Khảo sát sự tác động của IAA, NAA lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007 Sinh viên thực hiện: CAO THỊ THANH LOAN Thành phố Hồ Chí Minh 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. TRẦN THỊ LỆ MINH CAO THỊ THANH LOAN ThS. NGUYỄN VĂN CƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh 2007 iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Trần Thị Lệ Minh và Th.S Nguyễn Văn Cƣờng đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Phan Phƣớc Hiền và các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM. - KS. Trần Ngọc Hùng cùng các anh chị thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Nông Lâm Tp.HCM. - Bạn Hoàng Thị Thu cùng toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tháng 08 năm 2007 Cao Thị Thanh Loan iv TÓM TẮT CAO THỊ THANH LOAN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA HORMONE TĂNG TRƢỞNG AUXIN LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO” Hội đồng hướng dẫn: TS. Trần Thị Lệ Minh Th.S Nguyễn Văn Cường Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học và Trung tâm phân tích thí nghiệm trường Đại học Nông lâm Tp.HCM trên đối tượng cây Trường xuân hoa. Tiến hành tạo cây Trường xuân hoa in vitro từ chồi cây Trường xuân hoa trồng trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ Sinh học. Khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA được theo dõi ở các giai đoạn 7, 14, 21, 28, 35 ngày. Bên cạnh đó thay đổi nồng độ NAA, IAA sử dụng nhằm chọn loại chất kích thích tăng trưởng thích hợp thông qua các chỉ tiêu theo dõi như chiều cao cây, số rễ và chiều dài rễ; xác định sự tạo thành indol alkaloid trong cây in vitro bằng thuốc thử Wagner qua hiện tượng tạo kết tủa với thuốc thử. Bằng hệ thống điện di mao quản, thực hiện phân tích và định lượng các alkaloid đặc trưng của cây Trường xuân hoa in vitro như catharanthine, vindoline… Những kết quả thu được: Khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro: sử dụng NAA 0,5 mg/l và IAA 1 mg/l có tác động tốt lên sự tăng trưởng về chiều dài rễ và số rễ của cây. Định tính indol alkaloid bằng thuốc thử Wagner: các kết quả định tính cho thấy có sự hiện diện của indol alkaloid trong tất cả các mẫu cây Trường xuân v hoa in vitro. Và lượng kết tủa quan sát được nhiều nhất là ở mẫu cây sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l. Phân tích và định lượng indol alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro bằng hệ thống điện di mao quản: Hàm luợng catharanthine và vindoline của cây Trường xuân hoa in vitro cao hơn so với hàm luợng catharanthine và vindoline của cây in vivo, và hàm lượng catharanthine đạt được cao nhất là sau 28 ngày nuôi cấy và vindoline là sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l. vi SUMMARY “STUDY ON IMPACT OF AUXIN ON THE GROWTH AND THE SYNTHEIS ALKALOID IN Catharanthus roseus IN VITRO” The effect of different growth regulator on growth and production of indol alkaloid were studied in Catharanthus roseus. Shoots were grown in MS solid medium containing different concentrations of growth regulators. Extracted alkaloids were qualitative with Wagner reagent and analyzed by CE for determination of indol alkaloid quantities. The growth regulators on the experiment were NAA, IAA and the data were viewed for 7, 14, 21, 28, 35 days. The experiment result showed that NAA at concentration of 0,5 mg/l and IAA 1 mg/l resulted in elongation of roots and higher number of roots. The qualitative results of all in vitro plants have appeared precipitates which the 28 - day plant sample on the medium containing NAA 0,5 mg/l had the most. Analyses by CE showed that the concentration of indol alkaloid (catharanthine and vindoline) in the in vitro plant is more than in vivo plant, and these plants produce the highest catharanthine after 28 days and vindoline after 7 days cultured in MS medium adding NAA 0,5 mg/l. vii MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa ............................................................................................................. i Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tóm tắt ................................................................................................................. iv Summary .............................................................................................................. vi Mục lục ................................................................................................................. vii Danh sách các bảng ............................................................................................. xi Danh sách các hình và sơ đồ............................................................................... xiii Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................. xv CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ........................................................................................................... 2 CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây ....................................................................... 3 2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp ......................................................... 3 2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp ..................................................................... 4 2.2. Alkaloid ......................................................................................................... 4 2.3. Sơ lƣợc đặc điểm về cây Trƣờng xuân hoa Catharanthus roseus ............ 7 2.3.1. Nguồn gốc của cây Trường xuân hoa ......................................................... 7 2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trường xuân hoa ................... 8 2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trường xuân hoa .......................................... 9 2.3.4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trường xuân hoa .................................. 13 2.3.5. Tính chất dược lý của cây Trường xuân hoa............................................... 13 2.3.6. Ứng dụng của các alakloid Trường xuân hoa trong điều trị bệnh .............. 14 2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp ............................. 15 2.4.1. Các chất điều hòa sinh trưởng ..................................................................... 15 viii 2.4.2. Nguồn đạm .................................................................................................. 16 2.4.3. Nguồn cacbon .............................................................................................. 16 2.4.4. Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen .............................................................. 16 2.4.5. Các chất khác .............................................................................................. 16 2.5. Các phƣơng pháp chiết xuất alkaloid ........................................................ 17 2.5.1. Nguyên tắc của sự chiết xuất ...................................................................... 17 2.5.2. Phương pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ .............................................. 17 2.5.3. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước ..................... 18 2.6. Các phƣơng pháp định tính sự hiện diện của alkaloid ............................ 18 2.6.1. Phản ứng tạo tủa .......................................................................................... 19 2.6.2. Phản ứng tạo màu ........................................................................................ 19 2.7. Các phƣơng pháp định lƣợng alkaloid....................................................... 20 2.7.1. Phương pháp cân ......................................................................................... 20 2.7.2. Phương pháp trung hòa .............................................................................. 20 2.7.3. Định lượng alkaloid trong môi trường khan ............................................... 21 2.7.4. Phương pháp so màu ................................................................................... 21 2.7.5. Các phương pháp định lượng alkaloid hiện đại .......................................... 22 2.7.5.1. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp ..................................................................... 22 2.7.5.2. Hệ thống điện di mao quản ...................................................................... 22 2.8. Các nghiên cứu về việc tăng cƣờng sản xuất hợp chất thứ cấp ............... 23 2.8.1. Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao .................................................. 24 2.8.2. Xử lý với Elicitor ........................................................................................ 24 2.8.3. Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học .............................................. 24 2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất .................................................................................. 24 2.8.3.2. Sự biến đổi sinh học ................................................................................. 25 CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 26 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................. 26 ix 3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của IAA, NAA lên sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro ................................................. 26 3.3.1. Vật liệu ........................................................................................................ 26 3.3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 26 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 26 3.3.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy ............................................................... 26 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 27 3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA ......................... 27 3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro .......................................... 27 3.3.4. Phương pháp tiến hành ................................................................................ 29 3.4. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA .......................................................... 29 3.4.1. Vật liệu ....................................................................................................... 29 3.4.1.1. Mẫu kiểm tra ............................................................................................ 29 3.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ................................................................ 29 3.4.1.3. Hóa chất ................................................................................................... 30 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 30 3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner ................................................ 30 3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây Trường xuân hoa .................................................................................................. 31 3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro và cây Trường xuân hoa in vivo ................................... 31 3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lượng alkaloid trong cây Trường xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE ......................................... 32 3.4.3. Phương pháp tiến hành ................................................................................ 32 3.4.3.1. Định tính alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa ................................ 32 x 3.4.3.2. Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trường xuân hoa ........................................ 32 3.4.3.3. Phân tích và xác định hàm lượng alkaloid bằng CE ................................ 34 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 35 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 56 5.1. Kết luận ......................................................................................................... 56 5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 58 PHỤ LỤC xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây .................. 13 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro ...................................................... 27 Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro .............................................................. 28 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro ...................................................... 28 Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l..................................... 35 Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .................................... 36 Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .................................... 36 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy ............................................. 37 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy ............................................. 38 Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner ............................................................................ 41 Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau .................................... 43 Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau .................................... 46 Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE ................................... 50 N2 N3 N1 I2 xii Bảng 4.10. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE .................. 53 Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy ........................................... 54 xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid .................... 7 Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa ............................................................................................ 7 Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa ........................................................................... 8 Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine ................................................... 10 Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline .......................................................... 10 Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine ................................. 11 Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây Trường xuân hoa từ tiền chất ................................................................................ 12 Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có bổ sung NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy ....................................... 39 Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày .............................................. 42 Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA ..................................... 42 Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA ............................. 44 Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA .................................. 45 Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA ........................................................ 46 Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA .......................................................... 47 Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l, vindoline 20 mg/l ............................ 48 Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo tươi ................................................................................ 49 Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo khô ................................................................................ 50 xiv Hình 4.11: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro 2 tuần tuổi. ................................................................... 52 Hình 4.12: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi ..................................................................... 52 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu tươi ................................ 33 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu khô ................................ 34 Biểu đồ 4.1: Hàm lượng catharanthine và vindoline khi ly trích cây Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2 ......................................................... 51 Biểu đồ 4.2: So sánh hàm lượng catharanthine và vindoline giữa cây Trường xuân hoa in vitro và cây in vivo ......................................................... 53 xv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TDC : Tryptophan decarboxylase STR : Strictosidine synthase TIA : Terpenoid indole alkaloid EOF : electroosmosis flow CE : Capillary electrophoresis HPLC : High – performance liquid chromatography DNA : Deoxy nucleic acid MS : Murashiga & Skoog IAA : Indole-3-acetic acid NAA : 1-Naphthalene acetic acid BA : Benzyladenine CRD : Completely Randomized Design 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Thực vật bậc cao được coi là nguồn nguyên liệu quý giá để cung cấp các hợp chất thứ cấp đặc biệt là các alkaloid. Những chất này đóng vai trò quan trọng đối với ngành công nghiệp dược phẩm trong việc sản xuất ra các loại thuốc mới, có giá trị, trong số đó quan trọng nhất là nhóm dược phẩm điều trị ung thư. Hiện nay, trên toàn cầu có khoảng 25 triệu người đang phải sống chung với căn bệnh này và mỗi năm có thêm khoảng 11 triệu trường hợp mắc bệnh mới. Trong khi đó các loại thuốc chữa trị ung thư chưa nhiều và giá thành của chúng khá đắt. Xu hướng của thế giới hiện nay là nghiên cứu nhằm tìm phương pháp gia tăng lượng alkaloid ở các cây thảo dược để làm hạ giá thành của thuốc. Cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) là một trong các loại thực vật có khả năng sản xuất các indol alkaloid - có dược tính quan trọng trong chế tạo thuốc chống ung thư như vinblastine và vincristine. Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong tế bào thực vật và không thể tổng hợp được bằng con đường hóa học, do có cấu trúc phức tạp. Vì vậy, phương pháp bán tổng hợp vinblastine từ sự kết hợp tiền chất vindoline với catharanthine là hết sức hữu hiệu, vì vindoline là một nguồn dồi dào trong cây Trường xuân hoa và catharanthine có thể đạt nồng độ cao trong cây Trường xuân hoa nuôi cấy mô. Điều này có thể thực hiện được thông qua việc sử dụng các tác nhân kích thích như nấm và chất hóa học. Hiện nay, việc sản xuất catharanthine nhờ nuôi cấy mô vẫn còn quá thấp để tiến tới sản xuất công nghiệp. Bên cạnh đó, các alkaloid chỉ được tổng hợp trong những loại tế bào đặc trưng và vào những giai đoạn phát triển đặc biệt, điều này làm cho việc chiết xuất chúng gặp nhiều khó khăn. Do đó, việc chọn lọc các phương pháp và thời gian nuôi cấy hiệu quả là một trong những con đường quan trọng và thiết thực để gia tăng sức sản xuất các tiền chất như catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro. 2 Chính vì tầm quan trọng của các indol alkaloid trong việc điều trị bệnh và tính cấp thiết của việc gia tăng các hợp chất thứ cấp có giá trị này nên chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát sự tác động của IAA, NAA lên sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa (Catharanthus roseus) in vitro” nhằm kích thích khả năng sản xuất các indol alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro nhờ chất kích thích sinh trưởng (IAA. NAA). 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định giai đoạn nuôi cấy mô cây Trường xuân hoa sinh tổng hợp nhiều alkaloid nhất, từ đó chọn quy trình nuôi cấy cây Trường xuân hoa có khả năng sản xuất được nhiều catharanthine và vindoline thông qua việc sử dụng chất kích thích sinh trưởng IAA (indole - 3 - acetic acid) hay NAA (1- Naphthalene acetic acid). 1.3. Yêu cầu - Tạo được cây Trường xuân hoa in vitro có hàm lượng alkaloid cao . - Định tính sự hiện diện của alkaloid trong cây Trường xuân hoa bằng thốc thử Wagner. - Phân tích định lượng được lượng alkaloid trong từng giai đoạn nuôi cấy mô bằng hệ thống điện di mao quản (Capillary electrophoresis – CE). 3 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây [7, 9] Sinh vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển luôn tiến hành quá trình trao đổi chất, kết quả là tạo nên các sản phẩm của trao đổi chất. Trong thực vật các sản phẩm này được chia làm hai nhóm: - Chất trao đổi bậc một hay hợp chất sơ cấp: là các chất cơ bản cần cho sự sống của cây và có ở tất cả các loại cây trồng, bao gồm các hydrat cacbon, lipit và acid amin. Đó là những thành phần không thể thiếu trong cây. - Chất trao đổi bậc hai hay hợp chất thứ cấp: là những hợp chất đặc trưng cho loài cây trồng và chúng đóng vai trò quan trọng trong sự sống và sinh sản của thực vật. Các hợp chất thứ cấp là những hợp chất được sinh tổng hợp từ chất trao đổi sơ cấp nhưng có sự phân bố giới hạn trong thực vật [7]. 2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp không có chức năng rõ ràng như các hợp chất sơ cấp nhưng thường có vai trò sinh thái học: góp phần tạo màu sắc, quyến rũ ong bướm giúp cho quá trình thụ phấn của cây, giúp cho cây thích nghi được với những điều kiện khắc nghiệt của môi trường hay bảo vệ cây trồng chống lại côn trùng, các loại vi sinh vật và những động vật ăn mồi khác, như là cỏ ba lá hay cỏ đinh lăng có tác dụng như estrogen làm ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của động vật ăn cỏ [17]. Thậm chí là chúng còn ức chế sự phát triển của các thực vật khác bởi vì nhiều hợp chất thứ cấp có độc tính đối với thực vật. Vì vậy so với các chất sơ cấp, hợp chất thứ cấp được xem là nguồn nguyên liệu đặc biệt quý giá từ thực vật [14]. Các hợp chất thứ cấp đã được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau: chúng có vai trò quan trọng trong việc tạo hương vị và màu sắc cho các món ăn, đặc biệt hiện nay vấn đề sức khỏe rất được quan tâm do đó ngày càng nhiều các chất có nguồn gốc tự nhiên đang có xu hướng thay thế các chất tổng hợp làm 4 phụ gia trong thực phẩm. Bên cạnh đó các tinh dầu thơm của thực vật còn tham gia vào thành phần quan trọng của nước hoa. Ngoài ra chúng còn được ứng dụng trong lĩnh vực thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng do các chất chiết từ một số loài thực vật có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virút…, vì có nguồn gốc từ tự nhiên nên không làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái. Bởi vì có hoạt tính sinh học dồi dào, nên các hợp chất thứ cấp từ lâu đã được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền, và ngày nay chúng vẫn là nguồn nguyên liệu có giá trị trong bào chế dược phẩm. Một số chất thứ cấp như glucosinolate, alkaloid gây độc có chọn lọc đối với tế bào tiền ung thư được dùng để bào chế thuốc chống ung thư, hoặc một số chất có tác dụng trên tim như ajmalin, quinidin được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp tim… Hiện nay trên thế giới nhiều loại thuốc tổng hợp đã được sử dụng nhưng chúng vẫn không thay thế được các loại thuốc có nguồn gốc từ thực vật. Vì có một số hoạt chất thứ cấp chưa tổng hợp được bằng con đường hóa học hoặc nếu tổng hợp được thì giá thành của các loại thuốc sản xuất tổng hợp không rẻ hơn mà tác dụng lại không bằng các chất chiết xuất từ cây. Ví dụ như ajmalin, morphin, scopolamin, quinin, strychmin…. [5] 2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp Các hợp chất thứ cấp ở thực vật được phân loại theo con đường sinh tổng hợp của chúng. Gồm có ba nhóm chủ yếu: phenolic, terpene và steroid, alkaloid. Phenolic là nhóm hợp chất phổ biến ở thực vật bậc cao vì những phân tử này liên quan đến quá trình tổng hợp lignin, còn các hợp chất khác như alkaloid thì phân bố rải rác, nó đặc trưng cho giống, loài thực vật [17]. 2.2. Alkaloid [27] Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng * Đặc điểm chung: Trên 10.000 loại alkaloid đã được biết, khoảng 10 – 15 % alkaloid ở trong mạch nhựa cây có hoa, loại hai lá mầm nhưng đôi khi cũng được tìm thấy ở nấm, sinh vật biển, ở một số loài động vật và côn trùng… 5 * Thuật ngữ: Alkaloid thường có tên tận cùng bằng “ine”. Chúng được đặt tên theo một phần tên La tinh của loài sinh vật tạo ra nó. Ví dụ atropine từ Atropa belladonna (cây cà dược). Một vài hợp chất được đặt tên dựa trên hoạt tính sinh học của chúng ví dụ như emetine (thuốc gây nôn - emetic). * Tính chất vật lý: hầu hết alkaloid là không màu ở dạng tinh thể rắn và độ nóng chảy cao. Tuy nhiên một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở dạng lỏng như nicotine hay có màu như berberine. * Tính tan: phần lớn alkaloid là ở dạng bazơ tự do nên tan được trong dung môi hữu cơ và không tan được trong nước ở pH cao, các muối của alkaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ. Ở pH thấp alkaloid sẽ thêm vào một proton và trở nên tan trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ. Tính tan của alkaloid rất quan trọng trong việc ly trích các alkaloid ra khỏi cây, trong phân tích các loại alkaloid, và trong việc bào chế các alkaloid thành các dạng thuốc phù hợp. * Tính chất hóa học: alkaloid với những nhóm chức liền kề chủ yếu là cho điện tử. Những hợp chất thu điện tử (như nhóm amide carbonyl) là trung tính hay mang tính acid yếu. Những alkaloid ở dạng bazơ tự do không ổn định như ở dạng muối. Các alkaloid cho một số phản ứng chung thường dùng để xác định chúng: alkaloid tạo tủa với kim loại nặng hay acid hữu cơ. Có nhiều loại thuốc thử tạo tủa với alkaloid như thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendoff (potassium bismuth iodide solution). Nói chung, alkaloid là hợp chất tương đối bền; tuy vậy, một số hợp chất thuộc loại dẫn xuất của indol sẽ dễ bị phân hủy hoặc biến chất khi gặp ánh sáng và các tác nhân oxi hóa [27]. * Phân loại: do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng được cho số lượng alkaloid rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi các alkaloid được chia thành 3 loại: alkaloid thật, protoalkaloid và giả alkaloid (pseudoalkaloid). Alkaloid thật: là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính bazơ, thường chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ 6 amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ, ngoại trừ: colchicine, acid aristolochic, alkaloid tứ cấp. Các alkaloid loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (ornithine, lysin, phenilalanine, tryptophan, histidine, acid antranilic…) hơn là theo vòng dị hoàn. Các protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescaline và N,N - dimetiltryptamine. Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dị hoàn. Các giả - alkaloid là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino acid. Bao gồm hai hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid (như conesine) và purine (cafeine) [8]. Vài họ thực vật rất giàu alkaloid, ví dụ như họ Apocynaceae Lindl., Juss. Họ này phân bố trên toàn thế giới đặc biệt là ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong số đó các terpenoid indol alkaloid nổi lên với vai trò là các chất có hoạt tính sinh học mạnh và là tiềm năng ứng dụng trong y học. Terpenoid indole alkaloid (TIA) bao gồm hơn 3000 hợp chất trong đó có các chất chống ung thư như vinblastine, vincristine từ loài Catharanthus roseus và Vinca spp., camptothecin từ Camptotheca acuminata, chống sốt rét như quinine từ Cinchona officinalis [15]. Xét về vai trò sinh thái học các terpenoid indole alkaloid đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ cây chống lại sâu hại và các mầm bệnh. Trường hợp các chất indol alkaloid trong cây Trường xuân hoa là một ví dụ: năm 1989, Chockalingam và các cộng sự tìm thấy cao chiết Trường xuân hoa có hoạt tính chống lại sự ăn của ấu trùng Spodoptera. Theo Frischknecht (1987) sau khi gây vết thương vừa phải trên cây Trường xuân hoa, thì có sự gia tăng tổng hợp các alkaloid này như một cơ chế phòng vệ. Ngoài ra các alkaloid từ cây Trường xuân hoa còn có khả năng chống lại các loài vi sinh vật, ví dụ như ajmalicine, catharanthine và vindoline được tạo ra để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm (Hemandez, 1979) [16]. Hiện nay ngƣời ta đang dựa trên những đặc tính này của thực vật 7 Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa để tìm ra phƣơng thức tăng cƣờng sự sản xuất các hợp chất thứ cấp. TIA gồm có hai thành phần: một nhóm indole lấy từ tryptamine và một nhóm terpenoid có nguồn gốc từ iridoid glucoside secologanin [10]. Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid với sự tham gia của các enzym TDC: tryptophan decarboxylase, STR: strictosidine synthase [32]. 2.3. Sơ lƣợc đặc điểm về cây Trƣờng xuân hoa Catharanthus roseus 2.3.1. Nguồn gốc của cây Trƣờng xuân hoa [23, 33] Nguồn gốc phân loại [33] Giới : Thực vật Giới phụ : Tracheobionta Ngành : Magnoliophyta Ngành phụ : Spermatophyta Lớp : Magnoliopsida Lớp phụ : Asteridae Bộ : Gentianales Họ : Apocynaceae Tên khoa học : Catharanthus roseus 8 Tên thông thường: Bông dừa, hoa hải đằng, phjắc pót đông (Tày), dừa cạn, trường xuân hoa, Madagascar periwinkle… Chi Catharanthus G.Don có nguồn gốc ở Madagasca, cây Trường xuân hoa được du nhập sang nhiều nước nhiệt đới ở Nam Á cũng như Đông Nam Á trong đó có Việt nam và đảo Hải Nam Trung Quốc. Vào đầu khoảng giữa thế kỷ 18, Trường xuân hoa được trồng ở Paris, sau đó có mặt tại nhiều vườn thực vật khác ở Châu Âu. 2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trƣờng xuân hoa [23] Cây Trường xuân hoa là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 – 60 cm, phân nhiều cành. Thân mọc thẳng, hình trụ nhẵn, màu xanh lục nhạt hay nâu đỏ. Lá mọc đối, hình bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 4 – 6 cm, rộng 2 – 3 cm, hai mặt nhẳn, mặt trên sẩm bóng, mặt dưới nhạt (Hình 2.3). Hoa màu hồng hoặc trắng (trắng hiếm hơn). Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn, dài 5 thùy, hình ống ngắn, tràng có 5 cánh, ống tràng hẹp phình ra ở dưới các cánh hoa, nhị 5 đính vào họng của ống tràng (Hình 2.2). Quả dài 2,5 – 3 cm, mọc thẳng hơi choãi ra, hạt nhỏ, hình trứng màu nâu nhạt hoặc nâu đen. Mùa hoa quả, tháng 4 – 5 và tháng 9 – 10. Ở Việt Nam, Trường xuân hoa là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa 9 tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, Trường xuân hoa có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Trường xuân hoa còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc. Nơi tập trung nhiều nhất thuộc các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên và Khánh Hòa. Ngoài ra còn có ở Côn Đảo và Phú Quốc. Môi trường ven biển cũng là nơi mọc tập trung của Trường xuân hoa ở Madagasca, Srilanca, Ấn Độ, Philippin, Malaysia, Thái Lan. Ở Madagasca, cây còn mọc cả ở những vùng đồi, savan, cây bụi trên đất pha cát hoặc sỏi đá, độ cao tới 1.500m. Trường xuân hoa là loại cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu được hạn. Trong điều kiện trồng trọt (ở Hà Nội - vườn hoa, nông trường Đồng Gia - Ninh Bình, 1972) và ở Tuy Hòa hiện nay. Cây sinh trưởng phát triển mạnh, khối lượng chất xanh thu được có thể cao gấp đôi cây mọc từ thiên nhiên. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, cây trồng từ hạt ra hoa quả sau 4 - 5 tháng. Trong thời kỳ sinh trưởng mạnh, nếu bị cắt, cây tái sinh chồi khỏe. Nguồn Trường xuân hoa mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào. Trước năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1 - 3 tấn/năm. Những năm gần đây, lượng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, nhưng chủ yếu là từ cây trồng tại tỉnh Phú Yên [23]. 2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trƣờng xuân hoa [22] Nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy, Trường xuân hoa có chứa một số alkaloid có tác dụng hạ huyết áp như trong cây ba gạc Ấn Độ (Rawolfia serpentiana Benth). Ngoài ra còn có resecpin, secpentin, ajmalixin, vinxein, vindolixin, digitalin và hoạt chất giống insulin, nhưng đáng chú ý nhất là những alkaloid có nhân indol có trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất là ở rễ và rất thấp ở lá. Năm 1958, Noble và cộng sự đã chiết được một alkaloid từ lá Trường xuân hoa vincaleucoblastine (còn gọi là Vinblastine) [29]. Sau đó 4 năm, Svoboda và cộng sự cũng tìm thêm một alkaloid nữa là vincaleucocristin (còn gọi là vincristine) [30]. 10 Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline Hàm lượng các alkaloid này trong Trường xuân hoa rất nhỏ khoảng 1 phần vạn trong lá Trường xuân hoa khô đối với Vinblastine còn đối với vincristine thì ít hơn 10 lần nữa. Tùy theo nơi thu hái hàm lượng các alkaloid này thay đổi từ 0,2% đến 1% và khi dùng cũng dùng với liều rất thấp. Căn cứ vào cấu tạo hóa học người ta chia alkaloid trong cây Trường xuân hoa làm ba nhóm chính: Nhóm alkaloid có nhân indol: perivine, peviridine, perosine, catharanthine, cavicine, ajmalicine… Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine Nhóm alkaloid có nhân indoline: lochnericine, lochneridin, lochrovine, vindoline, ajmaline … Nhóm alkaloid có hai vòng indol hoặc một vòng indol và một vòng indoline như leurosine và leurosidine đặc biệt trong nhóm này có những alkaloid có tác dụng chữa bệnh ung thư như vinblastine nhưng có hàm lượng rất thấp: 0,005% - 0,015% trong lá và vincristine: 0,003 - 0,005% trong lá. 11 Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine Về mặt tính chất hóa học, các alkaloid có thể tham gia phản ứng cộng, oxi hóa khử… Dưới tác dụng xúc tác của enzyme, một số monomer có thể kết hợp tạo thành các dimer, ví dụ như sự kết hợp của hai tiền chất catharanthine với vindoline tạo thành vinblastine và vincristine như hình 2.7. 12 Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây Trường xuân hoa từ tiền chất [20] Đơn phản ứng Đa phản ứng 13 2.3.4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa Sự phân bố các alkaloid khác nhau ở các bộ phận khác nhau của Trường xuân hoa tùy thuộc nhiều vào các yếu tố liên quan đến quá trình sinh tổng hợp của cây. Sự hình thành alkaloid ở lá, thân, rễ tùy thuộc vào bước sóng ánh sáng chiếu vào cây. Quá trình tạo alkaloid trong rễ cây không có phản ứng quang hợp như các bộ phận trên mặt đất của cây nên các alkaloid trong rễ cây là indol alkaloid không chứa nhóm methoxy như ajmalicin, cathidine, serpentine, perivin, alstonin, tertrahydroalstonin, còn các alkaloid ở lá có chứa nhóm methoxy như anhydrovinblastine, catharanthine, leusosine, leurosidin, vinblastine, vincristine, vindoline, ở hạt thì có vinsedicin, vincedine, còn ở hoa chỉ có có vinblastine dạng vết [4]. Ngoài ra, hàm lượng của alkaloid trong cây cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh sáng, chất lượng đất, giống cây và cũng rất khác nhau tùy vào các bộ phận thu hái: Bảng 2.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây [5] Các bộ phận của cây Hàm lượng (%) Lá 0,37 - 1,15 Thân 0,46 Rễ chính 0,7 - 2,4 Rễ phụ 0,9 - 3,7 Hoa 0,14 - 0,84 Vỏ quả 1,14 Hạt 0,18 2.3.5. Tính chất dƣợc lý của cây Trƣờng xuân hoa [23, 24, 25] Theo tài liệu cổ, Trường xuân hoa vị hơi đắng, tính hàn, có tác dụng kháng nham (chống ung thư), an thần, trấn tĩnh, bình can, thanh nhiệt, lương huyết, giải 14 độc... thường được áp dụng chữa huyết áp cao, bệnh bạch huyết, u lim-phô [25]. Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và lá phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ, ít và làm thuốc điều kinh. Ở nam châu Phi, người dân dùng trị bệnh đái tháo đường. Có nơi dùng chữa tiêu hóa kém và lỵ [23]. Nói đến Trường xuân hoa trong cây thuốc của Việt Nam như là một cây thuốc rất quý dùng nhiều trong các bệnh về nội khoa mà đặc trưng ở 3 nhóm bệnh: bệnh lý về nội tiết, bệnh lý về tim mạch và bệnh lý về máu. Cao lỏng Trường xuân hoa có tác dụng hạ huyết áp, an thần gây ngủ và có độc tính nhẹ. Khi cho chuột cống trắng cái đã thụ tinh uống cao Trường xuân hoa, thấy liều cao không gây tai biến cho chuột mẹ nhưng có dấu hiệu ngăn cản sự phát triển của thai. Cao Trường xuân hoa dùng để trị bệnh cao huyết áp trên lâm sàng có tác dụng giảm huyết áp trên bệnh nhân thấy rõ rệt. Việc điều trị đơn giản, dễ áp dụng, không thấy biến chứng ngộ độc. Hai loại thuốc chế từ Trường xuân hoa chữa ung thư được dùng là Vinblastine và Vincristine. Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây Trường xuân hoa 2 alkaloid vinblastine và vincristine, là những chất ức chế mạnh sự phân bào. Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với tubulin, là protein ống vi thể ở thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa. Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào [24]. Vinblastine có tác dụng chống ung thư còn do tác động đối với chuyển hoá của glutamat và aspartat, và vincristine ngăn cản sự tổng hợp RNA và các protein. Ngoài ra cao Trường xuân hoa còn có tác dụng kháng một số chủng nấm gây bệnh [23]. 2.3.6. Ứng dụng của các alakloid Trƣờng xuân hoa trong điều trị bệnh  Vinblastin sulfat: Là thuốc dùng trong liệu pháp phối hợp, được lựa chọn hàng đầu để điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn và được lựa chọn hàng thứ hai trong liệu pháp trị bệnh ung thư lá lách, ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư 15 biểu mô thận. Lựa chọn hàng thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da [24].  Vincristin sulfat: Là một trong những thuốc chống ung thư được dùng rộng rãi nhất, đặc biệt có ích đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp. Nó được dùng trong liệu pháp phối hợp thuốc, là lựa chọn hàng đầu để điều trị bệnh ung thư biểu mô phổi, ung thư Hodgkin (ung thư hạch ở hệ bạch huyết), u bạch huyết không - Hodgkin, bạch cầu tủy bào mạn (đợt cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân [18]. Phối hợp thuốc chứa Vincristin là lựa chọn hàng thứ hai cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mạn tính. Hiện nay, Trường xuân hoa đang được ta xuất khẩu sang Pháp, chủ yếu để bào chế thuốc chữa bệnh bạch cầu.  Vindoline và catharanthine: vindoline và catharanthine được dùng trong việc điều trị bệnh bí tiểu và làm hạ lượng đường trong máu. Từ vindoline và catharanthine người ta tổng hợp được những alkaloid chứa nhóm dimer như vinblastine, vincristine có tác dụng trị ung thư.  Ajmalicine: là chất có biệt tính dược học mạnh, dùng để điều trị cao huyết áp, dùng làm thuốc giảm đau và điều trị các bệnh về hệ thần kinh và các triệu chứng lâm sàng khác.  Serpentine: dùng để điều trị bệnh cao huyết áp và thuốc an thần. 2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy mô 2.4.1. Các chất điều hòa sinh trƣởng [6] Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào cho thấy: - Chất điều hòa sinh trưởng cần thiết cho nuôi cấy tế bào - Chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào hình thành cơ quan như chồi, thân , lá, rễ. - Chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến sự tổng hợp các chất thứ cấp và cấu trúc tế bào: auxin cần thiết cho nuôi cấy tế bào như IAA, NAA, 2,4- 16 Dichlorophenoxy acetic acid và cytokinin như Kinetin và BA (Benzyladenine). Chất sinh trưởng tác động riêng lẽ hay phối hợp trong cùng nhóm hay cả hai nhóm đến sự sinh trưởng tế bào và tổng hợp các chất thứ cấp. Nồng độ chất sinh trưởng được sử dụng từ 1 đến 10 mg/l. 2.4.2. Nguồn đạm Chủ yếu là đạm hòa tan, đạm dạng nitrat hay hỗn hợp đạm nitrat và amonium. Đôi khi sử dụng casein hydrolysate hay nguồn đạm tự nhiên. 2.4.3. Nguồn cacbon Sucrose là nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu được sử dụng trong nuôi cấy mô. Trong nhiều trường hợp hàm lượng cacbon cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào và sản lượng của các chất trao đổi thứ cấp... Đôi khi phụ thuộc vào các loại cây trồng mà sử dụng mannose, galactose hay glucose. Loại đường và nồng độ đường được sử dụng cũng ảnh hưởng đến nồng độ các chất thứ cấp được thu nhận. 2.4.4. Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen [26] Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen là tất cả những thông số cần được kiểm tra trong nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp. - Nhiệt độ từ 17 - 25oC thường được dùng trong nuôi cấy tạo callus và phát triển tế bào nuôi cấy. Nhưng mỗi loại cây sẽ thích hợp với một nhiệt độ cụ thể. - pH của môi trường thường dao động từ 5 - 6 trước khi hấp khử trùng, không nên để pH quá cao, trong nuôi cấy bioreactor quy mô nhỏ hay fermentor thì pH tối ưu cần được đảm bảo bằng cách dùng thiết bị kiểm soát pH. - Ánh sáng: Các chất thứ cấp được tạo ra trong quá trình nuôi cấy ở điều kiện tối hay có ánh sáng phụ thuộc vào từng loài thực vật và trong quá trình dinh dưỡng ở nuôi cấy in vitro là quá trình quang tự dưỡng Mỗi loại thực vật có những điều kiện tối ưu khác nhau để sinh trưởng và sản xuất các chất hữu dụng, vì thế tùy từng trường hợp mà thay đổi các yếu tố cho phù hợp. 2.4.5. Các chất khác [4] Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng các cơ chất trong quá trình nuôi cấy là cần thiết để tăng hiệu suất thu nhận các chất thứ cấp. Điều này cho 17 phép thực hiện các phản ứng sinh tổng hợp ra các chất thứ cấp mới mà bản thân tế bào thực vật không có. Như vậy việc sản xuất các chất thứ cấp có trong tự nhiên hay các chất mới bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật và có sự tham gia của các cơ chất là có thể thực hiện. 2.5. Các phƣơng pháp chiết xuất alkaloid [2, 3] 2.5.1. Nguyên tắc của sự chiết xuất Dược liệu được cấu tạo bởi các tế bào thực vật. Khi cho dung môi chiết vào, dung môi sẽ đi qua các thành tế bào của dược liệu, các hoạt chất bên trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, khi đó xuất hiện một quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết trong thành tế bào và dung môi bên ngoài. Quá trình thẩm thấu này kết thúc khi có sự cân bằng về nồng độ hoạt chất của dung dịch bên trong và bên ngoài thành tế bào [2]. Có hai phương pháp cơ bản để ly trích các alkaloid ra khỏi bột cây khô, dựa vào tính bazơ đặc trưng của các alkaloid: - Alkaloid nói chung là những chất kềm yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạng muối của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin, nên phải tán nhỏ để dược liệu dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những kiềm trung tính hay kiềm mạnh. - Hầu hết các alkaloid kiềm không tan trong nước nhưng lại dễ tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực, các muối alkaloid thường tan trong nước cồn. Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid như loại hay bay hơi hoặc không bay hơi mà dùng phương pháp chiết xuất cho thích hợp [3]. 2.5.2. Phƣơng pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ [1, 5, 8] * Nguyên tắc: Tán nhỏ dược liệu rồi tẩm bột dược liệu với dung dịch kiềm để chuyển đổi các alkaloid ở dạng muối thành dạng bazơ tự do, kế tiếp bột cây tẩm này được trích với dung môi hữu cơ như: benzen, eter etil, chloroform, acetat etil, nhưng chloroform là dung môi thích hợp nhất cho việc chiết hầu hết các alkaloid kiềm, dung môi này hòa tan các alkaloid bazơ vừa được giải phóng. Cất thu hồi dung môi hữu cơ dưới áp lực hơi nước giảm rồi lắc dịch chiết cô đặc với dung dịch acid loãng (2 - 5%) thường dùng acid HCl, H2SO4…Các alkaloid 18 chuyển sang dạng muối tan trong nước, còn mỡ, sắc tố, sterol… ở lại dung môi hữu cơ. Gộp các dịch chiết muối lại rồi kiềm hóa để chuyển alkalod sang dạng bazơ, lắc với dung môi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alkaloid bazơ. Việc chiết bằng dung môi hữu cơ có thể dùng bình gạn hay các dụng cụ chiết chất lỏng. Sau khi lấy riêng lớp dung môi hữu cơ chứa alkaloid bazơ người ta thường loại nước bằng muối trung tính khan nước (Na2SO4 khan) rồi cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi sẽ thu được cắn alkaloid thô. 2.5.3. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nƣớc [5] Thấm ẩm bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất. Các alkaloid trong dược liệu sẽ chuyển sang dạng muối và tan trong dung môi trên. Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi dưới áp lực giảm, dùng ether rửa dịch chiết đậm đặc còn lại. Ở môi trường acid, ether thường hòa tan một số tạp chất chứ không hòa tan các alkaloid. Sau khi tách lớp ether, kiềm hóa dung dịch nước rồi lấy alkaloid bazơ được giải phóng ra bằng một dung môi hữu cơ thích hợp, cất thu hồi dung môi hữu cơ rồi bốc hơi tới khô sẽ thu được cặn alkaloid thô. Phương pháp này còn gọi là STAS- OTTO. Ngoài hai phương pháp trên người ta còn sử dụng phương pháp chiết bằng cồn đối với các alkaloid trong dược liệu tồn tại dưới dạng muối tan tốt trong cồn ở môi trường trung tính. Sau khi tán nhỏ dược liệu được đem thấm ẩm và chiết bằng cồn etylic cho tới kiệt alkaloid, quá trình tiếp theo được thực hiện tương tự như trên. 2.6. Các phƣơng pháp định tính sự hiện diện của alkaloid  Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid. Những phản ứng chung này chia làm hai loại: phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu. Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng tạo màu hoặc tạo kết tủa với alkaloid. Có 3 loại thuốc thử thông dụng là: Mayer, Dragendorff, Wagner, ngoài ra còn một số thuốc thử khác để phát hiện các loại alkaloid đặc thù. 19 2.6.1. Phản ứng tạo tủa [8] Thuốc thử Mayer (K2HgI4): hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất và hòa tan 5 g KI trong 10ml nước cất, trộn hai dung dịch này lại và thêm nước cất đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt, nhưng tủa tạo thành có thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi AcOH, etanol có sẵn trong dung dịch thử. Thuốc thử Dragendorff (KBiI4): hòa tan 8,0 g Nitrat bismuth trong 25 ml HNO