Khảo sát thành phần hóa học hạt cây móc mèo núi caesalpinia bonducella flem họ vang (caesalpiniaceae)

Khảo sát thành phần hóa học hạt cây móc mèo núi Caesalpinia bonducella Flem. 4. THỰC NGHIỆM 4.1. Điều kiện thực nghiệm Việc nghiên cứu thành phần hóa học cây móc mèo núi được thực hiện với các điều kiện sau: • Nguyên liệu: Hạt cây móc mèo núi (Caesalpinia bonducella Flem.) thu hái ở xã Vĩnh Lương, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa vào tháng 10 năm 2007. Cây được định danh bởi dược sĩ Phan Đức Bình, phó chủ nhiệm Bán nguyệt san Thuốc và sức khỏe. 7,0 kg hạt sau khi thu hái, đập vỏ, bỏ phần vỏ, lấy nhân, loại bỏ những nhân bị sâu bệnh thu được 3,8 kg nhân tươi; sấy khô, nghiền nhuyễn thành bột thu được 2,1 kg nhân khô; để sử dụng trong phần nghiên cứu. • Sắc ký cột: Silica gel pha thường (Merk, Kieselgel 60). • Sắc ký lớp mỏng: Silica gel pha thường (Merk, Kieselgel 60 F , 250 μm). 524 18 • Dung dịch H SO 20%. • hổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 [500 MHz (1H) và 125 M 13 y Spectroline MODEL ENF-240C/FE (USA) hai bước sóng 254 nm và 365 nm. Silica gel pha đảo RP18 (Whatman, KC F, 200 μm). Thuốc thử: 2 4 Các thiết bị ghi phổ: Máy ghi p Hz ( C)] Máy ghi phổ khối lượng Bruker Microtof-QII • Đèn UV: Má Học viên cao học: Vũ Thị Thúy Dung -39- GVHD: TS. Nguyễn Trung Nhân Khảo sát thành phần hóa học hạt cây móc mèo núi Caesalpinia bonducella Flem. • Dung môi sử dụng: Dung môi sử dụng là dung môi chưng cất metanol (64-65oC), eter dầu hỏa (60-90 oC), acetat etyl (77oC) và dung môi cloroform (61-62oC). 4.2. Trích ly cao thô Bột nguyên liệu hạt móc mèo núi được chia làm nhiều phần và được trích nóng với metanol bằng phương pháp đun hoàn lưu. Mỗi phần trích khoảng 200g bột và 1,5 lít metanol; trích trong thời gian ba giờ. Mỗi phần trích ba lần. Toàn bộ dịch trích thu được đem cô quay, thu được cao metanol thô. Cao metanol thô được hòa tan vào nước lần lượt đem trích với eter dầu hỏa, cloroform, acetat etyl (sử dụng phương pháp trích lỏng - lỏng) để thu được các loại cao tương ứng: cao eter dầu hỏa (105,62 g), cao cloroform (42,07 g), cao etyl acetat (1,02 g). Quá trình trích ly các loại cao được trình bày trong sơ đồ 1. 4.3. Quá trình cô lập Trong luận văn này chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cao eter dầu hỏa, cao cloroform của hạt cây móc mèo núi. 4.3.1. Khảo sát cao eter dầu hỏa Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel cao eter dầu hỏa (15,0 g) với hệ dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl có độ phân cực tăng dần. Dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20%, đun nóng thu được 12 phân đoạn (E1-E12). Phân đoạn E6 (762,2 mg) có vết rõ ràng nên được chọn để sắc ký tiếp tục, các phân đọan còn lại sẽ được khảo sát sau. Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn E6 (762,2 mg) với hệ dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl có độ phân cực tăng dần. Dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20%, đun nóng thu được 5 phân đoạn (E6.1-E6.5). Học viên cao học: Vũ Thị Thúy Dung -40- GVHD: TS. Nguyễn Trung Nhân Khảo sát thành phần hóa học hạt cây móc mèo núi Caesalpinia bonducella Flem. Sơ đồ 1: Quá trình trích ly các loại cao từ hạt móc mèo núi Thu hồi dung môi Nhân hạt (2,10 kg) - Trích nóng với MeOH - Lọc, thu hồi dung môi - Hòa tan với nước - Trích với eter dầu hỏa Cao MeOH (405,30 g) Dịch eter dầu hỏa Dịch nước Thu hồi dung môi Trích với CHCl3 Dịch CHCl3 Dịch nước Cao CHCl3 (42,07 g) Trích với acetat etyl Dịch acetat etyl Thu hồi dung môi Cao acetat etyl (1,02 g) Hạt tươi (7,00 kg) - Loại bỏ vỏ hạt - Sấy khô, nghiền nhuyễn Cao eter dầu hỏa (102,62 g) Dịch nước Học viên cao học: Vũ Thị Thúy Dung -41- GVHD: TS. Nguyễn Trung Nhân Khảo sát thành phần hóa học hạt cây móc mèo núi Caesalpinia bonducella Flem. Trong 5 phân đọan trên (E6.1-E6.5) thì chỉ có E6.2 có vết rõ ràng và khối lượng lớn (362,1g) nên được chọn sắc ký cột tiếp tục với hệ dung môi như trên cô lập được tinh thể hình kim, màu trắng đặt tên là CB4 (30,9 mg). Sơ đồ 2: Quá trình cô lập hợp chất CB4 Cao eter dầu hỏa (15,0 g) - SKC, hệ E:AE độ phân cực tăng dần - 5 phân đoạn (E6.1-E6.5) Phân đoạn E6 (762,2 mg) - SKC, hệ E:AE độ phân cực tăng dần - 12 phân đoạn (E1-E12) SKC, hệ E:AE độ phân cực tăng dần Phân đoạn E6.2 (362,1 mg) CB4 (30,9 mg) 4.3.2. Khảo sát cao cloroform Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel cao cloroform (42,07 g) với hệ dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl có độ phân cực tăng dần, sau đó chuyển sang cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần. Dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20%, đun nóng thu được 12 phân đoạn (C1-C12). • Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn C3 (2,99 g) với hệ dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl có độ phân cực tăng dần. Trong quá trình cô quay đuổi dung môi để gom thành các phân đoạn có xuất hiện tinh thể hình kim không màu, lọc riêng kết tủa này ta thu được tủa TC3. Phần còn lại dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20%, đun nóng thu được 10 phân đoạn (C3.1 - C3.10). Học viên cao học: Vũ Thị Thúy Dung -42- GVHD: TS. Nguyễn Trung Nhân Khảo sát thành phần hóa học hạt cây móc mèo núi Caesalpinia bonducella Flem. − Phân đoạn C3.3 xuất hiện kết tinh là một chất tinh thể hình kim, không màu đặt tên là CB5 (11,8 mg). − Sắc ký cột hấp phụ silica gel phân đoạn C3.4 (246,9 mg) với hệ dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl = 85:15; dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch H2SO4 đậm 20%, đun nóng gom thành 4 phân đoạn (C3.4.1 – C3.4.4). Sắc ký cột hấp phụ silica gel phân đoạn C3.4.2 (100 mg), với hệ dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl = 85:15 thu được tinh thể hình kim không màu ký hiệu là CB3 (18,2 mg). − Sắc ký cột hấp phụ silica gel phân đoạn phân đoạn TC3 (207,4 mg) với hệ dung ly cloroform : metanol = 99:1. Dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch H2SO4 đậm 20%, đun nóng gom thành 4 phân đoạn (TC3.1 – TC3.4). Phân đoạn TC3.2 xuất hiện kết tinh là một chất tinh thể hình kim, không màu đặt tên là CB2 (34,8 mg). Phân đoạn TC3.3 (27,8 mg) được thực hiện sắc ký điều chế với hệ dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl : metanol = 65:34:1 được chất tương đối sạch, kết tinh lại trong dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl được tinh thể hình kim, không màu ký hiệu là CB1 (13 mg). Sắc ký cột hấp phụ silica gel phân đoạn C3.5 (408,8 mg) với hệ dung ly cloroform:metanol có độ phân cực tăng dần (0%-1% metanol); dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch H2SO4 đậm 20%, đun nóng gom thành 7 phân đoạn (C3.5.1 – C3.5.7). Phân đoạn C3.5.2 (37,5 mg) được thực hiện sắc ký điều chế với hệ dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl = 65:35 được chất tương đối sạch, kết tinh lại trong dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl được tinh thể hình kim, không màu ký hiệu là CB6 (10 mg). Quá trình cô lập các hợp chất trên được trình bày trong sơ đồ 3. Học viên cao học: Vũ Thị Thúy Dung -43- GVHD: TS. Nguyễn Trung Nhân Khảo sát thành phần hóa học hạt cây móc mèo núi Caesalpinia bonducella Flem. Sơ đồ 3: Quá trình cô lập các hợp chất CB1, CB2, CB3, CB5, CB6. - Sắc ký điều chế - E:AE=65:35 - SKC - Hệ C:Me (0%-2%Me) - 7 phân đoạn (C3.5.1 – C3.5.7) ------------------- - Sắc ký điều chế - E:C:Me=65:34:1 - SKC - Hệ C:Me = 99:1 - 4 phân đoạn (TC3.1 – TC3.4). - SKC - Hệ E:AE = 85:15 --------------------------------------------------------- - SKC, hệ E:AE, độ phân cực tăng dần - 11 phân đoạn (C3.1-C3.10 và TC3) -------------------------------------- ------------------- - SKC, hệ E:AE, độ phân cực tăng dần - 12 phân đoạn (C1-C12) Phân đoạn C5 (4,28 g) Phân đoạn C3 (2,99 g) - SKC - Hệ E:AE = 85:15 - 4 phân đoạn (C3.4.1 – C3.4.4) CB5 (11,8 mg) Phân đoạn C3.4 (246,9 mg) Phân đoạn C3.4.3 (100 mg) CB3 (18,2 mg) TC3 (207,4 mg) CB2 (34,8 mg) CB6 (10 mg) Phân đoạn C3.5.2 (37,5 mg) Phân đoạn C3.5 (408,8 mg) Phân đoạn TC3.3 (27,8 mg) CB1 (13 mg) Cao cloroform (42,07g) Học viên cao học: Vũ Thị Thúy Dung -44- GVHD: TS. Nguyễn Trung Nhân Khảo sát thành phần hóa học hạt cây móc mèo núi Caesalpinia bonducella Flem. • Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn C4 (4,28 g) với hệ dung ly cloroform : metanol (0-3% metanol). Dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20%, đun nóng thu được 8 phân đoạn (C4.1 – C4.8). Sắc ký cột hấp thu trên silica gel phân đoạn C4.2 (956,0 mg) với hệ dung ly eter dầu hỏa : cloroform : metanol = 80 : 18 : 2. Dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20%, đun nóng thu được 8 phân đoạn (C4.2.1-C4.2.8). Phân đoạn C4.2.3 (23 mg) được thực hiện sắc ký điều chế với hệ dung ly eter dầu hỏa : cloroform : metanol = 80 : 18 : 2 thu được hai chất tương đối sạch, kết tinh lại trong dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl được tinh thể hình kim, không màu ký hiệu là CB7 (7,1 mg) và CB8 (5,1 mg). Sơ đồ 4: Quá trình cô lập các hợp chất CB7, CB8 - Sắc ký điều chế - Hệ E:C:Me = 80:18:2 - SKC, hệ E:C:Me = 80:18:2 - 8 phân đoạn (C4.2.1-C4.2.8) - SKC, hệ C:Me (0-3% Me) - 8 phân đoạn (C4.1 – C4.8) Phân đoạn C5 (4,28 g) Phân đoạn C4.2 (956,0 mg) Phân đoạn C4.2.3 (23 mg) CB7 (7,1 mg) CB8 (5,1 mg) Học viên cao học: Vũ Thị Thúy Dung -45- GVHD: TS. Nguyễn Trung Nhân