Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cây chùm ruột Phyllanthus acidus (L.) Skeels từ cao ethyl acetate thu hái ở tỉnh Bình Thuận

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS (L.) SKEELS TỪ CAO ETHYL ACETATE THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN Sinh viên thực hiện : NGUYỄN ĐÌNH PHƯỚC Giáo viên hướng dẫn : TS. BÙI XUÂN HÀO MSSV: K38.201.091 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC – BỘ MÔN HÓA HỮU CƠ TP. Hồ Chí Minh, 2016 Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước Hình 1.1: Thân và quả cây chùm ruột CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU 1.1.1 Giới thiệu về cây chùm ruột Phyllanthus acidus Thuộc họ Thầu dầu – Euphorbiaceae, chi Phyllanthus. Tên khoa học: Phyllanthus acidus (L.) Skeels. Tên thông thường: Cây chùm ruột, cây tầm ruột. Phân bố phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trong đó có Việt Nam. 1.1.2 Đối tượng nghiên cứu Trong nghiên cứu này, đối tượng nghiên cứu là cây chùm ruột Phyllanthus acidus (L.) Skeels (Euphorbiaceae) được thu hái ở huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận. 1.1.3 Mô tả thực vật Ở Việt Nam, một số cây thuộc chi Phyllanthus có trong danh mục từ điển cây thuốc Việt Nam. Theo Phạm Hoàng Hộ, Đỗ Tất Lợi, Đỗ Huy Bích và cộng sự, chùm ruột là loại cây nhỏ, cao 3-5 m, thân nhẵn, cành có vỏ màu xám nhạt, cành non màu lục nhạt, nhẵn; cành già màu xám có nhiều vết sẹo do lá rụng để lại. Lá chùm ruột thuộc loại lá kép, mọc so le, cuống dài, lá chét mỏng, mềm, dài 4-5 cm, rộng 18-20 mm. Gốc lá bầu, tròn, phần đầu phiến lá nhọn, mặt dưới màu xám nhạt, gân lá rõ ở cả hai mặt. Cụm hoa mọc ở kẽ những lá đã rụng thành xim, dài 6-15 cm, cuống mảnh có cạnh; hoa nhỏ màu đỏ, hoa cái và hoa đực ở cùng một cây; hoa đực có đài 4 răng, 4 nhị, rời; hoa cái có 4 lá đài, bầu 4 ô, hoa mọc thành cụm từ 4-7 hoa ở mỗi mấu tròn. Quả chùm ruột mọng, có - 1 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước khía, 4 mảnh, đường kính khoảng 5 mm, cuống quả dài khoảng 7 mm. Khi quả chín có màu vàng nhạt, vị chua, hơi ngọt, ăn được.[32-34] 1.1.4 Một số ứng dụng của cây chùm ruột Phyllanthus acidus trong y học Theo Đỗ Tất Lợi, Đỗ Huy Bích và cộng sự, trong y học cổ truyền các nước, những bộ phận khác nhau của cây chùm ruột được dùng làm thuốc chữa các bệnh ngoài da, như lá được dùng nấu nước tắm chữa lở ngứa và mề đay. Vỏ thân cây chùm ruột được dùng để tiêu hạch độc, ung nhọt, tiêu đờm trừ tích ở phổi, dùng bôi ngoài, chữa ghẻ, loét, vết thương sứt da chảy máu; ngậm chữa đau răng, đau họng. Bột vỏ thân ngâm giấm, uống chữa bệnh trĩ. Rễ và vỏ cây chùm ruột có độc, người Malaysia dùng đun sôi, xông hít chữa ho và nhức đầu hay được người dân đảo Giava dùng chữa hen suyễn (dùng lượng rất nhỏ). Vỏ rễ sắc đặc hoặc ngâm rượu, bôi chữa vảy nến (Psoriasis).[32-33] 1.2 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI CÂY THUỘC CHI PHYLLANTHUS Cây chùm ruột thuộc chi Phyllanthus từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền các nước để điều trị bệnh về thận, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng đường ruột, bệnh tiểu đường và viêm gan siêu vi B. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học trên cao chiết các bộ phận của cây chùm ruột cũng khá phổ biến như hoạt tính kháng khuẩn (Menlendez và cộng sự, 2006),[18] kháng nấm (Satish và cộng sự, 2009),[24] kháng ký sinh trùng giun đũa trên thực vật (Mackeen và cộng sự, 1997),[17] bệnh sơ nang (Sousa và cộng sự, 2007),[28] chữa trị tổn thương gan (Nilesh và cộng sự, 2011),[10] giảm nhẹ mỡ ở các mô, tạng, giảm lipid trong huyết thanh và trong gan của chuột lang trong 6 tuần (Chongsa và cộng sự, 2014).[5] Ngoài ra, các hợp chất thuộc khung sườn norbisabolane chỉ được thử nghiệm độc tính tế bào và kháng virus viêm gan siêu vi B (Lv và cộng sự, 2014; Vongvanich và cộng sự, 2000).[16][30] 1.2.1 Độc tính tế bào Nhiều công trình nghiên cứu gần đây nhất cho thấy cao chiết từ các loài thuộc chi Phyllanthus như Phyllanthus amarus, Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus watsonii, Phyllanthus emblica có độc tính đối với các dòng tế bào ung thư, - 2 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước bao gồm ức chế sự xâm lấn, di căn và kích hoạt sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) (Tang và cộng sự, 2011).[29] Năm 2011, các nghiên cứu của Lee và cộng sự cho thấy cao chiết của bốn loài, gồm Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus watsonii và Phyllanthus amarus đều có tác dụng ức chế sự di căn của dòng tế bào ung thư phổi A549 và dòng tế bào ung thư vú MCF-7, bằng cách kích hoạt quá trình apoptosis (Lee và cộng sự, 2011).[14] IC50 của cao chiết methanol của các loài trên có giá trị khoảng 50-180 µg/ml, và của cao chiết nước khoảng 65-470 µg/ml. Trong thành phần cao chiết, các hợp chất polyphenol giữ vai trò quan trọng trong sự ức chế xâm lấn, di chuyển và gắn bám của các tế bào ung thư. Năm 2013, Sumalatha đã công bố cao chiết ethanol của loài Phyllanthus emblica có tác dụng chống oxy hoá và có hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư tá tràng HT-29 (Sumalatha, 2013).[27] Ngoài ra, cao chiết polyphenol của loài này còn cho thấy vai trò của nó trong việc ức chế sự phân bào và kích hoạt quá trình apoptosis ở tế bào ung thư cổ tử cung (Zhu và cộng sự, 2013).[31] Nhiều thử nghiệm độc tính tế bào in vitro của các loại cao chiết từ các bộ phận của cây chùm ruột và của các hoạt chất tinh khiết cô lập được trên các dòng tế bào ung thư, bao gồm tế bào ung thử phổi NCI-H460, ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7, tế bào ung thư gan HepG2. 1.2.2 Tác dụng ức chế kí sinh trùng Tác dụng kháng ký sinh trùng của chi Phyllanthus vẫn chưa được nghiên cứu nhiều. Mặc dù vậy, nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều loài thuộc chi Phyllanthus có tác dụng rất hiệu quả lên ký sinh trùng. Năm 2011, nghiên cứu của Ajala và cộng sự cho thấy cao chiết của loài P. amarus có tác động kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium yoelii in vivo trên chuột Swiss (Ajala và cộng sự, 2011).[3] Tác động kháng ký sinh trùng này của loài P. amarus tương đương với thuốc kháng ký sinh trùng tiêu chuẩn khi dùng ở liều 1600 mg/kg thể trọng chuột/ngày. Một nghiên cứu khác trên ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum kháng thuốc chloroquine cho thấy cao chiết nước và cồn của loài P. amarus ức chế mạnh ký sinh trùng này ở mức độ in vitro với giá trị IC50 là 11.7 µg/ml (Opong). Một nghiên cứu cho thấy cao chiết nước từ loài P. niruri có tác dụng làm tê liệt và chết sán bao tử (Paramphistomes) ở động vật nhai lại theo thứ tự khoảng 2 giờ và 4 giờ - 3 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước ở nồng độ 10 mg/ml (Jahan và cộng sự, 2013).[9] Ngoài ra, cao chiết từ chùm ruột có thể kháng ký sinh trùng giun đũa trên thực vật (Mackeen và cộng sự, 1997).[17] Các kết quả này cho thấy, chi Phyllanthus có thể là nguồn dược liệu chứa các hợp chất kháng nhiều loài ký sinh trùng. 1.2.3 Hoạt tính kháng khuẩn Các bệnh về nhiễm khuẩn đang gây nhiều vấn đề nghiêm trọng đối với sức khỏe con người. Escherichia coli (E. coli) là những vi khuẩn thường trú chính trong đường ruột của người và động vật, nhưng một số chủng E. coli lại có khả năng gây tiêu chảy nặng và nhiều bệnh ngoài đường ruột như viêm đường tiểu, nhiễm trùng máu. E. coli có liều gây bệnh thấp và lây truyền qua đường phân – miệng. Trên thế giới đã có nhiều dịch tiêu chảy do E. coli gây bệnh gây nên và dẫn đến nhiều thương vong. Theo nghiên cứu GEMS (Global Enteric Multi-Center Study), thì các chủng E. coli gây bệnh là một trong bốn tác nhân chính gây tiêu chảy ở Châu Phi và Nam Á. Trong đó, tỉ lệ thương vong cao nhất đối với EPEC (enteropathogenic E. coli) và ETEC (enterotoxigenic E. coli) (Kapper và cộng sự, 2004).[11] Bệnh lỵ trực trùng (bacilli dysentery), một trong vấn đề về sức khỏe đang được quan tâm trên toàn cầu, bệnh do nhiễm trùng đường tiêu hóa với những triệu chứng đặc trưng như sốt, đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy (đi phân lỏng kèm máu và dịch nhầy). Trực trùng Shigella được xác định là nguyên nhân chính gây bệnh. Bệnh lỵ trực trùng có khả năng lây lan cao từ người sang người qua đường phân – miệng, nguồn nước hoặc thực phẩm nhiễm Shigella. Trong tổng số các ca bị bệnh tiêu chảy trên toàn thế giới, có khoảng 5-10% ca nhiễm được xác đinh do trực trùng Shigella gây ra. Cùng với đó, theo ước tính của Tổ chức y tế thế giới (WHO) năm 1999, số ca nhiễm Shigella chiếm đến 164.7 triệu mỗi năm tại các quốc gia đang phát triển với gần 1.1 triệu ca tử vong và hơn 1.5 triệu ca nhiễm hằng năm tại các quốc gia phát triển, trong đó có 61% các ca tử vong là trẻ em dưới 5 tuổi (Kotloff và cộng sự, 1999).[12] Cũng theo một báo cáo gần đây của Trung tâm nghiên cứu bệnh truyền nhiễm (CDC) - Mỹ, tỉ lệ nhiễm Shigella đến 7.6 ca trong tổng số 100 000 trong năm 1993. - 4 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước Các loại kháng sinh tổng hợp thường được sử dụng để đối phó với các bệnh nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, hơn 50% các loại thuốc hiện nay đang được sử dụng vẫn có nguồn gốc từ thiên nhiên (Sharmin và cộng sự, 2015).[26] Việc lạm dụng kháng sinh tổng hợp đang gây ra tình trạng kháng đa kháng sinh ở nhiều chủng vi khuẩn cũng như gây ra nhiều tác dụng phụ khác. Việc sử dụng các loài thảo dược được xem là một trong những phương pháp thay thế để đối phó với tình trạng kháng đa kháng sinh của vi khuẩn. Ngoài ra việc sử dụng các loài thảo dược còn làm giảm tác dụng phụ, không có hoặc rất ít độc tính, chi phí thấp hơn (Sharmin và cộng sự, 2015).[26] Cây chùm ruột hiện đang được sử dụng trong y học cổ truyền ở nhiều quốc gia như các chất kháng sinh và kháng oxy hóa. Nghiên cứu của Eldeen và cộng sự (2011), cho thấy các loài thuộc chi Phyllanthus thu thập ở Malaysia có khả năng kháng lại nhiều chủng vi khuẩn gram âm và gram dương như Escherichia coli, Staphylococcus aures, Bacillus licheniformis, Pseudomonas stutzeri (Eldeen và cộng sự, 2011).[8] Một số nghiên cứu của Mensah và cộng sự (1990), cho thấy các loài P. muellerianus và P. discoideus có tiềm năng lớn trong việc sử dụng như là một chất kháng khuẩn (Mensah và cộng sự, 1990).[18] Ở Việt Nam, chùm ruột cũng được sử dụng trong một số bài thuốc dân gian để trị các bệnh nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, các nghiên cứu chi tiết hơn về hoạt tính của loài này cũng như khả năng kháng khuẩn của nó vẫn chưa nhiều. 1.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS 1.3.1 Những nghiên cứu trên thế giới Một số nghiên cứu hoá thực vật trên cây chùm ruột được thực hiện khá sớm và chỉ công bố sự cô lập của các triterpene và phytosterol (Dekker, 1908; Sengupta và Mukhopadhyay, 1966; Pettit và cộng sự, 1982).[3][6][25] Các hợp chất triterpene đã được cô lập thuộc khung oleane như β-amyrin (22), khung lupane như lupeol (23) và khung cyclopropyl-hexacyclic triterpenoid như phyllanthol (24). Trong khi đó, các hợp chất sterol chủ yếu có khung sitosterol và các glycoside của chúng. - 5 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước Những nghiên cứu trong khoảng 15 năm gần đây trên các loài thuộc chi Phyllanthus đã công bố sự cô lập của một nhóm các hợp chất norbisabolane sesquiterpenoid, với hoạt tính sinh học của chúng khá đa dạng (Lv J.-J. và cộng sự, 2014; Vongvanich và cộng sự, 2000).[16][30] Năm 2000, hai hợp chất Phyllanthusol A (2) và B (3) đã được cô lập, có khung sườn serquiterpenoid loại norbisabolane gắn các phân tử đường glucosyl và mannosamine-N-acetate (Vongvanich và cộng sự, 2000).[30] Tuy nhiên, đến năm 2014, cùng với sự cô lập 19 hợp chất cũng thuộc khung sườn norbisabolane, các hợp chất Phyllanthusol A và B được xác nhận cấu trúc, trong đó hai đơn vị đường là glucopyranosyl và glucosamine-N-acetate. Như vậy, cho đến nay, 21 hợp chất norbisabolane đã được cô lập, với tên gọi tương ứng là phyllanthacidoid A-T (1-21). Trong đó hai hợp chất phyllantacidoid S (20) và T (21) chứa khung sườn rất lạ so với các hợp chất được cô lập trước đây, với hợp phần tricyclo[3.1.1.1] có trong cấu trúc của chúng. Các hợp chất này đã được thử nghiệm hoạt tính kháng virus viêm gan siêu vi B (HBV), với giá trị IC50 trong khoảng 0.8-36.0 µM (Lv J.-J. và cộng sự, 2014).[16] Ngoài ra, các hợp chất phyllanthacidoid cũng được xác định là thành phần chính có trong rễ cây chùm ruột, với hàm lượng khoảng 1 mg/g, tính trên khối lượng rễ chưa khô (Vongvanich và cộng sự, 2000).[30] Quá trình chiết xuất và phân tích hàm lượng của phyllanthacidoid A và B cũng được xác nhận bằng phương pháp điện di (capillary electrophoresis) (Durham D. G. và cộng sự, 2002).[7] Năm 2010, các hợp chất kaemferol (28), adenosine (29), 4-hydroxybenzoic acid (30), hypogallic acid (31), caffeic acid (32) được cô lập từ cao n-butanol của lá cây chùm ruột (Leeya Y. và cộng sự, 2010).[15] Cao n-butanol toàn phần và 5 hợp chất được cô lập đều có khả năng làm giảm huyết áp và giãn cơ vòng ở động mạch chủ. 1.3.2 Những nghiên cứu trong nước Năm 2014, nhóm nghiên cứu Nguyen T.T và cộng sự đã cô lập được các hợp chất phenylbutanoid và diphenylheptanoid, trong đó có một hợp chất diphenylpentanoid mới (Nguyen T. T. và cộng sự, 2014).[20] Cho đến nay, các hợp chất có khung sườn phenylbutanoid và phenylheptanoid chưa được công bố trong chi Phyllanthus. Các hợp - 6 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước chất cô lập gồm glochodinone (25), 4-[4’-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl-2-butanone (26), 1-[4’-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl]-5-[4”-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl]-3- pentanone (27). Năm 2015, trong tóm tắt kết quả nghiên cứu đề tài luận văn Thạc sĩ của Võ Thị Như Thảo, với đề tài : “Nghiên cứu tách chiết và xác định thành phần hóa học của vỏ thân cây chùm ruột Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam trong một số dịch chiết”, tác giả công bố đã thu được một số kết quả như xác định độ ẩm của nguyên liệu bột khô là 8.87%; hàm lượng tro trung bình là 5.00%; định tính được dịch chiết n-hexane có 15 cấu tử hữu cơ thuộc các nhóm hợp chất acid hữu cơ, ester, vitamin, sterol; dịch chiết chloroform có 9 cấu tử hữu cơ thuộc nhóm sterol, acid hữu cơ, ester của acid béo; dịch chiết ethyl acetate có 14 cấu tử hữu cơ thuộc nhóm acid béo, sterol, sesquiterpene....Ngoài ra, tóm tắt luận án cũng công bố thông tin về thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của bột vỏ cây chùm ruột trên hai dòng chủng vi khuẩn là Bacillus subtilis và Klebsiella. Tuy nhiên, công bố của tác giả không cho thấy bất kỳ sự xác định cấu trúc của hợp chất nào cô lập được từ vỏ thân cây chùm ruột ở Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam, và cho đến nay, các kết quả này vẫn chưa được tìm thấy trong các báo cáo khoa học tại Việt Nam. - 7 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước HO H HO (23) (24) HO (22) O O O OOO OHOH R1 OH HO HO O HO O HO HO HN HO R2 O R2 R3 4 H H 5 H OH 8 OH OH 10 OCH3 OH R1 R2 2 H OH 3 H H 7 OH OH 11 OCH3 OH O O O OOO OHOH R1 OH HO HO O HO O HO HO OH HO R2 O O O O HO O OR OHOH H OH 1 R =CH3 2a R = H O HO HO HO HN O O HO HO HO OH N-Ac-GlcN O O O O R3 O O OHOH R2 OH HO HO OR1 HO R1 R2 R3 6 H H OH 9 Glc(2-1)Glc OH OH O O O O OHOH H OH HO HO OR1 HO O O R2 R1 R2 15 N-Ac-GlcN H 16 Glc OH 17 N-Ac-GlcN OCH3 O O O O H OH H OH HO HO OR1 HO O O R2 R1 R2 12.N-Ac-GlcN H 13.N-Ac-GlcN OH 14.Glc OH Glc O O O OR HO HO HO OHOH OH HO O HO O O R 20 N-Ac-GlcN 21 Glc O O O O OHOH H HO HO OR HO O O HO O R 18 N-Ac-GlcN 19 Glc Hình 1.2: Một số hợp chất cô lập được từ cây chùm ruột - 8 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước Hình 1.2: Một số hợp chất cô lập được từ cây chùm ruột (tiếp theo) O HO HO OH O OH H3C O O 28 O O O O HO HO OH OH O OH OH HO HO (25) (26) (27) HO OH O O (28) O N N N N NH2 (29) OH O OH (30) OHO (31) OH HO (32) OH OH OH O OHOH HO HO OH - 9 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước CHƯƠNG 2 : THỰC NGHIỆM 2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 2.1.1 Hóa chất  Silica gel 0.04-0.06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí.  Sắc kí bản mỏng loại Kieselgel 60F 254 (20×20), Merck.  Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: n-hexane, ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol, petroleum ether và nước cất.  Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng là vanillin/H2SO4. 2.1.2 Thiết bị  Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, bình lóng,).  Các cột sắc kí.  Máy cô quay chân không.  Bếp cách thuỷ.  Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.  Cân điện tử.  Các thiết bị ghi phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và 2D- NMR tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 2.3 THỰC NGHIỆM 2.3.1 Thu hái và khảo sát nguyên liệu Cây chùm ruột Phyllanthus acidus được thu hái tại huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận vào tháng 4 năm 2014. Tên khoa học của cây được xác định là Phyllanthus acidus (L.) Skeels. - 10 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước 2.3.2 Quá trình trích ly và cô lập các hợp chất trên cây chùm ruột Nguyên liệu (rễ cây chùm ruột) được sấy khô ở 60oC và xay nhỏ thành bột thô. Sau đó đun hồi lưu trong ethanol ở 80oC trong 30 phút đối với mỗi bình cầu dung tích 1000 ml. Tiến hành lọc bỏ phần rắn, cô quay phần dịch thu được cao 1.0 kg ethanol thô. Cao ethanol thô (0.5 kg) được thực hiện sắc kí cột, giải ly bắt đầu từ hexane : ethyl acetate (95:5) rồi tăng dần độ phân cực lên (80:20), (50:50), (90:10), (0:100), sau đó tiếp tục giải ly bằng ethyl acetate : methanol (50:50), (0:100) thu được các cao tương ứng H1 (2.0 g), H2, H3, H4 (3.4 g), EA1 (67.0 g), EA2 (85.0 g), Me. Cao EA2 thực hiện phương pháp chiết lỏng – lỏng, thu được phần dịch Ea (7.0 g) và phần dịch Me:H2O (70.0 g). Phần dịch Ea thực hiện sắc kí cột và giải ly bằng hệ dung môi C:Me:H2O (4:0.9:0.1), thu được 5 phân đoạn E0.1 – E0.5. Phân đoạn E0.1 (1.16 g) được thực hiện sắc kí cột và giải ly bằng hệ dung môi PE:EA:AcOH (5:1:0.2) thu được 19 phân đoạn E0.1.1 – E0.1.19, sau đó thực hiện sắc kí cột rồi giải ly với với hệ dung môi PE:C:Me (1:8:0.2) trên phân đoạn E0.1.14 (46.0 mg) thu được hợp chất (1) (8.8 mg). Phần dịch Me:H2O hòa với methanol nguyên chất, đun nóng và khuấy đều một thời gian, thấy xuất hiện phần dịch D0 (9.0 g) và phần tủa T, lọc lấy phần dịch D0, thực hiện sắc kí cột và giải ly bằng hệ dung môi H:EA:Me (1:5:0.4) thu được 5 phân đoạn D0.1- D0.5. Từ phân đoạn D0.5 (162.9 mg), tiếp tục thực hiện sắc kí cột và giải ly bằng hệ dung môi C:Me:H2O (4:0.9:0.1) thu được 3 phân đoạn D0.5.1 (47.2 mg), D0.5.2, D0.5.3, thực hiện sắc kí bản mỏng điều chế trên phân đoạn D0.5.1 ta thu được hợp chất (2) (9.6 mg). Dưới đây là sơ đồ khái quát quá trình trích ly và cô lập hợp chất 1-2. - 11 - Sơ đồ 2.1: Quá trình trích ly và cô lập các hợp chất trên rễ cây chùm ruột Rễ chùm ruột Làm sạch, để khô, nghiền nhỏ Bột khô (20.0 kg) Đun hồi lưu trong ethanol ở 80oC trong 30 phút Bỏ phần rắn, cô quay phần dịch Cao ethanol thô (1.0 kg) Phần còn lại Hòa tan một nửa cao thô bằng methanol nóng Phần dịch methanol (300.0 g) Phần bã còn lại (200.0 g) Sắc kí cột Giải li bằng các dung môi khác nhau H1 (2.0 g) H2 H3 H4 (3.4 g) EA1 (67.0 g) EA2 (85.0 g) Me Chiết lỏng – lỏng Dịch Ea (E0) (7.0 g) Dịch Me:H2O (70.0 g) SKC/C:Me:H2O (4:0.9:1) Ngâm dầm với methanol đun nóng E0.1 E0.2 E0.3 E0.4 E0.5 Tủa T D0 (9.0 g) (1.16 g) (933.8 mg) (350.0 mg) (260.0 mg) (180.0 mg) SKC/H:EA:Me (1:5:0.5) SKC/PE:EA:AcOH (5:1:0.2) E0.1.1-E0.1.13 E0.1.14 (46.0 mg) E0.1.15-E0.1.19 D0.1-0.4 D0.5 (162.9 mg) SKC/PE:C:Me (1:8:0.2) SKC/C:Me:H2O (4:0.9:0.1) (1) (8.8 mg) D0.5.1 (47.2 mg) D0.5.2 D0.5.3 Sắc kí bản mỏng điều chế (2) (9.6 mg) - 12 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN Từ cây chùm ruột Phyllanthus acidus, đã cô lập được 2 hợp chất là (1) và (2). Cấu trúc hóa học của các hợp chất (1) và (2) được biểu diễn trong hình OH HO 3 1 10 9 11 1320 17 15 5 7 18 16 19 A B C Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của 1-2 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT (1) Hợp chất (1) được cô lập từ phân đoạn E0.1.14 của cao ethyl acetate.  Có dạng bột màu trắng.  Hiện hình với thuốc thử vanillin/H2SO4 cho vết màu tím, với đèn UV thấy vết màu tím sáng rõ.  Phổ 1H-NMR được trình bày ở Phụ lục 1.1.  Phổ 13C-NMR được trình bày ở Phụ lục 1.2.  Phổ HMBC được trình bày ở Phụ lục 1.4.  Phổ NOESY được trình bày ở Phụ lục 1.5. Phổ 13C-NMR (Bảng 3.1) cho thấy sự xuất hiện của 20 tín hiệu carbon, có 5 tín hiệu carbon Csp2 tứ cấp [δC (119.0, 125.3, 139.2, 147.9, 151.9)], 2 tín hiệu carbon Csp3 tứ cấp (δC 38.8) và 1 carbon của nhóm methine liên kết với dị tố oxygen (δC 78.9). O O HO OH HO O OHCH3 1 3 5 7 1' 3' 5' 1'' 9 10 A B C - 13 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước Phổ 1H-NMR (Bảng 3.1) cho thấy sự hiện diện của 1 proton thơm H-11 [δH 6.67 (1H, s)] và 3 proton olefin là H-15 [δH 6.57 (1H, dd, 17.5 Hz, 11.0 Hz)], H-16a [δH 5.53 (1H, dd, 11.0 Hz, 2.5 Hz)] và H-16b [δH 5.16 (1H, dd, 17.5 Hz, 2.5 Hz)], phân tích sự chẻ mũi của các proton H-15, H-16a và H-16b, giúp xác định (1) có chứa nhóm vinyl (CH2=CH-). Mặc khác, phổ 1H-NMR còn cho thấy 1 nhóm methyl liên kết với nhân thơm H3-17 [δH 2.18, (3H, s)], 3 nhóm methyl mũi đơn H3-18, H3-19 và H3-20 [δH 1.06 (3H, s), 0.83 (3H, s) và 1.20 (3H, s)], 1 nhóm oxygen methine H-3 [δH 3.29 (1H, dd, 11.5 Hz, 4.5 Hz)], 4 nhóm methylene H2-1 [δH 2.23 (1H, m) và 1.75 (1H, m)], H2-2 [δH 1.80 (2H, m)], H2-6 [δH 1.89 (1H, ddt, 13.5 Hz, 7.5 Hz, 1.0 Hz) và 1.67 (1H, ddd, 13.5, 11.5, 6.0)] và H2-7 [δH 2.78 (1H, ddd, 17.5 Hz, 6.0 Hz, 1.0 Hz) và 2.57 (1H, ddd, 17.5 Hz, 11.5 Hz, 7.5 Hz)]. Phổ HMBC cho thấy proton H-3 tương quan C-4, C-18 và C-19, các proton H3-18 và H3-19 cùng cho tương quan với C-3 và C-4 giúp xác định vị trí lân cận của chúng trên nhân A. Các proton H3-17 và H2-16 cùng cho tương quan HMBC với C-14 giúp xác định vị trí của chúng trên cấu trúc của hợp chất (1). Mặc khác H3-17 và H-11 cùng cho tương quan HMBC với C-12 giúp xác định vị trí lân cận của H-11, 12-OH và H3-17. Các tương quan HMBC còn lại giúp xác định toàn bộ cấu trúc của (1). Trên phổ NOESY cho thấy tương quan của proton H-3 với H-5 và H3-18 giúp xác định cấu hình lập thể của tâm bất đối của carbon C-3. Đồng thời proton H2-16 cho tương quan NOESY với H3-17 giúp xác định được cấu trạng s-trans của nhóm vinyl với nhân C. Dựa vào sự phân tích dữ liệu phổ trên, so sánh các dữ kiện phổ của hợp chất (1) với các dữ liệu phổ của hợp chất spruceanol đã được công bố (Bảng 1) thấy có sự tương hợp, đồng thời tương quan thu nhận được từ các phổ hai chiều như HSQC, HMBC và NOESY của (1) đều phù hợp với cấu trúc của hợp chất spruceanol, do đó cấu trúc của hợp chất (1) được đề nghị như Hình 3.2.[1] - 14 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước Hình 3.2: Cấu trúc và tương quan HMBC của (1) Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất (1) và spruceanol Vị trí C Hợp chất (1)-CDCl3 Spruceanol Loại C δC ppm δH ppm (J, Hz) δC ppm 1 -CH2- 37.4 2.23 (m) và 1.75 (m) 37.3 2 -CH2- 28.3 1.80 (m) 28.0 3 >CH- 78.9 3.29 (dd, 11.5, 4.5) 78.7 4 >C< 38.8 37.4 5 >CH- 49.3 1.29 (dd, 2.0, 2.0) 49.3 6 -CH2- 19.2 1.89 (ddt, 13.5, 7.5, 1.0) và 1.67 (ddd, 13.5, 11.5, 6.0) 18.7 7 -CH2- 29.8 2.78 (ddd, 17.5, 6.0, 1.0) và 2.57 (ddd, 17.5, 11.5, 7.5) 29.3 8 >C= 125.3 125.2 9 >C= 147.9 147.8 10 >C< 38.8 37.6 11 -CH= 109.5 6.67 (s) 109.7 12 >C= 151.9 152.0 13 >C= 119.0 119.1 14 >C= 139.2 139.2 15 -CH= 135.5 6.57 (dd, 17.5, 11.0) 135.2 16 =CH2 119.7 5.53 (dd, 11.0, 2.5) và 5.16 (dd, 17.5, 2.0) 119.5 17 -CH3 13.0 2.18 (s) 12.8 18 -CH3 28.2 1.06 (s) 28.2 19 -CH3 15.3 0.88 (s) 15.3 20 -CH3 24.8 1.20 (s) 24.8 HO H OH CH2H H H H H HO H OH BA C H H H H H HH H H HO H OH A B C A B C a b 3 1 5 19 2 10 4 9 1 5 4 6 7 4 1410 20 10 4 12 13 14 17 1615 10 - 15 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT (2) Hợp chất (2) được cô lập từ phân đoạn D0.5.1 của cao ethyl acetate:  Có dạng bột vô định hình, màu cam.  Hiện hình với thuốc thử vanillin/H2SO4 cho vết màu tím, soi UV thấy vết màu tím sáng rõ.  Phổ 1H-NMR được trình bày ở Phụ lục 2.1.  Phổ 13C-NMR được trình bày ở Phụ lục 2.2.  Phổ HMBC được trình bày ở Phụ lục 2.4. Phổ 13C-NMR (Bảng 3.2) cho thấy sự xuất hiện của 17 tín hiệu carbon, có 7 carbon Csp2 tứ cấp, trong đó có 1 tín hiệu carbon carbonyl (δC 197.9) (C-4), 4 carbon thơm tứ cấp liên kết trực tiếp với oxygen (δC 157.6, 157.5, 156.3 và 155.4) và 2 carbon thơm tứ cấp khác (δC 129.4 và 101.7). Ngoài ra, phổ 13C-NMR cho thấy 2 carbon của nhóm methine thơm (δC 128.1 và 115.4), 1 carbon của nhóm methoxy (δC 60.1) và 1 nhóm methylene (δC 41.8). Từ dữ liệu phổ 13C-NMR, kết hợp với tài liệu tham khảo, cho phép dự đoán (2) là có khung sườn flavanone, có mang nhóm thế methoxy (-OCH3). Phổ 1H-NMR (Bảng 3.2) cho thấy sự xuất hiện của một nhóm -OH kiềm nối (δH 13.06) đặc trưng cho nhóm 5-OH của nhân A. Mặc khác trên nhân A không có tín hiệu cộng hưởng của các nhóm methine và các carbon C-5, C-7 và C-9 đều chuyển dịch về vùng từ trường thấp chúng tỏ các vị trí này đều liên kết trực tiếp với oxygen. Trên nhân B có tín hiệu của hai mũi cộng hưởng của proton thơm H-1’/6’ [δH 7.40 (1H, d, 8.0 Hz)] và H-3’/5’ [δH 6.75 (2H, d, 8.0 Hz)] ghép ortho với nhau, ngoài ra, dựa vào độ chuyển dịch hóa học của các proton này, giúp xác định cấu trúc của nhân B. Trên phổ HMBC (Hình 3.4), H-2 [δH 5.53 (1H, dd, 11.0 Hz, 3.5 Hz)] cho tương quan với C-1’ và C-4. Proton H2-3 cho tương quan với C-1’, C-4 giúp xác định được cấu trúc nhân C của (2). Từ dữ liệu phổ 13C-NMR, 1H-NMR kết hợp với phổ HMBC, khẳng định (2) có khung sườn flavanone, mang 1 nhóm thế -OCH3, còn lại là các nhóm -OH. - 16 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước Hình 3.3: Hai cấu trúc có thể có của (2) (2a) (2b) Dữ liệu phổ HMBC chưa giúp xác định được vị trí nhóm methoxy -OCH3 trên nhân A được, so sánh các dữ liệu phổ 13C-NMR của (2) với các flavanone có trong tài liệu tham khảo (Bảng 3.3) giúp xác định vị trí nhóm -OCH3 ở C-8 (Hình 3.3).[22] Trên phổ 1H-NMR còn 1 tín hiệu nhóm -OH kiềm nối (δH 12.29), nên hợp chất (2) có thể tồn tại hai cấu trúc có thể có (Hình 3.3). Chúng tôi chưa thể có dữ liệu khối phổ để khẳng định cấu trúc của (2). O O HO OH HO O OHCH3 1 3 5 7 1' 3' 5' 9 10 1'' OH O HO OH HO O OHCH3 1 3 5 7 1' 3' 5' 9 10 1'' OH - 17 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR và tương quan HMBC của (2) Vị trí C Hợp chất (2) (DMSO-d6) Loại δC ppm δH ppm (J, Hz) HMBC (H → C) 5 -OH 13.06 (s) 9 -OH 12.29 (s) 4’ -OH 9.45 (s) 2 >CH- 78.3 5.53 (dd, 11.0, 3.5) C-4, C-1’ 3 -CH2- 41.8 3.11 (dd 17.5, 11.0) và 2.95 (dd, 17.5, 3.5) C-2, C-4, C-1’ 4 >C= 197.9 5 >C= 155.4 6 >C= 129.4 7 >C= 156.3 8 >C= 129.4 9 >C= 157.5 10 >C= 101.7 1’ >C= 129.4 2’ -CH= 128.1 7.40 (d, 8.0) C-2, C-1’, C-4’ 3’ -CH= 115.4 6.75 (d, 8.0) C-1’, C-2’, C-4’ 4’ >C= 157.6 5’ -CH= 115.4 6.75 (d, 8.0) C-1’, C-6’, C-4’ 6’ -CH= 128.1 7.40 (d, 8.0) C-2, C-1’, C-4’ 1’’ -CH3 60.1 3.63 (s) O O HO OH HO O OHCH3 1 3 5 7 1' 3' 5' 9 10 1'' H H H H H Hình 3.4: Cấu trúc và tương quan HMBC (2) - 18 - Bảng 3.3: Dữ liệu phổ 13C-NMR của (2) và một số hợp chất flavanone đã được công bố (2) Flavanone A (Didyomcarphin) B (Kanakugin) C D E Vị trí carbon O O HO OH HO O OHCH3 1 2 3 4 5 6 7 8 1' 3' 5' 9 10 O O H3CO OH H3CO OH 1 2 3 4 5 6 7 8 1' 3' 5' 9 10 O O H3CO OCH3 H3CO OCH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 3' 5' O O H3CO OH HO OH 1 2 3 4 5 6 7 8 1' 3' 5' 9 10 O O H3CO OH HO H3CO OCH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 3' 5' O OOH HO H3CO OCH3 OCH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 3' 5' δC δC δC δC δC δC 4 197.9 198.2 189.6 196.8 198.5 198.1 5 155.4 145.6 152.5 155.0 159.3 159.2 6 129.4 134.0 138.7 129.0 129.5 92.0 7 156.3 151.0 153.4 159.4 160.6 160.9 8 129.4 130.9 141.1 95.1 91.9 129.0 9 157.5 147.6 150.2 157.6 154.4 154.6 10 101.7 104.3 111.6 102.0 102.4 102.2 - 19 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN-KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Trong nội dung khóa luận này, từ cây chùm ruột Phyllanthus acidus thu hái ở tỉnh Bình Thuận, hai hợp chất được cô lập và xác định cấu trúc. Dựa vào các kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều cũng như kết hợp với so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc của các hợp chất đó là spruceanol (1) và 5,6,7-trihydroxy-2-(4’- hydroxyphenyl)-8-methoxychroman-4-one (2) được xác định. Trong đó hợp chất (1) lần đầu được tìm thấy trong chi Phyllanthus với hoạt tính sinh học đã được khảo sát là độc tính tế bào và kháng u và hợp chất (2) được đề nghị là hợp chất mới trong tự nhiên thuộc khung sườn flavanone. Hình 4.1: Cấu trúc hai hợp chất cô lập được từ cao ethyl acetate 4.2 KIẾN NGHỊ Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên cao E0.1.14 và D0.5.1 của cao ethyl acetate. Trong thời O O HO OH HO O OHCH3 1 3 5 7 1' 3' 5' 1'' 9 10 OH HO 3 1 10 9 11 13 19 20 17 15 5 7 18 16 5,6,7-trihydroxy-2-(4’-hydroxyphenyl)-8- methoxychroman-4-one (2) Spruceanol (1) - 20 - Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát các hợp chất còn lại trên cao ethyl acetate ở các phân đoạn khác và cao butanol. Đồng thời chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của hợp chất (2). - 21 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo nước ngoài [1] Agnes B. A., Kathlia A. D. C., Chien-Chang S., Wen-Tai L. and Consolacion Y. R., “Chemical constituents of the bark of Aleurites moluccana L. Willd”, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 6(5):1318-1320, 2014. [2] Ahmed B., Verma A., “Pharmacological and phytochemical review on Phyllanthus species’’, An Indian Journal, 4(1), 5-21, 2008. [3] Ajala T. O., Igwilo C. I., Oreagba I. A., Odeku O. A., “The antiplasmodial effect of the extracts and formulated capsules of Phyllanthus amarus on Plasmodium yoelii infection in mice”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 283-287, 2011. [4] Calixto J. B., Santos A. R. S., Filbo V. C., Yunes R. A., “A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and therapeutic potential”, Med. Res. Rev., 18(4), 225-258, 1998. [5] Chongsa W., Radenahmad N., Jansakul C., “Six weeks oral gavage of a Phyllanthus acidus leaf water extract decreased visceral fat, the serum lipid profile and liver lipid accumulation in middle-aged male rats”, Journal of Ethnophramacology, 396 – 404, 2014. [6] Dekker S., Pharm. Weekbe, 95, 1156, 1908. [7] Durham D. G., Reid R. G., Wangboonskul J., Daodee S., “Extraction of Phyllanthusols A and B from Phyllanthus acidus and analysis by capillary electrophoresis”, Phytochem. Anal., 13, 358-362, 2002. [8] Eldeen I. M. S., Seow E. M., Abdullah R., Sulaiman S. F., “In vitro antibacterial, antioxidant, total phenolic contents and anti-HIV-1 reverse transcriptase of extract of seven Phyllanthus sp”, South African journal of botany, 77: 75 – 79, 2011. [9] Jahan A., Jangde C. R., Khatoon S., Umap S. A., “In vitro antihelmintic activity of Phyllanthus niruri Linn. against Paramphistomes”. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, 5(3), 836-838, 2013. [10] Jain N. K., Singhai A. K., “Protective effects of Phyllanthus acidus (L.) Skeels leaf extracts on acetaminophen and thioacetamide induced hepatic injuries in Wistar rats”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 470 – 474, 2011. [11] Kaper J. B., Nataro J. P., Mobley H. L., “Pathogenic Escherichia coli”, Nature Reviews Microbioy, 2, 123-140, 2004. [12] Kotloff K. L, Winickoff J. P, B. Ivanoff J. D. Clemens D. L., Swerdlow P. J., Sansonetti G. K., Adak M. M. L., “Global burden of Shigella infections: implications for vaccine development and implementation of control strategies”, Bull World Health Organ, 77, 651-666, 1999. [13] Kumar S. C., Bhattacharjee C., Debnath S., Chandu A. N., Kanna K. K., “Remedial effect of Phyllanthus acidus against bleomycin provoked pneumopathy”, Journal of Advanced Pharmceutial Research, 2(1), 317 – 325, 2011. [14] Lee S. H., Jaganath I. B., Wang S. M., Sekaran S. D.,“Antimetastatic Effects of Phyllanthus on Human Lung (A549) and Breast (MCF-7) Cancer Cell Lines”, PLoS ONE, 6(6), e20994, 2011. [15] Leeya Y., Mulvany M. J., Queiroz E. F., Marston A., Hostettmann K., Jansakul C., “Hypotensive activity of an n-butanol extract and their purified compounds from leaves of Phyllanthus acidus (L.) Skeel in rats”, European Journal of Pharmacology, 649, 301-313, 2010. [16] Lv J.-J., Yu S., Wang Y.-F., Wang D., Zhu H.-T., Cheng R.-R., Yang C.-R., Xu M., Zhang Y.-J., “Anti-hepatitus B virus norbisabolane sesquiterpenoids from Phyllanthus acidus and the establishment of their absolute configurations using theoretical calculations”, The Journal of Organic Chemistry, 79(12), 5432-5447, 2014. [17] Mackeen, Muhammad M., Ali Abdul M., Abdullah Mohd A., Nasir Rozita M., Mat Nashriyah B., Razak Abdul R., Kawazu K., “Antinematodal activity of some Malaysian plant extracts against the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus”, Pesticide Science, 51(2), 165-170, 1997. [18] Menléndez P. A.; Capriles V. A., “Antibacterial properties of tropical plants from Puerto Rico”, Phytomedicine: international journal of phytotherapy and phytopharmacology, 13, 272 – 276, 2006. [19] Mensah, J. L., Lagarde I., Ceschin C., Michel G., Gleye J., Fouraste I., “Antibacterial acitivity of leaves of Phyllanthus discoideus”, Journal of Ethanopharmacology, 28, 129 -133, 1990. [20] Nguyen T. T., Duong T. H., Nguyen T. A. T., Bui X. H., “Study on the chemical constituents of Phyllanthus acidus (Euphorbiaceae)”, Journal of Science and Technology, 52(5A), 156-161, 2014. [21] Opong R. A., Nyarko A. K., Dodoo D., Gyang F. N., Koram K. A., Ayisi N. K., “Antiplasmodial activity of extracts of Tridax procumbens and Phyllanthus Amarus in in vitro Plasmodium falciparum Culture Systems”, Ghana medical journal, 45(4), 143-150, 2011. [22] P.K. Agrawal, Carbon-13 NMR of flavanoids, Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, India, 1989. [23] Pettit G. R., Cragg G. M., Gust D., Brown P., Can. J. Chem., 60, 939, 1982. [24] Satish S., Raghavendra M. P., Raveesha K. A., “Antifungal potentiality of some plant extracts against Fusarium sp.”, Archives of Phytopathology and Plant Protection, 42(7), 618-625, 2009. [25] Sengupta, P., Mukhopadhyay J., “Terpenoids and related compds. VII. Triterpenoids of Phyllanthus acidus”, Phytochemistry, 5(3), 531-4, 1966. [26] Sharmin M., Prangan D. B., Laboni P., Fouzia F. K. C., Sarak A., Mrityunjoy A., Tasmina R., Rqashed N, “Study of microbial proliferation and the in vitro antibacterial traits of commonly available flowers in Dhaka Metropolis”, Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 2, 91-97, 2015. [27] Sumalatha D., “Antioxidant and Antitumor activity of Phyllanthus emblica in colon cancer cell lines”, International Journal of current microbiology and applied sciences, 2(5), 189-195, 2013. [28] Supaporn P., Marisa S., Jiraporn O., Roswitha S., Ana R., Andre S., Tiago G., Chaweewan J., Margarida D. A., Shreiber Rainer, et al, “An extract from the medicinal plant Phyllanthus acidus and its isolated compounds induce airway chloride secretion: A potential treatment for cystic fibrosis.”, Molecular pharmacology, 71(1), 366-76, 2007. [29] Tang Y.-Q., Sekaran S. D., Evaluation of Phyllanthus, for Its Anti-Cancer Properties, Prostate Cancer - From Bench to Bedside, Dr. Philippe E. Spiess (Ed.), 978-953-307-331-6, InTech, 2011. [30] Vongvanich N., Kittakoop P., Kramyu J., Tanticharoen M., Thebtaranonth Y., “Phyllanthusols A and B, cytotoxic norbisabolane glycosides from Phyllanthus acidus skeel”, Journal of Organic Chemistry, 65(17), 5420-5423, 2000. [31] Zhu X., Wang J., Ou Y., Han W., Li H., “Polyphenol extract of Phyllanthus emblica (PEEP) induces inhibition of cell proliferation and triggers apoptosis in cervical cancer cells”, European Journal of Medical Research, 18, 46, 2013. Tài liệu tham khảo trong nước [32] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đảm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Như, Nguyễn Tập, Trần Toàn, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tập 1, 460 – 461, 2004. [33] Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 515 – 516, 2004. [34] Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, quyển II, NXB trẻ, 190, 2003. PHỤ LỤC 0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0 f1 (ppm) 3. 72 3. 10 3. 68 1. 66 2. 37 1. 15 1. 47 1. 26 4. 31 1. 32 1. 15 1. 05 1. 08 1. 01 1. 01 1. 00 0. 99 0. 88 3 1. 06 0 1. 20 0 2. 17 2 2. 18 4 2. 57 2 2. 58 8 2. 59 5 2. 75 8 2. 76 9 3. 27 9 3. 28 8 3. 30 2 3. 31 1 5. 14 3 5. 14 8 5. 17 9 5. 18 3 5. 51 5 5. 52 0 5. 53 8 5. 54 2 6. 54 4 6. 56 6 6. 57 9 6. 60 2 6. 66 9 (1)-CDCL3-1H 11 15 16a 16b 3 7a 7b 17 20 18 19 Phụ lục 1.2: Phổ 13C-NMR của hợp chất (1) Phụ l c 1.1: Phổ 1H-NMR của hợp chất (1) 5.25.35.45.55.65.75.85.96.06.16.26.36.46.56.66.7 f1 (ppm) 1. 01 1. 01 1. 00 0. 99 5. 14 3 5. 14 8 5. 17 9 5. 18 3 5. 51 5 5. 52 0 5. 53 8 5. 54 2 6. 54 4 6. 56 6 6. 57 9 6. 60 2 6. 66 9 (1)-CDCL3-1H 11 15 16a 16b Phụ lục 1.1: Phổ 1H-NMR của hợp chất (1) (tiếp theo) 0.800.850.900.951.001.051.101.151.201.251.301.351.401.451.501.551.601.651.701.751.801.851.901.952.00 f1 (ppm) 3. 72 3. 10 3. 68 1. 66 1. 73 0. 90 2. 10 1. 26 0. 88 3 1. 06 0 1. 20 0 1. 29 4 1. 52 2 1. 53 1 1. 67 7 1. 75 3 1. 80 2 1. 87 4 1. 88 9 1. 90 1 1. 91 6 (1)-CDCL3-1H 6a 2 6b1 5 Phụ lục 1.1: Phổ 1H-NMR của hợp chất (1) (tiếp theo) 102030405060708090100110120130140150160 f1 (ppm) 13 .0 12 15 .3 57 19 .2 44 24 .8 08 28 .2 00 28 .2 59 29 .5 92 29 .8 55 37 .4 92 38 .8 34 49 .3 06 78 .9 16 10 9. 54 1 11 9. 01 9 11 9. 53 5 11 9. 72 5 12 5. 32 9 12 5. 33 2 13 5. 57 9 13 7. 70 0 13 9. 26 1 14 7. 98 5 15 1. 97 4 15 6. 19 1 (1)-CDCL3-13C 12 9 15 8 16 11 3 5 1 4,10 2 20 6 19 17 18 7 1314 Phụ lục 1.3: Phổ 13C-NMR của hợp chất (1) 0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0 f2 (ppm) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 f1 (p pm ) (1)-CDCL3-HSQC 11 15 8 13 3 5 1 4,10 2 20 6 19 17 18 7 11 15 16a 16b 3 7a 7b 6a 18 19 2017 6b 5 Phụ lục 1.4: Phổ HSQC của hợp chất (1) Phụ lục 1.3: Phổ HSQC của hợp chất (1) 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0 f2 (ppm) 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 f1 (p pm ) (1)-CDCL3-HMBC Phụ lục 1.4: Phổ HMBC của hợp chất (1) 0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5 f2 (ppm) 0 1 2 3 4 5 6 f1 (p pm ) (1)-CDCL3-NOESY Phụ lục 1.5: Phổ NOESY của hợp chất (1) 2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.010.511.011.512.012.513.013.514.0 f1 (ppm) 1. 03 1. 38 3. 30 1. 00 2. 11 2. 00 0. 88 0. 85 0. 84 2. 93 9 2. 96 7 2. 97 4 3. 08 0 3. 10 3 3. 11 4 3. 63 4 5. 51 3 5. 52 0 5. 53 5 5. 54 2 6. 74 6 6. 76 3 7. 38 9 7. 40 5 9. 45 5 12 .2 91 13 .0 66 (2)-DMSO-1H 2.82.93.03.13.2 f1 (ppm) 1. 03 1. 38 2. 93 2 2. 93 9 2. 96 7 2. 97 4 3. 08 0 3. 10 3 3. 11 4 3. 12 6 3. 13 7 5-OH 4'-OH 2'/6' 3'/5' 2 1'' 3a 3b 3b3a 6.76.86.97.07.17.27.37.47.5 f1 (ppm) 2. 11 2. 00 6. 74 6 6. 76 3 7. 38 9 7. 40 5 2'/6' 3'/5' 5.55.6 f1 (ppm) 1. 00 5. 51 3 5. 52 0 5. 53 5 5. 54 2 2 Phụ lục 2.1: Phổ 1H-NMR của hợp chất (2) -30-20-100102030405060708090100110120130140150160170180190200210220230 f1 (ppm) 41 .8 33 60 .0 56 78 .2 56 10 1. 70 7 11 5. 39 0 12 8. 10 0 12 9. 41 7 15 5. 48 6 15 6. 28 1 15 7. 37 1 19 7. 92 0 (2)-DMSO-13C 4 2'/6' 3'/5' 1'' 2 3 105 7 4'9 Phụ lục 2.2: Phổ 1H-NMR của hợp chất (2) 2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.5 f2 (ppm) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 f1 (p pm ) (2)-DMSO-HSQC 2'/6' 3'/5' 2 1'' 3a 3b 2'/6' 3'/5' 2 3 1'' Phụ lục 2.3: Phổ HSQC của hợp chất (2) 2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.511.512.513.5 f2 (ppm) 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 f1 (p pm ) (2)-DMSO-HMBC Phụ lục 2.4: Phổ HMBC của hợp chất (2)