuligera và gây biến nạp cho Saccharomyces cerevisiae làm cho nó có 2 đặc tính đƣờng hóa cao và sinh tổng hợp protein cao dùng trong chế biến thức ăn (Trƣơng Nam Hải, 1994, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Hiện nay, các nhà chăn nuôi khá quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm sinh học bổ sung vào khẩu phần thức ăn cho gia súc, gia cầm. Đặc trƣng của các chế phẩm sinh học này là sự kết hợp của nhiều chủng loại vi sinh vật có ích nhƣ 20 Bacillus. spp, Lactobacillus. spp, Saccharomyces. spp, các enzyme amylase, protease… 21 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 03 đến tháng 08 năm 2007. 3.1.2. Địa điểm Phòng thực tập vi sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Mẫu khảo sát Chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho. 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ sấy, nồi hấp khử trùng autoclave, tủ lạnh, kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu, máy li tâm, máy sục khí, micropipette… Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đũa khuấy, bình tam giác, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm, lame, lamelle, giấy đo pH… 3.2.3. Hóa chất Hóa chất dùng trong phân lập và nuôi cấy nấm men nhƣ cồn 960, nƣớc cất, agar, KH2PO4, MgSO4, K2HPO4, (NH4)2PO4. 3.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng phân lập và giữ giống nấm men là môi trƣờng Sabouraud. 22 Môi trƣờng khảo sát nuôi cấy là môi trƣờng cám gạo, môi trƣờng rỉ đƣờng mía, môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu. 3.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho. Khảo sát sự phát triển của các chủng đƣợc phân lập từ 4 mẫu trên trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B. Khảo sát sự phát triển của nấm men trong các loại môi trƣờng nuôi cấy khác nhau. Khảo sát thời gian thu nhận sinh khối nấm men trong các loại môi trƣờng trên. Khảo sát sự phối hợp nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trƣờng cám gạo và môi trƣờng rỉ đƣờng mía. 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Phân lập nấm men 3.4.1.1. Mẫu chế phẩm sinh