Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cao Ethyl acetate của loài địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale thu hái ở Bình Thuận

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỮU CƠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO ETHYL ACETATE CỦA LOÀI ĐỊA Y ROCCELLA SINENSIS (NYL.) HALE THU HÁI Ở BÌNH THUẬN GVHD: Th.S DƯƠNG THÚC HUY SVTH: NGUYỄN THỊ THƯƠNG MSSV: K35106052 TPHCM, tháng 5 năm 2013 LỜI CẢM ƠN -------- Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Thầy Dương Thúc Huy, người đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức chuyên môn, luôn theo sát hướng dẫn tận tình và truyền đạt cho em những kinh nghiệm nghiên cứu quý báu trong suốt quá trình em thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp. Thầy Nguyễn Thụy Vũ đã giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Quý Thầy Cô trường Đại học Sư Phạm TP.HCM, những người đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em, đó chính là những nền tảng cơ bản, là những hành trang vô cùng quý giá, là bước đầu tiên cho em bước vào sự nghiệp sau này trong tương lai cũng như trong thời gian em thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Các bạn sinh viên bộ môn Hóa hữu cơ khóa K35 và K36 đã động viên, giúp đỡ chia sẻ những buồn vui khó khăn cùng em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Gia đình đã động viên, tạo mọi điều kiện vật chất và tinh thần để em hoàn thành tốt khóa học. Kính chúc mọi người vui vẻ, hạnh phúc, dồi dào sức khỏe và thành công trong công việc. Xin chân thành cảm ơn! DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT s d t m q NMR HSQC HMBC 1H-NMR 13C-NMR J ppm UV EA H A : : : : : : : : : : : : : : : : Mũi đơn (Singlet) Mũi đôi (Doublet) Mũi ba (Triplet) Mũi đa (Multiplet) Mũi bốn (Quartet) Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) Heteronuclear Single Quantum Correlation Heteronuclear Multiple Bond Coherence Proton Nuclear Magnetic Resonance Carbon Nuclear Magnetic Resonance Hằng số tương tác spin-spin Part per million Tia cực tím (Ultra violet) Ethyl acetate Hexane Acetone DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU 1. Hình ảnh Trang Hình 1: Ba dạng chính của địa y 8 Hình 2: Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y 13 Hình 3: Địa y sợi Roccella sinensis 14 Hình 4: Sự tương quan trong phổ HMBC của hợp chất RS-H13 24 Hình 5: Sự tương quan trong phổ HMBC của hợp chất RS-C9 26 Hình 6: Sắc kí lớp mỏng hợp chất RS-C3 28 2. Sơ đồ Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế các loại cao của địa y 21 Sơ đồ 2.2: Sơ đồ sắc kí cột trên cao ethyl acetate EA1 22 3. Bảng biểu Bảng 1: Số liệu phổ NMR của hợp chất RS-C9 và RS-H13 27 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................. 8 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... 8 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU ......................... 8 MỤC LỤC ................................................................................................... 8 LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................. 8 CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN ....................................................................... 8 1. GIỚI THIỆU VỀ ĐỊA Y ..................................................................................... 8 2. HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y ........................................... 9 3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VỀ CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG ĐỊA Y ..... 12 5. Nghiên cứu hóa học về chi Roccella. ................................................................ 14 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .............................................................. 18 1. Hóa chất và thiết bị ........................................................................................... 18 2. Khảo sát nguyên liệu ......................................................................................... 18 3. Điều chế các loại cao ......................................................................................... 18 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................... 22 1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RS-H13 .......... 22 2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RS-C9............. 23 3. THỰC HIỆN PHẢN ỨNG TẠO DẪN XUẤT ACETONIDE ................. 26 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN ........................................................................ 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 29 LỜI MỞ ĐẦU Ngay từ thời trung đại, nhiều người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm thuốc chữa bệnh như: Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi, Parmelia sulcata chữa các bệnh về sọ não[1], Ngày nay địa y vẫn được sử dụng làm một số loại thuốc dân gian. Người da đỏ ở Florida và người Trung Quốc đã sử dụng một số loại địa y khác nhau làm thuốc, đặc biệt là thuốc long đờm[1]. Ahmadjian và Nilsson[2] công bố rằng địa y Cetraria islandica bán rộng rãi trong các tiệm bào chế thuốc ở Thụy Điển và dùng để điều trị bệnh đái tháo đường, bệnh phổi và bệnh viêm mũi. Peltigera canina được sử dụng ở Ấn Độ như một dược phẩm làm giảm các cơn đau gan[1]. Ngoài công dụng chữa bệnh, địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm, xà phòng, nước hoa. Các loại hợp chất khác nhau và các dẫn suất của depside được chiết từ các chi Evernia, Parmelia và Ramalina, một số có mùi hương hấp dẫn được dùng trong xà phòng và nước hoa. Đặc biệt, địa y được xem như là các chất chỉ thị sinh học cho ô nhiễm môi trường, đặc biệt là ở những nơi có mật độ giao thông lớn. Với những công dụng đó, địa y được nhiều nhà hóa dược nghiên cứu, nhiều hợp chất tự nhiên được cô lập và một số được xác định có hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, kháng virut, giảm đau, hạ sốt[3,4] , Địa y là thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả của sự cộng sinh của tảo và nấm. Nhờ dạng sống này, địa y có thể sống được ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây,... trong những điều kiện khắc nghiệt và khô hạn của vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy sự có mặt của địa y với sự phân bố phong phú và đa dạng. Vậy mà từ trước đến nay ở Việt Nam chưa có nhiều tác giả nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như ứng dụng của địa y. Để góp phần vào sự phát triển của khoa học Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn loại địa y roccella sinensis thuộc chi Roccella (họ Rocellaceae) thu hái ở huyện Liên Hương, tỉnh Bình Thuận, Việt Nam. CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 1. GIỚI THIỆU VỀ ĐỊA Y 1.1 Khái niệm và phân loại địa y Địa y, dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm (mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay vi khuẩn lam (cyanobacterium). Khoảng 17.000 loài địa y đã được biết. Địa y thường được chia làm ba dạng chính: dạng khảm (crustose), dạng phiến (foliose) và dạng sợi (frucose). Hình 1: Ba dạng chính của địa y Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và các loài động vật ăn cỏ, ), cung cấp nước và khoáng chất. Kết quả từ sự cộng sinh này giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh. [6] 1.2 Vai trò của các hợp chất tự nhiên trong địa y [8] - Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao. - Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại bức xạ có hại. - Các carboxylic acid từ địa y là tác chất tạo phức mạnh và giúp cho địa y lấy được các khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate). - Giúp xua đuổi thú ăn thịt và côn trùng. 1.3 Một số ứng dụng của địa y Xanthoria sp., địa y khảm trên đá núi lửa tại miệng núi lửa ở Idaho, USA. Xanthoparmelia cf. lavicola, một địa y phiến, trên đá bazan Địa y sợi Hypogymnia cf. tubulosa với Bryoria sp. và Tuckermannopsis sp. ở miền núi Canada. Trang 9 Địa y đã được sử dụng làm thực phẩm, làm phẩm nhuộm, nguyên liệu thô trong sản xuất nước hoa và trong y học cổ truyền. Khoảng 700 tấn địa y Evernia prunastri và Pseudevernia furfuracea (gọi là oakmoss) được khai thác hàng năm ở Pháp cho ngành công nghiệp nước hoa.[5] Y học cổ truyền Trung quốc từng sử dụng 71 loài địa y của 17 chi (9 họ) với mục đích làm thuốc chữa bệnh.[5] Địa y thuộc họ Parmeliaceae, Usneaceae, Cladionaceae được sử dụng nhiều hơn hết. Một vài loại cao điều chế từ địa y được sử dụng để trị các bệnh khác nhau như Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi, Xanthoria parientina chữa bệnh vàng da, chi Usnea để dưỡng tóc, Cetraria islandica (được gọi Ireland moss) chữa nhiễm khuẩn và tiêu chảy. [5] 2. HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoạt tính sinh học và nhiều loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự nhiên. Tuy vậy, các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn, vì các địa y phát triển rất chậm. Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y trong phòng thí nghiệm cũng không dễ dàng, chỉ khoảng 10 % địa y được nuôi cấy thành công, tuy nhiên chúng lại chứa các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp chất có trong cùng loại địa y tự nhiên [5]. Lê Hoàng Duy [6] đã nghiên cứu nuôi cấy thành công 10 % trên khoảng 50 loài địa y lấy từ Việt Nam. Tuy đạt thành công về mặt cô lập hợp chất mới nhưng hầu như các hợp chất cô lập từ địa y nuôi cấy đều khác so với các hợp chất địa y tự nhiên. Khoảng gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập cho đến nay. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên từ địa y được thống kê đầy đủ của Boustie (2007) [9], Huneck (1999) [10], Muller (2001) [11] về kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme 2.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao[5] Địa y hoặc các hợp chất của địa y Hoạt tính Barbatic acid, 4-O-demethylbarbatic acid, diffractaic acid, evernic acid, lecanoric acid, β-orcinolcarboxylic acid, orsellinic acid Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp Trang 10 Ergochrome AA (secalonic acid A) Gây độc cho thực vật Evernic acid Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau bina Lecanoric acid Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây Allium cepa Các hợp chất phenol đơn vòng Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật Các quinone từ Pyxine sp. Ức chế sự nguyên phân của rễ cây Allium cepa Usnic acid Ức chế sự nẩy mầm và phát triển của Lepidium sativum 2.2 Hoạt tính kháng virus của các hợp chất địa y[5] Hợp chất Virus và enzyme của virus Depsidone: virensic acid và dẫn xuất Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV. Butyrolactone acid: protolichesterinic acid Sao chép ngược HIV (+)-Usnic acid và 4 depside khác Virus Epstein-Barr (EBV) Emodin, 7-Cloroemodin, 7-Chloro-1- O-methylemodin, 5,7- Dichloroemodin, Hypericin HIV, cytomegalovirus và các virus khác 2.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y[5] Hợp chất Vi khuẩn Usnic acid và các dẫn xuất Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp., Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Mycobacterium aurum Protolichesterinic acid Helicobacter pylori Trang 11 Methyl orsellinate, Ethyl orsellinate, Methyl β-orsellinate, Methyl haematommate Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, M. gypseum, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Verticillium achliae, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans Alectosarmentin Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatitis 1´-Chloropannarin, Pannarin Leishmania spp Emodin, Physcion Bacillus brevis Pulvinic acid và dẫn xuất Drechslera rostrata, Alternaria alternata Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí Leprapinic acid và dẫn xuất Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) 2.4 Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y[5] Hợp chất của địa y Enzyme bị ức chế Atranorin Trypsin, Pankreaselastase, Phosphorylase Baeomycesis acid 5-Lipoxygenase Bis-(2,4-dihydroxy-6-n- propylphenyl)methane, Divarinol, cao chiết từ Cetraria juniperina, Hypogymnia physodes và Letharia vulpina Tyrosinase Chrysophanol Glutathione reductase Confluentic acid, 2β-O-Methylperlatolic acid Monoaminoxidase B 4-O-Methylcryptochlorophaeic acid Prostataglandinsynthetase (+)-Protolichesterinic acid 5-Lipoxygenase (Sao chép ngược HIV) Vulpinic acid Phosphorylase Trang 12 Norsolorinic acid Monoamino oxidase Physodic acid Arginine decarboxylase Usnic acid Ornithine decarboxylase 2.5 Hoạt tính kháng ung thư và kháng đột biến của các hợp chất địa y[5] Hợp chất Hoạt tính trên loại tế bào (-)-Usnic acid Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại tế bào sừng hóa HaCaT Protolichesterinic acid Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu K-562 và khối u rắn Ehrlich Pannarin, 1-Chloropannarin, Sphaerophorin Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào Naphthazarin Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa Scabrosin ester và dẫn xuất, Euplectin Gây độc chống lại tế bào murine P815 mastocytoma và các dòng tế bào khác Hydrocarpone, Salazinic acid, Stitic acid Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan chuột Psoromic acid, Chrysophanol, Emodin và dẫn xuất Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu 3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VỀ CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG ĐỊA Y Có nhiều hệ thống phân loại các hợp chất hóa học từ địa y, trong đó hệ thống phân loại được sử dụng nhiều nhất là hệ thống phân loại do Shibata và cộng sự đề nghị[7]. Các hợp chất hóa học trong địa y được chia làm ba nhóm chính dựa theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (hình 3). ♦ Nguồn gốc polyketide: depside, depsidone, quinones, xanthones, chromones, aliphatic acid ♦ Nguồn gốc shikimic acid: terphenylquinone và dẫn xuất của tetronic acid. Trang 13 ♦ Nguồn gốc mevalonic acid: terpenoid, steroid Hình 2: Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y [5] 4. Mô tả thực vật Roccella sinensis (Nyl.) Hale (Roccellaceace). 4.1 Đối tượng nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, đối tượng nghiên cứu là loài địa y Roccella sinensis (Roccellaceace) được thu hái ở Bình Thuận. 4.2 Đặc điểm thực vật Tên khoa học: Roccella sinensis Họ: Rocellaceae Địa y mọc trên thân cây chín tầng ở chùa Hang, ở độ cao 300 mét so với mực nước biển, huyện Liên Hương, tỉnh Bình Thuận. Mẫu ký hiệu US-B028, được lưu trong quyển tiêu bản thực vật, bộ môn Hóa hữu cơ, khoa Hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM. Tên khoa học của các địa y được xác định bởi tiến sĩ Harrie J. M. Sipman, Khoa thực vật học, Đại học Freie, Berlin, Đức. Trang 14 Hình 3: Địa y sợi Roccella sinensis 5. Nghiên cứu hóa học về chi Roccella. • Các acid béo: Năm 1967, Huneck S. và các cộng sự đã cô lập được roccellaric acid (1) từ Roccella mollis [12]. Năm 1994, Huneck đã cô lập được roccellic acid (2) từ Roccella phycopis [13]. • Các hợp chất aliphatic mạch vòng: Năm 1970 Ferguson G., Mackey I. R., tìm ra acetylportentol (3) từ Roccella fuciformis[14]; cũng trong năm đó, Alberhart D. J., Overton K. H., Huneck S., đã phân lập được protentol (4) từ Roccella galapagones[15]. • Các hợp chất carbohydrat: Năm 1969, C. F. Culberson đã cô lập được hợp chất meso–erythitol (5) từ Roccella phycopis [16] và D-tagatose (6) từ Roccella fuciformis [16] Năm 1945, Anker R. M., Cook A. H. đã cô lập được ethyl orsellinate (7) từ Roccella fuciformis [17]. Sau đó hợp chất này cũng được tim ra bởi Dyke H. J., Elix J. A., Marcuccio S. M., Whitton A. A. (1987); Gavin J. , Tabacchi R. (1975); Hase T. A., Suokas E., McCoy K. (1978) và Sonn (1928). Năm 1969, C. F. Culberson và các cộng sự đã cô lập được (+) - montagnetol (8) từ Roccella Montagnei [16]. • Các hợp chất carotenoid: Trang 15 Năm 1988, Czeczuga đã cô lập được β-carotene (9) từ Roccella fuciformis [18] và γ- carotene (10) từ Roccella montagnei Bel [18]. • Các hợp chất chromane và chromone: Năm 1969 Alberhart D. J., Overton K. H., Huneck S. đã cô lập lepraric acid (11) từ Roccella fuciformis [19]. Năm 1972 Hucneck S., Follmann G. đã tìm được lobodirin (12) từ Roccella cerebriformis [20]. Cũng trong năm đó Huneck và các cộng sự của mình cô lập được 2–methyl–5-hydroxy-6–hydroxymethyl–7-methoxychromone (13) từ Roccella fuciformis [20]. Năm 1992 Huneck S., Jakupovic J., Follmann G. đã cô lập được mollin (14) và roccellin (15) từ Roccellaria mollis [21] . Năm 1992 Huneck S., Jakupovic J., Follmann G., đã công bố hợp chất galapagin (16) từ Roccella galapagoensis Follm [21]. • Các hợp chất depside: Năm 1980, Sundholm E. G. và Huneck S. đã cô lập được erythrin (17) từ Roccella phycopsis Ach[22]. • Các hợp chất dibenzofurane: Năm 1993, Huneck và cộng sự của mình đã tìm thấy 3-O-demethylschizopeltic acid (18) từ Roccella hypomecha Bory [23]. Năm 1991, Huneck và các cộng sự đã cô lập được 9-methylpannarate (19) từ Roccella capensis Follm [24]. • Các hợp chất chứa N: Năm 1983 Marcuccio S. M., Elix J. A., đã cô lập được picroroccellin (20) từ Roccella fuciformis [25]. Năm 1972 Bohman-Lindgren G., Ragnarsson U., tìm ra roccanin (21) từ Roccella canariensis [26]. • Công thức hóa học của các hợp chất: Me O O MeHOOC Roccellaric acid (1) H3C COOH COOH(H2C)11 H H H3C Roccellic acid (2) Trang 16 Acetylportentol (3) Prortentol (4) meso-Erythitol (5) D-tagatose (6) Ethyl orsellinate (7) (+)- Montagnetol (8) β - Carotene (9) γ – Carotene (10) Leprapic acid (11) Lobodirin (12) Me Me Me Me Me MeMe Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me O O CH3 H3C CH3C CH3 O OO CH3 CH3 H3C O O HO CH3 H3C CH3 OO CH3 H3C O CH3 CH2OH OHH OHH CH2OH Me COOC2H5 OHHO Me CO2 OH CH2 OHH HHO CH2OH O O Me OH H3CO O HOOC OCH3 O O O OAc AcO HO OAc OOH Me OH OH OH CH2OH OH HH OH H H Trang 17 2-methyl-5-hydroxy-6- Mollin (14) hydroxymethyl-7- methoxychromone (13) Roccellin (15) Galapagin (16) Erythrin (17) 3-O-Demethylschizopeltic acid (18) 9-Methylpannarate (19) Pricroccellin (20) Roccarin (21) HN N N NH H HHH O O OO O OOH Me HOH2C H3CO O OH O Me Me O O OAc HO HO OAc O OH O Me Me O O OAc HO HO OH O O O OHHO HO OAc Me OOH Me Me HO OH COO OH Me COO CH2 CH2OH OHH OHH O OMe OHMe COOH Me n-Bu HN N O OH O OMe Me N NH O OH O OMe MeO OH OHMe COOH Me COOMe hoặc Trang 18 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 1. Hóa chất và thiết bị 1.1 Hóa chất Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm eter dầu hỏa, ethyl acetate, acid acetic, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol là hóa chất của hãng Chemsol-Việt Nam và được làm khan bằng Na2SO4 nếu sử dụng lại và nước cất. Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dung dịch acid sulfuric 30%, vanillin/H2SO4, đèn UV. Sắc ký cột thường dùng silica gel sắc ký cột, cỡ hạt: 0.04-0.06 mm, Ấn Độ. 1.2 Thiết bị - Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu (becher, lọ thủy tinh, bình lóng). - Cột sắc ký: cột cổ điển. - Sắc ký lớp mỏng 25 DC – Alufolien 20 × 20 cm Kiesel gel F254 Merck. - Máy cô quay chân không Buchi-111 kèm bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath, máy sấy. - Các thiết bị ghi phổ: Phổ 1H-NMR, 13C-NMR: Ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR. - Tất cả phổ được ghi tại: Phòng Phân Tích Trung Tâm Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 2. Khảo sát nguyên liệu Chương I mục 4.2 3. Điều chế các loại cao 3.1 Điều chế cao methanol Mẫu cây ban đầu được rửa sạch, phơi khô, nghiền nhỏ có khối lượng là 1.7 kg được tiến hành bằng phương pháp ngâm dầm trong dung môi methanol ở nhiệt độ phòng. Lấy dịch chiết cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp. Trong khi dịch methanol bay hơi một kết tủa tách ra và được lọc ra khỏi dịch. Dịch còn lại được tiếp tục làm khô thu được cao methanol thô (450g). Thực hiện sắc ký cột silica gel Trang 19 trên cao methanol thô, giải ly bằng dung môi hexan thu được cao Hexan. Phần còn lại thực hiện sắc ký cột silica gel, giải ly lần lượt bằng hệ dung môi hexan : ethyl acetate có độ phân cực tăng dần từ 9:1 đến 0:10 thu được các loại cao EA1, EA2, EA3, EA4 và phần còn lại. Thực hiện sắc ký cột silica gel trên phần còn lại, giải ly bằng dung môi methanol thu được cao Methanol. 3.2 Sắc kí cột trên cao ethyl acetate EA1 Cao ethyl acetate EA1 chọn khảo sát được sắc kí cột giải ly với hệ dung môi eter dầu hỏa : ethyl acetate thu được 3 phân đoạn (EA1.1 - EA1.3). Phân đoạn EA1.2 (15.137g) thực hiện sắc kí cột và giải ly với hệ dung môi eter dầu hỏa: ethyl acetate (8:2) thu được 3 phân đoạn (EA1.2.1 - EA1.2.3). Tiếp tục thực hiện sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA1.2.2 và giải ly với hệ dung môi eter dầu hỏa: ethyl acetate (8:2) thu được 3 phân đoạn (EA1.2.2.1, EA1.2.2.2, EA1.2.2.3). Phân đoạn EA1.2.2.1 thực hiện sắc ký lớp mỏng điều chế và giải ly với hệ dung môi dietyl eter: eter dầu : acid acetic (9:1:0,01) thu được hợp chất kí hiệu là RS-C9. Phân đoạn EA1.2.2.2 thực hiện sắc ký lớp mỏng điều chế và giải ly với hệ dung môi eter dầu hỏa : ethyl acetate (6 : 4) thu được hợp chất kí hiệu là RS-H13. Trang 20 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế các loại cao của địa y. - Giải ly: Methanol - Lọc, cô quay thu hồi dung môi Bột địa y Roccella siensis (1.7kg) Cao Methanol thô (400g) -Ngâm, tận trích bằng methanol -Lọc, cô quay thu hồi dung môi - Sắc kí cột silica gel - Giải ly: Hexan 100% - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi Cao Methanol (8g) Cao H ( 250g) Phần còn lại - Giải ly: H:A (9:1  0:10) - Lọc, cô quay thu hồi dung môi Cao EA1 (21g) Cao EA2 (11g) Cao EA4 ( 64g) Cao EA3 ( 30g) Phần còn lại Trang 21 - Sắc kí cột silica gel. - Giải ly với hệ eter dầu: ethyl acetate - Sắc kí cột silica gel. - Giải ly với hệ eter dầu : ethyl acetate (8:2). - Sắc kí cột silica gel. - Giải ly với hệ eter dầu : ethyl acetate (8:2). - Sắc kí lớp mỏng điều chế. - Giải ly với hệ Dietyl eter : eter dầu : acid acetic (9 :1:0.01) - Sắc ký lớp mỏng điều chế - Giải ly với hệ eter dầu : ethyl acetate (6 : 4) Sơ đồ 2.2: Sơ đồ sắc kí cột trên cao ethyl acetate EA1. Phân đoạn EA1.2.3 (12.296g) Phân đoạn EA1.3 (2.178g) Phân đoạn EA1.2 (15.137g) Cao EA1 (21g) Phân đoạn EA1.1 (2.780g) Phân đoạn EA1.2.2.3 (430mg) Phân đoạn EA1.2.2 (1.3g) Phân đoạn EA1.2.1 (541mg) Phân đoạn EA1.2.2.1 (627mg) Phân đoạn EA1.2.2.2 (162mg) RS-C9 (200mg) RS-H13 (24mg) Trang 22 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Cao EA1 (22g) thực hiện sắc ký cột phân thành 3 phân đoạn ký hiệu từ EA1.1 đến EA1.3. Chọn khảo sát trên phân đoạn EA1.2 (15.137g), thực hiện sắc ký cột silica gel và sắc ký lớp mỏng điều chế nhiều lần đã cô lập được hai hợp chất RS-C9 và RS-H13. Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp hóa lý hiện đại như phổ NMR, HSQC, 1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RS-H13 Hợp chất H13 được cô lập từ phân đoạn EA1.2 (15.137g). • Trạng thái: chất dầu trong suốt. • Dữ liệu phổ 1H NMR (500 MHz, acetone-d6) và 13C NMR (125 MHz, acetone-d6) được trình bày trong bảng 1. • Phổ HSQC trình bày ở phụ lục 3 • Phổ HMBC trình bày ở phụ lục 4 Biện luận cấu trúc phổ RS-H13 Phổ 1H-NMR cho thấy có tín hiệu của 2 proton thuộc vòng thơm [δH 6.29 (1H, d, J=2.0Hz), 6.23 (1H, d, J=2.0Hz)] ghép cặp meta với nhau. Ngoài ra phổ 1H-NMR còn cho thấy tín hiệu của 3 nhóm methyl [δH 2.52 (3H, s), 1.41 (3H, s), 1.33 (3H, s)], 1 nhóm hydroxy kiềm nối [δH 11.46 (1H, s)], 1 nhóm methylen liên kết oxy với 2 proton không tương đương ghép cặp với nhau {δH 4.63 [1H, dd, (J=11.0, 3.5Hz), 4.44 [1H, dd, (J=11.0, 7.5Hz)]}, 1 nhóm methylen thứ hai [δH 3.72 (2H, m)], 2 nhóm methine {δH 4.59 [1H, ddd, (J=7.5, 6.0, 3.5Hz)], 4.32 (1H, like_q, J=6.0Hz)}. Sự chẻ mũi giữa nhóm methylen ở δH 4.63 và 4.44 với proton nhóm methine ở δH 4.59 cho thấy các proton của hai nhóm này ghép cặp với nhau theo hệ thống ABX. Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất RS-H13 có 15 carbon: 1 nhóm carboxyl ester có độ dịch chuyển hóa học δC 172.0 (-COO), 6 carbon vòng thơm trong đó có 2 carbon nối với oxy và 4 carbon mang nhóm thế khác [δC 166.4, 163.4, 144.7, 105.5, 112.4, 101.7], 1 nhóm methyl gắn nhân thơm [δC 24.3], 2 carbon methylen [δC 64.8, 61.1], 2 carbon methine [δC 75.8, 78.1], 1 carbon tứ cấp liên kết với 2 oxy [δC 109.2] và 2 carbon methyl [δC 28.2, 25.6]. Việc xác định được hỗ trợ bởi phổ HSQC. Ở vòng thơm, trên phổ HMBC cho thấy proton nhóm methyl ở δH 2.52 tương quan với các carbon δC 112.4 (C-5), 144.6 (C-6), 105.5 (C-1). Proton ở δH 6.29 tương quan với các Trang 23 carbon δC 24.3 (C-8), 105.5 (C-1), 163.4 (C-4) và ghép meta với proton δH 6.23. Proton ở δH 6.23 tương quan với carbon δC 112.4 (C-5), 163.4 (C-4), 166.4 (C-2). Nhóm hydroxyl kiềm nối (δH 11.46) cũng có tương quan với carbon δC 166.4 (C-2), 105.5 (C-1). Từ dữ liệu phổ trên khẳng định nhân thơm có cấu trúc của một đơn vị orsellinate. Proton nhóm methylen ở [δH 4.63, 4.44] dịch chuyển về vùng từ trường thấp nên phải liên kết ester với nhóm –COO của đơn vị orsellinate. Trên phổ HMBC thấy các proton của nhóm methylen này tương quan với carbon nhóm carboxyl ở δC 172.0 (C-7), carbon ở δC 75.8 (C-2’). Điều này tái khẳng định vị trí của nhóm methylen này. Thêm nữa, proton H-2’ (ở δH 4.59, ở δC 75.8) có tương quan với carbon ở δC 109.2 (C- 5’). Proton H-3’ (ở δH 4.32) cũng tương quan với carbon ở δC 109.2 (C-5’). Ngoài ra, hai nhóm methyl [δH 1.44, 1.33] cũng tương quan với carbon ở δC 109.2 (C-5’). Tất cả điều này khẳng định phần đường đã bị acetone hóa tại vị trí C-2’;C-3’. Như vậy, cấu trúc của RS- H13 được xác định. RS-H13 được đề nghị là [5-(hydroxymethyl)-2,2-dimethyl-1,3- dioxolan-4-yl]methyl 2,4-dihydroxy-6-methylbenzoate. Hình 4: Sự tương quan trong phổ HMBC của hợp chất RS-H13 2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RS-C9 Hợp chất RS-C9 được cô lập từ phân đoạn EA1.2 (15.137g). • Trạng thái: chất dầu trong suốt. • Dữ liệu phổ 1H NMR (500 MHz, acetone-d6) và 13C NMR (125 MHz, acetone-d6) được trình bày trong bảng 1. • Phổ HSQC trình bày ở phụ lục 7 • Phổ HMBC trình bày ở phụ lục 8 Biện luận cấu trúc phổ RS-C9 CH3 O O H HO H OH CH2 HC HC CH2OH O O CH3 CH3 1 3 5 8 7 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' Trang 24 Phổ 1H-NMR cho thấy có tín hiệu của 2 proton thuộc vòng thơm [δH 6.29 (1H, d, J=2.5Hz), 6.23 (1H, d, J=2.5Hz)]. Ngoài ra phổ 1H-NMR còn cho thấy tín hiệu của 3 nhóm methyl [δH 2.51 (3H, s), 1.36 (3H, s), 1.29 (3H, s)], 1 nhóm methylen liên kết oxy với 2 proton không tương đương ghép cặp với nhau {δH 4.58 [1H, dd, (J=11.5, 3.0Hz )], 4.32 [1H, dd, (J=11.5, 6.5Hz)]}, 1 nhóm methylen thứ 2 {δH 4.10 [1H, dd, (J=8.0, 6.5Hz)], 3.98 [1H, dd, (J= 7.5, 3.5Hz)]}, 2 nhóm methine {δH 3.90 [(1H, ddd, (J=8.0, 6.5, 3.0Hz)], 4.10 (1H, dd, (J=8.0, 6.5Hz)]. Sự chẻ mũi giữa nhóm methylen ở δH 4.58 và 4.32 với proton nhóm methine ở δH 3.90 cho thấy các proton của hai nhóm này ghép cặp với nhau theo hệ thống ABX. Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất RS-C9 có 15 carbon: 1 nhóm carboxyl ester có độ dịch chuyển hóa học δC 172 (-COO), 6 carbon vòng thơm trong đó có 2 carbon nối với oxy và 4 carbon mang nhóm thế khác [δC 166.0, 163.6, 144.6, 105.4, 112.4, 101.6], 1 nhóm methyl thơm [δC 24.4], 2 carbon methylen [δC 67.8, 67.7], 2 carbon methine [δC 77, 71.3], 1 carbon tứ cấp liên kết với 2 oxy [δC 110.0], 2 carbon methyl [δC 27.1, 25.5]. Việc xác định được hỗ trợ bởi phổ HSQC. Ở vòng thơm, trên phổ HMBC cho thấy proton nhóm methyl ở δH 2.51 tương quan với các carbon δC 112.4 (C-5), 144.6 (C-6), 105.4 (C-1). Proton ở δH 6.29 tương quan với các carbon δC 24.4 (C-8), 105.4 (C-1), 163.6 (C-4) và ghép meta với proton δH 6.23. Proton ở δH 6.23 tương quan với carbon δC 112.4 (C-5), 163.6 (C-4), 166.0 (C-2). Từ các dữ liệu phổ trên khẳng định nhân thơm có cấu trúc của một đơn vị orsellinate. Proton nhóm methylen ở [δH 4.58, 4.32] dịch chuyển về vùng từ trường thấp nên phải liên kết ester với nhóm –COO của đơn vị orsellinate. Trên phổ HMBC thấy proton này tương quan với carbon nhóm carboxyl ở δC 172.3 (C-7), carbon ở δC 77.0 (C-3’), carbon ở δC 71.3 (C-2’). Điều này tái khẳng định vị trí của nhóm methylen này. Thêm nữa, proton H-3’ (δH 4.10, ở δC 77.0) có tương quan với carbon ở δC 110.0 (C- 5’). Proton H-4’ (ở δH 3.98) cũng tương quan với carbon ở δC 110.0 (C-5’). Ngoài ra, hai nhóm methyl [δH 1.36, 1.29] cũng tương quan với carbon ở δC 110.0 (C-5’). Tất cả điều này khẳng định phần đường đã bị acetone hóa tại vị trí C-3’;C-4’. Như vậy, cấu trúc của RS-C9 được xác định. RS-C9 được đề nghị là 2-(2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)-2-hydroxyethyl 2,4-dihydroxy-6-methylbenzoate. Trang 25 Hình 5: Sự tương quan trong phổ HMBC của hợp chất RS-C9 Bảng 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất RS-C9 và RS-H13 Vị trí Hợp chất RS-C9 (Acetone-d6) Hợp chất RS-H13 (Acetone-d6) δH (ppm) δC (ppm) HMBC 1H 13C δH (ppm) δC (ppm) HMBC 1H13C 1 105.4 105.5 2 166.0 166.4 3 6.23 (d, 2.5) 101.6 2, 4, 5 6.23 (d, 2.0) 101.7 2, 4, 5 4 163.6 163.4 5 6.29 (d, 2.5) 112.4 1, 4, 8 6.29 (d, 2.0) 112.4 1, 3, 4, 8 6 144.6 144.7 7 172.3 172.0 8 2.51 s 24.4 1, 5, 6 2.52 s 24.3 1, 5, 6 1’ 4.58 (dd, 11.5, 3.0) 4.32 (dd, 11.5, 6.5) 67.8 7, 2’, 3’ 4.63 (dd, 11.0, 3.5) 4.44 (dd, 11.0, 7.5) 64.8 7, 2’ 2’ 3.90 (ddd, 8.0, 6.5, 3.0) 71.3 1’, 4’ 4.59 (ddd, 7.5, 6.0, 3.5) 75.8 1’, 5’ 3’ 4.10 (dd, 8.0, 6.5) 77.0 1’ 4.32 (like_q, 6.0) 78.1 1’, 5’ 4’ 4.10 (dd, 8.0, 6.5) 3.98 (dd, 7.5, 3.5) 67.7 2’, 3’, 5’ 3.72 m 61.1 2’ 5’ 110.0 109.2 6’ 1.29 s 25.5 5’ 1.41 s 25.6 5’ CH3 O O H HO H OH CH2 HC HC H2C OH O 1 3 5 8 7 1' 2' 3' 4' 5' 6' O CH3 CH3 7' Trang 26 7’ 1.36 s 27.1 5’ 1.33 s 28.2 5’ 2- OH 11.46 s 1, 2 3. THỰC HIỆN PHẢN ỨNG TẠO DẪN XUẤT ACETONIDE Thí nghiệm 1: Tiến hành ngâm hợp chất tinh khiết RS-C3 trong dung môi acetone lần lượt trong 24 giờ, 48 giờ. Thí nghiệm 2: Thực hiện phản ứng đun hoàn lưu hợp chất tinh khiết RS-C3 trong hệ dung môi acetone : DMSO ở 120oC lần lượt trong 30 phút, 1 giờ, 1 giờ 30 phút, 2 giờ, 2 giờ 30 phút. Sau mỗi thí nghiệm thực hiện sắc kí lớp mỏng điều chế với hệ dung môi chloroform : methanol : ethyl acetate : acid acetic (9:1:0.2:0.2) thấy xuất hiện thêm một vết mới, chứng tỏ hợp chất RS-H13 và hợp chất RS-C9 là những hợp chất giả tạo được hình thành trong quá trình ly trích các hợp chất từ địa y Roccella sinensis . Hình 6: Sắc kí lớp mỏng hợp chất RS-C3 Đối với dẫn xuất acetonide không cần xúc tác cũng có thể được tạo thành ở điều kiện thường. Trang 27 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN Từ mẫu địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale, họ Rocellaceae, thu hái trên thân cây chín tầng ở huyện Liên Hương, tỉnh Bình Thuận, Việt Nam. Sau khi làm sạch, phơi khô, xay nhuyễn thu được 1.7 kg mẫu. Tiến hành điều chế cao methanol thô (450g). Thực hiện sắc kí cột silica gel, giải ly lần lượt bằng dung môi hexan, hệ dung môi hexan: ethyl acetate có độ phân cực tăng dần từ 9:1 đến 0:10 và dung môi methanol thu được các loại cao như: cao hexan, cao etyl acetat EA1, EA2, EA3, EA4 và cao methanol. Tiến hành sắc ký cột trên cao ethyl acetate EA1 thu được 3 phân đoạn ký hiệu từ EA1.1 đến EA1.3. Chọn khảo sát trên phân đoạn EA1.2 thu được hai hợp chất ký hiệu là RS-H13 và RS-C9. Sử dụng các phương pháp quang phổ hiện đại đã xác định được cấu trúc của hai hợp chất hữu cơ cô lập được trong địa y Roccella sinennsis như hình. Và cả hai hợp chất này đều là hợp chất mới. CH3 O O H HO H OH CH2 HC HC CH2OH O O CH3 CH3 1 3 5 8 7 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' CH3 O O H HO H OH CH2 HC HC H2C OH O 1 3 5 8 7 1' 2' 3' 4' 5' 6' O CH3 CH3 7' 2-(2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)- 2-hydroxyethyl 2,4- dihydroxy-6-methylbenzoate (RS-C9). [5-(hydroxymethyl)-2,2-dimethyl-1,3- dioxolan-4-yl]methyl2,4-dihydroxy- 6-methylbenzoate (RS-H13). Trang 28 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO CỦA ĐỀ TÀI Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên cao ethyl acetate EA1. Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát thành phần hóa học của các cao còn lại. Đồng thời chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp chất đã cô lập được. Trang 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] E. J. W. Barrington, Arthur J.Willis, The biology of lichens: Contemporary biology, 2nd edition, Edward Arnold, London (1974). [2] Ahmadjian V.; Nilsson S, Swedish Lichens.Yb. Am. Swed. Hist. Fdn (1963). [3] B. C. Behera, Neerja Verma, Anjari Sonone, Urmila Markhija, “Antioxidant and antibacterial properties of some cultured lichens”, Bioresource Technology, 99, 776-784 (2008). [4] Muhammad I. Choudhary, Azizuddin Saima Jalil, Atta-ur-Rahman, “Bioactive phenolic compounds from a medicinal lichen, Usnea longissima”, Phytochemistry, 66, 2346-2350 (2005) [5] Yit Heng Choi, Generic potential of lichen-forming fungi in polyketide biosynthesis, A thesis for Doctor of Philosophy, RMIT University, 10-15, 2008. [6] Le Hoang Duy, Chemical study of common lichens in the south of Vienam, A thesis for Doctor of Philosophy, Kobe Pharmaceutical University, 2-8, 2012. [7] E. J. W. Barrington, Arthur J.Willis, The biology of lichens: Contemporary biology, 2nd edition, Edward Arnold, London, 1974. [8] Siegfried Huneck, Isao Yoshimura, Identification of lichen substances, Springer, Berlin, 155-311, 1997. [9] Boustie J, Grube M, Lichens - a promising source of bioactive secondary metabolites, Plant Genetic Resources 3, 273-287, 2007. [10] Siegfried Huneck, New results on the chemistry of lichen substances, Springer, Berlin, 2001. [11] Muller K., Pharmaceutically relevant metabolites from lichens, Applied Microbiology and Biotechnology, 56, 9-16, 2001. [12] Huneck S., Follmann G. Uber die Inhaltsstoffe von, Roccella mollis (Hampe) Zahlbr. Und die Strucktur sowie absolute Konfiguration der Roccellasarue. Z Nafurforsch 22b: 666- 670, 1967. [13] Huneck S., Schmidt J., Porzel A. Chemie der Roccellsaure. Z Naturforsch 49b: 561- 568,1994c. Trang 30 [14] Ferguson G., Mackey I. R., the structure of portentol:X-ray analysis of a heavy atom derivative. Chem Common: 665-666, 1970. [15] Aberhart DJ ,Overton K. H., Huneck S., Portentol: an unsual polypropionate feom the lichen Roccella portentosa .J Chem Soc (C): 1612-1623, 1970. [16] Culberson C. F., Chemical and botanical guide to lichen products. Univ North Carolina Press, Chapel Hill, 1969. [17] Anker R. M., Cook A. H., A new synthesis of olivetol. J Chem Soc:311-313,1945. [18] Czeczuga B., Carotenoids. In: Galun M (ed) CRC Handbook of lichenology, Vol III. CRC Press, Boca Raton, Floria, pp 25-34, 1988. [19] Alberhart D. J., Overton K. H., Huneck S., Studies on lichen sunstance. Part LXII. Aromatic constituents of the lichen Roccella fuciformis DC. A recised structure for lepraric acid. J Chem Soc:704-707, 1969. [20] Hucneck S., Follmann G. Mitteilungen ober Flechterninhaltssoffe. LXXIV. Zur Phytochemie und Chemotaxonomie der Lecanoraceengattung Haematomma. J Hattorl Bot Lab 35:319-324,1972. [21] Hucneck S., 6-hydroxymethyleugenitin, ein neues Chromon aus Roccella fuciformis. Phytochemistry 11:489-1490, 1972a. [22] Sundholm E. G., Huneck S., 13C-NMR – sdectra of lichen depsides, depsindones and depsones.1.Compounds of the orcinol series. Chem Scripta 16: 197-200, 1980. [23] Huneck S.,Elix J. A., Naidu R., Follmann G., 3-O-Demethylschizopeltic acid, a new dibenzofuran from the lichen Roccella hypomecha. Aust J Chem 46:407-410, 1993a. [24] Huneck S., Jakupovic J., Follmann G., 9-Methylpannarate from the lichen Roccella capesis. Z Naturforsch 46b: 969-970, 1991b. [25] Marcuccio S. M. , Elix J. A., A structual revision of picroroccellin . Tetrahedron Lett: 1445-1448, 1983. [26] Bohman-Lindgren G., Chemical studies of lichens .XXXIII , Roccanin, a new cyclic tetrapeptit from Roccella canarlensist .Tetrahedron 28:4625-4630,1972. Trang 31 Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của hợp chất RS-H13 Trang 32 Phụ lục 1a: Phổ 1H-NMR của hợp chất RS-H13. Trang 33 Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của hợp chất RS-H13. Trang 34 Phụ lục 3: Phổ HSQC của hợp chất RS-H13. Trang 35 Phụ lục 3a: Phổ HSQC của hợp chất RS-H13. Trang 36 Phụ lục 4: Phổ HMBC của hợp chất RS-H13. Trang 37 Phụ lục 4a: Phổ HMBC của hợp chất RS-H13. Trang 38 Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR của hợp chất RS-C9 Trang 39 Phụ lục 5a: Phổ 1H-NMR của hợp chất RS-C9 Trang 40 Phụ lục 5b: Phổ 1H-NMR của hợp chất RS-C9 Trang 41 Phụ lục 6: Phổ 13C-NMR của hợp chất RS-C9 Trang 42 Phụ lục 7: Phổ HSQC của hợp chất RS-C9 Trang 43 Phụ lục 7a: Phổ HSQC của hợp chất RS-C9 Trang 44 Phụ lục 8: Phổ HMBC của hợp chất RS-C9 Trang 45 Phụ lục 8: Phổ HMBC của hợp chất RS-C9