Khóa luận Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình lên men tỏi đen và phân tích một số hoạt chất trong tỏi đen

thắt dạ dày ruột. 10 2.1.4.3. Tỏi phòng chống ung thư Tỏi còn là vị thuốc chống ung thư hiệu nghiệm. Tỏi được thái mỏng thành từng lát để trong không khí khoảng 15 phút sẽ sinh ra chất “đại toán tố “ là chất chống ung thư, đó là hỗn hợp các chất có chứa lưu huỳnh, trong củ tỏi còn có các chất khoáng vi lượng như selen, gecmami, có tác dụng chống ôxy hóa tế bào, chống ung thư. Các vitamin C, vitamin E có khả năng ngăn chặn sự phát triển của các khối ung bướu. Theo các nhà nghiên cứu thì tỏi có công dụng trị ung thư da, ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư cột sống Được giải thích qua cơ chế: - Mọi khối ung thư đều trải qua ba giai đoạn phát triển, và ở giai đoạn nào chúng cũng bị tỏi chống phá. Trong giai đoạn đầu tiên, hoạt động của ôxy trong cơ thế qua quá trình ôxy hóa chuyển thức ăn thành năng lượng đã sản sinh ra gốc tự do ( loại chất có hại ) gây thương tổn các tế bào khiến nó phát triển bất thường. Việc ăn tỏi hàng ngày có thể vô hiệu hóa các gốc tự do. Các chất chống ôxy hóa trong tỏi có khả năng tấn công khối u trước khi nó có thể nhen nhóm. Ở giai đoạn thứ hai là giai đoạn phát bệnh, những tế bào ung thư sẽ phát triển nhanh nếu các hệ thống miễn dịch ban đầu bị phá vỡ. Lúc này tỏi sẽ có tác dụng ngăn không cho các tế bào ung thư phát triển, tiêu diệt sự phát triển của những mạch máu mới nuôi sống khối u. Một chất khoáng rất cần cho cơ thể lúc này là selen, có rất nhiều trong tỏi. Selen là một chất chống ôxy hóa rất mạnh nên có thể giúp cho cơ thể chống lại ung thư. - Các nhà khoa học Pháp thuộc Trung tâm nghiên cứu Nông học quốc gia còn đưa ra lập luận: Trong thành phần của tỏi chứa một hợp chất có khả năng ức chế hoạt động của các chất gây ung thư. Tuy nhiên chúng không tác dụng trực tiếp mà kích thích các enzyme của cơ thể có khả năng ngăn chặn quá trình tạo thành các chất gây ung thư. 11 - Ung thư phổi thì có một nghiên cứu của các chuyên gia độc chất học trường đại học Tổng hợp Queen ở Canada. Họ đưa chất dễ gây ung thư mô phổi động vật vào 2 lô chuột: lô A được tiêm chất chiết xuất từ tỏi, còn lô B dùng làm đối chứng không được tiêm. Kết quả lô A không hề hấn gì, còn lô chuột B thì ung thư phát triển. Từ năm 1952, các nhà khoa học gia Nga Xô Viết đã thành công trong việc ngăn chặn sự phát triển của một vài tế bào ung bướu ở chuột. Thí nghiệm ở Nhật Bản cho hay tỏi có thể làm chậm sự sự tăng trưởng tế bào ung thư vú ở loài chuột và có chất ôxy hóa rất mạnh để ngăn chặn sự phá tế bào do các gốc tự do gây ra. Tại viện Ung Thư M.D.Anderson Houston, các bác sĩ đã cứu một con chuột khỏi bị ung thư ruột già bằng cách cho uống chất Sulfur trong tỏi. Được biết viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ đang đặt trọng tâm vào việc nghiên cứu khả năng trị bệnh ung thư của hợp chất sulfur này. 2.1.4.4. Tác dụng giải độc kim loại nặng Tỏi có tác dụng bảo vệ cơ thể chống nhiễm độc các kim loại nặng . Hợp chất sulfur của tỏi là chất giải độc chì mãn tính. Sau khi ăn tỏi hàm lượng chì trong mô gan và mô cơ, giảm hẳn các triệu chứng nhiễm độc giảm đáng kể. Do đó có thể phòng chống bệnh nghề nghiệp nhiễm độc chì cho các công nhân thường xuyên phải tiếp xúc với các sản phẩm chì như công nhân khai thác và chế biến chì, sản xuất accu chì, súc rửa bồn xăng có pha chì, bằng cách ăn tỏi hàng ngày. Với các trường hợp nhiễm độc kim loại nặng như thủy ngân, cadium và các chế phẩm của chúng như methyl mircury, pheny mercury. Tỏi có tác dụng ngang với các thuốc giải độc kim loại nặng thường dùng như BAL ( Bristish Anti Lewisite ) hoặc DMSA (2,3 dimercapto succinic acid ). 12 2.1.4.5. Tác dụng tăng cường hệ miễn dịch Tỏi có tác dụng đáng kể lên hệ miễn dịch; tăng hoạt tính các thực bào lymphô cyte nhất là với thực bào CD4 giúp cơ thể bảo vệ màng tế bào chống tổn thương nhiễm sắc thể AND, kháng virus, phòng chống nhiễm trùng 2.1.5. Nguồn nguyên liệu tỏi ở Việt Nam Trên thế giới có nhiều nước trồng tỏi nhưng tỏi Việt Nam được đánh giá là loại tỏi có chất lượng nhất, tính dược học cao, được nhiều nước trên thế giới tin dùng. Ở Việt Nam tỏi được trồng trên khắp cả nước. Hiện tỏi được chia làm 2 loại: Tỏi trắng: lá xanh đậm, to bản, củ to, đường kính khoảng 4cm. Củ tỏi vỏ màu trắng nên gọi là tỏi trắng, loại tỏi này bảo quản kém. Tỏi tía: lá dầy, cứng màu xanh nhạt, củ chắc và cay, dọc thân gần củ có màu tía. Củ tỏi tía nhỏ hơn củ tỏi trắng (đường kính 3,5 – 4cm). Tỏi tía có hương vị đặc biệt nên được trồng nhiều (Đỗ Tất Lợi, 2003) [6]. Sản lượng tỏi nước ta năm 2009 đạt 2000 tấn trong đó: Lý Sơn trồng được 277/295 ha tỏi, năng suất khô gần 59 tạ/ha, sản lượng đạt 1,616 tấn, huyện Kinh Môn - Hải Dương đứng đầu về sản lượng tỏi của tỉnh trong 302,1 ha tỏi , năng suất tỏi khô khoảng 62 tạ/ha. Tỏi nước ta có chất lượng cao đặc biệt là tỏi Lý Sơn – Quảng Ngãi, tỏi Phan Rang, tỏi Hải Dương....được xuất khẩu sang nhiều thị trường nước ngoài: Lào, Đài Loan, Hàn Quốc, Canada (Theo tổng cục thống kê). 2.2. Đặc điểm của Tỏi Đen 2.2.1. Tổng quan về tỏi đen Tỏi đen là sản phẩm lên men từ tỏi tươi hay còn gọi là tỏi trắng ở nhiệt độ khoảng 60-750C và độ ẩm 70-90% (Choi và cs, 2014) [30]. Tỏi đen được sử dụng rộng rãi với vai trò là thực phẩm chức năng giúp tăng 13 cường sức khỏe, nó còn được tin là có khả năng kéo dài tuổi xuân (Kim J.H và cs, 2012) [23]. Trong vòng 20 năm qua, đã có hơn 700 nghiên cứu về tác dụng của tỏi, đã phát hiện thêm nhiều công dụng của tỏi như có nhiều chất chống oxy hóa và chất chống dị ứng (Kim, J.H. và cs, 2012) [23], giúp kéo dài tuổi thọ (Boyd, O.P. và cs, 2011) [12], phòng chống ung thư (Ejaz S, Woong LC, Ejaz A, 2003) [16]. Ngoài ra tỏi đen còn được chứng minh có nhiều tác dụng có lợi đối với sức khỏe con người, như: phục hồi các tổn thưởng ở gan do uống rượu (Kim và cs, 2011) [22], giảm béo phì và tăng mỡ máu (Kim I.J.Y và cs, 2011) [25], ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh (Nguyễn Thanh Hải và cs, 2013) [4]. Tuy nhiên, nhược điểm của tỏi là mùi khó chịu do các hợp chất sulfur gây ra. Để khắc phục nhược điểm này, các nhà khoa học Nhật Bản, Hàn Quốc đã nghiên cứu lên men tự nhiên tỏi tươi để tạo ra tỏi đen. Kết quả lên men tỏi đen thành công mĩ mãn, vừa khắc phục được mùi khó chịu của tỏi, vừa làm tăng tác dụng chống oxy hóa của tỏi đen lên rất nhiều lần so với tỏi tươi, khiến cho tỏi đen có tác dụng như vị thuốc đặc trị chống oxy hóa, chống lão hóa, phòng chống bệnh ung thư, các bệnh nan y (Nguyễn Đức Vượng, 2015) [8]. Quan trọng nhất là tỏi đen có chứa hàm lượng axit amin, chất chống oxy hóa cao và nhiều loại hóa chất có lợi cho sức khỏe con người. 2.2.2. Thành phần hóa học của tỏi đen Các thành phần hóa học có giá trị dinh dưỡng cao trong tỏi đen chủ yếu là các acid amin, peptide, protein, enzyme, glycosides, vitamin, chất béo, các chất vô cơ, carbonhydrate và các hợp chất lưu huỳnh và một số thành phần khác (Choi và cs, 2014) [13]. - Tỏi đen chứa hầu hết các loại acid amin thiết yếu trong cơ thể, nhiều nhất là : glutamate, arginine, acid aspartic, valine 14 - Trong tỏi đen chứa các loại vitamin như: Vitamin A, vitamin B, vitamin C - Trong tỏi đen có chứa các loại nguyên tố như: kali, photphate, magie, canxi, silic, nhôm, kẽm.. ngoài ra còn chứa nhiều selenium, germanium - Trong quá trình lên men, xảy ra phản ứng chuyển hoá các hợp chất chứa lưu huỳnh như methionin, cystein, methanethiol thành những hợp chất mới chứa lưu huỳnh có khả năng tan trong nước như S-Allyl-L-cysteine, Alliin, Isoalliin, Methionin, Cycloalliin, các dẫn chất của Cysteine, các dẫn chất của Tetrahydro-β-carboline (Shin, J.H. và cs, 2008) [33]. 2.3. Công dụng của tỏi đen *Phòng chống ung thư Các nghiên cứu về tác dụng sinh học của tỏi đen cho thấy: các hợp chất sunful hữu cơ, dẫn xuất của tetrahydro-β-carbolines được hình thành từ quá trình lên men có hoạt tính mạnh, dọn gốc tự do và ức chế quá trình perôxy hóa lipid cao hơn tỏi thường. Kết quả nghiên cứu mới đây cho thấy dịch chiết tỏi đen có hiệu lực mạnh kháng lại các tế bào khối u, do vậy có tác dụng phòng và hỗ trợ điều trị ung thư. Cơ chế tác dụng của tỏi đen không phải bằng cách trực tiếp gây độc tế bào mà thông qua con đường kích thích đáp ứng miễn dịch, loại trừ khả năng di căn, ức chế sự nhân lên các tế bào khối u. (Ejaz S, Woong LC, Ejaz A, 2003) [17]. * Tăng cường hệ miễn dịch Các thí nghiệm cho thấy tỏi đen tăng cường hệ thống miễn dịch. Allicin có chức năng kích hoạt các glycolipid màng tế bào, có thể làm tăng tính thấm của nó, chuyển hóa tế bào, tăng cường cải thiện sức sống, làm tăng sức mạnh của hệ miễn dịch. Lysine, serine cải thiện chức năng của hệ miễn dịch, vitamin C có thể tăng cường hệ thống miễn dịch của cơ thể. Tỏi đen có 15 chứa kẽm tổng hợp hormone, và cải thiện hệ thống miễn dịch của cơ thể (Purev, U và cs, 2012) [29]. *Tác dụng với rối loạn tiêu hoá, rối loạn cơ quan BG đặc biệt tốt để phòng tránh các rối loạn men tiêu hóa. Kích thích tiết dịch vị, tiết mật. Phòng tránh các nhiễm khuẩn dạ dày ruột, các chứng rối loạn tiêu hóa do men hoặc do thần kinh gây khó tiêu, đầy hơi, trướng bụng, bí trung tiện – chống co thắt dạ dày ruột (Banerjee, S.K và cs, 2002) [11]. *Tác dụng giải độc nicotin mạn tính BG là một loại thuốc giải độc nicotin mạn tính cho người nghiện thuốc lá và công nhân sản xuất thuốc lá rất hữu hiệu, chí ít cũng làm giảm cơn nguy cấp ở tim, động mạch và các rối loạn chức năng ruột của người bệnh (Banerjee, S.K và cs, 2002) [10]. *Tác dụng bảo vệ gan Tỏi đen có tác dụng tăng cường tổng hợp chức năng gan, hiệu quả cao trong việc ngăn ngừa các loại bệnh, trong đó. Công dụng hiệu quả trong việc điều trị viêm gan đã được kiểm chứng, tăng cường chức năng chuyển hóa ở gan, phân hủy bài tiết alcohol giúp giải độc cồn. Giúp giảm nhanh chóng lượng lipid peroxides và ngăn ngừa sự tích tụ triglycerides trong gan (EL KZ và cs, 2010) [18]. *Tác dụng chống các bệnh đường hô hấp BG được dùng làm thuốc trị lao khí quản, hoại thư phổi, ho gà, thuốc long đàm cho người lao phổi, trị viêm phế quản mãn tính, viêm họng (Banerjee, S.K và cs, 2002) [10]. *Chữa bệnh tiểu đường Tỏi đen có tác dụng điều hoa đường huyết nhờ vào S-methyl-L- cysteine sulfoxide và S-Allyl cysteine sulfoxide, sulfide có chứa G-6-P enzyme NADPH có tác dụng ngăn chặn và ức chế sự phá hủy insullin và tác 16 dụng hạ đường huyết. Do đó, tỏi đen có khả năng hỗ trợ điều trị cũng như phòng chống các biến chứng tiểu đường. Dịch chiết tỏi đen có tác dụng gia tăng sự phóng thích Insulin tự do trong máu, tăng cường chuyển hóa glucose trong gan – giảm lượng đường trong máu và trong nước tiểu (tác dụng tương đương với Tolbutamid, một loại sunfamid chữa tiểu đường type II) (Lee, YM, 2009) [27]. *Giảm cholesterol - giảm béo Hợp chất SAC (S-Allyl cysteine) và một dẫn xuất của amino acid cysteine được thấy có hàm lượng lớn hơn nhiều trong tỏi đen so với tỏi tươi. Hai thành phần đó có thể làm giảm lượng cholesterol bám rộng trên thành mạch. Từ đó ngăn ngừa được các bệnh xuất huyết máu não, đau thắt tim, cao huyết áp và một số bệnh tim mạch khác. Sử dụng tỏi đen thường xuyên sẽ làm tăng hàm lượng cholesterol có lợi (HDL) và giảm đi hàm lượng cholesterol xấu (LDL), cung cấp SAC (giảm mỡ trong máu). Tỏi đen rất tốt cho bệnh tim mạch, cao huyết áp và máu nhiễm mỡ (Kim, I., 2011) [25] *Các tác dụng khác BG còn có tác dụng khác như: Chữa các bệnh răng miệng, chữa bệnh mắt, chữa bỏng và lở loét ngoài da, chữa màng nhĩ thủng, chữa phong thấp và đau thần kinh và xua đuổi và diệt côn trùng. Ngoài ra BG còn có tác dụng diệt giun sán như giun đũa, giun kim, giun móc và trứng của chúng (Banerjee, S.K và cs, 2002) [10]. 2.4. Tình hình nghiên cứu lên men Tỏi đen và phân tích các hoạt chất ở Việt Nam và trên Thế giới 2.4.1. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam trong những năm gần đây BG là một loại thực phẩm chức năng rất có lợi cho sức khỏe của con người, BG bắt đầu xuất hiện tại Việt Nam vào năm 2003 đã có nhiều nghiên cứu về tỏi đen trong những năm qua: 17 Theo Vũ Bình Dương và cs khi nghiên cứu tác dụng bảo vệ của dịch chiết tỏi đen đối với một số cơ quan Lympho trên chuột bị chiếu xạ cho thấy tỏi đen có tác dụng duy trì quần thể tế bào miễn dịch tại lách, hạch, tuyến ức và tủy xương (Vũ Bình Dương và cs, 2014) [3] Một nghiên cứu khác của Vũ Bình Dương và Phạm Xuân Phong nghiên cứu thành phần hóa học của tỏi đen Lý Sơn đã phát hiện ra trong tỏi đen có rất nhiều các thành phần có lợi cho sức khỏe con người như: amino axit, các chất chống oxy hóa, đường, các vitamin A, B1, B2 (Vũ Bình Dương và Phạm Xuân Phong, 2013) [1]. Theo Vũ Xuân Nghĩa, Vũ Bình Dương và Phạm Xuân Phong đã nghiên cứu khả năng bảo vệ cơ quan tạo máu của dịch chiết tỏi đen Lý Sơn trên chuột bị chiếu xạ. Kết quả về hình ảnh mô bệnh học cơ quan tạo máu (tủy xương, hạch) cho thấy nhóm chuột uống tỏi đen chiếu xạ ít bị tổn thương hơn so với nhóm chứng chiếu xạ và chuột uống tỏi thường chiếu xạ. Với liều chiếu xạ duy nhất 7 Gy trong 1 tuần, nhóm uống tỏi đen có số lượng tế bào máu giảm ít hơn so với nhóm chứng chiếu xạ và chuột uống tỏi thường với p < 0,05. Như vậy dịch chiết tỏi đen có tác dụng bảo vệ cơ quan tạo máu của chuột trên mô hình chiếu xạ (Vũ Xuân Nghĩa và cs, 2013) [2]. 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. Theo Choi và cs nghiên cứu đặc điểm lý hóa và thuộc tính chống oxy hóa của tỏi đen. Kết quả cho thấy có sự thay đổi rõ rệt về màu sắc, ẩm độ, hàm lường đường và axit tổng qua từng giai đoạn lên men. Hai hoạt chất chống oxy hóa chính ở tỏi đen là polyphenol tổng số có hàm lượng cao nhất 58,33mg GAE/g vào ngày lên men thứ 21 và flavonoid tổng số có hàm lượng là 15,7mg RE/g cao nhất vào ngày lên men thứ 35 (Choi và cs, 2014) [13]. Một nghiên cứu của Kim, M.H và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của tỏi đen trên những tổn thương gan do rượu gây ra cho thấy tác dụng của dịch 18 chiết tỏi đen đối với việc chống lại tổn thương gan do rượu gây nên, thí nghiệm được thử nghiệm trên chuột trong 4 tuần đã kết luận: Dịch chiết tỏi có khả năng làm giảm các tế bào gan bị tổn thương do rượu gây ra trên chuột. Từ đó ông tin rằng dịch chiết tỏi đen cũng có khả năng chữa các tổn thương gan ở người (Kim, M.H và cs, 2011) [24]. Theo Kim, I nói về lợi ích của dịch chiết tỏi đen đến bệnh béo phì và tăng lipid máu ở chuột được cho ăn một chế độ ăn giàu chất béo. Nghiên cứu này đã thử nghiệm tác dụng chống béo phì và tăng lipid máu ở chuột bởi một chế độ ăn giàu chất béo trong khoảng thời gian 4 tuần. Chiết xuất từ tỏi đen 15 Brix đã được bổ sung trong theo tỷ lệ 1, 3, 5 và 7% trong khẩu phần ăn. Kết quả cho thấy rằng chiết xuất từ tỏi đen có thể có tác dụng chống béo phì và tăng mỡ máu giúp giảm chỉ số béo phì và giảm lipid máu (Kim, I., 2011) [22]. Theo Wang, X và cs nghiên cứu về ảnh hưởng của dịch chiết tỏi đen đến khả năng ức chế sự tăng trưởng tế bào ung thư dạ dày. Có bằng chứng cho thấy rằng chiết xuất tỏi có khả năng ức chế các tế bào ung thư dạ dày. Thí nghiệm này cũng được thử nghiệm trên chuột mang khối u trong 2 tuần. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu được báo cáo về ảnh hưởng của chất chiết xuất từ tuổi đen tỏi về ung thư dạ dày trong ống nghiệm hoặc trong cơ thể (Wang, X và cs, 2012) [36]. Mengmeng Lei và cs đã tiến hành phân tích hàm lượng đường và hoạt tính chống oxy hóa trong tỏi đen. Kết quả từ nghiên cứu này đã chứng minh hàm lượng đường trong các chất chiết xuất tỏi đen là 55,5%. Trong xét nghiệm chất chống oxy hóa in vitro và in vivo, chiết xuất từ tỏi đen có khả năng loại bỏ các gốc tự do một cách triệt để, thí nghiệm trên ruồi giấm cho thấy tuổi thọ của ruồi giấm Drosophila melanogaster được kéo dài rõ rệt (Mengmeng Lei và cs, 2014) [28]. 19 Theo Kim, J.H và cs đã so sánh khả năng chống oxy hóa và chống dị ứng ở tỏi đen và tỏi tươi cho thấy: Trong dịch chiết tỏi đen có hàm lượng các chất chống oxy hóa cao hơn hẳn so với dịch chiết tỏi thường. Ngoài ra trong dịch chiết tỏi đen còn có hàm lượng phenolic và hoạt động chống oxy hóa cao hơn so với tỏi tươi (Kim, J.H và cs, 2012) [23]. Một nghiên cứu của Lee YM đã nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa và khả năng chữa bệnh tiểu đường type 2 ở tỏi và tỏi đen, nghiên cứu này đã xác định hiệu lực chống oxy hóa của tỏi và tỏi đen trên chuột thí nghiệm mắc bệnh tiểu đường type 2. Kết quả cho thấy tỏi đen có tác dụng chữa bệnh cao hơn hẳn so với tỏi thường. Từ đó khẳng định tỏi đen có khả năng chữa bệnh tiểu đường trên người (Lee YM, 2009) [27]. 20 Phần 3 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tƣợng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng Giống tỏi nhiều nhánh Lý Sơn được trồng tại huyện đảo Lý Sơn- Tỉnh Quảng Ngãi. Giống tỏi được trồng tại một số tỉnh như Hải Dương và Bắc Giang. 3.1.2. Hóa chất - Natri hydroxide tinh thể (NaOH), Chì acetate (Pb(CH3COO)2), Đồng sunfate tinh thể (CuSO4.5H2O), Sắt (III) sunfate tinh thể (Fe2(SO4)3), Acid sunfuric đậm đặc(H2SO4), Kali pemaganate (KMnO4). - Methanol (CH3OH), Ethanol (C2H5OH), Nhôm clorua (AlCl3), Kali natri tartrate (KNaC4H4O6.4H2O), Clorofom, Kali clorua (KCl). Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết được sử dụng cho phân tích. 3.1.3. Dụng cụ - Bình tam giác 250 ml, 100 ml, 50 ml. - Bình định mức 500 ml, 250 ml, 100 ml. - Cốc thủy tinh 500 ml, 250 ml, 100 ml. - Ống đong 250 ml, 100 ml, 10 ml. - Ống nghiệm thủy tinh. - Ống Falcon đựng mẫu 50 ml. - Ống nhựa ly tâm 50 ml. - Pipet 10 ml, 5 ml, 2 ml. - Cuvet thạch anh. - Micropipet (10 - 100 µl, 100 – 500 µl, 100 - 1000 µl, 1 – 5 ml). 21 3.1.4. Thiết bị - Nồi cơm điện 2l Kangaroo và tủ sấy - Máy đo quang phổ UV - VIS (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Mỹ). - Máy vortex. - Bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). - Máy đo pH (pH meter để bàn CyberScan pH 150, Singapore). - Cân phân tích (OCE – Germany). - Tủ sấy vuông (Nhiệt độ sấy 0 - 300 °C, China). - Lò nung vuông XMT-15 (Nhiệt độ nung tối đa 1200 °C, Việt Nam) 3.1.5. Phạm vi nghiên cứu Đánh giá khả năng lên men và phân tích một số hoạt chất trong tỏi đen. 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 3.2.1. Địa điểm - Phòng thí nghiệm vi sinh khoa CNSH-CNTP. - Phòng Hóa Thực phẩm - Viện Dược Liệu 48 Tăng Bạt Hổ, Bạch Đằng, Hai Bà Trưng, Hà Nội. 3.2.2. Thời gian Từ tháng 12 năm 2015 đến tháng 5 năm 2016. 3.2.3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men, sự thay đổi màu sắc và các đặc tính lý hóa của tỏi đen. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng đường trong tỏi đen. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng các amino axit thiết yếu ở tỏi đen. Nội dung 4: Nghiên cứa ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng các chất chống oxy hóa chính ở tỏi đen. 22 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Sơ đồ qui trình lên men sản xuất tỏi đen Thuyết minh qui trình  Tỏi nguyên liệu: Tỏi sử dụng trong lên men là tỏi không bị dập nát, sâu mọt.  Xử lý: Tỏi nguyên liệu được lau sạch đất cát, cắt bỏ rễ và phần cuống của củ, để nơi thoáng mát.  Lên men: Tỏi sau khi được lựa chọn, được xếp vào nồi cơm điện hoặc tủ sấy trong điều kiện nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát trong khoảng thời gian nhất định. Nồi cơm điện được giữ ở nút ấm (warm – nhiệt độ khoảng....), tủ sấy được đặt ở nhiệt độ.....  Sấy khô: Sau khi lên men, tỏi đen được sấy khô đến hàm lượng nước đạt khoảng 30%.  Bao gói: Sau khi sấy khô, tỏi được để nguội và cho vào túi PA hoặc hộp đựng khô ráo.  Bảo quản: Tỏi đen sau khi bao gói được bảo quản ở nhiệt độ phòng. Hình 3.1: Sơ đồ qui trình lên men sản xuất tỏi đen 3.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện ở hình 3.2. 23 Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm Giải thích quy trình Tỏi nguyên liệu được loại bỏ đất, cát và các củ không đảm bảo chất lượng trước khi xếp vào nồi cơm điện hoặc tủ sấy để tiến hành lên men. - Đối với tỏi HD lên men bằng TS trong thời gian 3 ngày đầu tiên của quá trình lên men, tỏi được giữ ở nhiệt độ 75°C và độ ẩm tương đối là 90%. Trong 4 ngày lên men tiếp theo, tỏi được giữ ở nhiệt độ 60°C và độ ẩm tương Lấy mẫu phân tích Lên men Xử lý Tỏi nguyên liệu Chỉ tiêu hóa học Chỉ tiêu vật lý Điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm Màu sắc Độ ẩm Mùi vị Hàm lượng đường tổng Hàm lượng amino acid Hàm lượng polyphenol Hàm lượng flavonoids 24 đối 80%. Trong thời gian 28 ngày lên men cuối cùng, tỏi được duy trì ở nhiệt độ 60 °C và độ ẩm tương đối 70%. Trong thời gian lên men, mẫu tỏi được thu nhận ở các ngày 0, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 28 và 35 để tiến hành đánh giá sự biến đổi các thành phần hóa lý theo sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện ở hình 3.2. - Đối với tỏi HD lên men bằng NCĐ, tỏi được giữ ở nhiệt độ 700C trong suốt 23 ngày lên men. Trong thời gian lên men mẫu tỏi được thu nhận ở các ngày 0, 5, ,8, 11, 14, 17, 20, 23 để tiến hành đánh giá sự biến đổi các thành phần hóa lý theo sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện ở hình 3.2. - Đối với tỏi LS lên men bằng NCĐ, tỏi cũng được giữ ở nhiệt độ 700C trong suốt 23 ngày lên men. Trong thời gian lên men mẫu tỏi được thu nhận ở các ngày 0, 5, ,8, 11, 14, 17, 20 để tiến hành đánh giá sự biến đổi các thành phần hóa lý theo sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện ở hình 3.2. 3.4. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu phân tích Khoảng 100 g (15 - 20 củ) tỏi được thu nhận theo thời gian lên men. Các mẫu tỏi được bóc sạch vỏ, đồng hóa và bảo quản trong các ống Falcon 50 ml ở nhiệt độ 4°C trước khi tiến hành phân tích. 3.5. Phƣơng pháp phân tích 3.5.1. Xác định chỉ tiêu lý hóa Sau khi lên men tiến hành theo dõi cảm quan về sự thay đổi màu sắc, ẩm độ cũng như mùi vị của tỏi lên men. 3.5.2. Xác định chỉ tiêu hóa học 3.5.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng Xác định hàm lượng đường tổng trong tỏi theo thời gian lên men bằng phương pháp Bertrand. 25 • Nguyên lý: - Gluxit khử trực tiếp ôxy có tính chất khử Cu(OH)2 ở môi trường kiềm mạnh, làm cho nó kết tủa dưới thể Cu2O màu đỏ gạch. Số lượng Cu2O tương ứng với số lượng gluxit khử ôxy RCHO + 2Cu(OH)2RCOOH + Cu2O + 2H2O - Cu2O có tính chất khử ôxy, tác dụng với muối sắt ba (Fe +++) làm cho muối này chuyển thành muối sắt hai (Fe++) ở môi trường axit Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2 SO4 + 2CuSO4 + H2O + 2FeSO4 FeSO4 có tính chất khử ôxy, tác dụng KmnO4 là chất ôxy hóa, do đó dùng KmnO4 để chuẩn độ FeSO4 ở môi trường axit 10Fe SO4 + 8H2SO4 + 2KmnO4 K2 SO4 + 2MnSO4+ 5Fe2(SO4)3 + 8 H2O - Từ số ml KmnO4 0,1N dùng để chuẩn độ FeSO4 hình thành, tra bảng để có số mg đường glucoza, maltoza, lactoza hoặc saccaroza, nhân với hệ số pha loãng ta có hàm lượng đường trong 100g thực phẩm. • Tiến hành: - Chuẩn bị mẫu: Trước khi tiến hành xác định hàm lượng đường, mẫu đã được đồng nhất bằng đũa thủy tinh. Cân chính xác 5g mẫu tỏi đã chuẩn bị trước đó, cho vào cốc thủy tinh 50 mL và thêm 30 mL nước cất rồi đem đun trên bếp điện rồi lấy đũa thủy tinh đánh cho tan. - Sau đó, cho lượng mẫu đã được hòa tan trên vào bình định mức 500 mL, tráng lại cốc đựng mẫu vài lần với nước cất và cho cả vào bình định mức (chú ý không quá 250 mL) - Trung hòa axit hữu cơ có trong mẫu thử bằng dung dịch NaOH 10% đến pH = 7 (kiểm tra bằng giấy chỉ thị màu vạn năng). 26 - Sau đó, đun cách thủy ở 80°C trong vòng 15 phút, thỉnh thoảng lắc đều trong khu đun, để nguội đến nhiệt độ phòng , khử tạp chất, cuối cùng cho thêm nước cất vừa đủ 500 mL, lọc và lấy dịch lọc để chuẩn độ - Xác định hàm lượng đường: cho vào bình tam giác dung tích 250 ml:  Dung dịch Feling A: 10 mL  Dung dịch Feling B: 10 mL  Đun sôi trên bếp điện sau đó cho 10 mL dịch lọc đã chuẩn bị bên trên và 20 mL nước cất,sau 3 phút dung dịch phải sôi. Giữ cho đúng 2 phút kể từ khi bắt đầu sôi lại.  Lấy bình ra và nghiêng để cho cặn đồng (I) ôxyt lắng xuống. Dung dịch bên trên lớp cặn phải có màu xanh của đồng (II) hydrôxyt. Nếu dung dịch bên trên có màu vào lục, hoặc vàng nâu có nghĩa là không đủ lượng đồng cần thiết, phải làm lại và lấy lượng dịch lọc ít hơn.  Sau đó, gạn lớp nước bên trên . Chú ý giữ lại một lớp nước mỏng bên trên lớp kết tủa trong bình để tránh Cu2O bị ôxy hóa bởi ôxy không khí. Tiếp tục rửa kết tủa vài lần bằng nước đã đun sôi đến khi nước trong bình không còn màu xanh thì dừng lại. Lần cuối cùng đổ hết nước đi và thêm vào đó 15 mL dung dịch Bertrand ( là dung dịch Fe2(SO4)3 trong H2SO4 ) để hòa tan hết kết tủa Cu2O  Chuẩn độ Fe2+ hình thành trên cốc bằng dung dịch KmnO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 15 giây thì dừng lại. Đọc thể tích KmnO4 tiêu tốn và đem kiểm tra ở bảng để có hàm lượng đường Glucoza. • Tính kết quả: - Hàm lượng đường toàn phần biểu thị bằng đường glucoza trong 100g tỏi, tính bằng công thức: 27 X = (%) X : Hàm lượng đường toàn phần biểu thị bằng đường glucoza. M1 : Khối lượng đường Glucoza (mg) tương ứng với số mL KmnO4 0,1N theo bảng Bertrand. F : Hệ số pha loãng 1000 chuyển từ mg ra g 3.5.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng amino acid Định lượng axit amin bằng phương pháp quang phổ. Phương pháp này giúp xác định hàm lượng phenylalanine trong chuỗi polypeptide có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 280nm. Sử dụng BSA làm chất chuẩn, biết rằng ở bước sóng 280nm 1ml BSA có nồng độ 1mg/ml sẽ có mật độ quang học là OD = 0,67. Dựa vào đó có thể xác định hàm lượng protein trong các mẫu thí nghiệm theo công thức sau: Y(mg) = ([OD].a.V)/0,67 Trong đó: + [OD]: mật độ quang học của 1ml dung dịch mầu. + V: thể tích dung dịch mầu. + a: độ pha loãng dung dịch Con số 0,67 là hệ số tắt của BSA. Để xác định nồng độ các loại protein khác thì cần phải sử dụng hệ số tắt tương ứng đối với mỗi loại protein. Lựa chọn các protein tiêu chuẩn cần có cấu trúc tương tự như cấu trúc của các protein cần đo xét nghiệm ở mẫu nghiên cứu vì các protein thường có hệ số tắt khác nhau ở bước sóng 280nm (Hệ số tắt biểu thị bằng sự hấp thụ của dung dịch 1% protein đối với một tia sáng có bề dày 1cm). Thêm vào đó, các protein có cấu trúc khác nhau cũng cho khả năng tạo phản ứng mầu khác 28 nhau với các thuốc thử tạo mầu như thuốc thử folin – ciocalteu, coomassie brilliant blue G250. Nồng độ protein tổng số được tính theo công thức sau: Nồng độ protein, tính theo mg/ml = 1,55 x A280 – 0,77 x A260 Trong đó: + A280 là giá trị hấp thụ ở bước sóng 280 nm. + A260 là giá trị hấp thụ ở bước sóng 260 nm. 3.5.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng Flavonoid và Polyphenol * Phương pháp xác định hàm lượng Flavonoid Hàm lượng flavonoid trong tỏi được xác định theo phương pháp so màu. Cụ thể, 2g tỏi được đồng hóa với 20 mL methanol 80% và để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ. Sau đó dịch đồng hóa được li tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 15 phút (Hermile Z 323, Germany). Dịch li tâm được thu nhận và bổ sung methanol 80% cho đến khi đạt thể tích 45 mL. 1mL dịch li tâm được hòa trộn với 1 mL dung dịch AlCl3 2% trong ethanol, để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 giờ. Cường độ hấp thụ ánh sáng được đo ở bước sóng 420 nm (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Mỹ). Hàm lượng flavonoid được tính toán từ đường chuẩn được xây dựng bằng rutin và kết quả được thể hiện là mg rutin tương đương (RE) trong 1 g sản phẩm. * Phương pháp xác định hàm lượng Polyphenol Hàm lượng Polyphenol tổng số của BG được xác định bằng phương pháp so màu. Lấy một lượng dịch chiết BG (2,4ml) trộn với thuốc thử Folin- Ciocalteu (0,15 ml), tiếp theo bổ sung dung dịch NaCO3 1M (0,45 ml). Phản ứng xảy ra trong vòng 1 phút. Độ hấp thụ ở 750 nm được đo sau 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Tổng hàm lượng polyphenol được thể hiện bằng miligam đương lượng axit gallic (GAE). 29 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả về đặc tính lý hóa của tỏi đen 4.1.1. Thay đổi về màu sắc của tỏi đen Màu sắc là một đặc tính quan trọng của sản phẩm thực phẩm nói chung và tỏi đen nói riêng, ảnh hưởng đến tâm lý của người tiêu dùng. Màu sắc của tỏi đen thay đổi từ màu trắng -> xám nhạt -> nâu đen -> đen trong suốt quá trình lên men. Ở thí nghiệm này, giống tỏi là tỏi Hải Dương và tỏi Lý Sơn được khảo sát khả năng lên men bằng hai phương pháp khác nhau là lên men trong tủ sấy (điều kiện nhiệt độ là 600C) và trong nồi cơm điện (nhiệt độ 70 0 C). Ở cả hai phương pháp, tỏi được bọc kín trong túi nilon và giấy bạc để duy trì độ ẩm. Các kết quả cho thấy thời gian tối ưu để chuyển hóa thành tỏi đen là khác nhau đối với các giống tỏi khác nhau và điều kiện ủ (nhiệt độ) khác nhau. *Kết quả lên men của tỏi Hải Dƣơng trong tủ sấy Hình 4.1. Thay đổi màu sắc tỏi đen lên men trong tủ sấy Tỏi đã có sự thay đổi về màu sắc từ màu trắng nguyên thủy thành màu đen trong suốt 35 ngày chuyển hóa. Nguyên nhân của thay đổi màu sắc là do phản ứng Maillard, hay còn gọi là phản ứng hóa nâu không enzym. Theo các tài liệu có liên quan, các sản phẩm phản ứng Maillard thường liên quan với sự tăng hấp thụ ở 280 nm, 320-360 nm, và 420-450 nm, tương ứng với từng giai đoạn chuyển hóa: Giai đoạn đầu, giai đoạn giữa và giai đoạn cuối cùng của sản phẩm 30 phản ứng Maillard (MRPS) hình thành. Trong giai đoạn đầu của phản ứng Maillard tạo màu (khoảng 280 nm) sản sinh đường, amino axit. Giai đoạn trung giữa (320-360 nm) sinh ra sản phẩm không màu hoặc màu vàng thông qua một số phản ứng, chẳng hạn như mất nước đường, phân mảnh đường, và suy thoái axit. Giai đoạn cuối cùng (420-450 nm) được đánh giá cao với màu đối nghịch với màu ban đầu, aldehyde-amin ngưng tụ, và hình thành các hợp chất nitro dị vòng. MRPs bắt nguồn từ glucose và cysteine hấp thụ ở 285 nm với một độ hấp thụ tối đa ở mức 340-360 nm. Sự hình thành của MRPs phụ thuộc vào điều kiện chế biến như nhiệt độ và thời gian. Do đó, thay đổi màu sắc của tỏi đen có thể liên quan đến việc hình thành MRPs trong giai đoạn chuyển hóa ở nhiệt độ cao. Kết quả chuyển hóa tỏi đen trong hình 4.1 cho thấy khi tỏi Hải Dương ủ trong tủ sấy với nhiệt độ là 600C, thời gian chuyển hóa tối ưu nhất để tạo tỏi đen là 35 ngày, khi đó tỏi có màu đen đặc trưng và không bị khô, nếu để lâu hơn (40 ngày) thì màu sắc chuyển thành đen cháy và khô cứng, ăn có vị đắng. Kết luận: Lên men tỏi HD bằng tủ sấy trong 40 ngày thì tỏi được lên men vào ngày thứ 35 có màu sắc đẹp nhất. * Kết quả lên men tỏi Lý Sơn và Hải Dƣơng bằng nồi cơm điện Hình 4.2. Thay đổi màu sắc tỏi ủ trong nồi cơm điện ứng với tỏi Hải Dƣơng (a), tỏi Lý Sơn (b). 31 - Đối với tỏi Hải Dƣơng: Dựa vào kết quả màu sắc tỏi trên hình 4.2a ta thấy: Tỏi HD khi lên men bằng nồi cơm điện hóa nâu nhanh hơn so với tỏi được lên men bằng tủ sấy. Nguyên nhân cũng là do nồi cơm điện có nhiệt độ cao hơn so với nồi ủ nên quá trình hóa nâu xảy ra nhanh hơn. Nếu màu sắc của tỏi HD ủ bằng nồi ủ là đẹp nhất vào ngày thứ 35 thì tỏi được ủ bằng nồi cơm điện lại có màu đen đẹp nhất vào ngày thứ 23. Chính vì vậy tôi có kết luận như sau: Tỏi HD sau khi lên men bằng nồi cơm điện trong khoảng thời gian là 28 ngày thì tỏi được ủ vào ngày thứ 23 có màu đẹp nhất. - Đối với tỏi Lý Sơn Dựa vào hình 4.2b ta thấy: Màu sắc của tép tỏi qua các giai đoạn lên men(ngày) 0 -> 8 -> 11 -> 14 -> 17 -> 20 lần lượt như sau: Trắng -> nâu nhạt -> nâu đậm -> nâu đen -> đen -> đen khô -> đen cháy. Nguyên nhân sự thay đổi về màu sắc cũng do phản ứng Maillard, được gọi là phản ứng hóa nâu không enzym. Nếu như tỏi và tỏi HD có màu đẹp nhất vào ngày thứ 23 thì tỏi LS lại có màu đẹp nhất vào ngày thứ 17. Nguyên nhân gây ra sự khác biệt về màu sắc này là do tỏi LS nhỏ hơn tỏi HD. Tỏi LS có đường kính trung bình là 1,5cm tép tỏi nhỏ. Tỏi HD có đường kính từ 2 - 2,5cm tép tỏi to, chính vì vậy thời gian ủ màu cũng lâu hơn so với tỏi LS. => Kết luận chung: Khi tỏi ủ trong nồi cơm điện, thời gian để tạo tỏi đen có màu đặc trưng đối với tỏi LS là 17 ngày và tỏi HD là 23 ngày. Tỏi Lý Sơn có thời gian chuyển hóa là ít nhất (17 ngày) do có kích thước củ và tep tỏi bé nhất, và ngược lại tỏi HD là lâu nhất (23 ngày) do kích thước củ và tép tỏi to nhất. 4.1.2 Thay đổi về ẩm độ của tỏi đen lên men *Đối với tỏi Hải Dương lên men bằng tủ sấy 32 Trong quá trình lên men, tỏi có hiện tượng mất nước do ảnh hưởng bởi nhiệt độ cao trong khoảng thời gian dài. Qua những hình ảnh cắt ngang tỏi đen có thể dễ dàng nhận thấy sự thay đổi về hình dáng của tép tỏi qua từng giai đoạn lên men khác nhau: tỏi lên men được 17 ngày tép tỏi ướt, dễ bị bóp nát, nhìn rõ váng nước trên tép tỏi, vỏ của tỏi dính liền với tép tỏi, rất khó bóc. Tỏi lên men được 20 ngày tép tỏi vẫn khá bở tuy nhiên vỏ của tỏi không còn dính liền với tép tỏi, dễ bóc. Tỏi được lên men 35 ngày. Tép tỏi nhỏ đi đáng kể, dai và dẻo, mặt ngoài tép tỏi khô, dễ bóc. *Đối với tỏi Hải Dương lên men bằng nồi cơm điện Tỏi được lên men bằng nồi cơm điện nhanh khô hơn so với tỏi được lên men bằng tủ sấy vì nhiệt độ trong nồi cơm điện cao hơn nên thời gian chuyển hóa cũng nhanh hơn. Tỏi lên men được 23 ngày đạt được tính chất như tỏi lên men được 35 ngày bằng tủ sấy. *Đối với tỏi Lý Sơn lên men bằng nồi cơm điện Tỏi Lý Sơn có thời gian chuyển hóa tối ưu bằng nồi cơm điện là 17 ngày, chính vì vậy vào ngày thứ 17 tép tỏi cũng nhỏ đi khô, dẻo dai và dễ bóc. Nguyên nhân dẫn đến sự tạo thành tỏi đen nhanh hơn là do tỏi LS nhỏ và nhiệt độ trong nồi cơm điện cao hơn tủ sấy. 4.1.3. Thay đổi về mùi vị của tỏi lên men Tỏi sau khi được lên men hoàn chỉnh có sự thay đổi rõ rệt về mùi vị, không còn mùi vị hăng nồng như tỏi sống. Tép tỏi sau khi lên men hoàn chỉnh trở nên dai và dẻo, có mùi giống thuốc bắc thơm, không còn giòn, có vị chua ngọt giống vị hoa quả. Đối với tỏi Hải Dương được lên men bằng tủ sấy có mùi vị ngon nhất vào ngày thứ 35. Đối với 2 loại tỏi Hải Dương và Lý Sơn lên men bằng nồi cơm điện có mùi vị ngon nhất lần lượt vào ngày thứ 23 và 17. Khoảng thời gian tỏi cho mùi vị ngon nhất tương ứng với khoảng thời gian mà tỏi có màu đẹp nhất. 33 4.2. Kết quả về hàm lƣợng các chất hóa học có trong tỏi đen Dựa vào kết quả đánh giá cảm quan chúng tôi quyết định lấy mẫu tỏi Hải Dương được ủ vào ngày thứ 35 bằng tủ sấy để phân tích hàm lượng các chất hóa học có trong tỏi đen. 4.2.1. Kết quả về hàm lượng đường tổng của tỏi đen. Trong các chỉ tiêu đánh giá về chất lượng của tỏi đen thì đường là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất. Nó quyết định đến chất lượng của tỏi đen, tạo vị ngọt cho tỏi đen sau quá trình lên men. Đồng thời, đường là yếu tố quan trọng trong quá trình lên men để tạo nên các phản ứng tạo màu cho sản phẩm. Chính vì vậy việc xác định hàm lượng đường có ý nghĩa quan trọng quyết định đến chất lượng sản phẩm. Hàm lượng đường tổng trong tỏi Hải Dương được thể hiện ở bảng 4.1 Bảng 4.1: Kết quả phân tích hàm lƣợng đƣờng Giống Hàm lƣợng (mg/g) Tỷ lệ % Hải Dương 47,09 4,7% Dựa vào kết quả bảng 4.1 cho thấy: Hàm lượng đường là 47,09mg/100g chiếm 4,7%. Theo nghiên cứu của Choi và cs [13], tỏi được lên men trong điều kiện 70°C, độ ẩm tương đối 90%, trong thời gian 35 ngày thì hàm lượng đường đạt giá trị 16,07mg/g chiếm 1,6%. Tại Việt Nam Nguyễn Thanh Huyền – Đại học Nha Trang [7] trong thời gian 13 ngày lên men tỏi hàm lượng đường tổng đạt 50% . Theo trung tâm nghiên cứu và ứng dụng sản xuất thuốc - Học Viện Quân Y cũng đã nghiên cứu thành công sản phẩm tỏi đen trong khoảng thời gian là 35 ngày cho thấy hàm lượng đường 47,9% [38]. Từ kết quả của nghiên cứu đồng thời kết hợp với các nghiên cứu khác cho thấy sự khác nhau về hàm lượng đường tổng số có trong tỏi đen. Tuy 34 nhiên, sự khác nhau về hàm lượng đường của mỗi nghiên cứu là do khác nhau về giống tỏi, nhiệt độ và qui trình lên men dẫn đến sự biến đổi khác nhau cho mỗi qui trình. 4.2.2. Kết quả về thay đổi hàm lượng axit amin trong tỏi đen Axit amin là thành phần dinh dưỡng có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm, nó quyết định đến chất lượng và dinh dưỡng của sản phẩm thực phẩm. Axit amin có vai trò sản xuất kháng thể, giảm cholesterol, giúp hấp thụ canxi, giảm đau, kích thích tiêu hóa....Chính vì vậy iệc xác định hàm lượng axit amin có trong tỏi đen là cần thiết trong nghiên cứu. Bảng 4.2: Kết quả phân tích hàm lượng một số amino acid có trong tỏi đen Amino acid Hàm lƣợng (mg/g) Tỷ lệ % Leucine 61,05 6.10% Lysine 35,74 3,57% Isoleucine 65,03 6,50% Methionine 67,14 6,71% Phenylalanine 135,54 13,55% Năm chỉ tiêu a.a quan trọng được lựa chọn để xác định hàm lượng có trong 100g BG. Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy, Phenylalanine chiếm hàm lượng cao nhất là 135,54 mg chiếm 13,55%; tiếp theo là Methionine và Isoleucine với hàm lượng gần tương đương nhau – 67,14mg và 65,03mg (chiếm 6,71 và 6,5%). Hàm lượng của Lysine và Leucine là thấp nhất – 35,74 và 61.05g; chiếm 3,57 và 5,56%. Theo nghiên cứu của Choi và cs [13] tỏi được lên men ở nhiệt độ 700C với độ ẩm tương đối 90% và thời gian lên men là 35 ngày thì hàm lượng Leucine là 59,19 mg; Lysine 40,5 mg; Isoleucine 71,07mg; Methionine 71,11mg và Phenylalanine 143,07mg. Ngoại trừ Phelylalanine có hàm lượng cao nhất vào 35 ngày thứ 35 thì các axit amin còn lại đều đạt hàm lượng cao nhất vào ngày thứ 21 của quá trình lên men. Qua kết quả nghiên cứu đồng thời kết hợp với kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy sự khác nhau về hàm lượng axit amin có trong tỏi đen. Tuy nhiên, sự khác nhau về hàm lượng các axit amin của mỗi nghiên cứu là do khác nhau về giống tỏi, nhiệt độ và qui trình lên men dẫn đến sự biến đổi khác nhau cho mỗi qui trình. 4.2.3. Kết quả hàm lượng các chất chống oxy hóa chính trong tỏi đen 4.2.3.1. Kết quả hàm lượng Flavonoids trong tỏi đen Flavonoid là nhóm chất màu quan trọng trong thực phẩm, nó có nhiều trong các loại rau, quả và hoa, số lượng cũng như tỉ lệ các flavonoid khác nhau, do đó làm cho chúng có nhiều màu sắc khác nhau. Flavonoid là dẫn xuất của phenol hầu hết ở người, động thực vật và vi sinh vật do đưa trực tiếp vào từ nguồn thức ăn. Flavonoid tham gia vào tất cả các quá trình trao đổi chất, sinh tổng hợp và quá trình enzyme. Flavonoid thuộc nhóm hợp chất phenol, là nhóm hợp chất có khả năng chống ôxy hóa mạnh. Chính vì vậy, việc xác định hàm lượng flavonoid là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá về hoạt tính chống ôxy hóa của tỏi đen. Bảng 4.3: Kết quả hàm lƣợng Flavonoidss tổng số trong tỏi đen Chỉ tiêu Hàm lƣợng (mg/100g) Tỷ lệ % Flavonoid 5,6 0,05 Dựa vào bảng 4.3 cho thấy hàm lượng Flavonoids có trong tỏi HD lên men bằng tủ sấy trong khoảng thời gian 35 ngày là 5,66 mg/100g chiếm 0,05%. Theo một nghiên cứu của Nguyễn Thanh Huyền [7] trong thời gian 3 ngày đầu tiên của quá trình lên men, tỏi được giữ ở nhiệt độ 750C và độ ẩm 36 tương đối là 90%. Trong 4 ngày lên men tiếp theo, tỏi được giữ ở nhiệt độ 65 0C và độ ẩm tương đối 80%. Trong thời gian 6 ngày lên men cuối cùng, tỏi được duy trì ở nhiệt độ 600C và độ ẩm tương đối là 70%. Đến ngày lên men thứ 13 hàm lượng Flavonoids tổng số là cao nhất 21,5 mgRE/ g,. Theo nghiên cứu của Choi và cộng sự [13] tỏi được lên men ở nhiệt độ 700C với độ ẩm tương đối 90% và thời gian lên men là 35 ngày thì hàm lượng Flavonoids là 16,26 mg RE/g và có hàm lượng cao nhất vào ngày lên men thứ 21 của quá trình lên men. Từ kết quả của nghiên cứu đồng thời kết hợp với các nghiên cứu khác cho thấy sự khác nhau về hàm lượng Flavonoids tổng số có trong tỏi đen. Tuy nhiên, sự khác nhau về hàm lượng Flavonoids của mỗi nghiên cứu là do khác nhau về giống tỏi, nhiệt độ và qui trình lên men dẫn đến sự biến đổi khác nhau cho mỗi qui trình. 4.2.3.2. Kết quả hàm lượng Polyphenol trong tỏi đen Polyphenol là chất có đặc tính chống oxy hóa giúp chống lại việc tạo lập các gốc tự do dư thừa trong cơ thể. Gốc tự do chính là nguyên nhân gây ra sự lão hóa tế bào trong cơ thể. Polyphenol có thể bảo vệ cơ thể giúp cơ thể chống lại nhiều loại bệnh khác nhau: Chống lại ung thư, chống loãng xương, chống lại các bệnh về tim mạch....cũng như Flavonoids việc xác định hàm lượng Polyphenol là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá về hoạt tính chống ôxy hóa của tỏi đen. Bảng 4.4: Kết quả hàm lƣợng Polyphenol tổng số trong tỏi đen Chỉ tiêu Hàm lƣợng (mg/100g) Tỷ lệ % Polyphenol 17,91 1,79% Dựa vào bảng 4.3 cho thấy hàm lượng Polyphenol có trong tỏi HD lên men bằng tủ sấy trong khoảng thời gian 35 ngày là 17,91 mg/100g chiếm 37 1,79%. Cũng theo nghiên cứu của Choi và cs [13] khi lên men tỏi ở nhiệt độ 70 0 C với độ ẩm tương đối 90% và thời gian lên men là 35 ngày thì hàm lượng Polyphenol tổng số là 48,35 mg/g và có hàm lượng cao nhất vào ngày thứ 21 của quá trình lên men. Từ kết quả của nghiên cứu đồng thời kết hợp với các nghiên cứu khác cho thấy sự khác nhau về hàm lượng Polyphenol tổng số có trong tỏi đen. Tuy nhiên, sự khác nhau về hàm lượng Polyphenol của mỗi nghiên cứu là do khác nhau về giống tỏi, nhiệt độ và qui trình lên men dẫn đến sự biến đổi khác nhau cho mỗi qui trình. 38 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian thực tập tiến hành nghiên cứu khả năng lên men tỏi và phân tích hoạt chất của một số giống tỏi ở Việt Nam tại phòng vi sinh khoa CNSH – CNTP chúng tôi có những kết luận như sau: Sử dụng phương pháp lên men tỏi bằng tủ sấy cho màu sắc và mùi vị đạt chuẩn nhất vào ngày thứ 35 của quá trình lên men. Sử dụng phương pháp lên men bằng nồi cơm điện cho màu sắc và mùi vị đạt chuẩn vào ngày thứ 23 của quá trình lên men. Sau khi kết thúc 35 ngày lên men bằng tủ sấy cho ra sản phẩm tỏi đen có hàm lượng đường là 47,09mg/g chiếm 4,7%. Hàm lượng các axit amin thiết yếu trong tỏi đen lên men bằng tủ sấy trong khoảng thời gian 35 ngày là: Leucine 61,05 mg/100g chiếm 6,10%; lysine 35,74 mg/100g chiếm 3,57%; isoleucine 65,03 mg/100g chiếm 6,50%; methionine 67,14 mg/100g chiếm 6,71%; phenylalanine 135,54 mg/100g chiếm 13,55%. Hàm lượng flavonoids và polyphenol trong tỏi đen lên men bằng tủ sấy trong khoảng thời gian 35 ngày lần lượt là: 5,66 mg/100g chiếm 0,05% và 17,91 mg/100g chiếm 1,79%. Cả 2 phương pháp lên men đều cho sản phẩm tỏi đen đạt yêu cầu về màu sắc và mùi vị. Nhưng phương pháp lên men bằng tủ sấy hiệu quả hơn khi tạo ra sản phẩm tỏi đen có hàm lượng các chất cao hơn. 39 5.2. Đề nghị Qua quá trình thực tập tại trường tôi đã học được rất nhiều kinh nghiệm quý báu đồng thới cũng mạnh dạn đưa ra một số đề nghị sau: Tiếp tục lập lại chuyên đề quy mô, số lượng lớn hơn. So sánh hiệu quả của nhiều loại phương pháp lên men tỏi để tìm ra phương pháp lên men tốt nhất nhằm khuyến khích mọi người áp dụng, tuyên truyền sâu rộng và phổ biến quy trình lên men tỏi có hiệu quả, hạn chế áp dụng những qui trình kém hiệu quả. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu Tiếng Việt. 1. Vũ Bình Dương, Phạm Xuân Phong .Nghiên cứu thành phần hóa học của tỏi đen Lý Sơn. Tạp chí Y dược lâm sàng 108. 2013. 2. Vũ Bình Dương, Vũ Xuân Nghĩa, Phạm Xuân Phong. Nghiên cứu khả năng bảo vệ cơ quan tạo máu của dịch chiết tỏi đen Lý Sơn trên chuột bị chiếu xạ. Tạp chí Dược học. 2013, số 446. 3. Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long. Đánh giá tác dụng chống oxy óa của dịch chiết tỏi đen Lý Sơn trên động vật thực nghiệm. Tạp chí ược học số 447. 4. Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho. Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn invitro của dịch chiết tỏi (Allium Sativum L) đối với E.Coli gây bệnh và E.Coli kháng Ampicillin, Kanamycin. Tạp chí Khoa học và Phát triển 2013, tập 11, số 6: 804-808. 5. Phạm Hoàng Hộ (2006) “ Cây có vị thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản trẻ. 6. Đỗ Tất Lợi (2003). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXBY học, Hà Nội. 7. Nguyễn Thanh Huyền (2015). Nghiên cứu sự biến đổi thành phần hóa lý của tỏi (Allium Sativum L) Phan Rang theo thời gian lên men. 8. Nguyễn Đức Vượng (2015). Nghiên cứu lên men tỏi đen từ tỏi trắng xã Quảng Hòa - Quảng Trạch – Quảng Bình. Tạp chí thông tin khoa học và công nghệ Quảng Bình – số 1/2015. II. Tài liệu Tiếng Anh. 9. Amagase, H.; Petsch, B.L.; Matsuura, H.; Kasuga, K.; Itakura, Y. Intake of garlic and its bioactive components. J. Nutr. 2001, 131, 955S–962S. 10. Asdaq SM, Inamdar MN, Asad M (2009). Effect of conventional antihypertensive drugs on hypolipidemic action of garlic in rats. Indian J. Exp. Biol., 47(3): 176-181 11. Banerjee, S.K.; Maulik, S.K. Effect of garlic on cardiovascular disorders: A review. Nutr. J. 2002, 1, 1–14. 2 41 12. Boyd, O., P. Weng, X. Sun, T. Alberico, M. Laslo et al., 2011. Nectarine promotes longevity in Drosophila melanogaster. Free Radical Bio Med., 50(11): 669-1678. 13. Sook Choi, Han Sam Cha and Young Soon Lee, 2014. Physicochemical and Antioxidant Properties of Black Garlic. Molecules 2014, 19, 16811- 16823. 14. Corzo-Martínez, M.; Corzo, N.; Villamiel, M. Biological properties of onions and garlic. Trends Food Sci. Technol. 2007, 18, 609–625. 4. 15. Colin-Gonzalez, A.L.; Santana, R.A.; Silva-Islas, C.A.; Chanez- Cardenas, M.E.; Santamaria, A.; Maldonad, P.D. The antioxidant mechanisms underlying the aged garlic extract- and S-allylcystein-induced protection. Oxidative Med. Cell. Longev. 2012, 2012, 1–16. 16. Chao, L.F., H. Guo and Z. Li, 2012. Research progress in the nutritional value and health effects of black garlic. Sci. Technol. Food Ind., 33(13): 429-432. 17. Ejaz S, Woong LC, Ejaz A (2003). Extract of garlic (Allium sativum) in cancer chemopreventions. Exp. Oncol., 24: 93-97. 18. EL KZ, Rasheed W, Ramzy T, Hussein J, Agaiby M, Morsy S, Morsy F, Shaffie N (2010). Protective effect of garlic oil against liver injury in experimental animals. J. Med. Plants Res., 4(22): 2359-2369. 19. Folch J, Lees M, Sloan SGH (1957). A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem., 226: 497-509. 20. Ichikawa, M.; Ryu, . K.; Yoshida, J.; Ide, N.; Yoshida, S.; Sasaoka, T.; Sumi, S.I. Antioxidant effects of tetrahydro-β-carboline derivatives identified in aged garlic extract. BioFactors 2002, 16, 57–72 21. Ichikawa, M.; Yoshida, J.; Ide, N.; Sasaoka, T.; Yamaguchi, H.; Ono, K. Tetrahydro-β-carboline derivatives in aged garlic extract show antioxidant properties. J. Nutr. 2006, 136, 726S–731S. 42 22. Inhye Kim1,2*, Jin-Young Kim1, Yu-Jin Hwang1, Kyung-A Hwang1, Ae-Son Om2, Jae-Hyun Kim1 and Kang-Jin Cho1. The beneficial effects of aged black garlic extract on obesity and hyperlipidemia in rats fed a high-fat diet. (Journal of Medicinal Plants Research Vol. 5(14), pp. 3159-3168, 18 July, 2011). 23. Kim, J.H., S.H. Nam, C.W. Rico and M.Y. Kang, 2012. A comparative study on the antioxidative and antiallergic activities of fresh and aged black garlic extracts. Int. J. Food Sci. Tech., 47: 1176-1182. 24. Kim, M.H.; Kim, M.J.; Lee, J.H.; Han, L.J.; Kim, J.H.; Sok, D.E.; Kim, M.R. Hepatoproective effect of aged black garlic on chronic alcohol- induced liver injury in rats. J. Med. Food. 2011, 14, 732–738 25. Kim, I.; Kim, J.Y.; Hwang, Y.J.; Hwang, K.A.; Om, A.S.; Kim, J.H.; Cho, K.J. The beneficial effects of aged black garlic extract on obesity and hyperlipidemia in rats fed a high-fat diet. J. Med. Plants Res. 2011, 5, 3159–3168. 26. Kim JY, Kwon O (2009). Garlic intake and cancer risk: an analysis using the food and drug administration’s evidence-based review system for the scientific evaluation of health claims. Am. J. Clin. Nutr., 89: 257264 27. Lee YM, Gweon OC, Seo YJ, Im J, Kang MJ, Kim MJ, Kim JI (2009). Antioxidant effect of garlic and aged black garlic in animal model of type 2 diabetes mellitus. Nutr. Res. Pract., 3(2): 156-161. 28. Mengmeng Lei, Mengying Xu, Zesheng Zhang, Min Zhang and Yunfeng. The Analysis of Saccharide in Black Garlic and its Antioxidant Activity Gao Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin University of Science and Technology, Ministry of Education, Tianjin 300457, P.R. Chin(Advance Journal of Food Science and Technology 6(6): 755-760, 2014). 43 29. Purev, U., M.J. Chung and D. Oh, 2012. Individual differences on immunostimulatory activity of raw and black garlic extract in human primary immune cells. Immunopharm. Immunot., 34(4): 651-660. 30. Rahman, K.; Lowe, G.M. Garlic and cardiovascular disease: A critical 31. Sato, E.; Kohno, M.; Niwano, Y. Increased level of tetrahydro-β- carbokine derivatives in short-term fermented garlic. Plant Food Hum. Nutr. 2006, 61, 175–178. 32. Sook Choi, Han Sam Cha and Young Soon Lee. Physicochemical and Antioxidant Properties of Black Garlic. (Department of Food and Nutrition, Kyung Hee University, 1 Hoeki-dong, Dongdaemun-Ku, Seoul 130-701, Korea, Molecules 2014). 33. Shin, J.H.; Choi, D.J.; Chung, M.J.; Kang, M.J.; Sung, N.J. Changes of physicochemical components and antioxidant of aged garlic at different temperatures. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 2008, 37, 1174–1181. 34. The Herb Society of America. Garlic An Herb Society of America Guide. 35. Yang ST (2007). Antioxidant activity of extracts of aged black garlic on oxidation of human low density lipoprotein. J. Life Sci., 17(10): 13301335. 36. Wang, X., F. Jiao, Q.W. Wang, J. Wang, K. Yang et al., 2012. Aged black garlic extract induces inhibition of gastric cancer cell growth in vitro and in vivo. Mol. Med. Rep., 5: 66-72. III. Các website 37. http:// ndb.nal.usda.gov/ 38. toidenvietnam.vn