Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học cao Etyl acetat của loài địa y Parmotrema sancti-Angelii (Hale) Hale thu hái ở Đà Lạt

Trang 0 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETYL ACETAT CỦA LOÀI ĐỊA Y PARMOTREMA SANCTI-ANGELII (HALE) HALE THU HÁI Ở ĐÀ LẠT GVHD: Th.s Hồ Xuân Đậu SVTH: Nguyễn Thị Ái MSSV: K35106003 TP.HCM tháng 5/2013 LỜI CẢM ƠN ---------- Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến:  Thầy Hồ Xuân Đậu, người đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức chuyên môn, tận tình hướng dẫn và truyền đạt nhiều kinh nghiệm nghiên cứu quý báu trong suốt thời gian em học tập, thực hiện và hoàn thành đề tài.  Thầy Dương Thúc Huy đã tận tình truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.  Tất cả Quý Thầy Cô Khoa Hóa Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo học và thực hiện đề tài.  Gia đình, bạn bè đã động viên và tạo điều kiện tốt về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.  Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến Quý Thầy Cô, quý độc giả đã đọc, đóng góp ý kiến, chia sẻ khóa luận này. Xin chân thành cảm ơn. LỜI MỞ ĐẦU Ngay từ thời trung đại, nhiều người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm thuốc chữa bệnh như: Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi, Parmelia sulcata chữa các bệnh về sọ não[1], Ngày nay địa y vẫn được sử dụng làm một số loại thuốc dân gian. Người da đỏ ở Florida và người Trung Quốc đã sử dụng một số loại địa y khác nhau làm thuốc, đặc biệt là thuốc long đờm[1]. Ahmadjian và Nilsson[2] công bố rằng địa y Cetraria islandica bán rộng rãi trong các tiệm bào chế thuốc ở Thụy Điển và dùng để điều trị bệnh đái tháo đường, bệnh phổi và bệnh viêm mũi. Peltigera canina được sử dụng ở Ấn Độ như một dược phẩm làm giảm các cơn đau gan[1]. Ngoài công dụng chữa bệnh, địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm, xà phòng, nước hoa. Các loại hợp chất khác nhau và các dẫn suất của depside được chiết từ các chi Evernia, Parmelia và Ramalina, một số có mùi hương hấp dẫn được dùng trong xà phòng và nước hoa. Đặc biệt, địa y được xem như là các chất chỉ thị sinh học cho ô nhiễm môi trường. Với những công dụng đó, địa y được nhiều nhà hóa dược nghiên cứu, nhiều hợp chất tự nhiên được cô lập và một số được xác định có hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, kháng virut, giảm đau, hạ sốt[3,4] , Địa y là thực vật bậc thấp, là kết quả của sự cộng sinh của tảo và nấm. Nhờ dạng sống này, địa y có thể sống được ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây,... trong những điều kiện khác nghiệt và khô hạn của vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy sự có mặt của địa y ở những nơi quen thuộc với sự phân bố phong phú và đa dạng. Vậy mà từ trước đến nay ở Việt Nam chưa có tác giả nào nghiên cứu về hóa học cũng như ứng dụng của địa y. Để góp phần vào sự phát triển của khoa học Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn loại địa y Parmotrema Sancti-angelii Hale (Hale) thuộc chi Parmotrema (họ Parmeliaceae) thu hái ở thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam để nghiên cứu. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................... 0 LỜI MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 MỤC LỤC ........................................................................................................................... 0 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... 1 Chương 1: TỔNG QUAN .................................................................................................... 2 1.1. GIỚI THIỆU VỀ ĐỊA Y ............................................................................................... 2 1.2. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VỀ CHI PARMOTREMA ................................................. 3 1.2.1 Các hợp chất theo qui trình sinh tổng hợp polyketid ........................................... 3 1.2.2 Các hợp chất theo qui trình sinh tổng hợp mevalonic acid .................................. 4 1.2.3 Các hợp chất tạo nên bằng quá trình sinh tổng hợp của tảo ................................ 4 1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 9 Chương 2 : THỰC NGHIỆM ............................................................................................ 11 2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ. ........................................................................................ 11 2.1.1 Hóa Chất. ........................................................................................................... 11 2.1.2 Thiết Bị .............................................................................................................. 11 2.2 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU. .................................................................................... 11 2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO. ..................................................................................... 12 2.4 TÁCH CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ CAO EA3................................................................. 14 2.4.1 Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn EA3.1 ( sơ đồ 2.2, 5.17g) .......................... 14 2.4.2 Sắc kí cột silicagel cho phân đoạn EA3.3 (sơ đồ 2.2, 15.78g) .......................... 14 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 16 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PS–A3 ............................. 16 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PS – A7 ............................ 19 Chương 4: KẾT LUẬN ...................................................................................................... 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 22 Trang 1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT s d t m brs m/z MR HSQC HMBC 1H-NMR 13C-NMR DEPT J ppm UV HR-ESI-MS ED EA C Me Ac Mũi đơn (Singlet) Mũi đôi (Doublet) Mũi ba (Triplet) Mũi đa (Multiplet) Mũi đơn rộng Mass to charge ratio Transfer Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) Heteronuclear Single Quantum Correlation Heteronuclear Multiple Bond Coherence Proton Nuclear Magnetic Resonance Carbon Nuclear Magnetic Resonance High-Perfo Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Hằng số tương tác spin-spin Part per million Tia cực tím (Ultra violet) Hight Resolution- Electro Spray Ionization -Mass Spectrometry Ether dầu Ethyl acetate Chloroform Methanol Acid Acetic Trang 2 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ ĐỊA Y Địa y là loại thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh giữa nấm (mucobyont) và một bộ phận quang hợp (photobiont hoặc phycobyont), thường là tảo và đôi khi là vi khuẩn cyanobacterium Thông thường đại y được chia làm 3 dạng: - Dạng khảm (crustose lichen): Bề mặt của tản địa y khảm cực kì mỏng và bám chặt vào bề mặt chủ bằng những sợi nấm có lõi. - Dạng phiến (foliose lichen): Tản địa y dạng phiến có hình dạng như tờ giấy mỏng. Bề mặt trên và dưới khác biệt nhau rõ rệt. Tản bám lỏng lẻo trên bề mặt chủ bằng các rễ giả. - Dạng bụi (fruiticose lichen): Địa y dạng bụi có hình thức giống như bụi cây nhỏ, đứng trên bề mặt chủ và xõa xuống. Hình 1: Các dạng địa y (A :dạng khảm, B: dạng phiến, C: dạng bụi) Ðịa y hiện diện trên thân cây, đất và đá. Trên đá chúng là những sinh vật tiên phong, là những tộc đoàn đầu tiên chiếm cứ môi trường mới vì chúng có thể phá hủy đá dần dần do các acid mà chúng tiết ra, và sẽ tạo ra những hạt đất nhỏ. Những chất hữu cơ từ địa y thối rửa làm tăng thành phần của đất. Các acid được tiết ra thay đổi theo loài và thường được dùng để định danh địa y. Ðể hiểu được bản chất của địa y và giải thích nguồn gốc của chúng, các nhà thực vật học đã thử tổng hợp địa y từ tế bào tảo và nấm. Mặc dù cả hai thành phần được nuôi cấy riêng rẽ và việc tổ hợp lại thành địa y thật là khó khăn. Trong những năm gần đây, sự cộng sinh được tạo ra, chúng có hình dạng phần nào giống với địa y nhưng chưa phải là cấu trúc thật sự của địa y. Trang 3 1.2. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VỀ CHI PARMOTREMA Chi Parmotrema (Parmeliaceae) là loài địa y phiến rất phổ biến ở vùng nhiệt đới, trên thế giới có khoảng 220 loài thuộc chi này và một số trong chúng đã được nghiên cứu về mặt hóa dược, tập trung nhiều nhất trong những năm gần đây cho kết quả rất khả quan. 1.2.1 Các hợp chất theo qui trình sinh tổng hợp polyketid 1.2.1.1 Các acid béo Năm 2001, Sassaki GL[6] đã cô lập được acid béo trong một số loài địa y thuộc chi Parmotrema như 9-oxodecanoic acid (1), 9-metyltetradecanoic acid (2), 6- metyltetradecanoic acid (3), 3-hydroxydecanoic acid (4), nonanedioic acid (5) và decanedioic acid (6). 1.2.1.2 Các acid béo vòng Năm 1990, F. David[7] và cộng sự đã cô lập được praesoredioic acid (7) và protopraesorediosic acid (8) từ Parmotrema praesorediosum. Ngoài ra, cũng từ chi Parmotrema còn phân lập được lichesterinic acid (9) và protolichesterinic acid (10). 1.2.1.3 Các hợp chất phenol đơn vòng Cũng trong năm này, Irma S. Rojas[8] công bố sự có mặt của orcinol (11), metyl-β-orsellinate (12) và metyl haematommate (13) trong Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale. Năm 2000, từ địa y Parmotrema stuppeum (Nyl.) Hale, Javaprakasha G. K.[9] đã cô lập orsenillic acid (14) và metyl orsenillate (15). 1.2.1.4 Depside Năm 1999, Laily B. Din[10] đã công bố trong các loài địa y thuộc chi Parmotrema có chứa một hàm lượng lớn các hợp chất bậc hai bao gồm các depside là một loại ester tạo thành bằng sự liên kết của hai hay nhiều phân tử phenolcarboxylic acid như atranorin (16) và cloroatranorin (17). Năm 2002, Alcir Teixeira Gomes và cộng sự[12] đã cô lập lecanoric acid (18) từ Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale Trang 4 1.2.1.5 Depsidone Trong các loài địa y thuộc chi Parmotrema có mặt các depsidone[6,10,12,13] sau malonprotocetraric acid (19), protocetraric acid (20), furmaprotocetraric acid (21), succinprotocetraric acid (22), salazinic acid (23), consalazinic acid (24), α-collatolic acid (25), dehydrocollatolic acid (26), alectoronic acid (27), norstictic acid (28), và hypostitic acid (29). 1.2.1.6 Xanthone Theo N. K Honda và cộng sự đã cô lập được 2 xanthone là lichenxanthone (30) và secalonic acid (31) trong Parmotrema dilatatum, Parmotrema lichnxanthonium và Parmotrema sphaerospora[14]. 1.2.2 Các hợp chất theo qui trình sinh tổng hợp mevalonic acid Năm 1993, Bazyli Czeczuga[16] đã nhận danh được 17 carotenoid có mặt trong Parmotrema tinctorum dựa vào kỉ thuật HPLC và so sánh với phổ IR là α-carotene (33), β-carotene (34), β-eryptoxanthin (35), lutein (36), 3’-epilutein (38), zeaxanthin (39), luteinepoxide (40), antheraxanthin (41), violaxanthin (42), mutatoxanthin (43), flavoxanthin (44), echinenone (45), canthaxanthin (46), astaxanthin (47), neoxanthin (48), capsochrome (49), β-citraurin (50). 1.2.3 Các hợp chất tạo nên bằng quá trình sinh tổng hợp của tảo Năm 2005, Elaine R.Carbonero[16], nhà hóa học Brazil, đã định danh được hai glucan với tên là nigeran [(1 → 3), (1 → 4) - α - glucan] và lichenan [(1 → 3), (1 → 4) - β - glucan] trong Parmotrema austrosinense, Parmotrema delicatulum, Parmotrema mantiqueirense, Parmotrema schindleri và Parmotrema tinctorum. Trang 5 Công thức hóa học của các hợp chất: 113 11 9 7 5 3 13 11 9 7 5 3 114 COOH CH3 9 - Metyltetradecanoic acid 14 CH3 COOH 6 - Metyltetradecanoic acid (3) (1) 1 1 9 7 5 3 9 7 5 3 3 - Hydroxydecanoic acid (4 ) 10 COOH OH O COOH 9 - Oxodecanoic acid (2) 10 HO OC COOH COOH HOOC 9 7 5 3 1 9 7 5 3 1 Decanedioic acid (6)Nonanedioic acid (5) O (CH2)14 COOH O H3C COOH Praesorediosic acid (7) O (CH2)14 COOH O COOH H2C Protopraesorediosic acid (8) O (CH2)12 COOH O H3C CH3 O (CH2)12 COOH O CH3 H2C Lichesterinic acid (9) Protolichesterinic acid (10) Metyl Metyl haematommate- orcinol carboxylat ( 12) OH CH3 HO COOCH3 CH3 COOCH3 OH CHO HO CH3 (13) Orcinol (11) CH3 OHHO COOCH3 OH CH3 HO CH3 Metyl orsellinate (15) Orsellinic acid (14) OHHO CH3 COOH β Trang 6 CH3 HO CHO OH C O O CH3 OH C CH3 O OCH3 Atranorin (16) CH3 HO CHO OH C O Cl O CH3 OH C CH3 O OCH3 Cloroatranorin (17) CH3 HO OH C O O CH3 OH C CH3 O OH Lecanoric acid (18) O OH C CH3 O O O COOH OH O CH3 HO CHO C O O OH C CH3 O CH2OH OH O CH3 HO CHO C O Malonprotocetraric acid (19 ) Protocetraric acid (20 ) O OH C CH3 O O O OH O CH3 HO CHO C O HOOC Fumarprotocetraric acid (21) Succinprotocetraric acid (22) O OH C CH3 O O O OH O CH3 HO CHO C O HOOC O OH C CH2OH O OCHHO O CH3 HO CHO C O O OH C CH2OH O OCHHO O CH3 HO C O OH Salazinic acid (23) Consalazinic acid (24 ) O OH C O OCHHO CH3 O CH3 C O CH3O CH3 Hypostictic acid (29) Trang 7 O OH O O HO O C O CH3O O O OH O O O CH3 O C O CH3O O (CH2 )4 CH3 (CH2 )4 CH3 Dehydrocollatolic acid (26) O OH O O HO O C O HO O O OH CH O O HO CH3 O C O HO CH3 CHO Alectoronic acid (27) Norstictic acid (28) CH3 CH3O O O OH OCH3 Lichenxanthone (30 ) OH CH3 OH O COOCH3 O OH CHO O O OH CH3 OHSecalonic acid (31 ) α - Carotene (33 ) - Carotene)( β,ε β - Carotene (34 ) - Carotene)( β,β - Carotene-3,3'-diol)( β,ε OH HO Lutein (36 ) OH HO 3' - Epilutein (38 ) OH β - Eryptoxanthin (35) Carotene-3-ol)( β,β− α - Collatolic acid (25) Trang 8 - Carotene-3,3'-diol) Zeaxanthin (39) OH HO Luteinepoxide (40) HO O OH (5,6 - Epoxy - 5,6 - dihydro - b, b - carotene-3,3'-diol) HO O Antheraxanthin (41) O OH HO Flavoxanthin (44) O OH O HO Astaxanthin (47) O Carotene- 4-on)( β,β Echinenone (45) O O ( β,β Carotene - 4,4' - dion) Canthaxanthin (46) Neoxanthin (48) ( 5,6 - Epoxy - 6,7 - -didehydro - 5,5,5',6' - tetrahydro - β, β - carotene-3,5,3'-triol) Capsochrome (49) ( 5,8 - Epoxy - 3,3'- - dihydroxy - 5,8 - dihydro - β, χ - carotene - 6'- on) O HO O OH HO β - Citraurin (50) HO β,β ( (5,8 –Epoxy-5,8-dihdro-β,ε-carotene-3,3’-diol) 3,3’-Dihydroxy- β,β-carotene-4,4’-dion , (5,6 –Epoxy-5,6-dihdro-β,ε-carotene-3,3’-diol) 3-Hydroxy-8-apo-β-carotene-8’-al Trang 9 O H H H H O OH OH H O O H H H H O OH OH H HO Nigeran [( 1 3), ( 1 4)- α - glucan] n O H H H H OH OH HO O H Lichenan [( 1 3 4) -β - glucan] O H H H H OH OH H O HO O H H H H OH OH O H HO O H H H H OH OH H O HO O n ( 5,6,5',6' - Diepoxy - 5,6,5',6' - tetrahydro - β, β - carotene-3,3'-diol) Violaxanthin (42) O OH HO O ), (1 1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Điều chế cao methanol của địa y. Sử dụng phương pháp trích pha rắn silica gel trên cao metanol, giải ly lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: eter dầu hỏa, chloroform, etyl acetat và metanol. Dung dịch giải ly qua cột được thu hồi dung môi ở áp suất kém, thu được 4 loại cao (sơ đồ 2.1). Sau đó, cô lập các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp sắc kí pha thường và pha đảo. Xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ nghiệm IR, MS, 1H- NMR, 13C-NMR Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, kháng vài dòng tế bào ung thư, ...) của các cao chiết và các hợp chất cô lập được. Trang 10 Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế các loại cao của địa y - Sắc kí. - Ngâm dầm bằng methanol. - Thu hồi dung môi - Làm sạch, để khô, nghiền nhỏ. - Thử nghiệm hoạt tính sinh học. - Chiết pha rắn silica gel - Giải li bằng các dung môi khác nhau. Cao eter dầu hỏa Cao chloroform Cao methanol Hợp chất hữu cơ Cao ethyl acetate Địa y tươi Bột khô Cao methanol Trang 11 Chương 2 : THỰC NGHIỆM 2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ. 2.1.1 Hóa Chất. Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc kí điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm eter dầu hỏa, ethyl acetat, acid acetic, chloroform, aceton, methanol đều là hóa chất của hãng chemsol-Việt Nam và được làm khan bằng Na2SO4 nếu sữ dụng lại và nước cất. Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dung dịch acid sulfuric 30%, vanillin/ H2SO4, soi đèn UV. Sắc ký cột thường dùng silica gel, sắc ký cột 70-30, cở hạt: 0.04 – 0.06 mm, Ấn Độ. 2.1.2 Thiết Bị - Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu (lọ thủy tinh, becher, bình nóng) - Cột sắc kí: cột cổ điển - Máy cô quay chân không. - Sắc ký lớp mỏng 35DC-Alufolien 20 x 20 cm Kiesel gel F254 Merck - Các thiết bị ghi phổ: phổ 1H-NMR, 13C-NMR, PHỔ DEPT- NMR 135 VÀ 90: ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR - Tất cả phổ được ghi tại: Phòng Phân Tích Trung Tâm Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 2.2 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU. * Thu hái và xử lí mẫu Trong nghiên cứu này, đối tượng nghiên cứu là loài địa y Parmotrema sancti- angelii (Hale) Hale được thu hái ở Đà Lạt. Có tên khoa học là Parmotrema sancti- angelii (Hale) Hale. (hình 2), họ Parmeliaceae Trang 12 Hình 2. Tản địa y Parmotrema sancti-angelii Tên khoa học của địa y được xác định bởi thạc sĩ Võ Thị Phi Giao, khoa Sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh và tiến sĩ Harrie J. M. Sipman, Khoa Thực vật học, Đại Học Freie, Berlin, Đức. Thu hái ở độ cao 2.000 mét so với mực nước biển, trên thân cây thông Pinus dalatensis, thành phố Đà Lạt, Lâm Đồng. Mẫu ký hiệu US-B024, được lưu trong quyển tiêu bản thực vật, bộ môn Hóa hữu cơ, khoa Hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM. 2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO. Từ cây địa y khô và tiến hành ngâm dầm trong dung môi methanol ở nhiệt độ phòng. Lấy dịch chiết cô quay thu hồi bằng dung môi dưới áp suất thấp. Trong khi dịch methanol bay hơi một kết tủa tách ra và được lọc ra khỏi dịch. Dung dịch còn lại được tiếp thụ làm khô thu được cao methanol thô. Sử dụng phương pháp sắc ký cột trên cao methanol thô, giải ly bằng lần lượt các hệ dung môi dung môi C:EA (9:1 -> 5:5), EA:M (9:1 -> 5:5) thu được cao Cao ethyl acetate và một số phân đoạn khác. Sắc kí cột silica gel áp dụng cho cao ethyl acetate giải ly bằng lần lượt các hệ dung môi EA : Me (10:0 -> 5:5) thu được các phân đoạn cao EA1, EA2, EA3. Trang 13 Sơ đồ 2.2: các phân đoạn được tạo thành từ cao methanol Parmotrema sancti-angelii Cao Me 100g Tủa cao Me (20g) Dịch cao Me (180g) Cao ED (48,1g) Cao EA (83,7g) Cao Me (40.2g) EA1 (23,9g) EA3 (30.1g) EA2 (26,8g) EA:Me Sắc ký cột với lần lượt các hệ dung mội:C:EA 9:1 -> 5:5, EA:M 9:1 -> 5:5 EA3.2 (6,2g) EA3.1 (5,1g) EA3.3 (15,7g) Sắc kí cột silica gel. Giải ly C :M 9:1 -> 6:4 Cô quay thu hồi dung môi. Trang 14 2.4 TÁCH CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ CAO EA3 Sắc kí cột silica gel áp dụng cho cao EA3 30.1g giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 500ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 3 phân đoạn EA3.1, EA3.2, EA3.3 (sơ đồ 2.3) 2.4.1 Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn EA3.1 ( sơ đồ 2.2, 5.17g) Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn EA3.1 (5.17g), giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 250ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 2 phân đoạn EA3.1.1, EA3.1.2 (sơ đồ 2.3) Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn EA3.1.1 Phần cao thu được từ phân đoạn EA3.1.2 có khối lượng (0.58g) . Sau đó tiếp tục sắc kí cột silica gel nhiều lần, giải ly bằng hệ dung môi C: Me: AcOH (95:5:0.05). Kết quả thu được chất có vệt màu đỏ hồng khi kiểm tra bằng sắc kí bảng mỏng với hệ dung môi ED:DE (7:3). Kí hiệu là PS-A3 (12mg) 2.4.2 Sắc kí cột silicagel cho phân đoạn EA3.3 (sơ đồ 2.2, 15.78g) Sắc kí bản mỏng cho phân đoạn EA3.3 có khối lượng (15.78 g) thu được trong cao EA3 cho thấy có vết màu đỏ và vết rõ. Tiến hành sắc kí cột silica gel áp dụng cho 15,78g của phân đoạn EA3.3, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch thu được từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 500ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gôm lại thành một phân đoạn. Kết quả thu được các phân đoạn EA3.3.1, EA3.3.2, EA3.3.3 (sơ đồ 2.3) Trang 15 Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn EA3.2.2 Phần cao thu được từ phân đoạn EA3.3.2 có khối lượng (0.1.58g). Sau đó tiếp tục sắc kí cột silica gel nhiều lần, giải ly bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. giải ly bằng hệ dung môi C:ME: AcOH (8:2:0.03) thu được chất có vệt màu đỏ, tròn, hiện rỏ hiện rỏ trên bàn mỏng. Kí hiệu là PS – A7 (27mg) Sơ đổ 2.3: sơ đồ cô lập các chất từ phân đoạn EA3.3 Cao EA3 (30.1g) EA3.1 (5,17g) EA3.2 (6,21g) EA3.3 (15,78g) EA3.1.1 (0.58g) EA3.1.2 (4.37g) EA3.3.3 (5,17g) EA3.3.2 (1.58g) Sắc kí cột silica gel. Giải ly C :M 9:1 -> 6:4 Cô quay thu hồi dung môi. EA3.3.3 (8.22g) Sắc kí cột silica gel. Giải ly C :M 95:5 -> 85:5 Cô quay thu hồi dung môi. Sắc kí cột silica gel. Giải ly C: Me: AcOH Sắc kí cột silica gel. Giải ly C :M 9:1 -> 8:2 Cô quay thu hồi dung môi. Sắc kí cột silica gel. Giải ly C:Me:AcOH (8:2: 0.03) PS-A3 (12mg) PS-A7 (27mg) Trang 16 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PS–A3 O HOOC COOH COOH O CH3 CH3O 2 6 5 7 11 9 1 4 10 8 3 12 13 Hợp chất PS-A3 được cô lập từ phân đoạn EA3.1.1 (12mg) Trạng thái: chất bột màu trắng Dữ liệu phổ 1H-NMR (acetone-d6) và 13C-NMR (acetone-d6) được trình bày trong bảng 1 Phổ HSQC được trình bày ở phụ lục 3 Phổ HMBC trình bày ở phụ lục 4 Phổ HRMS trình bày ở phụ lục 5  Biện luận cấu trúc phổ PS-A3 Phổ 1H-NMR cho thấy một nhóm methylen tại mũi đơn δH=3.46 ppm; một nhóm methine mũi septet (mũi bảy) tại δH =5.05 ppm (J=6.5 Hz) và 2 nhóm methyl mũi đôi tại δH=1.26 ppm (J=6.5 Hz). Độ dịch chuyển hóa học của nhóm methylen giúp khẳng định vị trí của nó. Nhóm methine dịch về vùng từ trường thấp δH =5.05 ppm chứng tỏ phải liên kết với nhóm carboxyl. Sự chẻ mũi của CH và 2 nhóm CH3 khẳng định sự tồn tại của nhóm isopropyl. Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy: 1 nhóm methylen tại (δC=38.6 ppm), 1 nhóm methine liên kết với O (δC=69.0 ppm) và 2 nhóm methyl (δC=22.0 ppm). Thêm nữa, phổ 13C-NMR còn cho thấy 1 carbon xeton (δC=194.2 ppm), 4 nhóm carboxyl (-COO, δC=171.4 ppm, δC=176.5 ppm ) và các carbon tứ cấp khác. Phổ HSQC tái khẳng định các carbon mang proton trên hợp chất. Trang 17 Phổ HMBC, nhóm methylen tương quan với nhóm carboxyl (C-7) khẳng định vị trí của chúng. Hai nhóm methyl tương quan với carbon ở δC= 69.0 ppm và tương quan lẫn nhau tái khẳng định sự tồn tại của nhóm isopropyl. Carbon tứ cấp gắn với nhóm carboxyl phải ở δC=162.5 ppm. Giá trị này dịch về vùng từ trường thấp chứng tỏ carbon này phải chịu ảnh hưởng của 2 nhóm rút electron. Phổ HRMS, chế độ dương, cho mũi ion giả phân tử tại m/z 313.0576 [M+H]+ [tính cho công thức phân tử C13H12O9 313.0568 (sai số 1.6 o/oo )] Tất cả dữ liệu phổ trên và kết hợp với tính toán độ chuyển dịch hóa học, suy ra cấu trúc của hợp chất PS-A3 là: 4-(isopropoxycarbonyl)-6-oxocyclohexa-1,3-diene- 1,2,3-tricarboxylicacid Hình 3: Tương quan phổ HMBC của hợp chất PS-A3: O HOOC COOH COOH O CH3 CH3O 2 6 5 7 11 9 1 4 10 8 3 12 13 Trang 18 Bảng 1: Số liệu phổ NMR của hợp chất PS-A3 Vị trí δH(ppm), J(Hz) (Acetone-d6) δC (ppm) (Acetone-d6) HMBC (1H  13C) 1 162.5 2 140.3 3 162.5 4 162.5 5 194.2 6 3.46 (s, 2H) 38.6 7 7 176.5 8 171.4 9 171.4 10 171.4 11 5.05 (septet, 1H, 6.5 ) 69.0 12,13 12, 13 1.26 (d, 6H, 6.5) 22.0 11 Trang 19 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PS – A7 C CH3 HO OH O CH2 O HC HC H2C OH OH OH 1 8 7 1' 3' 2' 5 3 2 4' Hợp chất PS-A7 được cô lập từ phân đoạn EA3.3.2 (27mg) Trạng thái: chất bột màu trắng Dữ liệu phổ 1H-NMR (acetone-d6) và 13C-NMR (acetone-d6) được trình bày trong bảng 2  Biện luận cấu trúc phổ PS-A7 Phổ 1H-NMR cho thấy 1 nhóm methyl vòng thơm (δH 2.53ppm), 2 proton vòng thơm ghép cặp meta với nhau (δH 6.23ppm, broad, J= 2Hz; δH 6.26ppm, d, J=2.5Hz). Những tín hiệu này đặc trưng cho 1 đơn vị orcinol. Thêm nữa, phổ 1H-NMR cũng cho thấy tín hiệu của hệ thống ABX: 2 nhóm proton không tương đương của nhóm methylene liên kết với O (–CH2-O-) (HA-1’, δH 4.62 ppm, J=11.5Hz, J=2.75Hz, dd) (HB-1’, δH 4.45 ppm, J= 11.5Hz , J= 6.75Hz, dd) ghép cặp với 1 nhóm methine liên kết với O (>CH-O-) (δH 4.00 ppm, J=2.75Hz, J=6.75Hz, dd). Phổ 1H-NMR còn cho thấy 3 proton khác gồm 1 nhóm metylen (CH2-O) và một nhóm methine (δH 3.72ppm, m), δH 3.83 ppm, m). (δH 3.74ppm, m) Phổ 13C-NMR cho thấy có 12 carbon, gồm có 8 carbon đặc trưng của đơn vị orcinol (nhóm methine vòng thơm (δC 101.5 ppm, δC 112.2 ppm), các carbon vòng thơm gắn 1 O (δc=165.8 ppm, δc=163.0 ppm), 1 nhóm carboxyl (δC 172.3 ppm), carbon methine vòng thơm và các carbon từ cấp vòng thơm khác. Phổ 13C-NMR cũng cho thấy sự xuất hiện của 4 carbon sp3 có liên kết với O (δC 67.7 ppm, δC 70.9 ppm, δC 73.0 ppm, δC 64.3 ppm). Trang 20 Dữ liệu phổ tương đồng với hợp chất RS-C7 cô lập từ loài địa y Roccella Sinensis nên hợp chất PS-A7 có cấu trúc được đề nghị là: 2’,3’,4’-trihydroxybutyl- 2,4-dihydroxy-6 methylbenzoate C CH3 HO OH O CH2 O HC HC H2C OH OH OH Bảng 2: Số liệu phổ NMR của hợp chất PS-A7 Vị trí δH(ppm), J(Hz) (Acetone-d6) δC (ppm) (Acetone-d6) 1 105.5 2 165.8 3 6.23 (d) 101.5 4 163.0 5 6.26 (broad) 112.2 6 144.6 7 172.3 8 2.50 (s) 24.4 1’ 4.62 (dd, 11.5, 2.75) 4.45 (dd, 11.5, 6.75) 67.7 2’ 4.00 (dd, 2.75, 6.75) 70.9 3’ 3.72 (m) 73.0 4’ 3.83, 3.73 (m) 64.3 Trang 21 Chương 4: KẾT LUẬN Từ mẫu loài địa y Parmotrema sancti-angelii (Hale) Hale, họ Parmeliaceae, Thu hái ở độ cao 2.000 mét so với mực nước biển, trên thân cây thông Pinus dalatensis, thành phố Đà Lạt, Lâm Đồng. Sau khi làm sạch, phơi khô, xay nhuyễn, ngâm dầm trong methanol, cô quay thu hồi dung môi ta được cao metanol thô. Sử dụng phương pháp trích pha rắn silica gel trên cao metanol, giải ly lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần thu được các loại cao: eter dầu hỏa, chloroform, etyl acetat và metanol. Sắc kí cột silica gel áp dụng cho cao ethyl acetate giải ly bằng lần lượt các hệ dung môi khác nhau thu được các phân đoạn cao EA1, EA2, EA3. Chọn khảo sát trên phân đoạn EA3 (30.1g) thu được 2 hợp chất ký hiệu PS-A3, PS-A7 Sử dụng các phương pháp quang phổ hiện đại và so sánh với tài liệu tham khảo, đã xác định được cấu trúc của 2 hợp chất hữu cơ cô lập được trong địa y Parmotrema sancti-angelii (Hale) Hale như hình. Gồm hợp chất mới PS-A3 và hợp chất PS-A7 tương đồng với hợp chất RS-C7 cô lập từ loài địa y Roccella Sinensis. O HOOC COOH COOH O CH3 CH3O 2 6 5 7 11 9 1 4 10 8 3 12 13 C CH3 HO OH O CH2 O HC HC H2C OH OH OH 1 8 7 1' 3' 2' 5 3 2 4' (1) (2) Hình 4: Hợp chất PS-A3 (1) và hợp chất PS-A7 (2)  HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO CỦA ĐỀ TÀI Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên cao etyl acetat EA3. Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát các hợp chất còn lại trên cao còn lại của loài địa y Parmotrema sancti-angelii (Hale) Hale. Đồng thời chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các chất đã cô lập được. Trang 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] E. J. W. Barrington, Arthur J.Willis, The biology of lichens: Contemporary biology, 2nd edition, Edward Arnold, London (1974). [2] Ahmadjian V.; Nilsson S, Swedish Lichens.Yb. Am. Swed. Hist. Fdn (1963). [3] B. C. Behera, Neerja Verma, Anjari Sonone, Urmila Markhija, “Antioxidant and antibacterial properties of some cultured lichens”, Bioresource Technology, 99, 776-784 (2008). [4] Muhammad I. Choudhary, Azizuddin Saima Jalil, Atta-ur-Rahman, “Bioactive phenolic compounds from a medicinal lichen, Usnea longissima”, Phytochemistry, 66, 2346-2350 (2005) [5] P. Mc Carthy, Checklist of the lichens of Australia and its Island territories, Australian Biological Resources Study (1994.) [6] N. K. Honda, F. R. Pavan, R. G. Coelho, S. R. De AndradeLeite, A. C. Micheletti, T. I. B. Lopes, M. Y. Misutsu, A. Beatriz, R. L. Brum, C. Q. F. Leite, Antibacterial activity of lichen substances, Phytomedicine, 1-5 (2009). [7] F. David, J.A. Elix and M.W.Binsamsudin, Two new aliphatic acids from the lichen Parmotrema praesorediosum (Nyl.) Hale, Aust. J. Chem, 43, 1297-1300 (1990) [8] Irma S.Rojas, Blas Lotina-Hennsen, Rachel Mata, “Effect of lichen metabolites on thylakoid electron transport and photophosphorylation in isolated spinach chloroplasts”, J. Nat. Prod, 63, 1396-1399 (2002). [9] Marion Millot, Sophie Tomasi, Sourisak Sinbandhit, Joel Boustie, Phytochemical investigation of Tephromela atra: NMR studies of collatolic acid derivatives, Phytochemistry Letters, 1, 139-143 (2008). [10] Porntep C., Suthep W., Nongluksna S., Nattaya N., Aromatase inhibitory, radical scavenging, and antioxidant activities of depsidones and diaryl ethers from endophytic fungus Corynespora cassiicola L36, Phytochemistry, 70, 407-413 (2009). [11] Lai Yeap Foo, David J. Galloway, Pseudodepsidones and other constituents from Xanthoparmelia scabrosa, Phytochemistry, 18, 1977-1980 (1979). Trang 23 [12] Peter Fiedler, Vicente Gambaro, Juan A. Garbarino, Wanda Wilhot, Epiphorellic acids 1 and 2, two diaryl ethers from the lichen Cornicularia epiphorella, Phytochemistry, 25, 461-465 (1986). [13] Changon Seo, Jae Hak Sohn, Jong Seog Ahn, Joung Han Yim, Hong Kum Lee, Hyuncheol Oh, Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitory effects of depsidones and pseudodepsidone metabolites from the Antarctic lichen Stereocaulon apinum, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19, 2801-2803 (2009). [14] Vo Thi Phi Giao (2003), Crustose lichens in Binh Chau-Phuoc Buu Nature Reserive: taxonomy and ecology, Biological master dissertation, University of Natural Sciences Ho Chi Minh city, Vietnam. [15] Elaine R. Carbonero, Anderson V. Montai, Caroline G. Mellinger, Sionara Eliasaro, Guiherme L.Sassaki, Philip A.J.Gorin and Marcello lacomini (2005), “ Glucans of lichenized fungi: significance for taxonomy of the genera Parmotrema and Rimelia”, Phytochemistry, 66, 929-934. [16] Alcir Teixeira Gomes, Neli K. Honda, Fernanda Mesquita Roese, Rozanna M. Muzzi, Maria Rita Marques (2002), “Bioactive derivatives obtained from lecanoric acid, a constituent of the lichen Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale”, Rev. Bras.Farmacogn., 12, 74-75. [17] P. K. Divakar, D.K.Upreti (2005), Parmelioid lichens in India (A revisionary study), 295-397, Bishen Singh Mahendra Palsingh, India. [18] T. D. V. Swinscow, Hildur Krog (1988), Macrolichens of East Africa, 159- 198, BristishMuseum, London. Trang 24 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của hợp chất RS-C1a COOH CH3 OHHO 1 2 3 4 8 7 5 6 Trang 25 Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của hợp chất RS-C1a COOH CH3 OHHO 1 2 3 4 8 7 5 6 Trang 26 Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của hợp chất RS-C2 OHHO O O1 2 3 4 7 5 6 8 Trang 27 Phụ lục 4: Phổ 13C-NMR của hợp chất RS-C2 OHHO O O1 2 3 4 7 5 6 8 Trang 28 Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR của hợp chất RS-C1 CH3 OHHO OCH O CH H OH HO H O O CH3 HO OH H H 1 2 3 4 5 6 7 8 1' 2' 3'4' 5' 6' 7' 8'1" 2" 3" 4" H H H H Trang 29 Phụ lục 5a: Phổ 1H-NMR giản rộng của hợp chất RS-C1 Trang 30 Phụ lục 6: Phổ 13C-NMR của hợp chất RS-C1 CH3 OHHO OCH O CH H OH HO H O O CH3 HO OH H H 1 2 3 4 5 6 7 8 1' 2' 3'4' 5' 6' 7' 8'1" 2" 3" 4" H H H H Trang 31 Phụ lục 7: Phổ HSQC của hợp chất RS-C1 CH3 OHHO OCH O CH H OH HO H O O CH3 HO OH H H 1 2 3 4 5 6 7 8 1' 2' 3'4' 5' 6' 7' 8'1" 2" 3" 4" H H H H Trang 32 Phụ lục 7a: Phổ HSQC giản rộng của hợp chất RS-C1 CH3 OHHO OCH O CH H OH HO H O O CH3 HO OH H H 1 2 3 4 5 6 7 8 1' 2' 3'4' 5' 6' 7' 8'1" 2" 3" 4" H H H H Trang 33 Phụ lục 8: Phổ HMBC của hợp chât RS-C1 CH3 OHHO OCH O CH H OH HO H O O CH3 HO OH H H 1 2 3 4 5 6 7 8 1' 2' 3'4' 5' 6' 7' 8'1" 2" 3" 4" H H H H Trang 34 Phụ lục 8a: Phổ HMBC giản rộng của hợp chất RS-C1 CH3 OHHO OCH O CH H OH HO H O O CH3 HO OH H H 1 2 3 4 5 6 7 8 1' 2' 3'4' 5' 6' 7' 8'1" 2" 3" 4" H H H H Trang 35 Phụ lục 8b: Phổ HMBC giản rộng của hợp chất RS-C1 CH3 OHHO OCH O CH H OH HO H O O CH3 HO OH H H 1 2 3 4 5 6 7 8 1' 2' 3'4' 5' 6' 7' 8'1" 2" 3" 4" H H H H Trang 36 Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR của hợp chất RS-C15 COOH CH3 HO O O H OH H OH OH CH3 HOOC 5 6 8 1 23 4 7 1' 2' 3' 4' 5'6' 7' 8' 1" 2" 3" 4" Trang 37 Phụ lục 10: Phổ 13C-NMR của hợp chất RS-C15 COOH CH3 HO O O H OH H OH OH CH3 HOOC 5 6 8 1 23 4 7 1' 2' 3' 4' 5'6' 7' 8' 1" 2" 3" 4" Trang 38 Phụ lục 11: Phổ HMBC của hợp chất RS-C15 COOH CH3 HO O O H OH H OH OH CH3 HOOC 5 6 8 1 23 4 7 1' 2' 3' 4' 5'6' 7' 8' 1" 2" 3" 4"