Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách premna serratifolia l - Họ cỏ roi ngựa (verbenaceae)

37 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. 4. THỰC NGHIỆM 4.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 4.1.1. Hóa chất ¾ Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm: eter dầu hỏa (60oC - 90oC), benzen, cloroform, etyl acetat, aceton, metanol và etanol đều là hóa chất Trung Quốc. ¾ Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, dung dịch acid sulfuric đậm đặc hiện hình bằng cách nung nóng, soi đèn UV hoặc dùng hơi iod. ¾ Silica gel 60G F254 (0.040 – 0.063mm) loại dùng cho sắc ký lớp mỏng, Merck. 4.1.2. Thiết bị ¾ Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, ống đong, pipetman). ¾ Máy cô quay chân không, kèm bếp cách thủy. ¾ Cột sắc ký: cột cổ điển. ¾ Sắc ký lớp mỏng pha thường 25DC – Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel F254, Merck và pha đảo RP-18 F254 , Merck. ¾ Các thiết bị ghi phổ: - Phổ 1H–NMR, 13C–NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90, phổ HSQC và phổ HMBC: Ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR. Các phổ được ghi tại Phòng Phân Tích Cấu Trúc, Viện Hóa Học và Khoa Học Công Nghệ, Số 18 Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội. HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 38 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. 4.2. TRÍCH LY VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ TRONG LÁ VỌNG CÁCH (PREMNA SERRATIFOLIA L.) 4.2.1. Điều chế các loại cao Lá cây vọng cách thu hái ở quận 12, thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 12 năm 2006, được định danh bởi thầy Hoàng Việt, bộ môn Thực vật và Sinh môi trường đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM. Lá cây được sấy khô ở nhiệt độ 60oC đến khối lượng không đổi, vò nhuyễn được 2 kg mẫu khô. Mẫu khô được trích nóng với metanol bằng phương pháp đun hoàn lưu, lọc, cô quay thu hồi dung môi được cao thô metanol. Hòa tan cao metanol vào nước, lần lượt chiết với các dung môi eter dầu, cloroform, butanol, cô quay dịch trích ở áp suất kém thu được các loại cao tương ứng. Quy trình trích cao được tóm tắt trong sơ đồ 1. HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 39 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. Sơ đồ 1: Sơ đồ điều chế cao Lá khô (2kg) -Đun hoàn lưu trong metanol trong 3 giờ (3 lần). - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi Cao metanol - Hòa vào nước. - Trích với eter dầu - Thu hồi dung môi Dịch nước Cao eter dầu (60g) - Trích với cloroform - Thu hồi dung môi Cao cloroform (12 g) Dịch nước -Trích với butanol -Thu hồi dung môi Cao butanol (80g) Cao nước (50 g) HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 40 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. 4.2.2. Khảo sát cao eter dầu Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha thường cao eter dầu hỏa (60 g) với các hệ dung ly có độ phân cực tăng dần thu được mười phân đoạn từ E1 đến E10. Sơ đồ 2: Quy trình xử lý cao eter dầu hỏa của lá cây vọng cách Cao eter dầu (60 g) SKC silica gel pha thường với nhiều hệ dung ly có độ phân cực khác nhau Nhận xét: Trong mười phân đoạn (E1 đến E10), sắc ký bản mỏng các phân đoạn E2, E3, E5 cho những vết rõ ràng nên được chọn tiếp tục khảo sát. 4.2.2.1. Khảo sát phân đoạn E2 Sắc ký cột phân đoạn E2 trên silica gel với hệ dung ly eter dầu:etyl acetat có độ phân cực tăng dần, thu được chín phân đoạn (E2.1 – E.2.9). Ở các phân đoạn thứ E2.7 thấy có kết tủa màu trắng tách ra khỏi dung dịch. Lọc kết tủa, tiến hành sắc ký cột và sắc ký điều chế phần kết tủa nhiều lần với hệ dung ly eter dầu:etyl acetat (9:1) thu được 8mg VCE1. Quy trình được tóm tắt ở sơ đồ 3 E3 E5 VCE1 (8 mg) VCE3 (10 mg) VCE4 (2 mg) VCE2 (10 mg) E2 E1 E4 E6 E7 E8 E9 E10 HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 41 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. Sơ đồ 3: Sơ đồ cô lập hợp chất VCE1 từ phân đoạn E2 - SKC trên silica gel - Hệ dung ly eter dầu : etyl acetat Các phân đoạn E 2.1 – E 2.6 Phân đoạn E 2.7 (40 mg) - SKC silica gel và sắc ký điều chế nhiều lần - Eter dầu:etyl acetat (9:1) VCE1 (10 mg) Phân đoạn E2 (1g) Các phân đoạn E 2.8 – E 2.9 4.2.2.2. Khảo sát phân đoạn E3 Sắc ký cột silica gel phân đoạn E3 với các hệ dung ly có độ phân cực tăng dần. Hệ dung ly được sử dụng ở đây là eter dầu : etyl acetat 99:1→ 98:2→ 95:5→ 9:1→ 85:15→8:2 Quá trình sắc ký cột kết hợp với việc triển khai trên bản mỏng thu được 15 phân đoạn (E3.1-E3.15). Tiếp tục sắc ký cột phân đoạn E3.6 trên silica gel với hệ dung ly eter dầu:etyl acetat, thu được 12 phân đoạn (E3.6.1-E3.6.12). Ở phân đoạn E3.6.7 thấy xuất hiện kết tủa màu cam, tinh chế kết tủa thu được 10 mg hợp chất VCE3. Quy trình được tóm tắt ở sơ đồ 4. HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 42 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. Sơ đồ 4: Sơ đồ cô lập hợp chất VCE3 Phân đoạn E3 (500 mg) - SKC trên silica gel - Hệ dung ly eter dầu : etyl acetat Phân đoạn E3.6 (80 mg) - SKC trên silica gel - Hệ dung ly eter dầu : etyl acetat Phân đoạn E3.7 – E3.15 - SKC trên silica gel - Hệ dung ly eter dầu:etyl acetat Phân đoạn E3.1 – E3.5 Phân đoạn E3.6.1 – E3.6.6 Phân đoạn E3.6.8 – E3.6.12 Phân đoạn E3.6.7 (30mg) - Lọc kết tủa VCE3 (10 mg) 4.2.2.3. Khảo sát phân đoạn E5 Sắc ký cột phân đoạn E5 trên silica gel pha thường với hệ dung ly eter dầu:etyl acetat có độ phân cực tăng dần, dựa vào sắc kí bản mỏng gom thành sáu phân đoạn (E5.1–E5.6). Sắc ký cột silica gel pha thường phân đoạn E5.3 với hệ dung ly eter dầu : etylacetat có độ phân cực tăng dần (100 : 0 → 95 : 5→ 90 : 10 →80 : 20→ 70 : 30→ 60 : 40) thu được năm phân đoạn (E5.3.1-E5.3.5). Tinh chế HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 43 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. phân đoạn E5.3.2 thu được 2 mg hợp chất VCE4. Tiếp tục sắc ký cột silica gel pha thường trên phân đoạn E5.3.4 với hệ dung môi eter dầu:cloroform (40:60) thu được 10 mg hợp chất VCE2. Quy trình được tóm tắt ở sơ đồ 5. Sơ đồ 5: Sơ đồ cô lập VCE2 và VCE4 Phân đoạn E5 (2 g ) - SKC trên silica gel - Hệ dung ly eter dầu : etyl acetat có độ phân cực tăng dần Phân đoạn E5.1 Phân đoạn E5.3 , E5.2 ( 200 mg) Phân đoạn E5.4 - E5.6 - SKC trên silica gel - Hệ dung ly eter dầu:etylacetat Phân đoạn E5.3.4 (30 mg) Phân đoạn E5.3.2 (15 mg) VCE2 (10mg) Phân đoạn E5.3.1, E5.3.3 và E5.3.5 VCE4 (2 mg) HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 44 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. 4.2.3. Khảo sát cao butanol Sắc ký cột trên silica gel pha thường cao butanol (80 g) với các hệ dung ly có độ phân cực tăng dần thu được 8 phân đoạn từ B1 đến B8. Sơ đồ 6: Quy trình xử lý cao butanol Cao butanol (80 g) B1 VCB1 (5 mg) VCB2 (50 mg) B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 4.2.3.1. Khảo sát phân đoạn B1 Sắc ký cột trên silica gel pha thường phân đoạn B1 với hệ dung ly cloroform:metanol có độ phân cực tăng dần, dựa vào sắc ký bản mỏng thu được sáu phân đoạn (B1.1-B1.6). Tiếp tục sắc ký cột trên silica gel pha thường phân đoạn B1.5 trên silica gel với hệ dung ly cloroform:etyl acetat tỉ lệ tăng dần (100:0 → 95:5 → 90:10 → 85:15 → 80:20 → 70:30), thu được bốn phân đoạn (B1.5.1-B1.5.4). Sắc kí cột trên silica gel pha thường phân đoạn B1.5.2 trên silica gel với hệ dung ly cloroform: metanol có độ phân cực tăng dần thu được năm phân đoạn. Tiếp tục sắc ký cột trên silica gel pha đảo RP-18 phân đoạn B1.5.2.2 với hệ dung ly metanol:nước (1:1) thu được 5mg hợp chất VCB1. Quy trình được tóm tắt trong sơ đồ 7. HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 45 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. Sơ đồ 7: Sơ đồ cô lập VCB1 - SKC trên silica gel - Hệ dung ly cloroform:metanol - SKC trên silica gel - Hệ dung ly cloroform:etyl acetat Phân đoạn B1 (3 g) Phân đoạn B1.6 Phân đoạn B1.5 Phân đoạn B1.1-B1.4 Phân đoạn B1.5.2.1 - SKC trên silica gel - Hệ dung ly cloroform:metanol Phân đoạn B1.5.1 - SKC trên silica gel pha đảo RP-18 - Hệ dung ly metanol:nước VCB1 (5 mg) Phân đoạn B1.5.2 Phân đoạn B1.5.3-B1.5.4 - SKC trên silica gel - Hệ dung ly cloroform:metanol Phân đoạn B1.5.2.2 Phân đoạn B1.5.2.3- B1.5.2.5 HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 46 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. 4.2.3.2. Khảo sát phân đoạn B3 Sắc ký cột trên silica gel pha thường phân đoạn B3 với hệ dung ly cloroform:metanol:nước tăng dần (1:0:0→95:5:0 → 9:1:0 → 8:2:0 → 20:6:1→ 14:6:1→ 4:6:1). Quá trình sắc ký cột kết hợp với sắc ký bản mỏng thu được 25 phân đoạn (B3.1-B3.25). TIếp tục sắc ký cột phân đoạn B3.16 với hệ dung ly etyl acetat:metanol:nước (8:1:1) thu được hợp chất VCB2. Quy trình được tóm tắt ở sơ đồ 8 Sơ đồ 8: Sơ đồ cô lập hợp chất VCB2 - SKC trên silica gel - Hệ dung ly cloroform:metanol:nước (14:6:1) Phân đoạn B3 (700 mg ) Phân đoạn B3.1-B3.15 - SKC trên silica gel - Hệ dung ly etyl acetat:metanol:nước (8:1:1) Phân đoạn B3.16 VCB2 (50 mg) Phân đoạn B3.17-B3.25 HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 47 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. 4.2.4. Thử nghiệm độc tính tế bào Tiến hành thử nghiệm độc tính tế bào của các cao và hợp chất thu được bằng phương pháp Sulforhodamine B (SRB). Thử nghiệm SRB là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào. Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu. 4.2.4.1. Thiết bị - Hóa chất • Thiết bị - Cân phân tích. - Tủ cấy vô trùng - Tủ ấm 37 oC, 5% CO2 - Kính hiển vi, kính soi ngược. - Máy ly tâm - Máy lắc. - Máy đếm tế bào - Đĩa 96 giếng - Bình Roux - Micropipet • Hóa chất - Môi trường MC Coy HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 48 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. - Huyết thanh - Trypsin/EDTA - DMSO - Tricloroacetic (TCA) 50% - Acid acetic 1% - Tris bas 10nM - Tế bào ung thư ruột kết DLD-1 HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 49 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. 4.2.4.2. Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB Nuôi cấy tế bào trong bình Roux đạt độ phủ 80-90% Huyền phù để tách lớp đơn tế bào Đếm và phủ tế bào vào đĩa 96 giếng với mật độ 10.000 tế bào/ giếng Lắc trên máy 10 phút Hòa tan SRB đã gắn bằng 10nM Tris-bas Rửa 4 lần với 1% acid acetic Rửa 5 lần với nước Nhuộm SRB trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ phòng Cố định tế bào bằng TCA 50% đặt vào tủ 4oC trong vòng 1h Ủ 48h trong tủ ấm 37 oC, 5% CO2 Thêm các chất cần thử với nhiều nồng độ khác nhau Chất chứng dương là resveratrol Ủ 24h trong tủ ấm 37 oC, 5% CO2 Đọc kết quả tại bước sóng 492 và 620 nm HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 50 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. 4.2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel Phần trăm tăng trưởng tế bào được tính theo công thức (3.1) G (%) = ODTN ODDC 100 %x Phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào được tính theo công thức (3.2) Trong đó %G: phần trăm tăng trưởng tế bào %I : phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào ODTN : Giá trị OD của mẫu thí nghiệm ODDC: giá trị OD của mẫu đối chứng Các số liệu OD492 và OD620 thu nhận được từ máy được xử lý theo phương pháp sau trên Microsoft Excel. Từ hai thông số OD ở 492 nm và 620 nm, tính giá trị OD sử dụng theo công thức sau (3.3) I (%) = ODDC OD TN ODDC x 100 = 1 G [ OD492(TN) – OD620(blank)] – [ OD620(TN) – OD620(blank)] Tính giá trị trung bình OD giữa các lần lặp. Tính %G và %I theo công thức 3.1 và 3.2. Tính trung bình %G và %I của các lần lặp. HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan 51 Khảo sát thành phần hóa học lá cây vọng cách Premna serratifolia L. Tính độ lệch chuẩn (STD) theo công thức (3.4) Trong đó STD = x x 2 n 1 x : giá trị OD, %G hoặc %I của từng lần lặp : giá trị OD, %G hoặc %I trung bình x n : số lần lặp Trình bày kết quả: giá trị trung bình ± STD HVCH: Phạm Thị Bích Vân CBHD: TS. Trần Lê Quan