Khóa luận Khảo sát hiệu quả của thanh trùng lên một số chỉ tiêu chất lượng của rượu vang

s. [20] Hệ nấm men trong sản xuất rượu vang bao gồm: - Nấm men tự nhiên (Wild Yeast): Candida colliculosa, Candida pulcherrima, Hansennula anomala, Kloeckera apiculata. - Nấm men vang (Wine Yeast): Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces uvarum. Khoá luận tốt nghiệp Tổng Quan Tài Liệu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 6 1.3.5. Đường Thành phần không thể thiếu trong rượu vang là đường. Đường trong vang chủ yếu là đường fructose, glucose và một ít đường galactose. Vang khô chứa ít hơn 4g/l. Các đường pentose có mặt trong vang đã lên men gồm 0.05 – 0.13% arabinose, 0.02 – 0.04% rhamnose và xylose ở dạng vết. Nếu trong rượu vang thành phẩm có đường saccharose thì đường này đã được pha thêm vào sau khi lên men. Vị của rượu phụ thuộc vào sự cân đối giữa độ cồn và độ ngọt của rượu vang. Lượng cồn cao tương ứng với lượng đường khử cao có thể gây cảm giác ngon hơn cho người uống. [6] 1.3.6. Vitamin Rượu vang được đánh giá là loại rượu bổ dưỡng là do trong thành phần của nó có rất nhiều loại vitamin: vitamin C, vitamin B, vitamin PP,... Thực tế thì quá trình lên men rượu là một quá trình điều chỉnh lại thành phần vitamin và là kỹ thuật để giữ lại vitamin trong trái cây. Sau quá trình lên men thì một số vitamin được giữ lại, một số khác bị mất đi, đồng thời một số vitamin sẽ được bổ sung thêm. 1.3.7. Muối khoáng Trong rượu vang chứa rất nhiều các loại muối vi lượng , là muối của các nguyên tố: P, S, K, Na, Ca, Fe, Cu, Mn, Thông thường, lượng tro trong rượu vang thường dao động vào khoảng 1.5 – 3.0g/l, nhưng có tác dụng làm tăng hương vị của rượu và tăng giá trị dinh dưỡng cho rượu, cung cấp vi lượng cho cơ thể. 1.3.8. Chất thơm Chất thơm là tên dùng để gọi các thành phần dễ bay hơi trong rượu non. Trong quá trình chín và bảo quản, chúng được chuyển hoá thành các chất tạo hương vị cho vang, hàm lượng dao động trong khoảng 0.8 – 1.2g/l, một phần bắt nguồn từ nho (chất thơm sơ cấp), một phần được tạo thành trong quá trình lên men (chất thơm thứ cấp). Khoá luận tốt nghiệp Tổng Quan Tài Liệu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 7 1.4. TIÊU CHUẨN VIỆT NAM (TCVN) ĐỐI VỚI CHẤT LƯỢNG VANG 1.4.1. Các chỉ tiêu hoá học của rượu vang [1,9] Tên chỉ tiêu Mức 1. Hàm lượng ethanol (cồn) ở 200 6 – 18 C, % (V/V) 2. Hàm lượng methanol trong 1 lít ethanol 1000 3.0 , g/l, không lớn hơn 3. Hàm lượng acid bay hơi, tính theo acid acetic, g/l, không lớn hơn 1.5 4. Hàm lượng SO2 350 , mg/l, không lớn hơn 5. Xianua và các phức xianua +, mg/l, không lớn hơn 0.1 6. Hàm lượng CO Theo tiêu chuẩn đã được công bố của nhà sản xuất 2 1.4.1.1. Methanol Methanol (methyl alcohol: CH3OH) là một rượu có tính độc. Nó ức chế đến hệ thần kinh trung ương (gồm não và tủy sống). Nếu uống vào, tùy liều lượng, sẽ gây nhức đầu, ngây ngất , ói mửa, mù mắt (do gây hư hoại tế bào võng mạc và sợi thần kinh thị giác), hôn mê, và tử vong. Một khi vào trong cơ thể sẽ được thải trừ ra rất chậm. Biểu hiện triệu chứng không rõ ràng. Khoá luận tốt nghiệp Tổng Quan Tài Liệu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 8 Liều lượng của rượu ảnh hưởng đến sự tỉnh táo của con người thay đổi tùy từng cá nhân. Theo tài liệu của Đại học Cambridge cho biết, chỉ với 10ml methanol (bằng hai muỗng cà phê) có thể gây mù mắt, và 30ml gây tử vong. [21] Ngoài tác động ức chế đến hệ thần kinh trung ương tương tự như rượu ethanol, cồn methanol còn rất độc vì nó được phân hủy trong cơ thể (ở gan) do enzyme alcohol dehydrogenase để cho ra formaldehyde (H 2CO: đây là “hóa chất ư ớp xác”). Chất này lại được oxy hóa cho ra acid formic (CH2O2 1.4.1.2. Acid bay hơi ), là chất độc hại chính (chất này là tác nhân chính trong nọc độc của ong và kiến). Acid formic gây tăng độ acid (acidosis) trong máu, dẫn đến suy hô hấp và ngưng thở. Trong rượu vang, acid bay hơi gồm phần lớn acid acetic ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết (trong muối). Để tránh rượu vang bị hỏng trong quá trình lưu thông hoặc bảo quản, lượng acid bay hơi phải nhỏ hơn 0.98 g/l đối với rượu vang chất lượng cao, 1.0 g/l đối với rượu vang bàn, 1.2 – 1.5 g/l đối với vang trắng. [13] Não của người chết vì uống rượu nhiễm methanol Khoá luận tốt nghiệp Tổng Quan Tài Liệu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 9 1.4.1.3. SO SO 2 2 (sulfur dioxit) tồn tại trong rượu vang ở dạng tự do và liên kết. Nó không chỉ có vai trò là chất chống oxy hoá, sát khuẩn, mà còn ảnh hưởng đến tính hoà tan của các chất khác trong dung dịch cũng như tính chất cảm quan của rượu. Nhưng khi hàm lượng SO2 1.4.1.4. Xianua quá cao, nó có thể gây độc đối với người sử dụng. Xianua là một muối của acid xianhydric (HCN), có tính khử. Nó còn được gọi là chất độc mùi hạnh nhân vì khi muối tác dụng dần với CO 2 và H2 1.4.2. Các chỉ tiêu vi sinh vật của rượu vang [1,9] O có trong không khí tạo ra khí HCN có mùi hạnh nhân đặc trưng. Xianua là chất cực độc, có thể nhiễm vào cơ thể con người qua đường hô hấp, tiêu hoá hay qua da. Khi bị nhiễm độc nhẹ, người bệnh cảm thấy nhức đầu, nôn mửa, tim đập mạnh. Khi bị nặng dẫn đến mất cảm giác, ngạt thở, có thể đi đến ngừng hô hấp và tim ngừng đập. Nó là chất có thể tan trong nước, ether và rượu với bất kì tỉ lệ nào. Tên chỉ tiêu Giới hạn tối đa 1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1 ml sản phẩm 102 2. E.Coli, số vi khuẩn trong 1 ml sản phẩm 0 3. Coliforms, số vi khuẩn trong 1 ml sản phẩm 10 4. Cl. Perfringens, số vi khuẩn trong 1 ml sản phẩm 0 5. S. aureus, số vi khuẩn trong 1 ml sản phẩm 0 6. Tổng số nấm men – nấm mốc, số khuẩn lạc trong 1 ml sản phẩm 10 1.4.2.1. Vi sinh vật hiếu khí Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn sinh trưởng và phát triển trong điều kiện có oxy phân tử, tức là cho khuẩn lạc trong môi trường nuôi dưỡng có oxy phân tử. Khoá luận tốt nghiệp Tổng Quan Tài Liệu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 10 Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của mẫu. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu. Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm. 1.4.2.2. E. coli Ngành (phylum): Proteobacteria; Lớp (class): Gamma Proteobacteria; Bộ (order): Enterobacterialse; Họ (family): Enterobacteriaceae; Chi (genus): Escherichia; Loài (species): E. coli. [14] Từ năm 1700 người ta đã phát hiện E. coli là một loài vi sinh vật gây bệnh (Niel M.A. Tarr P.I, 1994). Năm 1885 nhà khoa học người Đức là Theodor Escherich đã tách được loài vi sinh vật này từ phân trẻ em bị bệnh. Sau này vi khuẩn này được mang tên ông. Năm 1971 người ta xếp chúng vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh trong th ực phẩm và là một vi sinh vật chỉ thị nhiễm trùng thực phẩm. [12] E. coli là trực khuẩn ngắn, gram (-), không tạo bào tử, chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 1000C trong 2 giờ, có thể kháng cồn, không bị phá hủy khi tiếp xúc với cồn 50%, mà bị hủy bởi formone 5%, có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 30 tới 500C, nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng là 370 1.4.2.3. Coliforms C, phát triển ở pH tối thích là 4.4. E. coli sống trong ruột già của người và động vật, có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi, có khả năng khử nitrate thành nitrite. Khả năng gây bệnh rất đa dạng và nguy hiểm. [12] Coliforms là những trực khuẩn hình que, gram âm (-), không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tuỳ ý. Chúng có khả năng phát triển ở phổ nhiệt độ rất rộng từ -20C đến 500C, pH trong khoảng 4.4 đến 9.0. Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, ở ruột Khoá luận tốt nghiệp Tổng Quan Tài Liệu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 11 người và động vật, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ. Khi số Coliforms trong rượu cao kéo theo khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao. [12] Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose trong 24 giờ khi ủ ở nhiệt độ 440C trong môi trường EC. Coliforms phân là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ 24 giờ ở 45 .50 1.4.2.4. Clostridium perfringens C trong canh Trypton. Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống. Giới: Bacteria; Ngành (phylum): Firmicutes; Lớp (class): Clostridia; Bộ (order): Clostridiales; Họ (family): Clostridiaceae; Chi (genus): Clostridium; Loài (species): C. perfringens. [14] Clostridium là các vi khuẩn gram (+), hình que, kị khí bắt buộc, sinh bào tử, không di động, có thể thủy giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng tạo ra các sản phẩm như acid acetic, butyric, rượu, tạo ra các mùi khó chịu trong sản phẩm. Clostridium có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 550C, nhiệt độ tối ưu là 43 – 470C. Nhiệt độ 15 – 200 1.4.2.5. Staphylococcus aureus C làm chậm hoặc làm ngưng sự phát triển của vi khuẩn này. Ở pH trên 9.0 và NaCl 5% sự sinh trưởng của Clostridium bị ức chế hoàn toàn. Trong tự nhiên, Clostridium có mặt trong đất, một số loài trong nhóm này gây bệnh cho người và động vật, một số loài khác gây hư hỏng thực phẩm, khử sulphite thành sulphur tạo ra màu đen và gây mùi khó chịu. Giới (kingdom): Eubacteria; Ngành (phylum): Firmicutes; Lớp (class): Cocci; Bộ (order): Bacillales; Họ (family): Staphylococcaceae; Chi (genus): Staphylococcus; Loài (species): S. aureus. [22] Khoá luận tốt nghiệp Tổng Quan Tài Liệu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 12 Năm 1894, I. Denys là người đầu tiên nghiên cứu về Staphylococcus và các độc tố của chúng trong thực phẩm. Năm 1914, Barber và sau đó 1930, GM. Dack tìm thấy Staphylococcus trong sữa. Hiện nay, người ta đã tìm thấy tất cả 31 loài Staphylococcus. Staphylococcus là loại cầu khuẩn gram (+), các tế bào của chúng liên kết thành hình chùm cho. Khi phát triển trong môi trường, Staphylococcus có khả năng tạo ra sắc tố từ màu trắng đến vàng sậm, nhiệt độ 20 – 250C thích hợp nhất cho chúng tạo màu. Staphylococcus không di động, không tạo bào tử, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 370C, chịu được sự khô hạn, hơi nóng (ở nhiệt độ 500 1.4.2.6. Nấm men, nấm mốc C chúng vẫn sống được trong 30 phút), có khả năng sống ở nồng độ muối 9 – 10%. Staphylococcus phát triển ở phổ pH rất rộng (pH từ 4.0 tới 9.8). Khoảng pH tối ưu của chúng là 6 – 7. [12] Staphylococcus được phân bố khắp nơi nhưng chủ yếu được phân lập từ da và màng nhầy của người và động vật máu nóng , có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose. Staphylococcus có thể nhiễm vào nước và thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của Staphylococcus trong mẫu chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật nhân thật, rất đa dạng, có vách tế bào và lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài nấm men, nấm mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng. Chúng chỉ có khả năng nhận các chất dinh dưỡng ở dạng hoà tan. Trong quá trình trao đổi chất xảy ra ở tế bào, chúng có khả năng chuyển hoá các chất hoà tan thành các chất không hoà tan như lignocellulose, Ngoài ra, chúng còn có thể tạo ra các chất độc, các chất độc đó được gọi chung là độc tố vi nấm (mycotoxins). Tiêu biểu có Asp. flavus, Asp. parasiticus, Asp. moninus, P. italicum, P. digitatum, P. roquefortii, P. cammenbertii. [12] Khoá luận tốt nghiệp Tổng Quan Tài Liệu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 13 Trong rượu vang, sự hiện diện của nấm men, nấm mốc có thể làm đổi màu rượu, gây cặn, phát sinh mùi vị lạ, thay đổi cấu trúc của rượu, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc. 1.5. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG TRÊN THẾ GIỚI VÀ NGÀNH RƯỢU VANG Ở VIỆT NAM 1.5.1. Thị trường rượu vang (theo số liệu thống kê năm 2001) NƯỚC TIÊU THỤ NƯỚC TIÊU THỤ Pháp 41.7% Úc 4.8% Italia 17.2% Bồ Đào Nha 4.3% Tây Ban Nha 9.2% Đức 4.3% Dưới đây là bảng số liệu so sánh sức tiêu thụ rượu vang của một số quốc gia trên thế giới năm 2003 và 2007 (theo số liệu thống kê năm 2009) Khoá luận tốt nghiệp Tổng Quan Tài Liệu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 14 1.5.2. Ngành rượu vang ở Việt Nam Trước đây, ngành rượu vang ở Việt Nam còn non trẻ, các cơ sở sản xuất rượu vang trong nước chưa nhiều và công nghệ chế biến không cao nên chưa chiếm được thị trường trong nước và thế giới. Nhưng hiện nay, khi con người nhận thức được vai trò và lợi ích củ a rượu vang trong cuộc sống thì đã có nhiều nhà máy sản xuất rượu vang mọc lên với quy mô công nghiệp cùng kỹ thuật và trang thiết bị tân tiến hơn: công ty Ladofoods (Lâm Đồng), Beco Đà Lạt, Vĩnh Tiến, vang Biên Hoà, Việt Nam có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển công nghệ sản xuất rượu vang. Với 85 triệu dân, đây là thị trường đầy tiềm năng với sản phẩm rượu vang. Mặt khác, do chính sách mở cửa và giao lưu văn hóa, người Việt Nam bước đầu làm quen với văn hóa châu Âu trong đó có văn hóa ẩm thực, rượu vang. Ngành du lịch phát triển cũng là một yếu tố thúc đẩy ngành công nghiệp sản xuất rượu vang. Trong xu thế tòan cầu nền kinh tế thế giới, hàng hóa của Việt Nam trong đó có rượu vang có điều kiện thâm nhập thị trường các nước và các nhãn hiệu rượu vang nổi tiếng thế giới vào Việt Nam đòi hỏi rượu vang Việt Nam ngày càng phải nâng cao chất lượng. Sự kiện hội nghị APEC tại Việt Nam sử dụng vang Đà Lạt để tiếp khách và Cuộc thi rượu vang quốc tế tại Việt Nam 2007, chứng tỏ thương hiệu rượu vang Việt Nam đã bắt đầu có chỗ đứng trên thị trường trong nước và thế giới. Nhưng bên cạnh những thế mạnh đó, Việt Nam cũng có những khó khăn không nhỏ để phát triển ngành công nghiệp sản xuất rượu vang. Chúng ta không có vùng nguyên liệu chuyên canh và giống nho tốt để đáp ứng sản xuất rượu vang ở quy mô công nghiệp, chúng ta cũng không có truyền thống trong ngành sản xuất vốn đòi hỏi rất nhiều bí quyết để tạo ra sản phẩm có chất lượng cao này. Điều kiện khí hậu nhiệt đới vốn không thuận lợi cho quá trình sản xuất rượu vang cũng là một bất lợi cho ngành sản xuất rượu vang. Mặc dù có thị trường giàu tiềm năng, nhưng người dân chưa có thói quen sử dụng rượu vang như thức uống khai vị trong bữa ăn hàng ngày. Chúng ta cũng chưa có chính sách về thuế đối với rượu vang sản xuất trong nước và rượu vang nhập khẩu để Khoá luận tốt nghiệp Tổng Quan Tài Liệu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 15 thúc đẩy ngành sản xuất rượu vang trong nước. Tình trạng rượu giả tràn lan trên thị trường gây khó khăn không nhỏ đối với rượu vang nội địa. 1.6. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG Ở CÔNG TY CỔ PHẦN RƯỢU BIA ĐÀ LẠT (BECO ĐÀ LẠT) Nguyên liệu Phân loại Xay, nghiền Trích ly Thanh trùng Nước Hoá chất diệt khuẩn Làm sạch Làm lạnh Len men phụ Xác men Tàng trữ Lọc, phối chế Đóng chai Thành phẩm Men giống Lên men chính 18 – 220C 15 – 180C 10 – 20 ngày 15 – 20 ngày Khoá luận tốt nghiệp Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 16 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - Đối tượng: Mẫu rượu vang được lấy ngay tại các tank ở giai đoạn trích ly (rượu vang bán thành phẩm) và giai đoạn đóng chai (rượu vang thành phẩm) của quá trình sản xuất rượu vang. - Xuất xứ của mẫu: Công ty cổ phần rượu bia Đà Lạt (Dalat Beco). - Tiêu chuẩn chọn mẫu: mẫu được lấy một cách ngẫu nhiên và đủ lớn để có thể tiến hành thí nghiệm kiểm tra tất cả các chỉ tiêu vi sinh và chỉ tiêu hoá lý. - Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Hoá Sinh – khoa Sinh học – trường Đại học Đà Lạt và phòng thí nghiệm vi sinh – thực phẩm, phòng thí nghiệm hoá lý – khoa xét nghiệm tổng hợp – Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Lâm Đồng. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thu lấy mẫu và bảo quản mẫu Lượng mẫu thu lấy đảm bảo độ tin cậy, có tính đại diện và đủ số lượng cần thiết cho thí nghiệm. Mẫu lấy phân tích phải đảm bảo không bị nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài trong quá trình lấy mẫu và vận chuyển mẫu, không có sự phát triển thêm của vi sinh vật có sẵn trong mẫu, hoặc số lượng vi sinh vật tiêu hao trong mẫu không ảnh hưởng nhiều đến kết quả thí nghiệm. Mẫu được phân tích trong vòng 6 giờ sau khi thu mẫu để đảm bảo độ chính xác. [12] Mẫu lấy về có thể bảo quản được trong vòng 2 ngày ở điều kiện thường. Nếu không sử dụng ngay thì phải bảo quản trong tủ lạnh (0 – 50 2.2.2. Đồng nhất và pha loãng mẫu C), bảo quản được trong vòng 1.5 tuần. [2] Khoá luận tốt nghiệp Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 17 Để đảm bảo tính đồng đều của mẫu, sau khi lấy, mẫu được lắc đều trong 5 phút. Trước khi phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật, mẫu cần phải pha lõang bằng nước muối sinh lý hoặc nước muối peptone có thành phần như bảng sau: Thành phần Nước muối sinh lý Nước muối peptone NaCl (g) 8.5 8.5 Peptone (g) - 1 Nước cất (ml) 1000 1000 Dịch pha loãng được phân phối vào ống nghiệm (9ml/ống) và trong bình tam giác (90ml/bình). Sau đó, hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210 Trộn lẫn 10ml mẫu vào 90ml dịch pha loãng ta được dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng là 10 C trong 15'. -1. Lấy 1ml dung dịch mẫu ở nồng độ pha loãng 10 -1 trộn lẫn với 9.0ml dịch pha loãng ta có dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng là 10-2. Tiếp theo lấy 1ml dung dịch mẫu nồng độ pha loãng 10-2 cho vào 9.0ml dung dịch pha loãng nhận được mẫu có độ pha loãng là 10-3 2.2.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật . Với cách làm tương tự ta sẽ có mẫu với độ pha loãng thích hợp. Thời gian pha loãng mẫu tới khi cấy không quá 20'. 2.3.3.1. Kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí Nguyên tắc: Trên cơ sở số lượng mẫu xác định và coi một khuẩn lạc là điểm xuất phát đầu tiên cho một vi sinh vật sống. Đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ các nồng độ pha loãng sau khi nuôi cấy ở 30 – 370 Môi trường: Thạch dinh dưỡng. C trong 24 – 48h. Tính số khuẩn lạc trong 1ml mẫu. Từ đó suy ra số lượng tế bào sống có trong mẫu phân tích. Thực hiện theo kỹ thuật hộp đổ. [2] Thực hiện: Cho vào mỗi đĩa petri 15ml môi trườn g thạch dinh dưỡng có nhiệt độ 44 - 460C. Dùng pipette cho vào các đĩa 1ml mẫu có độ pha loãng tương ứng, t rộn đều bằng cách xoay đĩa petri nhẹ nhàng theo chiều kim đồng hồ và ngược chiều kim Khoá luận tốt nghiệp Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 18 đồng hồ. Khi môi trường đã đông hẳn, úp ngược đĩa petri, gói giấy báo và ủ ở nhiệt độ 29 – 310 Tính kết quả: Sau 24h, đọc kết quả sơ bộ. Sau 48h, đếm tất cả các khuẩn lạc có trên các đĩa thạch đã nuôi cấy và lấy kết quả chính thức. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 15 – 300 để tính giá trị trung bình của các nồng độ pha loãng rồi tính ra số lượng vi khuẩn trong 1ml mẫu. Tính số vi khuẩn hiếu khí theo công thức: [10] C trong 24 – 48h. [2,3] 1 1 ( / ) ... i i NA CFU ml nVf nVf = + + A số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1ml mẫu. N tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn. ni V thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i. fi 2.3.3.2. Kiểm tra tổng số nấm men, nấm mốc độ pha loãng tương ứng. Nguyên tắc: Sử dụng kỹ thuật hộp đổ trên môi trường thạch sau khi ủ hiếu khí 28± 10 Môi trường: Thạch Saboraud. C. Sau thời gian từ 3 – 7 ngày, số lượng bào tử nấm men, nấm mốc trong 1ml mẫu được tính theo số khuẩn lạc đếm được trên môi trường thạch theo các nồng độ pha loãng khác nhau. [2] Nuôi cấy: Hút 1ml mẫu hoặc 1ml nồng độ pha loãng vào giữa đĩa petri, sau đó cho vào 15ml môi trường thạch dinh dưỡng (44 - 460C). Trộn đều bằng cách xoay đĩa nhẹ nhàng theo cùng và ngược chiều kim đồng hồ. Để các đĩa thạch đông tự nhiên. Khi thạch đã đông, gói giấy báo và để tủ ấm ở 27 – 290C hoặc nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 – 7 ngày. [2] Khoá luận tốt nghiệp Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 19 Tính kết quả: Sau 3 ngày, đọc kết quả sơ bộ, đếm tổng số khuẩn lạc mọc trên môi trường đã nuôi cấy. Sau 5 – 7 ngày đếm kết quả chính thức. Chọn tất cả các đĩa có không quá 150 khóm nấm để tính kết quả. [2] ( )1 2 C N n n d = + × ∑ N Tổng số nấm men, nấm mốc trong 1ml mẫu. C∑ Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa. n1; n2 d Hệ số pha loãng Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1, thứ 2. 2.3.3.3. Kiểm tra Coliform Nguyên tắc: Xác định bằng phương pháp MPN với nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần) (hệ 9 ống nghiệm). Ghi nhận số ống nghiệm dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1ml mẫu ban đầu. [2] Môi trường sử dụng: Môi trường LSB và canh trường mật bò BGBL 2%. Nuôi cấy: Hút 1ml mẫu cho vào 3 ống nghiệm khác nhau. Hút 10ml môi trường LSB cho vào 3 ống đó. Thực hiện tương tự với các nồng độ pha loãng khác nhau, từ 3 đến 5 nồng độ pha loãng liên tiếp. Ủ ống nghiệm ở tủ ấm 370 Tính kết quả: Sau 48h, ghi nhận số ống có sinh hơi (+). Nếu môi trường bị đục mà không sinh hơi là âm tính (-). Dùng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL (mỗi ống 1 khuyên cấy). Các ống được ủ ở nhiệt độ 30 C trong 48h. [2,3,13] 0C trong 48h. Ghi nhận số ống có sinh hơi ứng với mỗi nồng độ pha loãng . Ở mỗi nồng độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN thích hợp để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml. [2,10,13] Khoá luận tốt nghiệp Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 20 2.3.3.4. Kiểm tra E. coli Nguyên tắc: Định lượng E. coli bằng phương pháp MPN như nguyên tắc định lượng Coliform. Môi trường: Canh trường BGBL, thạch EMB, môi trường indole, thạch thường, nước peptone, môi trường MR – VP, môi trường Simmon Citrate. Kỹ thuật: Ria 1 khuyên cấy từ ống BGBL (+) sang môi trường thạch EMB và để tủ ấm 370C trong 24h. Sau thời gian nói trên, c họn các khuẩn lạc điển hình của E. coli (khuẩn lạc hình tròn, mặt phẳng hoặc hơi lồi, có ánh kim) cấy vào môi trường thạch thường, tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ 370 1) C trong 24h. Nếu môi trường sinh hơi thì thực hiện phản ứng IMViC. [2,10,13] Phản ứng sinh indol: Cấy vi khuẩn từ môi trường thạch thường vào môi trường nước peptone, nuôi cấy ở nhiệt độ 370 2) C trong 24 – 48h. Cho 5 giọt thuốc thử Kowac’s vào môi trường có vi khuẩn vừa cấy , để yên vài phút. Phản ứng (+) khi có vòng nhẫn màu đỏ cánh sen trên môi trường. Phản ứng MR (Methyl Red): Cấy vi khuẩn từ môi trường thạch thường sang môi trường MR – VP. Đặt ở tủ ấm 370 3) C trong 24 – 48h. Lấy 5ml MR – VP có vi khuẩn vào ống nghiệm khác để thực hiện phản ứng VP. Canh khuẩn MR – VP còn lại : cho 5 giọt methyl đỏ 0.2% vào. Phản ứng (+) khi môi trường có màu đỏ ngay sau khi cho thuốc thử. Phản ứng VP (Voges – Proskauer): α Cho 1.8 ml Naphthol 5% cùng 0.6ml KOH 40% vào canh khuẩn MR – VP. Phản ứng (+) khi có màu đỏ xuất hiện trong vòng 5 – 10' sau khi cho thuốc thử vào. Một số loài cho phản ứng (+) chậm nên phải hơ nóng nhẹ. Khoá luận tốt nghiệp Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 21 4) Phản ứng Citrate: Cấy chuyển vi khuẩn ngờ từ thạch thường vào môi trường Simmon Citrate. Nuôi ở tủ ấm 37 0 Tính kết quả: Xác định E. coli gây bệnh khi phát hiện vi khuẩn gram (-) bằng phương pháp nhuộm gram với đặc tính sinh hoá như sau: [2,10] C trong 18 – 24h. Phản ứng (+) khi môi trường chuyển sang màu xanh dương. Indol MR VP Citrate E. coli type I + + - - E. coli type II - + - - 2.3.3.5. Kiểm tra tụ cầu khuẩn Nguyên tắc: Nuôi cấy mẫu thử trong môi trường TSTC, sau đó nuôi cấy trên môi trường Chapman trong đĩa petri. Nuôi ở 370 Môi trường: Môi trường TSTC, Chapman, môi trường dextrose. C trong 24 – 48h, nhận định sự có mặt của Staphylococcus aureus theo các đặc điểm nuôi cấy, hình thái và các đặc tính sinh hoá. [13] Các bước tiến hành: Hút 1ml dịch mẫu cấy vào môi trường TSTC, lắc nhẹ để trộn đều mẫu. Nuôi ở tủ ấm 370 Chọn vài khuẩn lạc đặc trưng làm tiêu bản, nhuộm gram (phụ lục 1), soi kính hiển vi. Nếu thấy hình thái tế bào vi khuẩn điển hình hoặc nghi ngờ thì cấy chuyền vào môi trường dextrose. Nuôi ở 37 C trong 24h. Nếu thấy môi trường trong ống nghiệm bị đổi màu thì cấy chuyền bằng cách ria cấy trên bề mặt môi trường Chapman. Khi đó, St. aureus sẽ hình thành các khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, đường kính 1 – 3mm. Sau 24h, khuẩn lạc và môi trường xung quanh chúng có màu vàng sáng hoặc hơi sẫm. Sau 48h, đường kính của khuẩn lạc tăng lên, màu của khuẩn lạc và môi trường xung quanh vàng sẫm hơn. 0C trong 24h để thử phản ứng coaglucaza. Sau 24h lấy 0.1ml dịch cấy trên chuyển vào ống nghiệm có sẵn 0.3 – 0.5ml huyết tương thỏ. Lắc để trộn đều mẫu và nuôi cấy ở 370C. Song song với mẫu thí nghiệm làm một ống Khoá luận tốt nghiệp Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 22 nghiệm đối chứng có 0.1ml canh thang vô khuẩn với cùng lượng 0.3 – 0.5ml huyết tương thỏ. Sau 2h, 4h, 6h, đọc kết quả. Nếu phản ứng (-) thì để những ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng trong 24h và tiếp tục quan sát. Nếu St. aureus cho phản ứng (+) thì huyết tương trong ống nghiệm phải được thử đông lại. [2] Tính kết quả: Khi phát hiện các khuẩn lạc đặc trưng thì làm tiêu bản, n huộm gram và soi kính hiển vi. Vi khuẩn St. aureus có hình cầu, xếp thành hình chùm nho, thành đám hay cặp, gram (+), lên men đường mannitol, chuyển màu môi trường Chapman từ đỏ sang vàng. [2] 2.3.3.6. Kiểm tra vi khuẩn kỵ khí Nguyên tắc: Nuôi cấy 10ml mẫu thử hay dịch pha loãng trong ống môi trường dịch chọn lọc (nuôi cấy sâu), xử lý nhiệt độ ở 750C trong 10' sau khi cấy mẫu, làm lạnh ngay và đưa vào nuôi trong tủ ấm 37 0 Môi trường: Môi trường Wilson – Blair cải tiến. C trong 24 – 72h. Nhận định sơ bộ sự có mặt của Clostridium perfringens qua đặc điểm hình thái, tính sinh hoá. [2] Các bước tiến hành: Hút 1ml mẫu hoặc dịch pha loãng vào 2 ống nghiệm có môi trường Wilson – Blair (đã đun tan chảy, để nguội 45 – 500C), lắc đều, sau đó đun cách thuỷ ở 800C trong 10'. Lấy mẫu ra và làm lạnh ngay dưới vòi nước (hay để trong tủ lạnh). Khi thạch đông, nuôi trong tủ ấm ở 370 Tính kết quả: Sau 24h, lấy ra đọc kết quả sơ bộ. Cl. perfringens tạo khuẩn lạc tròn, màu đen, đường kính 1mm. Sau 72h, khuẩn lạc s ẽ lớn hơn (đường kính 4 – 6mm), có thể có vết nứt hay cột thạch có bọt khí (do sự sinh hơi). Nếu môi trường xuất hiện nhiều khuẩn lạc tạp hoặc nghi ngờ thì thuần khiết giống và kiểm tra tiêu bản qua kính hiển vi. Đồng thời, làm các phép thử tính di động, khả năng khử nitrate [2] C trong 24 – 72h. [2] 2.2.4. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa lý 2.2.4.1. Phương pháp xác định độ cồn Khoá luận tốt nghiệp Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 23 Nguyên tắc: Mẫu sau khi qua chưng cất, được đo bằng cồn kế ở 20 0C. Hàm lượng ethanol trong 100ml mẫu chính là độ rượu của mẫu ở 200 Quy trình: Lấy 500ml mẫu rượu, cho vào bình cất với vài viên đá bọt. Lắp hệ thống chưng cất hoàn chỉnh và chưng cất cho đến khi được 2/3 thể tích bình hứng (200ml) thì ngưng cất. Định mức lượng cồn thu được tới 250ml, lắc đều. [13] C. [13] Tính kết quả: Dùng alcoholmeter để đo độ cồn và nhiệt kế để đo nhiệt độ của dung dịch. Nếu nhiệt độ không ở 200C thì tra bảng hiệu chỉnh (tra bảng) để quy đổi về độ rượu ở 200 2.2.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng số C. [13] Nguyên tắc của phương pháp: trong rượu vang chứa rất nhiều loại acid hữu cơ khác nhau được tạo thành trong quá trình lên men. Acid tổng số là tổng các acid được chuẩn độ khi đưa pH của rượu vang về 7.0. H2CO3, SO2 Lượng acid trong mẫu được chuẩn độ bằng NaOH với chỉ thị bromothymol blue. tự do và liên kết không được tính trong acid tổng số. [5] Tiến hành thí nghiệm: dùng pipette hút 100ml rượu thử (không qua chưng cất) vào bình tam giác. Cho vào 5 giọt bromothymol blue , chuẩn độ bằng NaOH 0.1N tới khi dung dịch chuyển sang màu xanh, bền trong 30 giây. [13] Nếu sự chuyển màu của mẫu khó quan sát, cần pha loãng mẫu 1.5 – 2 lần. Việc pha loãng mẫu không gây ảnh hưởng đến kết quả chuẩn độ. Tính kết quả: lượng acid tổng số trong mẫu được biểu thị bằng acid acetic (mg) trong 100ml rượu quy về độ cồn 1000 1003 n A × × theo công thức: [13] 3 Số mg acid acetic ứng với 1ml NaOH 0.1N. n Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ (ml). Khoá luận tốt nghiệp Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 24 A Độ cồn của rượu 100 A Hệ số để chuyển rượu có độ cồn A thành rượu có độ cồn 1000 2.2.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng acid bay hơi . Nguyên tắc của phương pháp: Acid bay hơi được tách ra bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước. Dịch acid ngưng tụ được chuẩn độ bằng kiềm. Các acid được tạo thành từ CO2 và SO2 Quy trình: Cho vào bình tam giác dung tích 250ml, lấy 100ml rượu cất được cùng với 3 giọt thuốc thử PP (Phenol phtalein 1% trong rượu 60 không được tính là acid bay hơi. [5] 0 Tính kết quả: hàm lượng acid bay hơi trong mẫu (g/l) được tính th eo acid acetic. [13] ). Chuẩn độ bằng NaOH 0.1N tới khi dung dịch xuất hiện màu hồng nhạt, bền trong 30 giây. [13] 0 10000.006X V V = × V Thể tích dung dịch NaOH 0.1N đã chuẩn độ (ml) V0 1000 Hệ số quy về 1l. Thể tích mẫu đem đi chuẩn độ (ml) 0.006 Hệ số chuyển ra acid acetic (hệ số hiệu chỉnh dung dịch NaOH: F = 1) 1ml NaOH 0.1N tương ứng với 0.006g acid acetic 2.2.4.4. Phương pháp xác định hàm lượng aldehyde Nguyên tắc: Aldehyde trong rượu được định phân bằng iod dựa vào nguyên tắc cộng bisunfit nhóm aldehyde. Quá trình có 4 giai đoạn: - Qxy hóa rượu trong môi trường acid loãng tạo aldehyde ở dạng tự do. Khoá luận tốt nghiệp Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 25 - Cộng nhóm bisunfit vào nhóm aldehyde (acetaldehyde) ở pH = 7.0. - Chuẩn độ lượng bisunfit thừa bằng iod ở pH = 2.0. - Định lượng aldehyde kết hợp bằng iod ở pH: 9.0 – 9.5. [5] Quy trình: Cho vào bình tam giác 500ml thứ nhất (bình thí nghiệm) 50ml rượu cất được, 250ml nước cất và 10ml dung dịch Natri metabisunfit, đậy kín, lắc đều, để yên 15'. Tiếp tục cho vào hỗn hợp nói trên 10ml phosphate – EDTA (pH = 7.0), đậy kín, lắc đều, để yên 15'. Tiếp tục cho vào 10ml dung dịch HCl 25% (pH ≤2.0) và 1ml hồ tinh bột. Cho từng giọt iod 0.1N vào tới khi dung dịch trong bình chuyển màu xanh tím. Tiếp theo cho vào 10ml dung dịch Borat kiềm (pH: 9.0 – 9.5), dung dịch sẽ mất màu. Dùng iod 0.01N chuẩn độ dung dịch cho tới khi dung dịch chuyển sang màu xanh tím, bền trong 30 giây. Cho vào bình tam giác 500ml thứ hai (bình kiểm tra) các thành phần như bình thí nghiệm nhưng thay dung dịch rượu bằng ethanol không có aldehyde có độ cồn gần bằng độ cồn của mẫu thử. Các bước tiến hành tương tự như bình thí nghiệm. [13] Tính kết quả: Ghi lượng iod 0.01N đã chuẩn độ ở 2 bình. Lượng aldehyde tổng cộng (mg/l rượu 1000 ( )1 0 1000 1000.22X V V V A = − × × × ) tính theo acetaldehyde: [13] V1 V Thể tích iod 0.01N đã chuẩn độ mẫu thử (ml). 0 V Thể tích mẫu thử đem thí nghiệm (ml) Thể tích iod 0.01N đã chuẩn độ mẫu trắng (ml). A Độ rượu của mẫu thử ở 200 100 Hệ số chuyển về 100 C. 0 rượu. 1000 Hệ số chuyển về 1l rượu. Khoá luận tốt nghiệp Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 26 1ml iod 0.01N tương ứng với 0.22mg acetaldehyde Khoá luận tốt nghiệp Kết Quả Nghiên Cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 26 3.1. CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT Sự có mặt của vi sinh vật trong thực phẩm là dấu hiệu để nhận biết thực phẩm bị ô nhiễm và giảm chất lượng. Chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật trong các mẫu rượu vang, kết quả được trình bày ở bảng 1. Bảng 1: Các chỉ tiêu vi sinh vật thu được sau 24 giờ nuôi cấy 2 mẫu rượu vang. Mẫu TVKHK (CFU/ml) Coliform – E. coli S. aureus Cl. perfringens Mẫu 1 5.7 x 10 - 2 - - Mẫu 2 <10 - 2 - - Từ số liệu bảng 1, chúng tôi nhận thấy tổng số vi khuẩn hiếu khí ở mẫu 1 nhiều hơn mẫu 2 sau 24 giờ nuôi cấy, cũng tức là mẫu rượu bán thành phẩm có sự hiện diện của nhiều vi khuẩn hiếu khí nhiều hơn. Bên cạnh đó, không phát hiện thấy xuất hiện dấu hiệu của Coliforms, E. coli, cũng như S. aureus ở cả 2 mẫu rượu. Tuy nhiên, chỉ nuôi cấy mẫu sau 24 giờ vẫn chưa thể khẳng định được trong mẫu có các vi sinh vật trên hay không. Để kiểm tra kết quả nhận được, chúng tôi tiến hành xác định chỉ tiêu vi sinh vật của 2 mẫu nói trên sau 48 giờ nuôi cấy. Kết quả thể hiện ở bảng 2. Bảng 2: Các chỉ tiêu vi sinh vật thu được sau 48 giờ nuôi cấy 2 mẫu vang trên. Mẫu TVKHK (CFU/ml) Coliform – E. coli S. aureus Cl. perfringens Mẫu 1 6.4 x 10 - 2 - - Mẫu 2 <10 - 2 - + Số liệu trong bảng 2 cho thấy, ở mẫu 1 tổng số vi khuẩn hiếu khí tăng không đáng kể sau 48 giờ nuôi cấy. Kết quả cho thấy rõ có sự tương ứng giữa chỉ tiêu vi sinh vật ở các mẫu rượu vang sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy. Tổng số vi khuẩn hiếu khí ở mẫu 1 lớn hơn mẫu 2. Sau 48 giờ nuôi cấy, chúng tôi cũng không phát hiện thấy Coliform, E. coli cũng như S. aureus. Như vậy ở cả mẫu rượu vang thành phẩm và bán thành phẩm đều đạt tiêu chuẩn Việt Nam về chất lượng của rượu vang. Kết quả này Khoá luận tốt nghiệp Kết Quả Nghiên Cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 27 cũng chứng minh rằng trong quá trình chế biến và bảo quản rượu vang đảm bảo các điều kiện về vệ sinh an toàn thực phẩm. Tổng số vi khuẩn hiếu khí là một chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng sản phẩm. Do mẫu 1 và 2 ở trên có tổng số vi khuẩn hiếu khí khá lớn, chúng tôi tiến hành xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí ở cả mẫu 1 và 2. Kết quả biểu diễn ở bảng 3. Bảng 3: Số khuẩn lạc của vi khuẩn hiếu khí trong 2 mẫu rượu vang. Mẫu Đĩa thí nghiệm KẾT QUẢ (số khuẩn lạc) Sau 24h Sau 48h 10 10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 -3 Mẫu 1 Đĩa 1 32 26 0 53 18 5 Đĩa 2 30 27 3 55 27 6 Mẫu 2 Đĩa 1 3 0 0 7 3 1 Đĩa 2 4 2 0 6 5 0 Hình 1. Khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí của mẫu 1 được nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng. Khuẩn lạc có màu trắng, hình tròn. Khoá luận tốt nghiệp Kết Quả Nghiên Cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 28 Phù hợp với kết quả ở bảng 1 và 2, số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí đều có ở cả mẫu 1 và 2 với số lượng đáng kể, tuy nhiên số khuẩn lạc ở mẫu 1 nhiều hơn mẫu 2. Chúng tôi cũng nhận thấy sau 48 giờ nuôi cấy, số khuẩn lạc của vi khuẩn hiếu khí đều cao hơn nhiều so với sau 24 giờ nuôi cấy, các số liệu tương ứng thể hiện điều đó là ở nồng độ pha loãng 10-1: 32 – 53, 30 – 55; ở nồng độ pha loãng 10-2 Sau 24 và 48 giờ nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, cả 2 mẫu rượu đều cho kết quả âm tính đối với chỉ tiêu E. coli và Coliform. Đối với mẫu 1, môi trường nuôi cấy bị đục nhưng không có hiện tượng sinh hơi tức là chưa có sự xuất hiện của Coliform, mẫu 2 môi trường không bị đục và không sinh hơi. Như vậy, rượu bán thành phẩm và rượu thành phẩm đều không có sự xuất hiện của vi khuẩn gây bệnh đường ruột. : 26 – 18, Từ đó, chúng tôi rút ra nhận xét là muốn đánh giá chính xác tổng số vi khuẩn hiếu khí, cần phải tiến hành nuôi cấy sau 48 giờ. Với vi khuẩn kị khí Cl. perfringens, sau 24 giờ nuôi cấy thì cả 2 mẫu đều không thể hiện sự xuất hiện của vi khuẩn này, nhưng sau 48 giờ nuôi cấy thì mẫu 2 (mẫu rượu thành phẩm) lại thấy xuất hiện sự tồn tại của Cl. perfringens. Thí nghiệm trên mẫu rượu thành phẩm chưa pha loãng, sau 48 giờ nuôi cấy, thấy xuất hiện 7 khuẩn lạc của Cl. perfringens, ở nồng độ pha loãng 10 -1 có 4 khuẩn lạc và ở nồng độ pha loãng 10-2 có 3 khuẩn lạc. Điều này chứng tỏ quá trình khử trùng không tiêu diệt hết bào tử của vi khuẩn Cl. perfringens hoặc do quá trình vận chuyển làm nhiễm vi khuẩn từ môi Hình 2. Môi trường LSB (-) Hình 3. Môi trường BGBL (-) Khoá luận tốt nghiệp Kết Quả Nghiên Cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 29 trường ngoài vào. Như vậy, rượu thành phẩm không đạt chất lượng theo quy định về chất lượng rượu vang của TCVN 7045:2002. Cùng với việc phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật nói trên, chúng tôi cũng tiến hành xác định sự có mặt của nấm men và nấm mốc trong rượu vang. Kết quả trình bày ở bảng 4. Bảng 4: Tổng số nấm men, nấm mốc thu được sau 3 – 6 ngày nuôi cấy. Mẫu Sau 3 ngày (CFU/ml) Sau 6 ngày (CFU/ml) Mẫu 1 10.4 x 10 21.2 x 102 2 Mẫu 2 <10 <10 Sau 3 ngày nuôi cấy ở điều kiện thích hợp, số nấm men trong mẫu 2 ít hơn trong mẫu 1 là do quá trình lên men tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và hoạt động của men vang. Sau 6 ngày nuôi cấy, tế bào nấm men nhân sinh khối mạnh, tổng số nấm men vang tăng gần gấp đôi so với 3 ngày trước đó. So với mẫu 1, số nấm men và nấm mốc ở mẫu 2 ít hơn nhiều (<10 CFU/ml). Vì rượu thành phẩm thông qua giai đoạn khử trùng sản phẩm nên sự sinh trưởng và phát triển của nấm men, nấm mốc bị ức chế bởi các chất khử trùng. Hình 4. Khuẩn lạc của Clostridium perfringens của mẫu 2. Khuẩn lạc có hình tròn, màu đen Khoá luận tốt nghiệp Kết Quả Nghiên Cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 30 Để kiểm tra kết quả ở bảng 4, chúng tôi tiến hành xác định số khuẩn lạc của nấm men và nấm mốc. Số liệu thu được biểu diễn trong bảng 5. Bảng 5: Số khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc sau 3 – 6 ngày nuôi cấy. Mẫu Đĩa thí nghiệm KẾT QUẢ (số khuẩn lạc) Sau 3 ngày Sau 6 ngày 10 10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 -3 Mẫu 1 Đĩa 1 77 42 20 105 85 58 Đĩa 2 60 50 18 89 78 54 Mẫu 2 Đĩa 1 3 0 0 10 3 1 Đĩa 2 4 1 0 15 4 0 Kết quả ở bảng 5 cho thấy sau 6 ngày nuôi cấy số khuẩn lạc nấm men, nấm mốc đều nhỏ hơn nhiều sau 3 ngày nuôi cấy ở tất cả các nồng độ pha loãng, ở nồng độ pha loãng 10-1 là 77 – 105, 60 – 89; ở nồng độ pha loãng 10-2 là 42 – 85, 50 – 78; Chúng tôi cũng nhận thấy mẫu 2 có số khuẩn lạc nấm men, nấm mốc ít hơn rất nhiều so với số khuẩn lạc của mẫu 1 ở cùng một nồng độ pha loãng, ở nồng độ pha loãng 10-1 mẫu 1 có 77 khuẩn lạc trong khi mẫu 2 có 3 khuẩn lạc, ở nồng độ 10 -2 mẫu 1 có 42 khuẩn lạc, mẫu 2 không có khuẩn lạc nào. Hình 5. Khuẩn lạc nấm men vang trên môi trường thạch Saboraud Khoá luận tốt nghiệp Kết Quả Nghiên Cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 31 Quan sát thấy trên đĩa thạch xuất hiện 2 dạng khuẩn lạc khác nhau: một dạng có khuẩn lạc có hình tròn, dạng thứ 2 có hình ba cạnh nhọn. Làm tiêu bản, nhuộm gram, soi kính hiển vi để định danh nấm men (phụ lục 1), xác định được có 2 loài là Saccharomyces oviformis (tạo khuẩn lạc nhọn) và Saccharomyces cerevisiae (tạo khuẩn lạc tròn). Cùng với các chỉ t iêu vi sinh vật, các chỉ tiêu hóa lý là các chỉ tiêu rất quan trọng để đánh giá chất lượng rượu vang. Hình 7. Saccharomyces cerevisiae quan sát dưới kính hiển vi quang học Hình 6. Saccharomyces oviformis quan sát dưới kính hiển vi quang học Khoá luận tốt nghiệp Kết Quả Nghiên Cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 32 3.2. CÁC CHỈ TIÊU HÓA LÝ 3.2.1. Nồng độ cồn Kết quả phân tích hàm lượng ethanol ở mẫu 1 và 2 thể hiện ở bảng 6. Bảng 6: Nồng độ cồn trong rượu. Độ rượu ở nhiệt độ thực Quy đổi về độ rượu ở 200C Mẫu 1 140 ở 210 13.8C 0 Mẫu 2 90 ở 230 8.4C 0 Từ bảng trên, chúng tôi rút ra một số nhận xét sau. Nồng độ cồn ở mẫu 1 cao hơn mẫu 2. Khi kết thúc quá trình lên men phụ, nồng độ cồn lý thuyết nằm trong khoảng 12 – 15%. Độ cồn của mẫu rượu bán thành phẩm (mẫu 1) là 13.8 độ, tức là đang ở giai đoạn cuối của quá trình lên men. Nồng độ cồn ở mẫu rượu thành phẩm chỉ đạt 8.4 độ, mà ở độ cồn này, rượu khó bảo quản được lâu vì xảy ra hiện tượng chua rượu do quá trình lên men acid acetic theo phương trình phản ứng: 2CH3CH2OH 2CH3COOH + 2H2 Để ức chế quá trình lên men acetic người ta phải bổ sung thêm cồn vào trong rượu trước khi đóng chai. Trên thực tế, nồng độ cồn được ghi trên nhãn chai rượu của công ty Beco Đà Lạt là 12.5 độ, vì rượu này đã hiệu chỉnh để đạt độ cồn thích hợp. O 3.2.2. Hàm lượng acid tổng số, acid bay hơi và aldehyde trong rượu Trong các chỉ tiêu hóa lý của rượu, người ta quan tâm nhiều đến lượng acid và đặc biệt là hàm lượng aldehyde vì đây chính là nguyên nhân số một gây ngộ độc rượu. Kết quả phân tích các chỉ tiêu này trình bày ở bảng 7. Bảng 7: Hàm lượng acid tổng số, acid bay hơi và aldehyde trong rượu. Acid tổng cộng (mg/100ml) Acid bay hơi (g/l) Aldehyde (mg/l) Mẫu 1 291.52 0.18 95.65 Mẫu 2 535.36 0.92 20.95 O2 (điều kiện hiếu khí) Khoá luận tốt nghiệp Kết Quả Nghiên Cứu Tạ Kiều Oanh – CS_K29 33 Lượng acid tổng cộng và acid bay hơi của mẫu 2 nhiều hơn mẫu 1 tức là sau khi lên men, hàm lượng các acid trong rượu đã tăng lên. Điều đó chứng tỏ khử trùng không tiêu diệt hết các vi sinh vật sinh acid làm lượng acid của mẫu rượu thành phẩm nhiều hơn hàm lượng acid của mẫu rượu bán thành phẩm. Lượng acid bay hơi càng nhỏ, rượu vang càng bảo quản được lâu. Các mẫu rượu được lấy ở các giai đoạn khác nhau, m ẫu 1 (vang bán thành phẩm): lấy ngày 20/04/2009 ở tank X, giai đoạn đang lên men, chưa qua thanh trùng; mẫu 2 (vang thành phẩm): lấy ngày 27/04/2009 ở tank XVIII, giai đoạn sau lên men, đã qua thanh trùng. * TVKHK: Tổng số vi khuẩn hiếu khí Khoá luận tốt nghiệp Kết Luận và Đề Nghị Tạ Kiều Oanh – CS_K29 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. KẾT LUẬN Qua các thí nghiệm, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1. Do kết quả của giai đoạn khử trùng, rượu vang thành phẩm đều đạt tiêu chuẩn vi sinh vật và các chỉ tiêu hóa lý quan trọng. 2. Trong quá trình lên men, khi lượng đường còn lại trong dịch lên men là 7 Bx thì tiến hành khử trùng là hiệu quả nhất . Tác nhân khử trùng tốt nhất là Na2SO3 với liều lượng 70 – 120mg/l, hoặc có thể dùng SO2 với liều lượng từ 30 đến 120mg/l hay khử trùng bằng nhiệt: hấp ở 600 II. ĐỀ NGHỊ C trong 10phút, 1. Giai đoạn khử trùng là cần thiết và đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành sản phẩm đạt chất lượng cao. Tuy nhiên, để sản phẩm đạt được chất lượng tốt nhất nên kết hợp khử trùng với một số phương pháp xử lý khác: sử dụng nhiệt độ, các tác nhân vật lý, 2. Quá trình lên men sản xuất rượu vang trải qua nhiều giai đoạn khác nhau, vì vậy cần có các nghiên cứu về hiệu quả của thanh trùng ở từng giai đoạn để sản phẩm đạt chất lượng tốt nhất. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Kiều Hữu Ảnh (1999), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ thuật. [2] Bộ Y tế, Quy định về vệ sinh an toàn đối với bia hơi và rượu lên men độ cồn thấp, số 3542. [3] Công ty cổ phần rượu bia Đà Lạt, Hướng dẫn kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh. [4] Trần Xuân Hiển (2007), Đánh giá chất lượng thực phẩm , Khoa Nông nghiệp & TNTN. [5] Phạm Thành Hổ (2005), Nhập môn Công nghệ Sinh học, NXB Giáo dục. [6] Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thuỷ, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi (2006), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. [7] Lê Thị Mai (2005), Luận văn tốt nghiệp, Đại học Đà Lạt. [8] Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật học, NXB Nông nghiệp [9] TCVN 7045:2002, Rượu vang – Quy định kỹ thuật. [10] Trần Thị Thanh (2003), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục. [11] Trần Linh Thước (2008), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB Giáo dục. [12] Trung tâm Y tế dự phòng Lâm Đồng, Hướng dẫn kiểm nghiệm các chỉ tiêu vi sinh và hoá lý của rượu vang. [13] Đào Xuân Vinh (2008), Giáo trình các kỹ thuật kiểm nghiệm thực phẩm , Đại học Đà Lạt. Các website [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] Khoá luận tốt nghiệp Phụ lục Tạ Kiều Oanh – CS_K29 PHỤ LỤC 1. Môi trường thạch dinh dưỡng Cao thịt 5g Glucose 1g Peptone 10g Agar 12 – 15g NaCl 5g Nước cất 1000ml pH: 6.8 0.2± . Đun sôi và khuấy đều cho tan. Phân phối vào ống nghiệm (15ml/ống). Hấp ướt ở 1210 2. Môi trường thạch Saboraud: C/15'. Glucose 20g Agar 10 – 15g Peptone 10g Nước cất 1000ml pH: 4.5 – 5.5. Phân phối vào ống nghiệm (15ml/ống). Khử trùng ở nhiệt độ 1100 3. Môi trường tăng sinh chọn lọc LSB (Lauryl Sulphate Broth) C/30'. Trypton 20g Lactose 5g K2HPO 2.75g 4 KH2PO 2.75g 4 NaCl 5g Natri lauryl sulphate 0.1g Nước cất 1000ml pH: 6.8 0.2± . Trộn đều và khuấy cho tan. Phân phối vào ống nghiệm có chứa ống Durham (10ml/ống). Hấp ở 1210 4. Canh trường mật bò BGBL 2% (Brilliant green 2% Bile Broth) C/15'. Môi trường LSB tổng hợp: 35.6g /l. Peptone 10g Lactose 10g Mật bò 20g Brilliant Green 0.0133g Nước cất 1000ml pH = 7.2. Phân phối vào ống nghiệm có ống Durham (5ml/ống). Hấp ở 1150 C/20'. Môi trường tổng hợp: 40g/l. Khoá luận tốt nghiệp Phụ lục Tạ Kiều Oanh – CS_K29 5. Môi trường EMB (Eosin Methylrn Blue lactose agar) Dipotassium 2g Peptone 10g Lactose 5g Sucrose 5g Eosin và Yellowish 0.4g Methyl blue 0.07g Agar 13.5g Nước cất 1000ml pH = 7.1. Phân phối vào ống nghiệm có ống Durham (20ml/ống) . Hấp khử trùng ở 1210 6. Môi trường Indole C/15'. Môi trường tổng hợp: 36g/l. L-tryptophan 1g NaCl 1g K2HPO 3.13g 4 KH2PO 0.27g 4 Nước cất 200ml pH 7.2 0.2± . Hoà tan các thành phần. Phân phối vào ống nghiệm 13 x 100mm có nắp (1ml/ống). Nhiệt độ hấp là 1210 7. Môi trường MR – VP (Methyl Red Voges – Proskauer Broth) C/15'. Peptone 5g KH2PO 5g 4 D (+) Glucose 5g Nước cất 1000ml pH 6.9 0.2± . Đun tan các thành phần. Phân phối vào ống nghiệm (5ml/ống). Nhiệt độ hấp là 1210C/15'. Bảo quản 2 – 80 8. Môi trường Simmon Citrate C cho tới khi sử dụng. Môi trường tổng hợp: 17g/l. NH4H2PO 1g 4 K2HPO 1g 4 NaCl 5g Na2SO 2g 3 MgSO 0.2g 4 Bromothymol blue 0.08g Agar 13g Nước cất 1000ml pH 6.6 0.2± . Đun cho tan. Phân phối vào ống nghiệm (15ml/ống). Nhiệt độ hấp 1210 C/15'. Môi trường tổng hợp: 22.3g/l. Đổ thạch nghiêng. Khoá luận tốt nghiệp Phụ lục Tạ Kiều Oanh – CS_K29 9. Môi trường nước peptone Peptone 10g NaCl 10g Nước cất 1000ml pH 7.0 0.2± . Đun tan. Phân phối vào ống nghiệm (10ml/ống). Hấp 1210 10. Môi trường thạch thường C/15'. Cao thịt 3g Peptone 10g NaCl 5g Agar 12g Nước cất 1000ml pH 7.0 0.2± . Đun tan. Phân phối vào ống nghiệm (15ml/ống). Hấp 1210 11. Môi trường dextrose C/15'. Cao thịt 3g Peptone 10g NaCl 5g Nước cất 1000ml pH: 7.0 0.2± . Đun tan. Phân phối vào ống nghiệm (10ml/ống). Hấp ở 1210 12. Môi trường TSTC (Staphylococcus Enrichment Broth) C/15'. Peptone từ thịt 8g Peptone từ casein 2g Cao nấm men 1g Cao thịt 5g Sodium pyruvate 10g Glycine 12g Lithium chloride 5g Nước cất 1000ml pH: 6.6 0.2± . Đun tan các thành phần. Phân phối vào ống nghiệm (10ml/ống). Nhiệt độ hấp 1210 13. Môi trường Chapman (Mannitol salt phenol – red agar) C/15'. Môi trường tổng hợp: 55g/l. Peptone 10g Cao thịt 1g NaCl 75g D (-) Mannitol 10g Đỏ phenol 0.025g Agar 12g Nước cất 1000ml Khoá luận tốt nghiệp Phụ lục Tạ Kiều Oanh – CS_K29 pH: 7.4 0.2± . Đun tan các thành phần. Phân phối vào ống nghiệm (20ml/ống). Môi trường tổng hợp: 108g/l. Hấp để nguội ở 500C rồi cho 10ml dung dịch egg york vào. Hấp khử trùng ở 1210 14. Môi trường Wilson – Blair cải tiến: C/15'. Đổ đĩa petri. Cao thịt 5g Glucose 20g Peptone 10g Agar 15g NaCl 5g Nước cất 1000ml pH: 7.7 0.2± . Đun tan các thành phần. Phân phối vào ống nghiệm (20ml/ống). Thanh trùng ở 121 0C/15'. Trước khi sử dụng thì đem đun tan chảy rồi thêm vào 2ml dung dịch Na2SO3 15. Thuốc thử Methyl red 20% và 5 giọt phèn sắt amoni 5% (thao tác ở điều kiện vô trùng). Methyl Red 0.1g Ethanol 95% 300ml Nước cất 500ml Hoà tan methyl red vào ethanol. Thêm nước cất vào cho đủ thể tích 500ml. 16. Thuốc thử Kowac’s Paradimethyl aminobenzaldehyt 5g Cồn Amilic (hoặc izoamilic) 75ml HCl 25ml Hoà Paradimethyl aminobenzaldehyt trong cồn Amilic, khi hoà tan cho dần HCl vào. Nên đặt lọ dùng để pha thuốc thử trong 1 chậu nước lạnh. Trước khi cho acid vào không được nút lọ thuốc thử bằng nút cao su vì một số loại cao su có thể hoà tan trong cồn Amilic. Phải để thuốc thử trong chai nâu, đậy kín, bảo quản lạnh. 17. Dung dịch Crystal violet Dung dịch A Crystal violet Dung dịch B 20g Ammonium oxalate 8g Ethanol 95 200ml 0 Nước cất 800ml Khoá luận tốt nghiệp Phụ lục Tạ Kiều Oanh – CS_K29 Trộn đều 2 dung dịch A và B lại với nhau, để yên 24h. Sau đó, đem lọc rồi để vào chai nâu. 18. Dung dịch Lugol Iod 20g KI 100g Nước cất 900ml Hoà KI trong nước cất cho tan rồi thêm iod vào, định mức tới 1000ml. 19. Dung dịch Fuchsin Fuchsin 1g Ethanol 95 100ml 0 Nước cất 900ml Hoà tan fuchsin trong ethanol. Sau đó thêm nước cất cho đủ 1000ml, lọc qua giấy lọc, bảo quản trong chai nâu. 20. Cồn iod Ethanol 95 100ml 0 Dung dịch iod 10% 2 – 4ml 21. Dung dịch acid acetic 5N Acid glacial acetic 28.75ml Nước cất 71.25ml Đậy kín và bảo quản trong chai đen hoặc nâu. 22. Dung dịch α Naphthol α Naphthol 1g Acid acetic 5N 200ml Đậy kín và bảo quản trong chai đen hoặc nâu. Khoá luận tốt nghiệp Phụ lục Tạ Kiều Oanh – CS_K29 23. Dung dịch Natri metabisunfit: Hoà tan 15g Natri metabisunfit vào nước cất, cho thêm 70ml HCl đặc, thêm nước cất cho đủ 1l. 24. Dung dịch phosphate – EDTA: KH2PO 71.7g 4 NaOH 42g EDTA 4.5g Hoà tan các chất trên, thêm nước cất cho đủ 1l. 25. Dung dịch Borat kiềm Hoà 100g acid boric (H3BO3 ) với 170g NaOH. Định mức nước cất tới 1l. Phụ lục 1: Phương pháp nhuộm gram. Nhỏ mẫu thử lên lame kính, để khô, sau đó cố định bằng cồn và hơ nóng nhẹ. Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1 – 2'. Đổ hết thuốc nhuộm đi, nhỏ dung dịch lugol lên và để trong 1'. Rửa bằng nước, nhúng vào cồn iod trong 30 – 40". Rửa bằng nước, nhuộm bổ sung bằng fuchsin loãng trong 0.5 – 1'. Rửa, để khô và soi trên kính hiển vi. Vi khuẩn gram (+) bắt màu tím, gram (-) bắt màu đỏ.