Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cao Hexane của rễ cây chùm ruột (Phyllanthus acidus) thu hái ở tỉnh Bình Thuận

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ  KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO HEXANE CỦA RỄ CÂY CHÙM RUỘT (PHYLLANTHUS ACIDUS) THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN GVHD: Th.S Dương Thúc Huy SVTH: Trần Thị Huệ MSSV: K38.201.040 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i MỤC LỤC .ii DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT .iv DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU .v LỜI MỞ ĐẦU .vi CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 1 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS ...................... 1 1.1.1. Tên gọi ............................................................................................................... 1 1.1.2. Phân bố .............................................................................................................. 1 1.1.3. Mô tả thực vật .................................................................................................... 1 1.1.4. Công dụng của cây chùm ruột trong y học cổ truyền ........................................ 2 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS .................................................................................... 2 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS ............................................................................................... 3 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS TRONG NƯỚC ................................................................................................. 4 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ..................................................................................... 7 2.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ .......................................................................................... 7 2.1.1. Hóa chất ............................................................................................................. 7 2.1.2. Thiết bị ............................................................................................................... 7 2.2. LY TRÍCH VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT .......................................................... 7 2.2.1. Nguyên liệu ....................................................................................................... 7 2.2.2. Điều chế các loại cao ......................................................................................... 8 2.2.3. Cô lập các hợp chất hữu cơ trong cao hexane ................................................... 8 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 10 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT T1A ..................................... 10 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT CRT3A ................................ 13 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN - ĐỀ XUẤT ....................................................................... 15 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................... 15 4.2. ĐỀ XUẤT ............................................................................................................. 15 -ii- TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 16 PHỤ LỤC -iii- -iii- LỜI CẢM ƠN Bằng tất cả sự trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến với:  Thầy Dương Thúc Huy – người Thầy đầy tâm huyết và nhiệt tình. Thầy không những chỉ dạy cho em kiến thức chuyên môn cùng với những kinh nghiệm nghiên cứu quý báu mà còn giúp em có niềm say mê nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian được Thầy hướng dẫn.  Tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo học và hoàn thành khóa luận.  Các bạn trong nhóm làm khóa luận K38, cùng các bạn sinh viên khóa K39 trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình cộng tác, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này.  Và cuối cùng con xin cảm ơn gia đình – chỗ dựa vững chắc về tinh thần trong suốt thời gian con theo học và thực hiện đề tài ở trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh. -i- LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực có khí hậu nhiệt đới gió mùa, được thiên nhiên ưu đãi cho các loài thực vật rất đa dạng. Từ xưa, người Việt Nam đã biết tận dụng nguồn tài nguyên này vào việc làm thuốc chữa bệnh (gọi là thảo dược). Nhưng có thể do ngẫu nhiên hoặc phải mất rất nhiều thời gian thì người ta mới nhận biết được một loại cây có thể dùng làm thuốc. Ngày nay với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kĩ thuật, ngành tổng hợp hóa dược rất phát triển. Tuy vậy, không phải hợp chất nào cũng dễ dàng được tổng hợp. Để đáp ứng yêu cầu đó, đồng thời cũng tận dụng những ưu đãi của thiên nhiên, ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên đã ra đời và phát triển rất mạnh mẽ. Rất nhiều các hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng rộng rãi để sản xuất các loại thuốc chữa bệnh bảo vệ sức khỏe con người. Hơn nữa, việc sử dụng thuốc Nam hầu như không gây tác dụng phụ và phù hợp với sức khỏe con người. Các nguồn tài liệu cho thấy cây chùm ruột là một loài cây được phân bố khá phổ biến ở các nước nhiệt đới gió mùa như Thái Lan, Việt Nam, Ấn Độ, Malaysia,Các hợp chất được phân lập từ lá và vỏ thân cây chùm ruột đều có hoạt tính sinh học rất cao như chống lại những tổn thương ở gan, làm giảm huyết áp, có tính chất kháng viêm, giảm đau, chống oxi hóa. Tuy nhiên cho đến nay, rễ cây chùm ruột vẫn chưa được nghiên cứu kĩ và sâu rộng. Từ những điều trên, chúng tôi thấy cần thiết phải nghiên cứu và khảo sát tiếp tục thành phần hóa học của rễ cây chùm ruột Phyllanthus acidus ở Việt Nam để tìm ra những hợp chất mới có hoạt tính mới và tương tự như lá và vỏ thân cây chùm ruột. Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá và kế thừa những nghiên cứu đã có nên chúng tôi quyết định chọn nghiên cứu đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học của cao hexane của rễ cây chùm ruột Phyllanthus acidus, thu hái ở tỉnh Bình Thuận”. -vi- DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT Tiếng Việt Ac Acetone AcOH Acid acetic C Chloroform 13C-NMR Carbon Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13) d Doublet Mũi đôi dd Doublet of doublets Mũi đôi đôi EA Ethyl Acetate J Hằng số tương tác spin – spin H Hexane HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence Tương quan 1H-13C qua 2, 3 nối HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Tương quan 1H-13C qua 1 nối 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Me Methanol NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ppm Part per million s Singlet SKC Sắc kí cột UV Ultra violet Tia cực tím δ Chemical shift Độ chuyển dịch hóa học -iv- DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU  HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cây chùm ruột .......................................................................................1 Hình 1.2. Một số hợp chất cô lập từ cây Phyllanthus acidus .................................. 5,6 Hình 3.1. Cấu dạng và tương quan HMBC của hợp chất T1A ................................ 11 Hình 3.2. Cấu dạng của hợp chất CRT3A ............................................................... 13 Hình 4.1. Hai hợp chất cô lập được từ cao hexane của rễ cây chùm ruột ................ 15  SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quá trình trích ly và cô lập hợp chất từ rễ cây chùm ruột .........................9  BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Sắc kí cột trên dịch methanol ...................................................................... 8 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC của chất T1A (CDCl3) và 13C- NMR (CDCl3) của hợp chất phyllanthol[12] .............................................................. 12 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của chất CRT3A (CDCl3) và 13C-NMR (CDCl3) của hợp chất 𝛼𝛼 – lupene[10,20] ...................................................................... 14 -v- Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS 1.1.1. Tên gọi Tên thông thường: cây chùm ruột. Tên gọi khác: cây tầm ruột hay cây tầm giuộc. Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Tên khoa học: Phyllanthus acidus. Hình 1.1. Cây chùm ruột 1.1.2. Phân bố Cây chùm ruột có nguồn gốc từ Madagasca, sau đó di nhập vào nhiều nước vùng châu Á, châu Phi. Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây chùm ruột được trồng phổ biến ở miền Nam. 1.1.3. Mô tả thực vật Theo Phạm Hoàng Hộ, Đỗ Tất Lợi, Đỗ Huy Bích và cộng sự, cây chùm ruột là loại cây nhỏ, cao 3–5 m, thân nhẵn, cành có vỏ màu xám nhạt, cành non màu lục nhạt, nhẵn; cành già màu xám có nhiều vết sẹo do lá rụng để lại. Lá chùm ruột thuộc loại lá kép, mọc so le, cuống dài, lá chét mỏng, mềm, dài 4–5 cm, rộng 18–20 mm. Gốc lá bầu, tròn, phần đầu phiến lá nhọn, mặt dưới màu xám nhạt, gân lá rõ ở cả hai mặt. Cụm hoa mọc ở kẽ những lá đã rụng thành xim, dài 6–15 cm, cuống mảnh có cạnh; hoa nhỏ màu đỏ, hoa cái và hoa đực 1 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ ở cùng một cây; hoa đực có đài 4 răng, 4 nhị, rời; hoa cái có 4 lá đài, bầu 4 ô và hoa mọc thành cụm từ 4–7 hoa ở mỗi mấu tròn. Quả chùm ruột mọng, có khía, 4 mảnh, đường kính khoảng 5 mm và cuống quả dài khoảng 7 mm. Khi quả chín có màu vàng nhạt, vị chua, hơi ngọt và ăn được.[21 -23] 1.1.4. Công dụng của cây chùm ruột trong y học cổ truyền Theo Đỗ Tất Lợi, Đỗ Huy Bích và cộng sự, trong y học cổ truyền các nước, những bộ phận khác nhau của cây chùm ruột được dùng làm thuốc chữa các bệnh ngoài da, như lá được dùng nấu nước tắm chữa lở ngứa và mề đay. Vỏ thân cây chùm ruột được dùng để tiêu hạch độc, ung nhọt, tiêu đờm trừ tích ở phổi, dùng bôi ngoài, chữa ghẻ, loét, vết thương sứt da chảy máu; ngậm chữa đau răng và đau họng. Bột vỏ thân ngâm giấm, uống chữa bệnh trĩ. Rễ và vỏ cây chùm ruột có độc, người Malaysia dùng đun sôi, xông hít chữa ho và nhức đầu; hay được người dân đảo Giava dùng chữa hen suyễn (dùng lượng rất nhỏ). Vỏ rễ sắc đặc hoặc ngâm rượu, bôi chữa vảy nến (psoriasis). Tuy nhiên, không được dùng rễ và vỏ rễ ở dạng uống. [21,22] 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS Các nghiên cứu về cây chùm ruột Phyllanthus acidus cho thấy có nhiều nhóm hợp chất như alkaloid, flavonoid, lactone, steroid, terpenoid, lignan và tannin, trong đó lignan, triterpene, alkaloid và tannin là các loại hợp chất phổ biến được phát hiện trong cây này. Một số nghiên cứu hoá thực vật trên cây chùm ruột Phyllanthus acidus được thực hiện khá sớm và chỉ công bố sự cô lập của các triterpene và phytosterol (Dekker, 1908; Ultee, 1933; Sengupta và Mukhopadhyay, 1966; Pettit và cộng sự, 1982).[2,18,16,14] Các hợp chất triterpene đã được cô lập thuộc khung oleane như β-amyrin (22), khung lupane như lupeol (23) và khung cyclopropyl-hexacyclic triterpenoid như phyllanthol (24). Trong khi đó, các hợp chất sterol chủ yếu có khung sitosterol và các glycoside của chúng. Những nghiên cứu trong khoảng 15 năm gần đây trên cây chùm ruột Phyllanthus acidus đã công bố sự cô lập của một nhóm các hợp chất norbisabolane sesquiterpenoid, với hoạt tính sinh học của chúng khá đa dạng (Lv J.-J và cộng sự, 2014; Vongvanich và cộng sự, 2000).[8,19] Năm 2000, hai hợp chất phyllanthusol A (2) và B (3) đã được cô lập, có khung 2 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ sườn serquiterpenoid loại norbisabolane gắn các phân tử đường glucosyl và mannosamine- N-acetate (Vongvanich và cộng sự, 2000).[19] Tuy nhiên, đến năm 2014, cùng với sự cô lập 19 hợp chất cũng thuộc khung sườn norbisabolane, các hợp chất phyllanthusol A và B được xác nhận cấu trúc, trong đó hai đơn vị đường là glucopyranosyl và glucosamine-N- acetate. Như vậy, cho đến nay, 21 hợp chất norbisabolane đã được cô lập, với tên gọi tương ứng là phyllanthacidoid A-T (1-21). Trong đó, hai hợp chất phyllantacidoid S (20) và T (21) chứa khung sườn rất lạ so với các hợp chất được cô lập trước đây, với hợp phần tricyclo[3.1.1.1] có trong cấu trúc của chúng. Ngoài ra, các hợp chất phyllanthacidoid cũng được xác định là thành phần chính có trong rễ cây chùm ruột, với hàm lượng khoảng 1 mg/g, tính trên khối lượng rễ chưa khô (Vongvanich và cộng sự, 2000).[19] Quá trình chiết xuất và phân tích hàm lượng của phyllanthacidoid A và B cũng được xác nhận bằng phương pháp điện di (capillary electrophoresis) (Durham D. G. và cộng sự, 2002).[3] Năm 2010, các hợp chất kaemferol (28), adenosine (29), 4-hydroxybenzoic acid (30), hypogallic acid (31), caffeic acid (32) được cô lập từ cao n-butanol của lá cây chùm ruột (Leeya và cộng sự, 2010).[7] 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học trên cao chiết các bộ phận của cây chùm ruột Phyllanthus acidus cũng khá phổ biến, như hoạt tính kháng khuẩn (Menlendez và cộng sự, 2006),[11] kháng nấm (Satish và cộng sự, 2009),[15] kháng ký sinh trùng giun đũa trên thực vật (Mackeen và cộng sự, 1997),[9] bệnh sơ nang (Sousa và cộng sự, 2007; Santhosh và cộng sự, 2011),[17,6] chữa trị tổn thương gan (Nilesh và cộng sự, 2011),[5] giảm nhẹ mỡ ở các mô, tạng, giảm lipid trong huyết thanh và trong gan của chuột lang trong 6 tuần (Chongsa và cộng sự, 2014).[1] Ngoài ra, các hợp chất thuộc khung sườn norbisabolane đã được thử nghiệm độc tính tế bào và hoạt tính kháng virus viêm gan siêu vi B (HBV), với giá trị IC50 trong khoảng 0.8-36.0 µM (Lv và cộng sự, 2014; Vongvanich và cộng sự, 2000).[8,19] Các hợp chất được cô lập từ cao n-butanol của lá cây chùm ruột Phyllanthus acidus đều có khả năng làm giảm huyết áp và giãn cơ vòng ở động mạch chủ (Leeya và cộng sự, 2010).[7] 3 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS TRONG NƯỚC. Năm 2014, Nguyễn Thái Thế đã cô lập được các hợp chất phenylbutanoid và diphenylheptanoid, trong đó có một hợp chất diphenylpentanoid mới (Nguyen T. T. và cộng sự, 2014).[13] Cho đến nay, các hợp chất có khung sườn phenylbutanoid và phenylheptanoid chưa được công bố trong chi Phyllanthus. Các hợp chất cô lập gồm glochodinone (25), 4-[4’-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl-2-butanone (26), 1-[4’-(O-β-D- glucopyranosyl)phenyl]-5-[4”-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl]-3-pentanone (27). Năm 2015, trong tóm tắt kết quả nghiên cứu đề tài luận văn Thạc sĩ của Võ Thị Như Thảo, với đề tài : “Nghiên cứu tách chiết và xác định thành phần hóa học của vỏ thân cây chùm ruột Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam trong một số dịch chiết”, tác giả công bố đã thu được một số kết quả như: xác định độ ẩm của nguyên liệu bột khô là 8.87%; hàm lượng tro trung bình là 5.00%; định tính được dịch chiết n-hexane có 15 cấu tử hữu cơ thuộc các nhóm hợp chất acid hữu cơ, ester, vitamin, sterol; dịch chiết chloroform có 9 cấu tử hữu cơ thuộc nhóm sterol, acid hữu cơ, ester của acid béo; dịch chiết etyl acetat có 14 cấu tử hữu cơ thuộc nhóm acid béo, sterol, sesquiterpen....Ngoài ra, tóm tắt luận án cũng công bố thông tin về thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của bột vỏ cây chùm ruột trên hai dòng chủng vi khuẩn là Bacillus subtilis và Klebsiella. Tuy nhiên, công bố của tác giả không cho thấy bất kỳ sự xác định cấu trúc của hợp chất nào cô lập được từ vỏ thân cây chùm ruột ở Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam và cho đến nay, các kết quả này vẫn chưa được tìm thấy trong các báo cáo khoa học tại Việt Nam. 4 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ O O O OOO OHOH R1 OH HO HO O HO O HO HO HN HO R2 O R2 R3 4 H H 5 H OH 8 OH OH 10 OCH3 OH R1 R2 2 H OH 3 H H 7 OH OH 11 OCH3 OH O O O OOO OHOH R1 OH HO HO O HO O HO HO OH HO R2 O O O O HO O OR OHOH H OH 1 R =CH3 2a R = H O HO HO HO HN O O HO HO HO OH GlcN-Ac-GlcN O O O O R3 O O OHOH R2 OH HO HO OR1 HO R1 R2 R3 6 H H OH 9 Glc(2-1)Glc OH OH O O O O OHOH H OH HO HO OR1 HO O O R2 R1 R2 15 N-Ac-GlcN H 16 Glc OH 17 N-Ac-GlcN OCH3 O O O O H OH H OH HO HO OR1 HO O O R2 R1 R2 12.N-Ac-GlcN H 13.N-Ac-GlcN OH 14.Glc OH O O O OR HO HO HO OHOH OH HO O HO O O R 20 N-Ac-GlcN 21 Glc O O O O OHOH H HO HO OR HO O O HO O R 18 N-Ac-GlcN 19 Glc H HO HO HO 22 23 24 5 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ Hình 1.2. Một số hợp chất cô lập từ cây Phyllanthus acidus O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324 25 26 27 28 29 30 25 O HO HO OH O OH H3C O 1 2 3 4 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 26 O O O 5" 1' 2' 3' 4' 6' 1 2 3 4 5 1" 2" 3" 4" 5' 6"O HO HO OH OH 1'" 2'" 3'" 4'" 5'" 6'" 1"" 2"" 3 "" 4"" 5"" 6""O OH OH HO HO27 HO OH O O 28 O OHOH HO N N N N NH2 29 OH O OH 30 OHO 31 OH HO 32 OH OH OH O OHOH 6 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ Hình 1.2. Một số hợp chất cô lập từ cây Phyllanthus acidus (tiếp). 7 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ. 2.1.1. Hoá chất  Silica gel: silica gel 60, 0.04-0.06 mm, Merck dùng cho cột sắc kí.  Sắc kí bản mỏng loại 25DC - Aflufolein 20×20, Kiesel gel 60F 254 , Merck.  Dung môi dùng cho quá trình sắc kí cột và sắc kí điều chế : n-hexane, ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, n-butanol và nước cất.  Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: sử dụng vanillin/H2SO4. 2.1.2. Thiết bị  Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.  Các cột sắc kí.  Máy cô quay chân không.  Bếp cách thuỷ.  Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.  Cân điện tử.  Các thiết bị ghi phổ: phổ 1H-NMR (500 MHz), phổ 13C-NMR (125 MHz), phổ HMBC và phổ HSQC ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker.  Tất cả phổ NMR được ghi tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. LY TRÍCH VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT 2.2.1. Nguyên liệu Rễ chùm ruột được thu hái ở tỉnh Bình Thuận vào tháng 4 năm 2014. Rễ cây được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, chặt nhỏ, phơi khô trong bóng râm và nghiền nhỏ thành bột. Sau đó tiến hành đun chiết và phân lập các hợp chất. 8 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ 2.2.2. Điều chế các loại cao Sau khi xử lý mẫu nguyên liệu thu được 20.0 kg nguyên liệu dạng bột. Nguyên liệu bột được đun hồi lưu trong ethanol ở 80oC trong 30 phút đối với mỗi bình cầu dung tích 1000 ml. Tiến hành lọc bỏ phần bã rắn, cô quay phần dịch dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (1.0 kg). Một nửa cao ethanol thô tiếp tục được hòa tan bằng methanol nóng thu được phần dịch methanol (300.0 g). Tiến hành sắc ký cột pha thuận nhiều lần bằng hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate : methanol với độ phân cực tăng dần thu được các phân đoạn tương ứng (Bảng 2.1). Bảng 2.1. Sắc kí cột trên dịch methanol. Hệ dung môi Cao H:EA (95:5) H1 (2.0 g) H:EA (9:1) H2 H:EA (8:2) H3 H:EA (5:5) H4 (3.4 g) EA EA1 (67.0 g) EA:Me (5:5) EA2 (85.0 g) Me Me 2.2.3. Cô lập các hợp chất hữu cơ trong cao hexane Trên phân đoạn H1 (2.0 g) thực hiện sắc kí cột (SKC) silica gel và giải ly bằng hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate (9:1) thu được 4 phân đoạn H1.1 (125.0 mg), H1.2 (250.0 mg), H1.3 (152.0 mg) và H1.4 (150.0 mg). Từ phân đoạn H1.2 tiếp tục SKC silica gel và giải ly bằng hệ dung môi n-hexane: methanol (100:0.2) thu được 3 phân đoạn H1.2.1 (60.0 mg), H1.2.2 (55.0 mg) và H1.2.3 (75.0 mg). Trên phân đoạn H1.2.1 thực hiện SKC và giải ly bằng hệ dung môi n-hexane: methanol (100:0.2) thu được hợp chất T1A (Sơ đồ 2.1). Trên phân đoạn H1.2.3 thực hiện SKC silica gel và giải ly bằng hệ dung môi n-hexane: methanol (100:0.2) thu được hợp chất CRT3A (Sơ đồ 2.1). 9 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ Sơ đồ 2.1. Quá trình trích ly và cô lập hợp chất từ rễ cây chùm ruột Rễ chùm ruột Làm sạch, để khô, nghiền nhỏ Bột khô (20.0 kg) Đun hồi lưu trong ethanol ở 80oC trong 30 phút Bỏ phần rắn, cô quay phần dịch Cao ethanol thô (1.0 kg) Phần còn lại Hòa tan một nửa cao tổng bằng methanol nóng Phần dịch methanol (300.0 g) Phần bã còn lại (200.0 g) Sắc kí cột Giải li bằng các dung môi khác nhau H1 (2.0 g) H2 H3 H4 (3.4 g) EA1 (67.0 g) EA2 (85.0 g) Me H1.1 (125.0 mg) H1.2 (250.0 mg) H1.3 (152.0 mg) H1.4 (150.0 mg) H1.2.1 (60.0 mg) H1.2.2 (55.0 mg) H1.2.3 (75.0 mg) T1A (6.0 mg) CRT3A (5.3 mg) H:EA (9:1) H:EA (95:5) EA H:EA (8:2) H:EA (5:5) Me H:EA (9: 1) EA:Me (5:5) H:Me (100:0.2 ) H:Me (100:0.2) H:Me (100:0.2) 10 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT T1A. Hợp chất T1A cô lập được từ phân đoạn H1.2.1. Hợp chất T1A là chất bột màu trắng, tan trong dung môi chloroform. Phổ 1H-NMR (CDCl3): phụ lục 1. Phổ 13C-NMR (CDCl3): phụ lục 2. Phổ HSQC (CDCl3): phụ lục 3. Phổ HMBC (CDCl3): phụ lục 4.  Biện luận cấu trúc T1A. Phổ 1H-NMR của hợp chất T1A cho thấy sự hiện diện của bảy nhóm methyl đặc trưng cho hợp chất triterpene khung sườn ursane tại 𝛿𝛿RH 0.96 (3H, s), 𝛿𝛿RH 0.77 (3H, s), 𝛿𝛿RH 0.86 (3H, s), 𝛿𝛿RH 1.14 (3H, s), 𝛿𝛿RH 0.90 (3H, s), 𝛿𝛿RH 0.94 (3H, d, J = 6.0 Hz) và 𝛿𝛿RH 0.87 (3H, d, J = 6.0 Hz) lần lượt là H3-23, H3-24, H3-25, H3-26, H3-28, H3-29 và H3-30. Ngoài ra, trong phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu proton của nhóm methine liên kết với oxygen (H-3) tại 𝛿𝛿RH 3.19 (1H, dd, J1 = 11.0 Hz, J2 = 5.0 Hz), tín hiệu của hai proton không tương đương của nhóm methylene ở vùng từ trường rất cao ghép cặp với nhau (H2-27) tại 𝛿𝛿RH 0.01 (1H, d, J = 5.5 Hz) và 𝛿𝛿RH 0.66 (1H, d, J = 5.5 Hz). Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất T1A có ba mươi tín hiệu carbon của khung sườn ursane, trong đó có bảy tín hiệu của nhóm methyl tại 𝛿𝛿RC 15.3, 16.0, 18.0, 18.1, 20.7, 27.3 và 28.2; ba tín hiệu của nhóm methine tại 𝛿𝛿RC 50.1, 54.0 và 55.7 lần lượt là C-9, C-18 và C- 5; một nhóm methine của C-3 liên kết với oxygen tại 𝛿𝛿RC 79.1; một nhóm methylene của C- 27 tại 𝛿𝛿RC 13.3 và các tín hiệu của carbon khác. Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của proton H-3 tại 𝛿𝛿RH 3.19 có dạng mũi dd với hằng số ghép lần lượt là J1 = 11.0 Hz và J2 = 5.0 Hz chứng tỏ proton này phải ghép cặp với hai proton (H-2𝛼𝛼 và H-2𝛽𝛽) lần lượt với Jaa = 11.0 Hz và Jae = 5.0 Hz, do đó proton H-3 phải ở vị trí trục hay nhóm –OH ở vị trí xích đạo. 11 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ Phổ HMBC cho thấy proton H3-23 (𝛿𝛿RH 0.96, s) và proton H3-24 (𝛿𝛿RH 0.77, s) cùng tương quan với những carbon C-3 (𝛿𝛿RC 79.1), C-4 (𝛿𝛿RC 38.8) và C-5 (𝛿𝛿RC 55.7) từ đó giúp xác định vị trí của nhóm –OH gắn với C-3. Ngoài ra, phổ HMBC còn cho thấy proton H3-25 (𝛿𝛿RH 0.86, s) tương quan với C-5 (𝛿𝛿RC 55.7), C-9 (𝛿𝛿RC 50.1) và C-10 (𝛿𝛿RC 37.3); proton H3-26 (𝛿𝛿RH 1.14, s) tương quan với C-8 (𝛿𝛿RC 37.0), C-9 (𝛿𝛿RC 50.1) và C-14 (𝛿𝛿RC 32.2); proton H-28 (𝛿𝛿RH 0.90, s) tương quan với C-16 (𝛿𝛿RC 27.9), C-17 (𝛿𝛿RC 31.1), C-18 (𝛿𝛿RC 54.0) và C-22 (𝛿𝛿RC 42.0); proton H-29 (𝛿𝛿RH 0.94, d, J = 6 Hz) tương quan với C-18 (𝛿𝛿RC 54.0). Từ đó giúp xác định vị trí của các nhóm methyl. Trên 1H-NMR xuất hiện hai tín hiệu proton của nhóm methylene không tương đương H2-27, mũi d với hằng số ghép J = 5.5 Hz tại 𝛿𝛿RH 0.01 và 0.66. Chứng tỏ nhóm methylene này phải liên kết với carbon tứ cấp. Trên phổ HSQC cho thấy hai proton này cùng gắn trên một carbon C-27 tại 𝛿𝛿RC 13.3. Trên phổ HMBC, hai proton này cùng tương quan với những carbon kế cận tương tự nhau C-12 (𝛿𝛿RC 35.2), C-13 (𝛿𝛿RC 26.6), C-14 (𝛿𝛿RC 32.2), C-15 (𝛿𝛿RC 21.3) và C-18 (𝛿𝛿RC 54.0) giúp khẳng định vị trí của nhóm methylene này. Từ những dữ liệu phổ và tài liệu tham khảo,[12] suy ra hợp chất T1A là phyllanthol (13,27-cycloursan-3𝛽𝛽-ol). Hình 3.1. Cấu dạng và tương quan HMBC của hợp chất T1A HO 1 3 5 2 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324 25 26 27 28 29 30 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H 1 3 23 24 25 26 29 30 28 27 12 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC của chất T1A (CDCl3) và 13C-NMR (CDCl3) của hợp chất phyllanthol.[12] Vị trí Hợp chất T1A (CDCl3) Hợp chất phyllanthol [12] (CDCl3- ) 1H-NMR 𝛿𝛿RH [số H; dạng mũi; J (Hz)] 13C-NMR 𝛿𝛿RC HMBC 1H – 13C 2J, 3J. 13C-NMR 𝛿𝛿RC 1 38.5 38.7 2 29.4 27.5 3 3.19 (1H, dd, 5.0,11.0) 79.1 C-4, C-24, C-23 79.3 4 38.8 39.1 5 55.7 C-7, C-23, C-3 55.9 6 18.1 18.3 7 38.4 38.7 8 37.0 37.2 9 50.1 C-10, C-8, C-7, C-11 54.2 10 37.3 37.5 11 17.6 C-12, C-13, C-10, C-8 17.8 12 35.2 C-27, C-11, C-13 35.4 13 26.6 26.6 14 32.2 32.4 15 21.3 21.5 16 27.9 27.5 17 31.1 32.1 18 54.0 50.3 19 40.8 41.0 20 37.3 38.7 21 29.7 31.3 22 42.0 42.3 23 0.96 (3H, s) 27.3 C-3, C-4, C-5, C- 24 28.1 24 0.77 (3H, s) 15.3 C-3, C-4, C-5, C- 23 15.5 25 0.86 (3H, s) 16.0 C-5, C-9, C-10 16.2 26 1.14 (3H, s) 17.9 C-8, C-9, C-14 18.2 27 0.01 (1H, d, 5.5) 0.66 (1H, d, 5.5) 13.3 C-12, C-13, C-15, C-18 13.5 28 0.90 (3H, s) 28.2 C-17, C-18, C-22 28.4 29 0.94 (3H, d, 6.0) 18.0 C-18 18.3 30 0.87 (3H, d, 6.0). 20.7 20.9 13 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT CRT3A. Hợp chất CRT3A cô lập được từ phân đoạn H1.2.3. Hợp chất CRT3A là chất bột màu trắng, tan trong dung môi chloroform. Phổ 1H-NMR (CDCl3): phụ lục 5. Phổ 13C-NMR (CDCl3): phụ lục 6, phụ lục 7.  Biện luận cấu trúc CRT3A Phổ 13C-NMR của hợp chất CRT3A có ba mươi tín hiệu carbon, giúp xác định hợp chất CRT3A thuộc hợp chất triterpene. Phổ 1H-NMR của hợp chất CRT3A xuất hiện sáu mũi đơn tương ứng với sáu nhóm methyl có độ dịch chuyển nằm trong khoảng 0.8–1.07 ppm (H3-23, H3-24, H3-25, H3-26, H3-27 và H3-28). Ngoài ra có một nhóm methyl mũi đơn cộng hưởng ở vùng từ trường thấp tại 𝛿𝛿RH 1.68 là nhóm methyl gắn với carbon sp2 –C=C- CH3. Trên phổ 1H-NMR xuất hiện hai tín hiệu ở vùng từ trường thấp của hai proton tại 𝛿𝛿RH 4.69 và 𝛿𝛿RH 4.57 ghép với nhau với hằng số ghép nhỏ J = 2.5 Hz. Bên cạnh đó phổ 13C- NMR có hai tín hiệu carbon ở vùng alkene, trong đó có một tín hiệu carbon tứ cấp tại 𝛿𝛿RC 151.0 và một tín hiệu carbon tại 𝛿𝛿RC 109.5. Từ đó giúp xác định trong hợp chất CRT3A có chứa nhóm isopropenyl –C(CH3)=CH2. Kết hợp với tài liệu tham khảo (Mahato, 1994)[10] giúp xác định hợp chất CRT3A có khung sườn lupane. Từ những dữ liệu phổ kết hợp với tài liệu tham khảo,[10,20] suy ra hợp chất CRT3A là 𝛼𝛼 – lupene. CH3 H3C CH3 CH3 CH3 H3C CH3 1 2 3 4 5 10 6 7 89 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324 25 26 28 27 29 30 Hình 3.2. Cấu dạng của hợp chất CRT3A 14 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của chất CRT3A (CDCl3) và 13C-NMR (CDCl3) của hợp chất 𝛼𝛼 – lupene.[10,20] Vị trí Hợp chất CRT3A (CDCl3) Hợp chất 𝛼𝛼 – lupene [10,20] (CDCl3) 1H-NMR 𝛿𝛿RH [số H; dạng mũi; J (Hz)] 13C-NMR 𝛿𝛿RC 13C-NMR 𝛿𝛿RC 1 40.1 40.3 2 19.4 18.7 3 42.2 42.1 4 33.3 33.2 5 55.1 56.3 6 19.4 18.7 7 34.3 34.3 8 40.9 41.0 9 49.9 50.5 10 37.8 37.5 11 21.2 20.8 12 25.3 25.2 13 38.3 38.0 14 43.0 42.8 15 27.6 27.4 16 35.7 35.6 17 43.1 43.0 18 48.4 48.3 19 48.1 47.9 20 151.0 150.6 21 30.0 29.9 22 39.8 40.0 23 1.03 (3H, s) 33.7 33.4 24 0.80 (3H, s) 21.6 21.6 25 0.96 (3H, s) 15.9 16.1 26 1.07 (3H, s) 16.1 16.1 27 0.93 (3H, s) 14.6 14.6 28 0.87 (3H, s) 18.2 18.0 29 4.57 (1 H, d, 2.5) 4.69 (1 H, d, 2.5) 109.5 109.2 30 1.68 (3H, s) 19.8 19.3 15 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN Từ rễ cây chùm ruột Phyllanthus acidus được thu hái ở tỉnh Bình Thuận, phơi khô, xay nhuyễn thu được 20.0 kg mẫu. Tiến hành điều chế thu được cao ethanol thô (1.0 kg). Thực hiện các phương pháp sắc kí trên cao ethanol thô thu được hai hợp chất T1A và CRT3A. Sử dụng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại và so sánh với tài liệu tham khảo, đã xác định được cấu trúc của 2 hợp chất hữu cơ này như sau: HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2324 25 26 27 28 29 30 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324 25 26 27 28 29 30 T1A CRT3A Phyllanthol 𝜶𝜶 – lupene Hình 4.1. Hai hợp chất cô lập được từ cao hexane của rễ cây chùm ruột. 4.2. ĐỀ XUẤT Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên phân đoạn H1. Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát các hợp chất trên cao còn lại. Đồng thời, chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp chất đã cô lập được. 16 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng anh [1] Chongsa W., Radenahmad N., Jansakul C., “Six weeks oral gavage of a Phyllanthus acidus leaf water extract decreased visceral fat, the serum lipid profile and liver lipid accumulation in middle-aged male rats”, Journal of Ethnophramacology, 396-404, 2014. [2] Dekker S., Pharm. Weekbe, 95, 1156, 1908. [3] Durham D. G., Reid R. G., Wangboonskul J., Daodee S., “Extraction of Phyllanthusols A and B from Phyllanthus acidus and analysis by capillary electrophoresis”, Phytochem. Ana, 13, 358-362, 2002. [4] Eliel E. L., Wilen S. H., Mander L. N., “Stereochemistry Organic Compounds”, John Wiley & Sons: New York, 716, 1994. [5] Jain N. K., Singhai A. K., “Protective effects of Phyllanthus acidus (L.) Skeels leaf extracts on acetaminophen and thioacetamide induced hepatic injuries in Wistar rats”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 470-474, 2011. [6] Kumar S. C., Bhattacharjee C., Debnath S., Chandu A. N., Kanna K. K., “Remedial effect of Phyllanthus acidus against bleomycin provoked pneumopathy”, Journal of Advanced Pharmceutial Research, 2(1), 317-325, 2011. [7] Leeya Y., Mulvany M. J., Queiroz E. F., Marston A., Hostettmann K., Jansakul C., “Hypotensive activity of an n-butanol extract and their purified compounds from leaves of Phyllanthus acidus (L.) Skeel in rats”, European Journal of Pharmacology, 649, 301-313, 2010. [8] Lv J.-J., Yu S., Wang Y.-F., Wang D., Zhu H.-T., Cheng R.-R., Yang C.-R., Xu M., Zhang Y.-J., “Anti-hepatitus B virus norbisabolane sesquiterpenoids from Phyllanthus acidus and the establishment of their absolute configurations using theoretical calculations”, The Journal of Organic Chemistry, 79(12), 5432-5447, 2014. 17 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ [9] Mackeen M. M., Ali A. M., Abdullah M. A., Nasir R. M., Mat N. B., Razak A. R., Kawazu K., “Antinematodal activity of some Malaysian plant extracts against the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus”, Pesticide Science, 51(2), 165- 170, 1997. [10] Mahato S. B., Kundu A. P., “13C NMR spectra of pentacyclic triterpenoids- A compilation and some salient features”, Phytochemistry, 37(6), 1517-1575, 1994. [11] Menlendez P. A., Capriles V. A., “Antibacterial properties of tropical plants from Puerto Rico”, Phytomedicine: international journal of phytotherapy and phytopharmacology, 13, 272-276, 2006. [12] Ndlebe V. J., Crouch N. R., Mulholland D. A., “Triterpenoid from the African tree Phyllanthus polyanthus”, Phytochemistry Letters 1, 11-17, 2008. [13] Nguyen T. T., Duong T. H., Nguyen T. A. T., Bui X. H., “Study on the chemical constituents of Phyllanthus acidus (Euphorbiaceae)”, Journal of Science and Technology, 52(5A), 156-161, 2014. [14] Pettit G. R., Cragg G. M., Gust D., Brown P., Can J. Chem., 60, 939, 1982. [15] Satish S., Raghavendra M. P., Raveesha K. A., “Antifungal potentiality of some plant extracts against Fusarium sp.”, Archives of Phytopathology and Plant Protection , 42(7), 618-625, 2009. [16] Sengupta P., Mukhopadhyay J., “Terpenoids and related compds. VII. Triterpenoids of Phyllanthus acidus”, Phytochemistry, 5(3), 531-534, 1966. [17] Marisa S., Jiraporn O., Roswitha S., Supaporn P., Ana R., Andre S., Tiago G., Chaweewan J., Margarida D. A., Rainer S., et al, “An extract from the medicinal plant Phyllanthus acidus and its isolated compounds induce airway chloride secretion: A potential treatment for cystic fibrosis.”, Molecular pharmacology, 71(1), 366-376, 2007. [18] Ultee A. J., “The phytosterol of Phyllanthus acidus Skeels”, Pharmaceutisch Weekblad, 70, 1173-1175, 1933. 18 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Huệ [19] Vongvanich N., Kittakoop P., Kramyu J., Tanticharoen M., Thebtaranonth Y., “Phyllanthusols A and B, cytotoxic norbisabolane glycosides from Phyllanthus acidus skeel”, Journal of Organic Chemistry, 65(17), 5420-5423, 2000. [20] Wenkert E., Baddeley G. V., Burfitt I. R., Moreno L. N., “Carbon – 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Naturally – occurring Substances LVII. Triterpenes Related to Lupane and Hopane”, Organic Magnetic Resonance, 11(7), 337-343, 1978. Tài liệu tham khảo tiếng việt [21] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đảm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Như, Nguyễn Tập, Trần Toàn, “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, NXB. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tập 1, 460-461, 2004. [22] Đỗ Tất Lợi, “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học, 515-516, 2004. [23] Phạm Hoàng Hộ, “Cây cỏ Việt Nam”, quyển II, NXB trẻ, 190, 2003. 19 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất T1A trong dung môi CDCl3. 0. 0 0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 1. 0 1. 2 1. 4 1. 6 1. 8 2. 0 2. 2 2. 4 2. 6 2. 8 3. 0 3. 2 f1 (p pm ) 0.95 1.02 3.21 3.37 3.32 3.16 2.88 3.04 3.00 1.00 0.747 0.767 0.858 0.863 0.875 0.897 0.929 0.941 0.962 1.003 1.141 1.259 1.279 1.294 1.307 1.333 1.708 1.734 1.766 1.781 1.813 1.837 1.851 1.866 2.043 2.169 3.172 3.183 3.195 3.205 T1 A- CD CL 3- 1H 26 0. 75 0. 85 0. 95 1. 05 1. 15 f1 (p pm ) 3.21 3.37 3.32 3.16 2.88 3.04 3.00 0.747 0.767 0.858 0.863 0.875 0.897 0.929 0.941 0.962 1.003 1.141 3 25 24 30 28 23 29 27 27 Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất T1A trong dung môi CDCl3. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 f1 (p pm ) 13.32 14.20 15.28 16.03 17.59 17.87 17.96 18.12 20.70 21.29 27.26 27.88 28.21 29.37 29.69 31.07 32.06 35.18 37.02 37.29 38.41 38.45 38.88 40.75 42.04 50.13 54.03 55.72 79.36 T1 A- CD CL 3- 13 C 5 18 9 22 19 4 3 1 7 10 208 12 141 7 2 1 228 162 4 13 15 30 629 26 1 12 5 23 27 Phụ lục 3. Phổ HSQC của hợp chất T1A trong dung môi CDCl3. -0 .6 -0 .4 -0 .2 0. 0 0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 1. 0 1. 2 1. 4 1. 6 1. 8 2. 0 2. 2 2. 4 2. 6 2. 8 3. 0 3. 2 3. 4 f2 (p pm ) 20 30 40 50 60 70 80 f1 (ppm) T1 A- CD CL 3- HS QC 3 3 27 27 27 Phụ lục 4. Phổ HMBC của hợp chất T1A trong dung môi CDCl3. -0 .4 -0 .2 0. 0 0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 1. 0 1. 2 1. 4 1. 6 1. 8 2. 0 2. 2 2. 4 2. 6 2. 8 3. 0 3. 2 f2 (p pm ) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 0 11 0 12 0 f1 (ppm) T1 A- CD CL 3- HM BC 27 27 3 24 23 324 5 189 Phụ lục 5. Phổ 1H-NMR của hợp chất CRT3A trong dung môi CDCl3. 0. 4 0. 6 0. 8 1. 0 1. 2 1. 4 1. 6 1. 8 2. 0 2. 2 2. 4 2. 6 2. 8 3. 0 3. 2 3. 4 3. 6 3. 8 4. 0 4. 2 4. 4 4. 6 4. 8 5. 0 f1 (p pm ) 3.82 3.76 5.36 4.60 5.57 9.16 5.40 3.34 2.29 0.92 1.00 0.799 0.874 0.933 0.957 1.026 1.072 1.254 1.684 2.356 2.371 2.379 2.389 2.395 2.402 2.411 2.418 2.427 2.453 2.468 2.473 2.488 2.500 2.504 2.512 2.519 2.527 2.534 4.571 4.573 4.576 4.689 4.694 CR T3 A- CD CL 3- 1H 4. 5 4. 6 4. 7 4. 8 f1 (p pm ) 0.92 1.00 4.571 4.573 4.576 4.689 4.694 29 0. 75 0. 80 0. 85 0. 90 0. 95 1. 00 1. 05 1. 10 f1 (p pm ) 3.82 3.76 5.36 4.60 5.57 9.16 0.799 0.874 0.933 0.957 1.026 1.072 29 29 30 29 26 23 25 27 28 24 Phụ lục 6. Phổ 13C-NMR của hợp chất CRT3A trong dung môi CDCl3. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 0 11 0 12 0 13 0 14 0 15 0 f1 (p pm ) 15.933 16.123 18.161 19.800 21.189 21.616 26.618 26.797 27.575 29.852 29.979 33.710 34.316 35.668 38.314 39.765 40.124 48.037 48.314 49.829 55.042 109.483 151.051 CR T3 A- CD CL 3- 13 C 20 29 Phụ lục 7. Phổ 13C-NMR dãn rộng của hợp chất CRT3A trong dung môi CDCl3. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 f1 (p pm ) 14.660 15.933 16.123 18.161 19.800 21.189 21.616 25.262 26.618 26.797 27.575 29.852 29.979 33.710 34.316 35.668 38.314 39.765 40.124 43.043 48.037 48.314 49.829 55.042 CR T3 A- CD CL 3- 13 C l 5 9 18 24 19 17 21 15 14 12 3 11 30 1 8 2 6 22 28 26 13 25 16 27 7 2 3 10 4