Khóa luận Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP - VT2eB trên heo

nhiều lần để tăng hàm lƣợng kháng thể cũng không hiệu quả. Ngƣời ta sử dụng thêm protein mang để liên kết với đƣờng. Việc này sẽ chuyển kháng nguyên độc lập với tế bào T thành kháng nguyên phụ thuộc tế bào T nhờ việc tạo ra những epitope của tế bào T. 11 11 Kỹ thuật này đã thành công trên những loại vacxin viêm gan B,viêm gan A, Salmonella typhi... b.Vacxin tái tổ hợp (recombinant vaccine)[17] Cùng với sự tiến bộ vƣợt bậc của các kỹ thuật sinh học phân tử, xu hƣớng sản xuất vacxin tái tổ hợp ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi. Việc sản xuất vacxin bằng các công nghệ truyền thống có nhiều hạn chế không chỉ do tính an toàn mà còn do nhiều tác nhân gây bệnh không thể nuôi cấy trên qui mô lớn. Gen mã hóa cho protein immunoprotective (những kháng nguyên tạo ra phản ứng miễn dịch tự nhiên) trên vi sinh vật gây bệnh sẽ đƣợc clone. Những gen này sau đó đƣợc tái tổ hợp với DNA của một vector của loài vi khuẩn hay virus khác, thƣờng là plasmid rồi đƣợc đƣa vào tế bào vi sinh vật tạo nên dòng vi sinh vật tái tổ hợp. Những vi sinh vật tái tổ hợp này sẽ đƣợc nuôi cấy trong các bình lên men lớn để có thể thu đƣợc lƣợng lớn protein tái tổ hợp mà sau đó sẽ đƣợc tinh sạch dễ dàng. Bằng kỹ thuật này ngƣời ta có thể sản xuất vacxin trên qui mô công nghiệp với giá thành thấp. Hiện nay, ngƣời ta đã thành công trong việc sản xuất vacxin hepatitis B, B. pertussis,...bằng phƣơng pháp này. Tuy nhiên việc nghiên cứu vacxin này đòi hỏi tốn nhiều thời gian, tài chính, trang thiết bị đắt tiền. Ngƣời ta cũng có thể dùng kỹ thuật công nghệ sinh học để loại bỏ những gen mã hóa cho những protein “không cần thiết”. Do đó có thể làm giảm tính độc của vi sinh vật. c.Vacxin peptide tổng hợp [17] Hƣớng sản xuất vacxin này phát triển nhanh nhờ sự tiến bộ của kỹ thuật tạo dòng và giải trình tự của DNA. Ngƣời ta nghiên cứu các cấu trúc không gian và trình tự của các epitope của kháng nguyên đƣợc nhận biết bởi tế bào B và tế bào T. Nhóm này có thành phần vào khoảng 8-12 axit amin. Sau khi đƣợc tổng hợp các axit amin này phải đƣợc gắn vào giá đỡ, thƣờng là các hạt polyme có khả năng hấp phụ cao và sử dụng chung với các loại chất bổ trợ tốt. Ƣu điểm của loại vacxin này là an toàn, ổn định, dễ bảo quản và vận chuyển. Tuy nhiên việc sản xuất vacxin này đòi hỏi kỹ thuật cao. d.Vacxin DNA [17] Khi đƣa DNA của một loại plasmid vectơ có chứa gen kháng nguyên vào cơ thể thì thấy có hiện tƣợng gen kháng nguyên đó tổng hợp ra protein kháng nguyên 12 12 và kích thích cơ thể sinh miễn dịch chống lại protein do gen kháng nguyên kích thích sinh ra. Dựa trên hiện tƣợng này, ngƣời ta tạo ra vacxin DNA bằng cách tái tổ hợp gen kháng nguyên của một plasmid vectơ với một hệ thống promotor mạnh. Loại kháng nguyên này sẽ kích hoạt tiết interleukin 12. Interleukin này sẽ tác động vào những tế bào chết tự nhiên gây phân tiết interferon-g kích thích sự phát triển của tế bào trợ giúp T. Vacxin này có ƣu thế lớn với phƣơng thức gây miễn dịch đơn giản, bền với nhiệt độ do chỉ chứa DNA thuần khiết.Vacxin DNA an toàn đối với những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch. Tuy nhiên việc đƣa một DNA lạ vào cơ thể đôi khi gặp nguy hiểm do sự nhạy cảm của tế bào miễn dịch đối với chính DNA đó. e.Vacxin phối hợp với công nghệ chuyển gen thực vật[3] Nhờ công nghệ gen ngƣời ta có thể chuyển nhiều gen quý giá vào hệ gen thực vật tạo nên nhiều loại cây có khả năng sản xuất ra nhiều sản phẩm có giá trị thông qua hệ thống plasmid Ti và Agrobacter tumefaciens. Dựa vào cách này ngƣời ta đã chuyển một hay nhiều gen kháng nguyên của vacxin động vật và ngƣời vào thực vật, thƣờng chú trọng vào những loại cây thực phẩm . Nhờ đó có thể thu đƣợc vacxin thông qua thực vật. Ƣu điểm của vacxin này là an toàn, dễ sử dụng. Tuy nhiên, việc tạo vacxin này đòi hỏi kỹ thuật cao. 2.2 BỆNH PHÙ VÀ ĐỘC TỐ VT2e Bệnh phù ở heo xuất hiện ở heo sau cai sữa với các triệu chứng phù ở nhiều vị trí nhƣ: mi mắt, sống mũi và trán, thành dạ dày, màng treo ruột và cuối cùng rối loạn thần kinh. Bệnh này liên quan độc tố VT2e không bền nhiệt đƣợc tạo ra bởi một vài chủng E. coli nhƣ: O138:K81; O139:K82; O141: K85 [11]. Độc tố này tác động lên các tế bào ruột, đồng thời chúng cũng tác động lên nội mô thành mạch máu, hậu quả là làm giảm sự hấp thu do các tế bào nhung mao ruột bị tổn thƣơng. Sự hƣ hại của các tế bào nội mô mạch máu sẽ gây ra triệu chứng xuất huyết (Nguyễn Ngọc Hải, 1999). Lƣợng độc tố cần thiết để có thể dẫn đến các triệu chứng và các thƣơng tổn thần kinh đặc trƣng cho bệnh phù thì rất thấp. Liều LD50 (Lethal Dose)của VT2e trên heo khi tiêm tĩnh mạch là 3ng/kg thể trọng (MacLeod và cộng sự, 1991). 13 13 VT2e hay còn gọi là SLT-IIv là nhóm độc tố vero, đƣợc Konowalchuk và cộng sự đặt tên đầu tiên năm 1977. Độc tố này chung họ với nhóm của Shigella và có đặc trƣng gây độc trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero (African green monkey kidney) hơn là trên tế bào Hela, do đó còn đƣợc gọi là độc tố VT2e. Độc tố VT2e bị trung hòa một phần bởi kháng thể của SLT-II và không bị trung hòa bởi kháng thể của SLT-I. VT2e đƣợc cấu tạo từ hai thành phần: một đơn vị A nặng 32kDa và năm đơn vị B (7.7kDa/ đơn vị). Tiểu phần A mã hóa cho enzyme RNA N-glycosidase. Enzyme này sẽ phân cắt một liên kết N-glycosidic trên tiểu phần 28S của rRNA. Sự phân cắt này sẽ làm sai hỏng yếu tố kéo dài EF1 (elongation factor 1) liên kết aminoacyl-tRNA với tiểu phần 60S của RNA ribosome. Do đó ức chế sự tổng hợp protein và gây chết tế bào. Những tiểu phần B chịu trách nhiệm cho khả năng kết dính những thụ thể bản chất glycolipid có sẵn trên bề mặt của tế bào ruột cũng nhƣ trên các tế bào vero. Các độc tố SLT-I và SLT-II chỉ liên kết với Gal 1-4Gal -4Glc 1-1Cer (globotriosyl ceramid- Gb3), trong khi độc tố VT2e liên kết với cả Gb3 và GalNAc 1-3Gal 1- 4Gal 1-4Glc 1-Cer (globotetraosyl ceramid-Gb4), Gal 1-3GalNAc 1-3Gal 11- 4Gal 1-aGlc 1-1Cer (globopenosyl- Gb5) trên tế bào vero [13]. Các tế bào của lớp nội mô ở heo nhạy cảm với độc tố VT2e. Và độc tố này gây ra những tổn thƣơng chủ yếu trên lớp nội mô của mạch máu, làm biến đổi khả năng thấm của mạch máu và hậu quả gây nên chứng phù . Năm 1988, trình tự của một operon mã hóa cho độc tố VT2e đã đựơc báo cáo. Trình tự axit amin của tiểu đơn vị A của VT2e dài hơn một axit amin và tƣơng đồng 94% so với SLT-II. Trong khi tiểu đơn vị B của VT2e ngắn hơn hai axit amin, và tƣơng đồng 87% với SLT-II [7]. Việc phòng bệnh phù nhờ vacxin dựa vào độc tố VT2e cũng đã đƣợc nghiên cứu. MacLeod và Gyles đã chứng minh đƣợc khả năng bảo vệ heo con bằng cách tiêm tĩnh mạch độc tố VT2e bị vô hoạt bởi glutaraldehyde. Gordon và cộng sự đã phát hiện độc tố VT2e sau khi xử lý với formaldehyde có thể tạo miễn dịch trên heo con [9]. Tuy nhiên cách này có thể gây tồn dƣ độc tố in vivo. Ngƣời ta cũng có thể sử dụng một kháng nguyên từ độc tố VT2e đã bị thay đổi một axit amin (Glu167-->Gln) trên vùng hoạt động của tiểu đơn vị A. Việc miễn dịch này có thể bảo hộ cho heo con khỏi bệnh phù bằng đƣờng miệng và không tạo các phản ứng phụ [7]. Tuy nhiên, cho đến nay 14 14 vẫn chƣa thấy loại vacxin dựa vào độc tố VT2e nào hiệu quả trong việc phòng chống bệnh phù trên heo. 2.2 PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB[6] Protein MBP-VT2eB là protein tái tổ hợp đƣợc tổng hợp từ gen MPB-VT2eB có trọng lƣợng phân tử 47kDa. Gen này đƣợc mang bởi vectơ pMal-c2X chứa trong chủng E. coli DH5 do TS. Nguyễn Ngọc Hải tạo ra tại Pháp. Gen MPB-VT2eB đƣợc cấu thành từ gen mục tiêu VT2eB và gen MBP có sẵn trong vectơ pMal-c2X. Trong đó gen VT2eB mã hóa cho tiểu phần B của độc tố VT2eB. Tiểu phần B qui định khả năng kết dính của độc tố đối với các thụ thể có bản chất glycolipid trên tế bào đích. Do đó protein tiểu phần B không có khả năng gây bệnh và mang đặc tính kháng nguyên cho độc tố này. Việc gắn kết gen mục tiêu với gen MBP sẽ tạo nên hệ thống protein dung hợp với MBP (maltose binding protein). Hệ thống này sẽ biểu hiện khi gen đƣợc cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) và tổng hợp protein dung hợp mang protein MPB ở đầu amin và protein mục tiêu ở đầu carboxyl. Protein sinh ra sẽ tích lũy trong vùng chu chất (periplasm) nằm giới hạn giữa màng trong và màng ngoài của vi khuẩn. MPB có trung tâm cơ chất có ái lực cao đối với maltose và amylose, do đó có thể tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với MPB thông qua sắc ký ái lực. Ngoài ra, trên protein tái tổ hợp còn mang vị trí nhận biết đặc hiệu của một protease, do đó có thể phân cắt protein mục tiêu dễ dàng. Hệ thống gen chung VT2eB-MPB đƣợc mang bởi vectơ plasmid pMal-C2X. Gen mục tiêu VT2eB sẽ đƣợc tái tổ hợp với gen malE nhờ các vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn trên các polylinker. Gen malE qui định cho việc tổng hợp protein MBP và hoạt động dƣới sự kiểm soát của gen khởi động ptac. Gen này đƣợc hoạt hóa bởi IPTG. Do đó khi có mặt IPTG, gen ptac sẽ kích ứng sự tổng hợp protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Protein này sẽ đƣợc tinh sạch bằng cách cho qua các cột sắc ký mang hạt amylose. Protein mục tiêu có ái lực với amylose sẽ đƣợc giữ lại. Sau đó, tiếp tục cho dung dịch đệm maltose chạy qua cột sắc ký sẽ thu đƣợc protein này. 2.4 PHƢƠNG PHÁP OUCHTERLONY Phƣơng pháp Ouchterlony hay còn gọi là phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch đƣợc Orjan Ouchterlony phát hiện năm 1948. 2.4.1 Nguyên tắc Phƣơng pháp này dựa trên hai nguyên tắc: 15 15 Cấu trúc phân tử của agar Cấu trúc phân tử đặc trƣng của agar hay agarose cho phép các phân tử có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn 200 kDa khuyếch tán dễ dàng qua các khoảng trống giữa chúng. Nhờ vậy mà các phân tử kháng nguyên hay kháng thể có thể khuyếch tán qua gel tùy theo nồng độ ban đầu và bán kính Stoke, trong khi đó những phân tử ở dạng kết hợp có kích thƣớc lớn sẽ không thể di chuyển. Liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên- kháng thể Kháng nguyên liên kết với epitop kháng thể thông qua vị trí paratop theo nguyên tắc bổ sung không gian tƣơng tự liên kết giữa “ổ khóa- chìa khóa”. Sự liên kết đƣợc thiết lập và duy trì là nhờ các lực hấp dẫn có năng lƣợng nhỏ nhƣ:  Lực tĩnh điện giữa các nhóm COO- và NH3 + đối diện nhau của axid amin trong các chuỗi polypeptit.  Các liên kết hydro giữa các nguyên tử H+ và N- hoặc O-.  Các liên kết kị nƣớc giữa các axit amin kị nƣớc.  Lực Van der Waals do sự di động của các điện tử giữa hai phân tử. Sự liên kết giữa các kháng nguyên- kháng thể là một phản ứng phát nhiệt, giải phóng ra năng lƣợng từ khoảng 2- 40Kcal/mol. Sự liên kết giữa kháng nguyên- kháng thể là một phản ứng cân bằng, có thể đƣợc biểu diễn nhƣ sau: KN + KT KN-KT + nhiệt lƣợng Hằng số kết hợp K= [KN-KT]/[KN][KT] (K: biểu hiện cho sự nghịch đảo của nồng độ l/mol). Sự phù hợp của một kháng thể đối với kháng nguyên đặc hiệu tạo điều kiện xuất hiện nhanh chóng một phản ứng kết tủa hay ngƣng kết. Phản ứng giữa kháng nguyên kháng thể là phản ứng đặc hiệu: một vị trí paratop của kháng thể chỉ kết hợp với một epitop của kháng nguyên. Tuy nhiên tính chất này chỉ tƣơng đối chứ không tuyệt đối có thể bị phân li do các yếu tố nhƣ nhiệt độ, môi trƣờng axit, môi trƣờng ion cao. Do đó phản ứng này phụ thuộc vào hằng số kết hợp, hóa trị của kháng thể và số lƣợng của epitop, nhiệt độ pH và lực ion của môi trƣờng phản ứng. 16 16 2.3.2 Định tính kháng nguyên- kháng thể bằng phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch Các thử nghiệm này đƣợc thực hiện bằng cách cho kháng nguyên hay kháng thể vào các giếng nhỏ đƣợc cắt trên agar hay agarose. Dung dịch kháng nguyên hay kháng thể chuẩn đƣợc cho vào các giếng trung tâm, kháng thể hay kháng nguyên cần tìm sẽ đƣợc cho vào các giếng xung quanh. Chúng sẽ khuyếch tán trong thạch. Nếu chúng gặp nhau ở cùng một tỉ lệ tƣơng đƣơng thì sẽ tạo nên một vạch có thể quan sát bằng mắt thƣờng. 2.4 PHẢN ỨNG TRUNG HÕA ĐỘC TỐ VEROTOXIN TRÊN TẾ BÀO VERO 2.4.1 Sơ lƣợc về tế bào vero Dòng tế bào biểu mô vero nhạy cảm với độc tố SLT đƣợc Y. Yasumura và Y. Kawakita phát hiện đầu tiên vào năm 1962 ở trƣờng đại học Chipa (Nhật Bản). Tế bào này thu đƣợc từ mô tế bào thận khỉ Châu Phi trƣởng thành (African green monkey) (Cercopithecus) [13]. Dòng tế bào này có nhiều Gb3 và Gb4 trên màng tế bào chất do đó nên chúng đƣợc dùng để phát hiện các VT2e. Ngƣời ta có thể phát hiện sự hiện diện của SLT trong mẫu thông qua việc ủ dịch này trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero đơn lớp mỏng. Thông thƣờng các thử nghiệm đƣợc tiến hành trên những đĩa polystyren 96 giếng. Việc phát hiện sự hiện diện của độc tố này dựa trên sự phân tách tế bào vero sau khi ủ 48-72 giờ. Hình 2.2 Liên kết kháng nguyên- kháng thể ( 17 17 2.4.2 Nguyên tắc phản ứng trung hòa độc tố [4] Khi kháng thể đặc hiệu gặp độc tố tƣơng ứng chúng sẽ kết hợp và làm mất hoạt tính của độc tố. Do đó độc tố không còn gây độc đối với cơ thể động vật. Phản ứng đó đƣợc gọi là phản ứng trung hòa độc tố. Huyết thanh chứa kháng thể kháng độc tố là huyết thanh kháng độc tố. Ngƣời ta có thể định hiệu giá kháng thể kháng độc tố dựa trên phản ứng trung hòa xảy ra khi kháng độc tố kết hợp với độc tố tƣơng ứng. 2.4.3 Đánh giá hiệu quả vacxin bệnh phù bằng phƣơng pháp trung hoà độc tố verotoxin trên tế bào vero. Phƣơng pháp trung hòa độc tố verotoxin trên tế bào vero đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá hiệu giá của kháng huyết thanh mang kháng thể của độc tố vero. Nguyên tắc của phản ứng này nhƣ sau: Trên tế bào vero, độc tố verotoxin sẽ liên kết với các thụ thể đặc hiệu có trên màng tế bào rồi cản trở sự tổng hợp protein của tế bào gây chết tế bào. Nếu độc tố này đƣợc ủ với kháng huyết thanh chứa kháng thể của độc tố này, thì kháng thể có trong huyết thanh sẽ liên kết với độc tố làm bất hoạt độc tố và tế bào không bị chết. Dựa trên sự quan sát độ phân tách của tế bào ngƣời ta có thể biết đƣợc là nó chết hay không. Căn cứ trên nồng độ huyết thanh trung hòa đƣợc lƣợng độc tố ở liều TCID50 ngƣời ta có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh và đánh giá hiệu quả của vacxin. Protein MBP-VT2eB đƣợc tạo ra dựa trên tiểu phần B của độc tố VT2e qui định khả năng liên kết với các thụ thể đặc trƣng trên tế bào đích. Do đó khi tiêm protein MBP-VT2eB trên heo thì heo sẽ tạo ra kháng thể chống lại tiểu phần B của độc tố VT2e. Do đó, độc tố này không có khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên tế bào gốc nên mất khả năng gây bệnh. Dựa trên phản ứng trung hòa độc tố verotoxin trên tế bào vero, có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh. Nhờ đó đánh giá đƣợc khả năng gây đáp ứng miễn dịch của protein MBP-VT2eB trên heo. 18 18 PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM - Thời gian : từ 1/3/2005 đến 30/7/2005 - Địa điểm thực hiện:  Trại chăn nuôi heo của anh Thắng ở ấp 8, xã Tân Thạnh Đông, huyện Củ Chi.  Trung tâm phân tích thí nghiệm trƣờng ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.  Phòng kiểm định vacxin viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Tiêm protein tái tổ hợp trên MBP-VT2e trên heo con theo mẹ và đánh giá độ an toàn của dịch tiêm. - Khảo sát liều TCID50 của độc tố VT2e trên tế bào vero. - Khảo sát hiệu giá kháng thể kháng MBP- VT2e theo phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch. - Khảo sát hiệu giá kháng thể kháng MBP-VT2e bằng phƣơng pháp trung hòa độc tố trên tế bào vero. 3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 3.3.1 Vật liệu và thú thí nghiệm - Heo con theo mẹ: 25 con. - Máu heo thí nghiệm - Vi khuẩn E. coli sinh độc tố VT2e O138:K28 (H28) - Vi khuẩn E. coli không sinh độc tố VT2e (DH5 ) - Tế bào vero 3.3.2 Hóa chất thí nghiệm - Chất bổ trợ Al(OH)3 - Môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero DMEM - Trypsin 0,5% - Versene 0,2% - Huyết thanh bê (Fetal calf serum: FCS) - Môi trƣờng lactose broth - Agarose 19 19 - Phenol - Muối NaCl, muối NaH2PO4.2H2O, muối NaHPO4.12H2O - Dung dịch đệm PBS (phosphate buffer saline) - Sodium azid NaN3. - Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB - Đệm borat - Formol - Thuốc nhuộm xanh methylene - Nƣớc cất 3.3.3 Dụng cụ thí nghiệm - Syringe vô trùng 1ml và 5ml - Effendof 1,5ml - Tủ cấy vô trùng - Máy li tâm lạnh - Tủ ấm CO2 - Đĩa polystyren 96 giếng - Miếng plastic dán đĩa polystyren - Chai nuôi tế bào Roux 25, 80cm2 - Pippete man - Pippete Pasteur - Đầu côn 1000 l,100 l - Ống thủy tinh 3ml - Máng nhựa tiệt trùng - Kính hiển vi soi ngƣợc IOD3 - Máy Spectrophotomer - Buồng đếm hồng cầu GASSALEM - Tủ lạnh 2-8oC, tủ lạnh -20oC - Đĩa petri 3cm - Dụng cụ đục lỗ - Lò microwave - Cân phân tích 20 20 3.4 PHƢƠNG PHÁP 3.4.1 Bố trí thí nghiệm - Tiến hành khảo sát trên 5 lô, số lƣợng heo con 5 cá thể/lô, phân bố ngẫu nhiên từ heo con lớn nhất trong bầy của 5 nái:  Lô 1: lô đối chứng không tiêm vac-xin chỉ tiêm chất bổ trợ.  Lô 2: tiến hành tiêm 1 lần vào lúc 14 ngày tuổi với liều 50 g protein tái tổ hợp/ml.  Lô 3: tiêm 2 lần vào lúc 14 ngày tuổi và 24 ngày tuổi với liều 50 g protein tái tổ hợp/ml.  Lô 4: tiến hành tiêm 1 lần vào lúc 14 ngày tuổi với liều 75 g protein tái tổ hợp/ml.  Lô 5: tiêm 2 lần vào lúc 14 ngày tuổi và 24 ngày tuổi với liều 75 g protein tái tổ hợp/ml. Lô 1* 2 3 4 5 Liều tiêm( g/ml) 0 50 50 75 75 Số lần tiêm 0 1 2 1 2 *: tiêm chất bổ trợ Al(OH)3 2 lần, 1ml/con 3.4.2 Cách pha dịch tiêm - Chuẩn bị dịch Al(OH)3 vô trùng - Pha liều protein tái tổ hợp với thể tích tƣơng ứng với Al(OH)3 để đạt hàm lƣợng 50 g hay 75 g protein tái tổ hợp/ml. Sau đó lắc đều trong thời gian 45 phút. Phân phối vào các chai nhỏ 2 liều/ chai bảo quản ở 4oC cho đến khi tiêm. - Mỗi lần tiêm 1ml. Tiêm bắp. 3.4.3 Lấy máu Máu đƣợc lấy ngay trƣớc khi tiêm và mỗi tuần một lần sau khi tiêm ở tất cả các cá thể thí nghiệm cho đến 42 ngày tuổi. Lấy máu heo: dùng syringe lấy 1ml máu ở xoang tĩnh mạch cổ. Sau đó để 4oC qua đêm, chắt lấy huyết thanh. Đem ly tâm 3000 vòng/5 phút, thu dịch nổi, chia làm 21 21 2 phần: cho sodium azid NaN3 khoảng 0,05% bảo quản ở 4 oC một phần, phần kia không bổ sung sodium azid NaN3 bảo quản ở -20 o C. 3.4.4 Định tính kháng thể bằng phƣơng pháp Ouchterlony  Phƣơng pháp tiến hành: [18]  Chuẩn bị giá thạch: - Cân 1,125 g agarose và 8g NaCl cho vào 100ml dung dịch nƣớc cất khử ion. Nấu sôi ở 100oC cho đến khi agarose tan hoàn toàn đƣợc dung dịch trong suốt. Sau đó cho 500μl phenol, lắc cho phenol tan đều. - Để nguội khoảng 60oC, rồi đem rót vào các đĩa Petri có đƣờng kính 3cm, để cho thạch đông cứng rồi tiến hành đục một giếng trung tâm và 6 giếng xung quanh với chiều cao 1,5mm, đƣờng kính là 6mm và khoảng cách giữa các giếng là 5mm.  Tiến hành lót mẫu: theo 2 cách - Kháng nguyên là dịch độc tố VT2e (đƣợc thu nhƣ dùng trong phản ứng trung hòa độc tố mục 3.4.5) hay protein tái tổ hợp MBP-VT2eB (nồng độ 0.38mg/ml) với các độ pha loãng từ 1, 1/2, 1/4, …,1/32 đƣợc cho vào các giếng xung quanh, kháng huyết thanh đƣợc cho vào giếng trung tâm. - Kháng nguyên đƣợc cho vào giếng trung tâm và kháng huyết thanh đƣợc cho vào ở các giếng xung quanh. Đem đĩa petri này bỏ vào trong một hộp nhựa kín có lót giấy thấm nƣớc để giữ ẩm. Đem ủ ở nhiệt độ phòng, rồi đọc kết quả trong 24g -48g.  Cách đọc kết quả: Quan sát trên đĩa, nếu ở vị trí nào có một đƣờng cong mờ đục (hình 3.1) thì ở giếng đó cho kết quả dƣơng tính nghĩa là ở độ pha loãng đó kháng huyết thanh này có chứa kháng thể tƣơng ứng và hàm lƣợng kháng thể tƣơng đƣơng. Các đƣờng cong do vạch kết tủa tạo ra có thể có hình dạng khác nhau( hình 3.2) Phản ứng dƣơng tính hoàn toàn (complete identity) (+): nếu hai kháng nguyên giống nhau hay có hai epitop tƣơng tự, cung kết tủa kháng thể có đặc tính liên tục. Phản ứng âm tính (non- identity) (-): nếu hai kháng nguyên khác nhau thì chúng sẽ kết hợp với hai kháng thể tạo ra cung kết tủa bắt chéo nhau. 22 22 Phản ứng dƣơng tính một phần (partial identity) (±): nếu hai kháng thể có một epitop chung và một epitop riêng cho mỗi loại thì sẽ thấy một cung kết tủa bổ sung tạo ra nhánh có kháng nguyên thứ hai [5]. 3.4.5 Xác định liều TCID50 3.4.5.1 Chuẩn bị dịch độc tố Vi khuẩn E. coli dòng O139:K82 có gen qui định độc tố VT2e đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lactose broth, ở 37oC lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ. Dịch nuôi cấy đem ly tâm 10000 vòng/30 phút, thu dịch trong đem lọc qua màng lọc 0,45 m để thử độc tố trên tế bào vero. 3.4.5.2 Chuẩn bị tế bào vero Tế bào vero sẽ đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng Eagle minimum, bổ sung 10% huyết thanh bê, 2mM gentamycin trong các chai nhỏ ở 37oC, 5% CO2 [12]. Các tế bào này sẽ đƣợc chuyển vào các đĩa 96 giếng theo các bƣớc sau: + Đổ bỏ môi trƣờng cũ trong chai. + Rửa lớp tế bào 2 lần bằng versene 0,2% để loại bỏ các tế bào chết. (-) Vạch kết tủa (+) KN (hay KT) KT (hay KN) Hình 3.1 Phản ứng dƣơng tính của phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch. ( P/immu2.htm) Hình 3.2 Hình dạng các vạch kết tủa của phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch. An: antigen, Ab: antibody. (+) (-) (±) 23 23 + Rửa tế bào 2 lần với trypsin 0,5% cho vào trong chai, loại bỏ trypsin chỉ giữ lại 1-2 giọt để giữ ẩm bế mặt tế bào. + Ủ trong tủ ấm 2-3 phút. + Sau đó hút 2 ml môi trƣờng DMEM có 10% huyết thanh bê cho chảy trên thành chai nhiều lần để phân tách tất cả tế bào vero ra khỏi thành chai. Hút 0,2ml đem đếm. Tiếp tục pha loãng bằng môi trƣờng DMEM để nồng độ tế bào là 300.000 tế bào/ml và nồng độ huyết thanh là 10%. Đem phân vào đĩa 96 giếng, ủ ở 34oC trong 24 giờ. Nếu còn dƣ tế bào thì tiếp tục cho môi trƣờng DMEM có 10% huyết thanh bê rồi chuyển sang chai mới để tiếp tục nuôi cấy. 3.4.5.3 Xác định liều TCID50: đƣợc thực hiện theo sơ đồ 3.1[16] 24 24 Sơ đồ 3.1: Xác định liều TCID50 của dịch lọc vi khuẩn đối với tế bào vero  Đối chứng (-)1: giếng chỉ chứa môi trƣờng nuôi cấy tế bào.  Đối chứng (-)2: giếng có dịch lọc canh khuẩn E. coli DH5α không chứa độc tố VT2e. Đổ bỏ môi trƣờng. Tráng 1 lần bằng dung dịch đệm PBS Hút 100 l dịch lọc canh khuẩn ở mỗi nồng độ pha loãng trên vào mỗi giếng. Ủ 37oC, 5% CO2 từ 1-2 ngày Dịch thu từ huyễn dịch vi khuẩn E. coli dòng O139: K82 nuôi cấy ở trên đƣợc pha loãng theo tỷ lệ 1/2, 1/20, 1/200… trong môi trƣờng DMEM. Đọc độ hấp thụ bằng máy Spectrophotometre ở bƣớc sóng 620nm Cho vào mỗi giếng 200µl formalin 2% trong PBS 0,067M (pH 7,2) trong 1 giờ Cho vào mỗi giếng 100µl/giếng thuốc nhuộm blue methylene đƣợc pha loãng trong dung dịch đệm borat 0,01M Đổ formol, tráng qua các giếng 2 lần bằng dung dịch đệm borat 0,01M, pH 8,5 Đổ bỏ thuốc nhuộm. Tráng 5 lần bằng nƣớc khử ion. Rửa 4 lần với ethanol 50% pha loãng trong 0,9ml đệm PBS để loại bỏ thuốc nhuộm Để đĩa khô ở 37oC trong 1 giờ Xác định liều TCID50 Quan sát trực tiếp dƣới kính hiển vi ở các thời điểm 24giờ, 48giờ. Những giếng dƣơng tính là những giếng có sự phân tách tế bào 25 25 - Kết quả ghi nhận: nồng độ TCID50 là nồng độ gây chết 50% tế bào vero nghĩa là giá trị OD 50% so với OD của giếng đối chứng (-)1. 3.4.6 Thực hiện phản ứng trung hòa độc tố [8], sơ đồ 3.2  Tiến hành ủ độc tố với huyết thanh trên đĩa 96 giếng nhƣ sau: Hút100 l dungdịch môi trƣờng nuôi cấy tế bào cho vào mỗi giếng. Sau đó hút 100 l huyết thanh cho vào giếng đầu tiên rồi hút 100 l từ giếng này cho vào các giếng tiếp theo. Pha loãng cho đến khi nồng độ đạt 1/152. Tiến hành tƣơng tự cho các mẫu huyết thanh còn lại, mỗi một mẫu là một hàng. Tiếp theo cho 100 l dịch độc tố có nồng độ 10TCID50 vào tất cả các giếng, dán giấy plastic rối đem ủ ở 37oC trong 24g.  Tiến hành trung hòa độc tố trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero: Hút 100 l hỗn hợp huyết thanh và độc tố đã chuẩn bị nhƣ ở mục 3.4.5.1cho vào các giếng tế bào đã đƣợc chuẩn bị nhƣ ở mục 3.4.4.2. Mỗi hàng sẽ là một mẫu huyết thanh theo trình tự nồng độ pha loãng tăng dần, mỗi mẫu tiến hành trên hai hàng giếng. Đối chứng dƣơng là những giếng chỉ có tế bào vero, đối chứng âm là những giếng ủ với dịch độc tố có nồng độ TCID50 đã xác định. Ủ 37 o C trong 5% CO2. Quan sát hình thái tế bào dƣới kính hiển vi ở các thời điểm 24g và 48g. Sau đó tiến hành nhuộm với xanh methylene nhƣ các bƣớc đƣợc mô tả ở mục 3.4.5 26 26 Sơ đồ 3.2: Thử nghiệm trung hòa độc tố trên tế bào vero 3.5 CÁC CHỈ TIÊU THEO DÕI - Các triệu chứng shock phản vệ khi tiêm vac-xin vào nhƣ dị ứng, sốt,... có hay không - Liều TCID50 tính theo công thức Reed- Muench - Hiệu giá kháng thể trung hòa có trong kháng huyết thanh - Xử lý số liệu bằng trắc nghiệm F trên phần mềm Statgraphic 7.0 Hút 100 l huyết thanh heo thí nghiệm pha loãng với 100 l dung dịch môi trƣờng nuôi cấy tế bào.Tiếp tục pha loãng cho đến nồng độ từ 1/2 1/152 Hút 100 l hỗn hợp này vào mỗi giếng đã đƣợc nuôi cấy tế bào vero để kiểm tra phản ứng trung hòa độc tố. Đối chứng (+) là những giếng chỉ có tế bào vero, đối chứng (-) là giếng đƣợc ủ với 100 l dịch lọc vi khuẩn có nồng độ TCID50 đã xác định. Ủ 37oC trong CO2 5% trong 48-72g Ủ huyết thanh với độc tố ở 37oC trong 1g, ủ ở 4oC trong 24g Đánh giá kết quả bằng cách quan sát dƣới kính hiển vi, nhuộm , đọc kết quả và xác định hiệu giá kháng huyết thanh trung hòa độc tố VT2e 27 27 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA VACXIN Theo dõi heo con sau khi tiêm vacxin 24 giờ thì không thấy có các phản ứng shock phản vệ nhƣ sốt, biếng ăn, dị ứng… xảy ra. Theo dõi tăng trọng của heo con trong 5 tuần thấy tăng trọng trung bình của heo con tuy có khác nhau nhƣng không có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các lô thí nghiệm (P>0.05) Bảng 4.1: Tăng trọng của heo con trong thời gian thí nghiệm Lô Trọng lƣợng trung bình heo con lúc 2 tuần tuổi (kg/con) Trọng lƣợng trung bình heo con lúc 7 tuần tuổi (kg/con) Tăng trọng bình quân heo con (kg/con) 1 3,96 ± 1,083 10,6 ± 1,817 6,74 ± 0,873 2 3,83 ± 0,153 9,67 ± 1,53 5,84 ± 1,46 3 4,15 ± 0,404 10,75 ± 1,9 7,12 ± 0,44 4 3,78 ± 0,23 10,9 ± 0,89 7,12 ± 0,44 5 3,67 ± 0,96 10,5± 1,73 6,82 ± 1,11 Từ đó cho thấy, vacxin tái tổ hợp MBP-VT2eB ở liều tiêm là 50μg và 75μg/heo trong keo phèn là an toàn đối với heo con. 4.2 ĐỊNH TÍNH KHÁNG HUYẾT THANH THEO PHƢƠNG PHÁP KẾT TỦA KHUYẾCH TÁN TRÊN THẠCH Phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch cho phép xác định sự hiện diện của kháng thể dựa trên nguyên tắc kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên kháng thể. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là đơn giản và nhanh chóng. Chúng tôi đã tiến hành định tính kháng huyết thanh thu đƣợc theo phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch nhằm đánh giá sơ bộ hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp. 4.3.1 Với kháng nguyên là độc tố của E. coli H28 Thực hiện định tính kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch với kháng nguyên là độc tố của E.coli H28 đều cho kết quả âm tính với cả mẫu huyết thanh heo và đối chứng dƣơng. Đối chứng dƣơng là huyết thanh thỏ đã cho kết quả dƣơng tính trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào. Phƣơng pháp khuyếch tán 28 28 kết tủa khuyếch tán trên thạch là một phƣơng pháp kém nhạy, do đó kết quả âm tính có thể do những nguyên nhân sau đây: Hàm lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh quá thấp hay không có nên không có phản ứng kết tủa xảy ra. Hàm lƣợng độc tố: do dịch độc tố sử dụng trong thử nghiệm này là dịch lọc vi khuẩn nuôi cấy có thể hàm lƣợng độc tố thấp nên không đủ để phản ứng kết tủa xảy ra. Vì lí do trên nên chúng tôi tiến hành định tính kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch với kháng nguyên là protein tái tổ hợp MBP- VT2eB. 4.3.2 Với kháng nguyên MBP-VT2eB Tiến hành định tính kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch với kháng nguyên là protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có nồng độ 0,38mg/ml đƣợc kết quả nhƣ sau: Đối với đối chứng dƣơng: kết quả dƣơng tính đến nồng độ protein pha loãng 1/4 (hình 4.1) Đối với mẫu huyết thanh: kết quả âm tính ở tất cả các mẫu (hình 4.2) 1 2 3 4 5 6 KT Vạch kết tủa Hình 4.1 Kết quả dƣơng tính với huyết thanh thỏ KT: Kháng thể Kháng nguyên: protein MBP-VT2eB 0.38mg/ml 1.Kháng nguyên pha loãng 1 2. Kháng nguyên pha loãng ½ 3.Kháng nguyên pha loãng ¼ 4. Kháng nguyên pha loãng 1/8 5. Kháng nguyên pha loãng 1/16 6. Kháng nguyên pha loãng 1/32 1 2 3 4 5 6 KT Hình 4.2 Kết quả âm tính với huyết thanh heo 1. 2 3 4 5 6 KN 29 29 Từ đó kết luận liều tiêm 50 g/heo và 75 g/heo có lập lại và không lập lại đều tạo lƣợng kháng thể không đủ để phát hiện bằng phƣơng pháp kết tuả khuyếch tán trên thạch. 4.3 LIỀU TCID50 CỦA DỊCH LỌC VI KHUẨN Thực hiện chuẩn độ độc tố VT2e đã lọc qua màng lọc 0,45 m trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero có kết qủa nhƣ sau:  Hình thái tế bào khi quan sát dƣới kính hiển vi tại thời điểm 24- 48 giờ:  Thời điểm 24 giờ: Ở giếng đối chứng tế bào và giếng DH5α, thảm tế bào phát triển tốt. Ở các giếng nồng độ pha loãng 1/2 thấy có xuất hiện các tế bào chết nhiều hơn so với các giếng có nồng độ pha loãng thấp hơn nhƣng số lƣợng chƣa nhiều, các tế bào chết có hình dạng co tròn và sẫm màu hơn so với thảm tế bào ở dƣới, môi trƣờng có sự đổi màu từ màu hồng sang màu hồng nhạt. Ở các giếng còn lại cũng có tế bào chết nhƣng rất ít chủ yếu là do những tế bào già bị chết và không có sự chênh lệch rõ rệt giữa các độ pha loãng.  Thời điểm 48 giờ: Ở giếng đối chứng tế bào, thảm tế bào vẫn phát triển tốt (Hình 4.3) Các giếng mẫu ở các nồng độ 1/2, 1/20, 1/200 tế bào chết với số lƣợng lớn, chết nhiều nhất ở nồng độ ½ và giảm dần ở các nồng độ loãng hơn. Ở các giếng 1/2000 thì tế bào cũng chết nhiều hơn so với các giếng còn lại nhƣng số lƣợng không đáng kể. Các giếng ở các nồng độ còn lại tế bào chết không rõ rệt và không có sự chênh lệch giữa các nồng độ pha loãng. Do đó có thể kết luận đƣợc hiện tƣợng chết tế bào ở các nồng độ 1/2, 1/20, 1/200, 1/2000 chủ yếu là do độc tố.  Kết quả đo OD 620nm: Bảng 4.2 Kết quả đo OD trên đĩa nuôi cấy tế bào với dịch lọc vi khuẩn Nồng độ 1/2 1/20 1/200 1/2.103 1/2.104 1/2.105 ĐC OD 620nm 0.123 0.156 0.419 0.984 1.052 1.056 1.097 % tế bào sống 11.2 14.2 38.2 89.7 95.9 96.3 30 30 Biểu đồ 4.1 Đồ thị chuẩn độ độc tố Từ kết quả đo OD 620nm, ta thấy liều TCID50 sẽ nằm ở khoảng nồng độ pha loãng 1/200 và 1/2.103. Điều này hợp lí với kết quả ghi nhận bằng quan sát hình thái tế bào ở các thời điểm 24g và 48g. Ta có thể xác định đƣợc nồng độ pha loãng của độc tố gây chết 50% tế bào theo phƣơng pháp Reed- Muench: Vậy liều TCID50 của dịch lọc vi khuẩn E. coli O139: K82 nuôi cấy trong môi trƣờng lactose broth trong 24g là ở độ pha loãng 1/340. Sử dụng liều này để tiến hành thực hiện phản ứng trung hòa độc tố. 4.4 HIỆU GIÁ KHÁNG HUYẾT THANH TRÊN MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO 4.4.1 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid chƣa bất hoạt Tiến hành thực hiện phản ứng trung hòa độc tố trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero đối với mẫu huyết thanh của lô 5 có bổ sung sodium azid chƣa bất hoạt. Đây là lô có xác suất tạo kháng thể cao nhất do liều tiêm cao nhất 75μg/ml và có lập lại. Kết quả nhƣ sau: % tế bào sống ở nồng độ 1/2.103- % tế bào sống ở nồng độ 1/200 Liều TCID50 = log1/200 + 50- % tế bào sống ở nồng độ 1/200 x log 10 50 – 38.2 = 2.3 + x 1 = 2.53 ~ log 1/340 89.7 – 38.2 1/2.10 3 31 31 Thời điểm 24 giờ: Đối chứng dƣơng : tế bào phát triển tốt. Đối chứng âm: có hiện tƣợng tế bào chết với hình thái nhƣ chết do độc tố: tế bào co tròn, chuyển màu sậm hơn so với thảm tế bào bên dƣới nhƣng chƣa rõ ràng. Đối với các mẫu: xuất hiện hiện tƣợng tế bào chết hàng loạt với các triệu chứng khác hẳn với chết do độc tố. Các tế bào này chết co tròn, có màu sậm và tụ thành cụm. Không có sự khác biệt rõ rệt giữa các nồng độ. Tuy nhiên, thảm tế bào bên dƣới vẫn còn nên chúng tôi tiếp tục quan sát ở thời điểm 48 giờ. Thời điểm 48 giờ: Đối chứng dƣơng: tế bào vẫn phát triển bình thƣờng, màu tế bào không đổi chứng tỏ không có hiện tƣợng nhiễm khuẩn. Đối chứng âm (không có huyết thanh chỉ có độc tố) : Tế bào chết hàng loạt sau 48 giờ nuôi cấy với các triệu chứng nhƣ chết do độc tố. Đối với các giếng mẫu: tế bào chết với triệu chứng nhƣ trên rất rõ rệt, thảm tế bào bên dƣới chết hoàn toàn. Do đó chúng tôi kết luận tế bào chết không phải do độc tố mà do một thành phần nào đó trong huyết thanh gây ra nhƣ bổ thể hay do sodium azid. Vì vậy để tìm ra nguyên nhân gây chết tế bào chúng tôi tiến hành thử nghiệm trung hòa độc tố với mẫu huyết thanh này nhƣng có bất hoạt ở 56oC trong thời gian 30 phút. 4.4.2 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid và có bất hoạt Tiến hành thực hiện phản ứng trung hòa độc tố trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero đối với mẫu huyết thanh của lô 5 có bổ sung sodium azid và bất hoạt ở 56oC trong thời gian 30 phút. Kết quả nhƣ sau: Hình thái tế bào khi quan sát dưới kính hiển vi ở thời điểm 24h và 48h  Thời điểm 24 giờ: Đối chứng tế bào phát triển tốt, môi trƣờng vẫn có Đối chứng độc tố: có hiện tƣợng tế bào chết với hình thái nhƣ chết do độc tố: tế bào co tròn, chuyển màu sậm hơn so với thảm tế bào bên dƣới nhƣng chƣa rõ ràng. Ở các giếng mẫu: có hiện tƣợng tế bào chết hàng loạt nhƣng lớp tế bào dƣới đáy giếng vẫn còn. Môi trƣờng vẫn còn màu hồng chứng tỏ tế bào vẫn phát triển tốt không có hiện tƣợng nhiễm khuẩn. 32 32  Thời điểm 48 giờ: Đối chứng dƣơng: tế bào vẫn phát triển bình thƣờng, màu môi trƣờng không đổi chứng tỏ không có hiện tƣợng nhiễm khuẩn. Đối chứng âm: Tế bào chết hàng loạt sau 48giờ nuôi cấy. Đối với mẫu: Các tế bào này khi chết co cụm, bám thành mảng và sậm màu, thảm tế bào ở dƣới chết hoàn toàn. Ở nồng độ pha loãng huyết thanh càng thấp thì số tế bào chết càng ít. Điều này khác với chết do độc tố. Tế bào chết do độc tố cũng co lại nhƣng riêng rẻ, có màu nhạt, bên dƣới vẫn còn thấy lớp tế bào mỏng, và nếu nhƣ huyết thanh không có kháng thể để trung hòa độc tố thì tế bào ở các giếng này phải chết tƣơng đƣơng nhau. Ngƣợc lại, nếu huyết thanh có kháng thể thì lƣợng tế bào chết là tỉ lệ nghịch với độ pha loãng. Hơn nữa, đối chứng tế bào vẫn phát triển tốt, môi trƣờng không đổi màu nên không có hiện tƣợng bị nhiễm khuẩn ở đây. Do đó chúng tôi kết luận tác nhân chính gây hiện tƣợng chết tế bào không phải do độc tố VT2e. Kết quả đo OD 620nm Từ kết quả đo OD 620nm (bảng 3) cho thấy: Các giếng ở nồng độ huyết thanh cao (1/2, 1/4, 1/8, 1/32, 1/64) thì chỉ số OD thấp và thấp so với đối chứng âm, có nghĩa là tế bào chết nhiều so với đối chứng độc tố. Các giếng có nồng độ huyết thanh càng thấp (1/128, 1/256, 1/512, 1/1024, 1/2048) thì chỉ số OD càng cao, nghĩa là tế bào chết càng ít. Điều này không đúng với nguyên tắc trung hòa độc tố: nếu huyết thanh có kháng thể thì nồng độ huyết thanh càng cao khả năng trung hòa độc tố càng cao. Do đó tế bào không bị chết bởi độc tố nên chỉ số OD cao. Hay nói cách khác nồng độ huyết thanh tỉ lệ thuận với chỉ số OD. Trong trƣờng hợp nếu huyết thanh không có kháng thể chống lại độc tố hay kháng thể quá thấp thì các giếng này sẽ chết tƣơng đƣơng nhau và tƣơng đƣơng với đối chứng âm. Chỉ số OD của giếng đối chứng âm chênh lệch với đối chứng dƣơng không rõ rệt (0.041 ở phiến 1 và 0.046 ở phiến 2) chứng tỏ độc tố trong thử nghiệm này kém hoạt tính và chỉ số OD của các giếng có nồng độ huyết thanh thấp lại cao hơn so với đối chứng dƣơng. Do đó độc tố không khả năng gây chết tế bào hàng loạt nhƣ trên. Bởi vì huyết thanh chúng tôi lấy trong điều kiện vô trùng, có bất 33 33 hoạt các thành phần có trong huyết thanh có khả năng gây hại cho tế bào trƣớc khi thử nghiệm nhƣ bổ thể,…nhƣng lại bổ sung sodium azid để tăng thời gian bảo quản nên có thể do sodium azid đã gây chết tế bào hàng loạt. Vì chất này là một chất kháng khuẩn nên có thể gây hại cho tế bào. Để khẳng định điều này chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm chứng minh sodium azid là yếu tố gây chết tế bào. 4.4.3 Thí nghiệm chứng minh sodium azid gây chết tế bào vero 4.4.3.1 Mẫu huyết thanh có sodium azid có bất hoạt Tiến hành ủ huyết thanh có bổ sung sodium azid đã bất hoạt với tế bào vero thì sau 24 giờ nuôi cấy xuất hiện hiện tƣợng tế bào chết hàng loạt với các đặc điểm nhƣ thử nghiệm trung hòa độc tố. 4.4.3.2 Đối với mẫu không có sodium azid có bất hoạt Tiến hành ủ huyết thanh không bổ sung sodium azid đã bất hoạt với tế bào vero thì sau 24 giờ nuôi cấy tế bào vẫn phát triển bình thƣờng, màu môi trƣờng chuyển sang màu hồng nhạt. Do đó chúng tôi kết luận sodium azid đã gây ra hiện tƣợng chết tế bào hàng loạt. 4.4.4 Đối với mẫu huyết thanh không có sodium azid và có bất hoạt Qua các kết quả khảo sát trên chúng tôi chọn mẫu kháng huyết thanh không có sodium azid để thực hiện phản ứng trung hòa trên tế bào vero. Chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Tiến hành thực hiện phản ứng trung hòa độc tố trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero đối với mẫu huyết thanh không bổ sung sodium azid có kết quả nhƣ sau:  Hình thái tế bào khi quan sát dƣới kính hiển vi ở thời điểm 24-48 giờ:  Thời điểm 24 giờ: Ở giếng đối chứng tế bào (đối chứng dƣơng) tế bào phát triển tốt, giếng đối chứng độc tố (đối chứng âm) có hiện tƣợng tế bào chết rải rác, sậm màu hơn so với thảm tế bào nhƣng không đáng kể. Ở các giếng mẫu tế bào có chết nhƣng không rõ ràng, thảm tế bào vẫn phát triển tốt. Môi trƣờng nuôi cấy có màu hồng nhạt, không có hiện tƣợng nhiễm khuẩn.  Ở thời điểm 48 giờ: 34 34 Ở giếng đối chứng tế bào (đối chứng dƣơng) tế bào phát triển tốt, giếng đối chứng độc tố (đối chứng âm) có hiện tƣợng tế bào chết hàng loạt, sậm màu hơn so với thảm tế bào bên dƣới. Ở các giếng mẫu cũng có hiện tƣợng tế bào chết hàng loạt nhƣ ở giếng đối chứng âm, tuy nhiên không có sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu và các nồng độ pha loãng.  Chỉ số OD 620nm (bảng 4) Ở tất cả các mẫu thí nghiệm, chỉ số OD đều thấp hơn so với đối chứng dƣơng và cả đối chứng âm. Bên cạnh đó chỉ số OD ở các nồng độ và ở các lô thí nghiệm tƣơng dƣơng nhau không có sự chênh lệch rõ rệt. Điều đó chứng tỏ tế bào chết ở tất cả các giếng là tƣơng đƣơng nhau. Từ đó ta có thể kết luận hiệu giá của kháng huyết thanh ở tất cả các lô thí nghiệm là rất thấp không đủ khả năng trung hòa độc tố ở liều 10TCID50 và không có sự khác biệt giữa các lô thí nghiệm. Tiến hành thí nghiệm giảm liều độc tố vero xuống còn 2TCID50 thì kết quả vẫn âm tính. Điều này chứng tỏ liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB 75 g và 50 g/heo kích ứng đáp ứng miễn dịch rất yếu, hiện tƣợng trên có thể do các nguyên nhân sau:  Vì đây là protein tái tổ hợp nên có thể cấu trúc không gian bị thay đổi không giống với cấu trúc của tiểu phần B của độc tố VT2e nên kháng thể tạo ra không đặc hiệu với độc tố nên không có khả năng trung hòa độc tố, hay có thể protein bị biến tính trong quá trình bảo quản và pha dịch tiêm do đó mất đặc tính kháng nguyên đặc trƣng.  Liều tiêm thấp nên lƣợng kháng thể tạo ra không đủ khả năng trung hòa liều 10TCID50. Chúng tôi cho rằng nguyên nhân thứ hai là nguyên nhân chính. Bởi vì trong một thử nghiệm tiêm protein này trên thỏ với liều tiêm 100μg/ml thì protein tái tổ hợp MBP-VT2eB đã kích ứng thỏ tạo kháng thể trung hòa độc tố vero (Phan Lê Mai, 2005, số liệu chƣa công bố). 35 35 Hình 4.3 Hình tế bào vero chết do sodium azid Hình 4.4 Hình tế bào vero chết do độc tố Hình 4.5 Giếng đối chứng độc tố đã nhuộm Hình 4.6 Giếng đối chứng tế bào đã nhuộm 36 36 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN MPB-VT2eB pha trong dung dịch keo phèn là một kháng nguyên an toàn đối với heo với liều tiêm 50µg/heo hay 75µg/heo. Phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch có thể dùng để định tính kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Huyết thanh không bất hoạt và có bổ sung sodium azid 0,05% sẽ gây độc đối với tế bào vero. Liều tiêm 50μg/heo và 75µg/heo có lập lại và không lập lại không đủ khả năng gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể có thể phát hiện đƣợc bằng phƣơng pháp kết tủa khuếch tán trên thạch cũng nhƣ phƣơng pháp trung hòa độc tố trên tế bào vero ở liều 2TCID50. 5.2 ĐỀ NGHỊ Thử nghiệm tăng dần liều kháng nguyên MBP- VT2eB (từ 200- 250 μg/heo). Nếu huyết thanh dùng để trung hòa độc tố trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào thì không nên bổ sung sodium azid và phải bất hoạt ở 56oC trong 30 phút. 37 37 PHẦN 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bùi Thị Cẩm Thuý, 2002. Nghiên cứu thu nhận virus dại từ nuôi cấy tế bào vero dòng thường trực. Khoá luận cử nhân khoa học ngành Sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh. 2. Nguyễn Ngọc Hải, 1999. Phân lập vi khuẩn E. coli gây bệnh phù trên heo cai sữa và khảo sát khả năng nhạy cảm của chúng đối với một số kháng sinh. Luận án thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh . 3. Lê Thanh Hòa, 2004. Bài giảng miễn dịch học và ứng dụng. Viện công nghệ sinh học Hà Nội. 4. Lê Văn Hùng, 2002. Giáo trình miễn dịch học thú y. NXB Nông Nghiệp. 5. Đỗ Ngọc Liên, 1999. Miễn dịch học cơ sở. NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội. 6. Trần Ngọc Phƣơng, 2003. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất độc tố VT2eB tái tổ hợp. Khoá luận cử nhân khoa học ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 7. Bosworth, B. T., Samuel J. E., Moon H. W., O’Brien A. D., Gordon V. M. and Whipp S. C., 1996. Vaccination with Genetically Modified Shiga-like Toxin-IIe prevents Edema Disease in Swine. Infec. Immun. p: 55-66. 8. Gentry and Dalrymple, 1980. Quantitative Microtiter Cytotoxicity Assay Shigella Toxin. J. Clin. Microbiol. p: 361-366. 9. Gordon V. M., Whipp S. C., Moon H. W., O’Brien A. D and Samuel J.E.,1992. An Enzymatic Mutant of Shiga-like toxin-II Variants Is a Vaccine Candidate for Edema Disease of Swine. Infect. Immun. p:485-490. 10. Guigo Grandi, 2004. Genomics, Proteomics and Vaccines. John Wiley & Sons, Ltd. p:7-11 11. James C. Paton and Adrienne W. Paton,1998. Pathogenesis and Diagnosis of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Infections. J. Clin. Microbiol, p:450- 479. 12. Konowalchuk J., Speirs J. I., and Stavric S., 1977. Vero Response to a Cytotoxin of Escherichia coli. Infect. Immun. 18. p:775-779. 38 38 13. Rebecca Sheets, 2000. History and Characterization of Vero Cell Line. A Report for the Vaccines and Related Biological Advisory Committee. 14. Salmuel J. E., Perera L. P., Ward S., O’ Brien A. D., Ginsburg V., and Krivan H.C., 1990. Comparision of the Glycolipid Receptor Specificities of Shiga- Like Toxin Type II and Shiga-Like Toxin II Variants. Infect. Immun. p: 611- 618. 15. Tizard Ian R . 1991. Immunology introduction. 3rd edition, A Harcourt Brace Jovanovich, Florida, USA. 16. Tyler S.D., Jonhnson W.M., Lior H., Wang G., and Rozee K. R., 1991. Identification of Verotoxin Type 2 Variant B Subunit genes in Escherichia coli by the Polymerase Chain Reaction and Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis. J. Clin. Microbiol. p: 1339-1343 Trang Web 16. vaccinesoverviewbody.html 17. 39 39 PHẦN 7 PHỤ LỤC Thành phần các hóa chất Môi trƣờng DMEM ( lƣợng glucose cao) AMINO ACID L-Glutamine 584mg/l L-Valine 94mg/l L-Tyrosine +2Na+ 2H2O 103,79mg/ml L-Tryptophan 16mg/ml L-Threonine 95mg/ml L-Serine 42mg/ml L-Phenylalanine 66 mg/ml L-Methyonine 30 mg/ml L-Lysine + HCl 146 mg/ml L-Isoleusine 105 mg/ml L-Leusine 105 mg/ml L-Histidine+HCl+H2O 42 mg/ml L-Cystine + 2HCl 62,6 mg/ml L-Arginine+HCl 84 mg/ml Glycine 30 mg/ml MUỐI VÔ CƠ CaCl2 6400 mg/ml Sodium Phosphate MonobasicAnhydrous 109 mg/ml NaCl 400 mg/ml Magnesium sulphate anhydryous 97,67 mg/ml Ferric nitrate Nonanhydrate 0,1 mg/ml Calcium chloride dihydrate 265 mg/ml VITAMINS Thiamine+HCl 4mg/ml Riboflavin 0,4 mg/ml 40 40 Nicotiamide 4 mg/ml Myo-inositol 7,2 mg/ml Folic acid 4 mg/ml D-Ca pantothenate 4 mg/ml Choline chloride 4 mg/ml Pyrodoxal + HCl 4 mg/ml CÁC THÀNH PHẦN KHÁC Pyruvic acid.Na 110 mg/ml Phenol red 15,9 mg/ml D-Glucose 4500 mg/ml Đệm Borat Axit boric: 1,2336g H2O: 200ml pH: 8,5 Đệm PBS (phosphate buffer salin) NaCl: 8g NaH2PO4.2H2O: 0,4g NaHPO4.12H2O: 2,5g H2O: 1000ml 41 41 Bảng phân tích biến lƣợng tăng trọng heo thí nghiệm One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: TLG.tlg Level codes: TLG.lo Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.056429 4 .2641071 .195 .9374 Within groups 21.661667 16 1.3538542 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 22.718095 20 Table of means for TLG.tlg by TLG.lo -------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 5 6.7400000 .3906405 .5203564 5.9597925 7.5202075 2 3 7.0666667 .4630815 .6717773 6.0594231 8.0739102 3 4 6.6250000 .7962150 .5817762 5.7527015 7.4972985 4 5 7.1200000 .3484250 .5203564 6.3397925 7.9002075 5 4 6.5750000 .7792892 .5817762 5.7027015 7.4472985 --------------------------------------------------------------------------- Total 21 6.8238095 .2539079 .2539079 6.4431072 7.2045118 Multiple range analysis for TLG.tlg by TLG.lo --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 5 4 6.5750000 X 3 4 6.6250000 X 1 5 6.7400000 X 2 3 7.0666667 X 4 5 7.1200000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.32667 1.80181 1 - 3 0.11500 1.65507 1 - 4 -0.38000 1.56041 1 - 5 0.16500 1.65507 2 - 3 0.44167 1.88438 2 - 4 -0.05333 1.80181 2 - 5 0.49167 1.88438 3 - 4 -0.49500 1.65507 * denotes a statistically significant difference. 42 42 Đ C ( * ) 0 .8 9 8 ( 1 ) 0 .9 3 9 ( 2 ) 0 .7 5 2 ( 3 ) 0 .7 9 8 ( 4 ) 1 /2 0 4 8 0 .9 1 .0 2 0 .8 8 2 0 .8 2 5 0 .8 5 2 1 .0 2 2 1 /1 0 2 4 0 .9 1 5 0 .9 6 8 0 .9 4 5 0 .8 8 6 0 .9 3 1 1 .0 3 6 1 /5 1 2 0 .8 5 5 0 .9 2 8 0 .9 6 0 .8 7 7 0 .9 2 2 0 .9 2 7 1 /2 5 6 0 .8 9 4 0 .9 1 2 0 .8 9 0 .3 8 8 0 .9 1 1 1 /1 2 8 0 .9 0 1 0 .9 5 6 0 .9 2 2 0 .8 4 2 0 .5 9 2 0 .8 5 2 1 /6 4 0 .8 1 8 0 .8 3 8 0 .8 7 9 0 .0 5 4 0 .5 4 9 0 .5 0 4 1 /3 2 0 .5 3 5 0 .8 2 1 0 .4 1 2 0 .0 4 4 0 .3 8 9 0 .0 4 5 1 /1 6 1 0 .0 4 8 0 .5 0 6 0 .0 4 4 0 .4 0 3 0 .0 4 6 1 /8 0 .1 9 9 0 .0 4 4 0 .0 4 5 0 .0 8 5 0 .3 5 6 0 .0 5 5 ¼ 0 .2 7 6 0 .0 4 6 0 .0 4 8 0 .0 5 8 0 .3 8 8 0 .0 4 4 ½ 0 .4 8 2 0 .0 9 8 0 .2 3 4 0 .2 1 9 0 .2 6 6 0 .0 7 1 M ẫu ( * ) 8 8 .5 D 8 9 .5 D 9 0 .4 D 9 2 .1 A 9 2 .2 D 9 3 .2 D B ả n g 3 . K ết q u ả đ o O D 6 2 0 n m đ ố i v ớ i m ẫ u c ó s o d iu m a zi d (1 ) Đ ố i ch ứ n g â m p h iế n 1 . (2 ) Đ ố i ch ứ n g d ƣ ơ n g p h iế n 1 . (3 ) Đ ố i ch ứ n g â m p h iế n 2 . (4 ) Đ ố i ch ứ n g d ƣ ơ n g p h iế n 2 (* ) 8 8 .5 D , 8 9 .5 D ,9 0 .4 D , 9 2 .2 D , 9 3 .2 D l à cá c m ẫu c ủ a lô 5 , 9 2 .1 A l à lô đ ố i ch ứ n g . 43 43 Đ C ( * ) 0 .6 6 7 (1 ) 0 .2 1 2 ( 2 ) 0 .7 0 4 ( 3 ) 0 .1 3 8 ( 4 ) 1 /1 2 8 0 .1 3 6 0 .1 3 0 .1 1 2 0 .1 2 4 0 .1 3 1 0 .1 0 .0 9 8 0 .1 6 5 0 .1 5 5 0 .1 3 8 0 .1 7 3 1 /6 4 0 .1 5 4 0 .1 5 8 0 .1 0 2 0 .1 1 1 0 .1 3 1 0 .1 3 1 0 .1 1 0 .1 6 4 0 .1 4 2 0 .1 6 5 0 .1 4 3 1 /3 2 0 .1 3 9 0 .1 3 4 0 .1 4 4 0 .1 2 0 .1 1 6 0 .1 3 4 0 .1 1 0 .1 4 3 0 .1 1 2 0 .0 7 1 0 .1 1 1 1 /1 6 0 .1 4 2 0 .1 6 3 0 .1 3 3 0 .1 0 5 0 .1 5 1 0 .1 0 4 0 .1 1 0 .1 7 2 0 .1 1 9 0 .0 4 7 0 .1 4 5 1 /8 0 .1 3 3 0 .1 7 4 0 .1 6 0 .1 0 7 0 .1 5 7 0 .1 3 3 0 .1 7 1 0 .1 6 5 0 .0 9 1 0 .0 6 2 0 .0 9 4 ¼ 0 .1 5 2 0 .1 8 0 .1 0 7 0 .1 0 1 0 . 1 3 6 0 .1 6 4 0 .1 5 4 0 . 1 5 2 0 .1 1 4 0 .1 9 4 0 .0 9 3 ½ 0 .1 5 7 0 .1 5 7 0 .1 2 7 0 .0 8 8 0 .0 9 0 .1 0 6 0 .1 2 1 0 .1 5 9 0 .1 1 8 0 .4 8 1 0 .1 M ẫu A 1 4 A 2 4 B 6 4 B 5 4 C 4 4 C 5 4 D 4 4 A 4 4 B 1 4 B 3 4 B 4 4 B ả n g 4 . K ết q u ả đ o O D 6 2 0 n m đ ố i v ớ i m ẫ u k h ô n g c ó s o d iu m a zi d (5 ) Đ ố i ch ứ n g â m p h iế n 1 . (6 ) Đ ố i ch ứ n g d ƣ ơ n g p h iế n 1 . (7 ) Đ ố i ch ứ n g â m p h iế n 2 . (8 ) Đ ố i ch ứ n g d ƣ ơ n g p h iế n 2