Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính chống oxi hóa của cao Hexan lá bình bát dây Coccinia grandis (L.)J.Voigt họ Cucurbitaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM KHOA HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC ĐỀ TÀI: CHUYÊN NGÀNH HÓA HỮU CƠ Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Tiến Dũng Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Dân An Tp.HCM, tháng 5- 2013 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy Lê Tiến Dũng đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt trong quá trình làm khóa luận này. Em cũng gởi lời cảm ơn chân thành đến thầy Mai Đình Trị, phòng các chất có hoạt tính sinh học đã giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến giúp em hoàn thành tốt khóa luận này. Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Hóa học, trường Đại học Sư Phạm Tp.HCM đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu giúp em có những kiến thức như một hành trang giúp ích cho việc hoàn thành khóa luận này. Em cũng gởi lời cảm ơn đến các anh chị và các bạn làm đề tài tại phòng các hợp chất có hoạt tính sinh học đặc biệt là các bạn trong lớp cùng làm khóa luận này đã luôn giúp đỡ nhau và góp ý cho em trong suốt quá trình làm khóa luận này. Con gởi lời cảm ơn chân thành đến ba, mẹ, và anh chị đã luôn động viên, hỗ trợ con không những về mặt tinh thần mà lẫn vật chất để con yên tâm hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Tp.Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2013 Nguyễn Thị Dân An MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. 1 MỤC LỤC ...................................................................................................................... 3 DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................................. 5 DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ .................................................................................. 6 DANH MỤC PHỤ LỤC................................................................................................. 7 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................................... 8 LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 10 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................ 11 1.1 Giới thiệu về bình bát dây[1,4] ............................................................................. 11 1.1.1 Đặc điểm thực vật ........................................................................................ 11 1.1.2 Phân bố sinh thái[1,4] ..................................................................................... 13 1.2 Tác dụng dược lý ................................................................................................ 13 1.2.1 Theo y học cổ truyền [1] ............................................................................... 13 1.2.2 Theo y học hiện đại [16] ................................................................................ 14 1.3 Thành phần hóa học của bình bát dây[8] ............................................................. 17 1.4 Hoạt tính chống oxi hóa [3,9,15] ............................................................................ 21 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .................................................................................... 23 2.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ .............................................................................. 23 2.1.1 Hóa chất ....................................................................................................... 23 2.1.2 Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 23 2.2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu .......................................................... 24 2.2.1 Nguyên liệu .................................................................................................. 24 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 24 2.2.2.1 Phương pháp phân lập các chất ............................................................. 24 2.2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hóa học .......................... 24 2.2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH[3,9.15] ..................... 25 2.3 Thực nghiệm ...................................................................................................... 26 2.3.1 Điều chế cao ethanol .................................................................................... 26 2.3.2 Cô lập và tinh chế các hợp chất ................................................................... 27 2.3.3 Sơ đồ phân lâp hợp chất ............................................................................... 30 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 31 3.1 Hợp chất BBH7 ................................................... Error! Bookmark not defined. 3.2 Hoạt tính chống oxi hóa ...................................... Error! Bookmark not defined. CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 35 4.1 Kết luận .............................................................................................................. 35 4.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 36 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 39 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Dây bình bát Hình 1.2 Lá bình bát dây Hình 1.3 Quả bình bát dây Hình 1.4 Hoa bình bát dây DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Kết quả sắc kí cột cao Hexan Bảng 2.2: Kết quả SKC trên phân đoạn H5 Bảng 3.1: Bảng so sánh số liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của DFA V với phổ 1H NMR và 13C NMR của cycloartanol Bảng 3.2: Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH các cao chiết Bình bát dây Sơ đồ 1: Quy trình chiết Sơ đồ 2: Quy trình phân lập các hợp chất DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl3 Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl3 Phụ lục 3: Phổ DEPT của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl3 Phụ lục 4: Phổ HSQC của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl3 Phụ lục 5: Phổ HMBC của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl3 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt H Hexane C Chloroform EA Ethyl acetate EtOH Ethanol MeOH Methanol SKLM Sắc kí lớp mỏng SKC Sắc kí cột NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13) 1H-NMR Hydro (1) Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (1) DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Phổ DEPT HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết δ Chemical shift Độ chuyển dịch hóa học Ppm Part per million Phần triệu Mp Melting point Điểm nóng chảy S Singlet Mũi đơn D Doublet Mũi đôi Dd Double of doublet Mũi đôi đôi J Coupling constant Hằng số ghép spin (M)Hz (Mega) Hertz G Gram Mg Milligram Kg Kilogram LỜI MỞ ĐẦU Từ lâu, chúng ta có nguồn thực vật đa dạng và phong phú trong đó có nhiều loài thực vật có ích như đậu xanh được dùng để thanh nhiệt, giải độc và tiêu khát; gừng có tác dụng ngăn ngừa cơn đau thắt ngực, kích thích tiêu hóa... Ngày nay, với sự phát triển của khoa học và kỹ thuật ngày càng hiện đại . Các nhà khoa học đã quan tâm nhiều đến việc tạo ra các sản phẩm từ thiên nhiên có ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như: y học, dược học, sinh học và nông nghiệp,Bên cạnh đó các nhà hóa học đã tiến hành tách chiết, cô lập, bán tổng hợp ngày càng nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học để tạo ra các sản phẩm từ thiên nhiên để nâng cao chất lượng cuộc sống và không lãng phí nguồn thực vật phong phú. Bình bát dây Coccinia grandis L. thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) là một loại dây leo chúng ra hoa kết trái quanh năm và phân bố rộng rãi ở Việt Nam với những hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, chống oxi hóa, trị bệnh tiểu đường,Ngoài ra, người ta còn sử dụng lá chế biến nhiều loại món ăn khác nhau. Trên Thế giới có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của bình bát dây nhưng ở Việt Nam thì những công trình nghiên cứu về loài cây này có rất ít. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính chống oxi hóa từ cao hexan của lá bình bát dây. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về bình bát dây[1,4] − Tên khoa học: Coccinia grandis (L.) Voigt, thuộc họ Bầu bí ( Cucurbitaceae) − Tên gọi khác: Dây mảnh bát, bình bát dây, mảnh bát. − Tên nước ngoài: Ivy Gourd, Baby Water Melon, Baby Gourd. 1.1.1 Đặc điểm thực vật Cây thảo nhẵn và mảnh, mọc leo cao, đôi khi dài tới 5m hay hơn, tua cuốn đơn. Lá hình 5 cạnh, có răng, rộng 5 – 8 cm, hình tim ở gốc, rất nhẵn, chia 5 thùy tam giác, có mũi nhọn cứng. Hình 1.1 Dây bình bát Hình 1.2 Lá bình bát dây Hoa đực và hoa cái giống nhau, mọc đơn độc hay xếp lại hai cái một ở nách lá, có cuống dài 2cm. Quả hình trứng ngược hoặc thuôn, dài 5cm, rộng 2.5cm, khi chín có màu đỏ và thịt quả đỏ chứa nhiều hạt. Hình 1.3 Quả bình bát dây Hình 1.3 Hoa bình bát dây 1.1.2 Phân bố sinh thái[1,4] Bình bát dây phân bố nhiều ở Ấn Độ, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Malaixia,cũng gặp nhiều ở Châu Phi và Trung Mỹ. Ở Việt Nam bình bát dây mọc chủ yếu ở Quảng Ninh, Nam Hà, Ninh Bình, Thừa Thiên- Huế, Quảng Nam, Khánh Hòa, Lâm Đồng vào tới An Giang. Mọc hoang trên nương rẫy, bờ rào, lùm bụi từ vùng thấp tới vùng cao 1500m. Ra hoa kết quả gần như quanh năm. 1.2 Tác dụng dược lý 1.2.1 Theo y học cổ truyền [1] Lá non và quả dùng làm rau ăn. Ở Campuchia, người ta dùng dịch chiết từ thân cây để trị bệnh đau giác mạc. Ở Ấn Độ, người ta còn dùng cả cây để làm thuốc trị bệnh lậu, dịch lá và rễ dùng trị bệnh đái đường; lá dùng đắp ở ngoài da trị phát ban da, ghẻ lỡ, mụn nhọt, các vết thương và các vết cắn của rắn rết. Ở Inđônêxia, cây còn được dung làm thuốc trị bệnh đậu mùa, đau dạ dày và ruột. Trong dân gian dùng củ ngâm rượu bóp chữa sưng đau hay các khớp bị viêm, hoặc dùng dây bình bát để ngâm. Ngoài ra, lá bình bát dây phối hợp với Bùm sụm, Cỏ mầm trầu, Dền gai, mỗi thứ một nắm sắc uống để trị huyết áp. Coccinia grandis Linn. (Curcubitaceae) là một loại thảo mộc dây leo trồng trên khắp Ấn Độ. Trong y học cổ truyền quả của nó được sử dụng để điều trị bệnh phong, sốt, hen suyễn, viêm phế quản và vàng da. Tóm lại trong y học dân gian thì rễ, lá và trái cây được sử dụng cho nhiều mục đích như trị vàng da, bệnh tiểu đường, chữa lành vết thương, vết loét, đau dạ dày, bệnh ngoài da, sốt, hen suyễn, ho. 1.2.2 Theo y học hiện đại [16] Một số nghiên cứu và bài báo cho thấy bình bát dây Coccinia grandis L. có nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, trị bệnh tiểu đường, hoạt tính chống oxi hóa, chống viêm và giảm đau Hoạt tính kháng khuẩn [5] Cao nước, cao hexan từ lá và cao nước, cao hexane, cao ethyl acetate, cao ethanol của thân bình bát dây Coccinia grandis đã được thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và kết quả thu được là chống lại bốn vi khuẩn gram dương (Bacillus cereus, Corynebacterium bạch hầu, Staphylococcus aureus và Staphylococcus pyogenes) và sáu vi khuẩn gram âm (vi khuẩn Salmonella typhi, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis và Shigella boydii). Trong đó, cao ethanol của thân cây có hoạt tính đối với Pseudomonas aeruginosa trong khi cao ethyl acetate và cao hexan từ thân cây có hoạt tính hơn với vi khuẩn Salmonella typhi và Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus pyogenes, Salmonella typhi và Pseudomonas aeruginosa. Cao ethanol có hoạt tính chống lại vi khuẩn Salmonella typhi và Pseudomonas aeruginosa còn cao nước có hoạt tính chống lại vi khuẩn Shigella boydii. Hoạt tính chống oxy hóa[7] Một thử nghiệm cho thấy cao methanol và bột của lá bình bát dây Coccinia grandis có hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt tính chống loét [11] Cao methanol, cao nước và bột lá của bình bát dây Coccinia grandis L. được thử nghiệm hoạt tính chống loét ở chuột trong đó thì cao methanol và bột lá có hoạt tính còn cao nước hầu như không có. Hoạt tính hạ máu trong mỡ Cao ethanol của Coccinia grandis (L.) Voigt cho thấy hiệu ứng làm giảm đáng kể triglyceride (TG) và cholesterol trong mô hình thử nghiệm ở chuột . Hoạt tính bảo vệ gan[18] Cao diethyl ether của lá bình bát dây Coccinia grandis được thử nghiệm trên chuột có hoạt tính bảo vệ gan chống lại CCl4 gây độc hại gan ở chuột. Hoạt động chống viêm, giảm đau và hoạt động hạ sốt [14] Hoạt tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt của lá bình bát dây Coccinia grandis đã được nghiên cứu ở chuột. Khả năng ức chế enzyme alpha amylase Một nghiên cứu cho thấy cao methanol của lá bình bát dây Coccinia grandis có khả năng ức chế 81,13% hoạt động của enzym alpha amylase và điều này giúp ích trong việc giảm nguy cơ bệnh tiểu đường. Khả năng trị bệnh tiểu đường[13] Cao nước và ethanol của bình bát dây có tác dụng hạ đường huyết. Nó giúp điều hòa lượng đường trong máu. Các hợp chất trong cây ức chế enzyme glucose-6- phosphate hỗ trợ và thúc đẩy một cân bằng giúp cơ thể khỏe mạnh và do đó nó được khuyến khích cho bệnh nhân tiểu đường. 1.3 Thành phần hóa học của bình bát dây[8] Hợp chất đầu tiên được phân lập trong Bình bát dây là C60-polyprenol bởi G. Singh. C60-polyprenol Một số hợp chất được phân lập từ Coccinia indica[16] Một số hợp chất phân lập từ quả Coccinia indica Taraxerone (1) Taraxerol (2) β – carotene (3) Lycopene (4) Cryptoxanthin (5) Apo-6’-lycopenal (6) β- sitosterol (7) Một số hợp chất được chiết tách từ thân và lá Coccinia indica Lupeol (8) β-amyrin (9) β- sitosterol (7) Stigmast -7- en-3-one (10) Heptacosane (11) Một số hợp chất được phân lập từ Coccinia indica bởi Rahman vào năm 1990 như: Aspartic acid (12) Glutamic acid (13) Asparagine (14) Tyrosine (15) 1.4 Hoạt tính chống oxi hóa [3,9,15] Khái niệm về gốc tự do Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi hoạt động sống của con người. Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) . Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O), đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ superoxyde (O2•–) nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl (HO●), hydroperoxyl (HOO●), peroxyl (ROO●), alkoxyl (RO●), lipoperoxyde (LOO•), H2O2 . Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA, gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể . Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như: ung thư, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng. Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay. Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA, RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc. Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng. Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan. Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px),enzyme catalase (CAT) để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis). Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con người. Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 2.1.1 Hóa chất Hạt silica gel cỡ hạt 0.04- 0.06 mm dung cho pha thường. Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien F254 (Merck) dung cho pha thường. Dung môi dung cho quá trình thí nghiệm gồm: − Hexane sử dụng có nhiệt độ sôi 690C. − Chloroform sử dụng có nhiệt độ sôi 620C. − Ethyl acetate có nhiệt độ sôi 770C. − Acetone có nhiệt độ sôi 560C − Methanol có nhiệt độ sôi 640C − Ethanol có nhiệt độ sôi 780C − Nước cất. Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: dung 10% H2SO4/EtOH. 2.1.2 Thiết bị và dụng cụ Đèn UV tử ngoại cầm tay, bước song 254nm và 365nm hiệu UVITEC. Máy cô quay chân không Buchi – 11. Bếp cách thủy Julabo 461 Water Bath. Thiết bị gia nhiệt hồng ngoại hiệu SCHOTT. Cân phân tích AND HR 200. Tủ sấy hiệu Memmert. Máy đánh siêu âm Cột sắc kí đường kính từ 2 – 5.5cm. Các dụng cụ thông thường dùng để trích ly như: bình tam giác, cốc thủy tinh, ống nghiệm, bình cô quay, ống đong, phễu chiết, 2.2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nguyên liệu Lá bình bát dây Coccinia grandis L., thuộc họ Bầu bí ( Cucurbitaceae) được thu hái ở Bến Tre vào tháng 7 năm 2012. Lá tươi sau khi thu hái, loại bỏ những lá sâu bệnh, vàng úa, rửa sạch, để ráo, sấy khô sau đó xay nhuyễn thành bột, được sử dụng cho việc nghiên cứu. 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1 Phương pháp phân lập các chất Sử dụng phương pháp ngâm dầm, trích chiết bằng ethanol để trích ly các hợp chất ra khỏi nguyên liệu. Các cao phân đoạn được điều chế bằng phương pháp trích ly pha lỏng cao ethanol ban đầu với các dung môi có độ phân cực tăng dần: hexan, ethyl acetate, nước. Sử dụng sắc kí cột silica gel pha thường kết hợp với sắc kí lớp mỏng để cô lập các chất tinh khiết. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4/EtOH. 2.2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hóa học Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500MHz), 13C-NMR (125MHz) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, phổ DEPT, phổ HMBC, phổ HSQC, Viện Hóa Học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. Với chất nội chuẩn là CDCl3 . 2.2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH[3,9,15] Hiện nay có rất nhiều phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa: oxigen radical absorbane capacity (ORAC), Total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP), ferrie reducing antioxidant power assay (FRAP), 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl radical scavenging (DPPH), Tuy nhiên ở đây chúng tôi chọn phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH vì những ưu điểm của nó so với các phương pháp khác như sau: - Phương pháp đơn giản, thiết bị yêu cầu không quá phức tạp. - Tiến hành nhanh chóng - Thích hợp nhiều tác nhân chống oxi hóa. Ngoài ra, nó còn được dùng đo tính chống oxi hóa cho các sản phẩm thực phẩm. Marsden Blois là người đầu tiên đặt nền móng cho phương pháp DPPH cách đây gần 50 năm (1958), ở thí nghiệm đầu tiên Blois đã thử hoạt tính chống oxi hóa của amino axit cystein bằng cách dùng DPPH chuẩn độ nó rồi đo độ hấp thu theo thời gian ở bước sóng 517nm. Tên khoa học của DPPH là 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl (2,2 diphenyl- picrylhydrazyl), là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dime hóa như một số gốc tự do khác. N N O2N O2N NO2 . DDPH (1,1-dihenyl-2-picrylhydrazyl) Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử H, nó sẽ chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl). Phản ứng được thực hiện như sau: N N O2N O2N NO2 . + RH N H N O2N O2N NO2 + R . Nguyên tắc hoạt động gốc tự do DPPH. DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517nm. Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Hoạt tính chống oxi hóa của một chất được xác định bằng phương pháp đo phổ UV, sử dụng thuốc thử là DPPH Phản ứng được tiến hành dựa theo trên nguyên lý: DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bước sóng 517nm 2.3 Thực nghiệm 2.3.1 Điều chế cao ethanol Lá bình bát dây được phơi hoặc sấy khô và xay nhuyễn thành bột mịn. Bột lá khô được ngâm dầm bằng ethanol 960 trong 24 giờ. Sau đó lọc lấy dung dịch, cô quay thu hồi dung môi. Tiếp tục thực hiện nhiều lần cho đến khi dịch chiết được nhạt màu dần, cô quay thu được cao ethanol. Cao ethanol sẽ được hòa tan bằng methanol – nước theo tỉ lệ 1:4. Sau đó trích ly pha lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: hexan, ethyl acetate, nước. Quá trình thực hiện theo sơ đồ sau: Sơ đồ 1: Quy trình chiết 2.3.2 Cô lập và tinh chế các hợp chất Trong khóa luận này, chúng tôi khảo sát cao Hexan. Thực hiện SKC cao Hexan (m=171g) trên silica gel với hệ dung môi rửa giải là H:EA lần lượt là Hexan 100%, 100H:1EA, 50H:1EA, 20H:1EA, 10H:1EA, 1H:1EA và EA 100% các phân đoạn giống nhau trên SKLM ( thuốc thử hiện diện là H2SO4 10%/EtOH) gom chung lại được 7 phân đoạn, mã hóa thành H1 – H7. Kết quả được tóm tắt trong bảng 2.1. Bột lá khô 1,4 kg − Ngâm dầm với EtOH 960 − Lọc, cô quay thu hồi dung môi Cao ethanol 300g Cao nước 76,1g Cao ethyl acetate 9,8g Cao hexan 171g − Trích pha lỏng với các dung môi: hexan, ethyl acetate, nước. − Cô quay thu hồi dung môi. Bảng 2.1: Kết quả sắc kí cột cao Hexan Phân đoạn Tên mã hóa Khối lượng (g) Kết quả SKLM Ghi chú 1 H1 112,33g Nhiều vết Không khảo sát 2 H2 13,70g Rõ vết Khảo sát 3 H3 3,93g Nhiều vết Không khảo sát 4 H4 3,90g Nhiều vết Không khảo sát 5 H5 5,20g Rõ vết Khảo sát 6 H6 10,16g Nhiều vết Không khảo sát 7 H7 23,50g Nhiều vết Không khảo sát Khảo sát phân đoạn H5 (5,2g) Phân đoạn H5 được SKC silica gel với hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần: 50H:1EA, 20H:1EA, 10H:1EA, 5H:1EA và cuối cùng là MeOH. Dựa vào SKLM gom các đoạn giống nhau thành 8 phân đoạn được mã hóa thành H5.1 – H5.8. Kết quả được tóm tắt trong bảng 2.2. Bảng 2.2: Kết quả SKC trên phân đoạn H5 Phân đoạn Tên mã hóa Khối lượng (mg) Kết quả SKLM Ghi chú 1 H5.1 380mg Nhiều vết Không khảo sát 2 H5.2 390mg Nhiều vết Không khảo sát 3 H5.3 477,5mg Nhiều vết Không khảo sát 4 H5.4 400mg Nhiều vết Không khảo sát 5 H5.5 250mg Nhiều vết Không khảo sát 6 H5.6 742mg Rõ vết Khảo sát 7 H5.7 960mg Nhiều vết Không khảo sát 8 H5.8 974,6mg Nhiều vết Không khảo sát Khảo sát phân đoạn H5.6 (m=742mg) Phân đoạn này tiếp tục được SKC silica gel pha thường với hệ dung môi H:EA theo tỉ lệ 15H:1EA, 10H:1EA, 7H:1EA và MeOH dựa vào SKLM thu được 3 phân đoạn từ H5.6.1 – H5.6.3. Phân đoạn H5.6.2 (m=199mg) được SKC silica gel pha thường với hệ dung môi H:AC tăng dần độ phân cực theo tỉ lệ 15:1, 10:1, 7:1 và AC100% thì thu được 4 phân đoạn mã hóa thành H5.6.2.1 – H5.6.2.4. Tiếp tục khảo sát H5.6.2.3 (m=103mg) với SKC silica gel pha thường với hệ dung môi H:C theo tỉ lệ 5:1, 3:1 và AC 100% thu được 3 phân đoạn dựa vào SKLM, mã hóa thành H5.6.2.3.1 – H5.6.2.3.3. Phân đoạn H5.6.2.3.2 thu được với m=20mg thực hiện SKLM thì có vết màu nâu đen nhúng vào H2SO4/EtOH và nung với bếp hồng ngoại thì xuất hiện màu xanh lá và kèm theo nhiều vết mờ. Từ đây tiến hành cạo bảng với hệ dung môi H:C tỉ lệ 2:1 thu được hợp chất BBH7 (m=1.5mg). 2.3.3 Sơ đồ phân lâp hợp chất Bột lá khô 1,4 kg − Ngâm dầm với EtOH 960 − Lọc, cô quay thu hồi dung môi Cao ethanol 300g − Trích pha lỏng với các dung môi: hexan, ethyl acetate, nước. − Cô quay thu hồi dung môi. Cao nước 76,1g Cao ethyl acetate 9,8g Cao hexan 171g BBH7 m=1.5mg Phân đoạn H1 m=112.33g Phân đoạn H2 m=13.70g Phân đoạn H3 m=3.93g Phân đoạn H7 m=23.50g Phân đoạn H6 m=10.16g Phân đoạn H5 m=5.20g Phân đoạn H4 m=3.90g SKC silica gel pha thường với hệ dung môi H:EA Sơ đồ 2: Quy trình phân lập các hợp chất CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hợp chất BBH7 Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH, ppm: 3,29 (1H; dd; 5,0 Hz; 10,5 Hz; H-3); 0,96 (3H; s; H-18); 0,33 (1H; d; 4,5 Hz; H-19a); 0,56 (1H; d; 4,5 Hz; H-19b); 0,87 (3H; d; 6,5 Hz; H-21); 0,86 (3H; d; 6,5 Hz; H-26); 0,86 (3H; d; 6,5 Hz; H-27); 0,96 (3H; s; H-28); 0,81 (3H; s; H-29); 0,89 (3H; s; H-30). Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC, ppm: 32,9 (C-1); 30,4 (C-2); 78,8 (C-3); 40,5 (C-4); 47,9 (C-5); 21,1 (C-6); 26,0 (C-7); 47,1 (C-8); 20,0 (C-9); 26,1 (C-10); 26,5 (C-11); 31,9 (C-12); 45,3 (C-13); 48,8 (C-14); 35,6 (C-15); 28,1 (C-16); 52,6 (C-17); 18,0 (C-18); 29,9 (C-19); 36,1 (C-20); 18,3 (C- 21); 36,4 (C-22); 24,1 (C-23); 39,5 (C-24); 28,0 (C-25); 22,5 (C-26); 22,8 (C-27); 25,4 (C-28); 14,0 (C-29); 19,3 (C-30). Hợp chất BBH7 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, cho phản ứng dương tính với thuốc thử đặc trưng của terpenoid. Phổ 1H NMR (phụ lục 1 ) cho thấy tín hiệu của bốn nhóm metyl bậc bốn tại δH [0,96 (3H, s, H-18); 0,96 (3H, s, H-28); 0,81 (3H, s, H-29); 0,89 (3H, s, H-30)], ba nhóm metyl bậc ba δH [0,87 (3H; d; 6,5 Hz; H-21); 0,86 (3H; d; 6,5 Hz; H-26); 0,86 (3H; d; 6,5 Hz; H-27)], hai proton không tương đương đặc trưng của vòng cycloartanol 1 3 5 7 9 10 12 14 17 18 19 20 21 22 26 27 28 29 30 HO cyclopropyl δH [ 0,33 (1H; d; 4,5 Hz; H-19a) và 0,56 (1H, d, 4,5 Hz; H-19b)]. Trên phổ 1H NMR cũng xác nhận sự có mặt của nhóm β-OH gắn trên C-3 tại δH 3,29 (1H; dd; 5,0 Hz; 10,5 Hz; αH-3). Phổ 13C NMR (phụ lục 2) kết hợp kỹ thuật DEPT (phụ lục 3 ) cho thấy BBH7 có 30 carbon trong đó có 7 nhóm -CH3, 12 nhóm -CH2, 6 nhóm -CH, 5 carbon bậc bốn. Sự hiện diện của nhóm carbinol (–CH-OH) được tái khẳng định bởi tín hiệu δC 78,8 trên phổ 13C NMR. Từ các kết quả phổ nêu trên, công thức phân tử của hợp chất BBH7 là C30H52O với độ bất bão hòa là 5. Như vậy BBH7 là hợp chất triterpenoid năm vòng. Phổ HSQC (phụ lục 4 ) cho thấy hai tín hiệu proton ở trường cao δH [0,33 (1H; d; 4,5 Hz; H-19a) và 0,56 (1H; d; 4,5 Hz; H-19b)] gắn trên cùng một carbon bậc hai tại δC 29,9 (C-19). Đồng thời trên phổ HMBC (phụ lục 5) cho thấy proton H-19a tương quan với hai carbon bậc bốn δC [20,0 (C-9) và 26,1 (C-10)] chứng tỏ BBH7 có chứa một vòng cyclopropyl. Điều này chứng tỏ khung cơ bản của BBH7 là cycloartan. Ngoài ra các dữ kiện phổ NMR xác định hợp chất BBH7 chỉ mang 1 nhóm thế -OH cấu hình β trong phân tử. Với những kết quả phân tích phổ nêu trên, kết hợp đối chiếu với số liệu phổ của hợp chất cycloartanol nhận thấy có sự trùng hợp [6] (bảng 3.1). Do đó, hợp chất BBH7 được xác định là 9,19-cyclolanostan-3-ol (cycloartanol). Bảng 3.1: Bảng so sánh số liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của DFA V với phổ 1H NMR và 13C NMR của cycloartanol Vị trí BBH7 (CDCl3) DEPT Cycloartanol (CDCl3) δC, ppm δH, ppm (J, Hz) δC, ppm δH, ppm (J, Hz) 1 32,9 -CH2 32,1 2 30,4 -CH2 30,0 3 78,8 3,29 (1H, dd, 5,0; 10,5) -CH-O 79,0 3,29 (1H, dd, 4,5; 11,5) 4 40,5 >C< 45,5 5 47,9 -CH 52,4 6 21,1 -CH2 22,4 7 26,0 -CH2 26,3 8 47,1 -CH 48,1 9 20,0 >C< 21,3 10 26,1 >C< 26,6 11 26,5 -CH2 27,4 12 31,9 -CH2 30,6 13 45,3 >C< 47,3 14 48,8 >C< 49,0 15 35,6 -CH2 33,1 16 28,1 -CH2 28,4 17 52,6 -CH 52,6 18 18,0 0,96 (3H, s) -CH3 18,2 0,94 (3H, s) 19 29,9 0,33 (1H; d; 4,5) 0,56 (1H; d; 4,5) -CH2 29,2 0,33 (1H, d, 4) 0,54 (1H, d, 4) 20 36,1 -CH 35,7 21 18,3 0,87 (3H; d; 6,5) -CH3 19,5 0,91 (3H, d; 6,6) 22 36,4 -CH2 37,2 23 24,1 -CH2 25,6 24 39,5 -CH2 40,7 25 28,0 -CH 28,2 26 22,5 0,86 (3H; d; 6,5) -CH3 22,8 0,87 (3H; d; 6,6) 27 22,8 0,86 (3H; d; 6,5) -CH3 23,1 0,87 (3H; d; 6,6) 28 25,4 0,96 (3H, s) -CH3 26,2 0,95 (3H, s) 29 14,0 0,81 (3H, s) -CH3 14,2 0,82 (3H, s) 30 19,3 0,89 (3H, s) -CH3 20,2 0,90 (3H, s) 3.2. Hoạt tính chống oxi hóa Bảng 3.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH các cao chiết Bình bát dây Stt Mẫu SC50(µg/ml) Kết quả Ghi chú 1 Chứng (+) 14,78 Dương tính Vitamin C 2 Chứng (−)  Âm tính DMSO 3 BBD-C-H 78,12 Dương tính 4 BBD-C-EA 41,74 Dương tính 5 BBD-C-H2O 113,05 Dương tính CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cao hexan và hoạt chính chống oxi hóa của lá bình bát dây Coccinia grandis L., thuộc họ Cucurbitaceae được thu hái tại tỉnh Bến Tre vào tháng 7 năm 2012. Bằng kỹ thuật SKC silica gel pha thường, SKLM tiến hành với nhiều hệ dung môi khác nhau chúng tôi đã phân lập được hợp chất BBH7. Dựa vào các số liệu phổ 1H- NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và tìm hiểu them trên các tài liệu thì cấu trúc hợp chất được xác định là cycloartanol. Đồng thời tiến hành thử hoạt tính chống oxi hóa của các cao hexan, ethyl acetate, nước bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH kết quả thu được là cao ethyl acetate có hoạt tính chống oxi hóa mạnh hơn cao hexan và cao nước của lá bình bát dây. 4.2 Kiến nghị Bình bát dây chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam nhưng qua những tài liệu tham khảo thì bình bát dây có nhiều hoạt tính như chống oxi hóa, ức chế alpha amylase, trị bệnh tiểu đường Và để có những nhận định tổng quan hơn về bình bát dây cần có những hướng nghiên cứu như: Tiếp tục khảo sát thành phần hóa học của các phân đoạn và cao còn lại từ lá bình bát dây và khảo sát thành phần hóa học của các chất cô lập được. Ngoài ra, có thể khảo sát thành phần hóa học từ thân, quả của bình bát dây. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Võ Văn Chi, Trần Hợp (1999), Cây cỏ có ích ở Việt Nam Tập 2, NXB Giáo dục, 170-171. 2. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 3. Lê Thanh Tâm (2010), Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của một số hợp chất Lignan và Stilbene, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Luận văn thạc sĩ, 3-7. Tài liệu nước ngoài 4. Aggarwal Ashish S, Suralkar Ujwala R, Chaudhari Sugandha G, Deshpande SV2, Garud Aniket A, Talele Sandeep G (2011), “Analgesic and antipyretic activity of methanolic extract of Coccinia grandis L. leaves in experimental animals”, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 2(4), 175 – 182. 5. A. Sivaraj, B. Preethi Jenifa, M. Kavitha, P. Inbasekar, B. Senthilkumar, A. Panneerselvam (2011),” Antibacterial activity of Coccinia grandis leaf extract on selective bacterial strains”, Journal of Applied Pharmaceutical Science 01 (07); 120-123. 6. Bushra khan (1998), Studies on the chemical constituents of Cucumis prophetarum, Luận án tiến sĩ hóa học, Đại học karachi, Pakistan. 7. Deshpande S.V., Patil M.J., Parmar K.K., Daswadkar S.C. and Khodade R.B. (2011), “A study on antioxidant activity of fruit extracts of Coccinia grandis L.Voigt”, 2011, International Journal of Drug Research and Technology, 1(1), 69-72. 8. Geetu Singha, Prasoon Guptaa, Preeti Rawata, Anju Purib, Gitika Bhatiab, Rakesh Mauryaa(2007), “Antidyslipidemic activity of polyprenol from Coccinia grandis in high-fat diet-fed hamster model”, Phytomedicine 14, 792– 798. 9. Gouki, M., Kensaku, T., Koji, W., Tomoyuki, O. K. I., Mami, M., Ikuo, S., et al., (2006), Evaluation of antioxidant activity of vegetables from Okinawa Prefecture and determination of some antioxidative compounds. Food Science and Technology Research, 12, 8–14. 10. Muthuswamy Umamaheswari, Kuppusamy AsokKumar, Arumugam Somasundaram, Thirumalaisamy Sivashanmugam, Varadharajan Subhadradevi, Thenvungal Kochupapy Ravi (2007), “Xanthine oxidase inhibitory activity of some Indian medical plants”, Journal of Ethnopharmacology, 109, 547–551. 11. Papiya Mitra Mazumder, D Sasmal and R Arivudai Nambi (2008), “ Antiulcerogenic and antioxidant effects of Coccinia grandis (Linn.) Voigt leaves on aspirin – induced gastric ulcer in rats”, Natural product radiance, 7(1), 15 – 18. 12. Rajeswari Arunachalam , Sujatha Dhanasingh , Balasaraswathi Kalimuthu , Mani Uthirappan , Chellan Rosea, Asit Baran Mandal (2012), “Phytosynthesis of silver nanoparticles using Coccinia grandis leaf extract and its application in the photocatalytic degradation”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 94, 226–230. 13. Raju Patil , Ravindra Patil , Bharati Ahirwar , Dheeraj Ahirwar (2011), “Current status of Indian medicinal plants with antidiabetic potential: a review”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, S291-S298. 14. S.V Deshpande, M. J. Patil, S.C. Daswadkar, U. Suralkar, A. Agarwal (2011), “A study on anti-inflammatory activity of the leaf and stem extracts of Coccinia grandis L. Voigt”, International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology, 2 (3), 247-250. 15. Takuya Katsube, Yoko Tsurunaga, Mari Sugiyama, (2009), Effect of air- drying temperature on antioxidant capacity and stability of polyphenolic compounds in mulberry (Morus alba L.) leaves, Food Chemistry, 113, 964– 969. 16. Tamilselvan N, Thirumalai T, Elumalai EK, Balaji R, David E (2011), “Pharmacognosy of Coccinia grandis: a review”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, S299-S302. 17. U. A. Deokate and S. S. Khadabadi (2011), “Pharmacology and phytochemistry of Coccinia indica”, Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, 3 (11), 155-159. 18. Vadivu R, Krithika A, Biplab C, Dedeepya P, Shoeb N, Lakshmi KS (2008), “Evaluation of Hepatoprotective Activity of the Fruits of Coccinia grandis Linn”, International Journal of Health Research, 1(3), 163-168. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl3 Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl3 Phụ lục 3: Phổ DEPT của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl3 Phụ lục 4: Phổ HSQC của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl3 Phụ lục 5: Phổ HMBC của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl3 NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... Chủ tịch Thư ký Uỷ viên