Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của loài địa y dirinaria applanata (fée) d. d. awasthi

OH HO O Me CHO OH O O HO 15 16 17 18 O Me O O Me OH OH Me HO Me O 19 O O OH CO2HHO O Me Me O Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: T ỔNG QUAN T ÀI LIỆU 8 Hình 2.2: Địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi. Hợp chất chứa nhân anthraquinone (20) phân bố rộng trong tự nhiên, hiện diện nổi bật trong thực vật bậc cao và nấm nhưng cũng là thành phần quan trọng trong địa y. Các hợp chất anthraquinone là tác nhân kháng virus, kể cả HIV, đặc biệt là hypericin (21) kháng virus phiên mã ngược [10]. Napthoquinone là nhóm hợp chất có nguồn gốc từ naphthalene. Đáng chú ý có naphthazarin (22) có hoạt tính gây độc đối với tế bào ung thư biểu mô [10]. 2.1.4.8 Terpenoid, steroid và carotenoid [11] Như những loài thực vật khác, địa y cũng chứa các hợp chất terpenoid, steroid và carotenoid quen thuộc trong hóa học hợp chất thiên nhiên. Terpenoid gồm có monoterpenoid (camphor, limonene, pinene), diterpenoid (phytol, manool), triterpenoid (amyrin, lupeol, pyxinol). Steroid như cholesterol, ergosterol, lichesterol Carotenoid như carotene, lutein, neoxanthin 2.2 Đại cương về địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi OH HO OH Me O MeHO OH OHO 20 21 22 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: T ỔNG QUAN T ÀI LIỆU 9 2.2.1 Tên gọi Tên khoa học: Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi. Tên gọi khác: Parmelia applanata, Placodium flavostramineum, Lecanora flavostraminea, Parmelia redacta. 2.2.2 Phân loại thực vật học Gi ới: Nấm Phân giới: Ascomycota Ngành: Pezizomycotina Lớp: Lecanoromycetes Thứ: Lecanorales B ộ: Lecanorineae Họ: Physciaceae Chi: Dirinaria Loài: Dirinaria applanata 2.2.3 Đặc điểm hình thái thực vật [12] Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi là loài địa y dạng phiến thuộc chi Dirinaria, một chi rất phổ biến và chiếm đa số ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt với 36 loài trên thế giới. Loài địa y này phát triển với kích thước rộng khoảng 5 ­ 10 cm. Các thùy rộng 0,5 ­ 2 mm, dạng lông chim kế tiếp nhau, gấp nếp theo chiều dọc và tỏa ra ngoài. B ề mặt trên có màu xám, xám xanh, xám vàng hoặc trắng nhạt, có thể có phủ phấn trắng, có các chồi vảy phát tán bào tử dạng bột. Mặt dưới có màu đen ở giữa, rìa màu đen hoặc nâu. Đặc trưng của loài địa y này là sự hiện diện của divaricatic acid. (Nguồn: Hình 2.3: Cấu tạo địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi. Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: T ỔNG QUAN T ÀI LIỆU 10 2.2.4 Phân bố Địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi phân bố ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt và mở rộng sang cả vùng ôn đới. Chúng phát triển trên thân cây, gỗ, đá, từ vùng duyên hải đến rừng núi, có mặt ở một số đảo của thái B ình Dương, châu Úc, châu Mỹ, châu Á v à châu Phi [12]. 2.2.5 Thành phần hóa học Địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi có thành phần chính là divaricatic acid (23). Ngoài ra, còn có atranorin (13), chloroatranorin, 3β­ acetoxyhopane­1β,22­diol, một số loại terpene [12] và các thành phần cơ bản của địa y. Không tìm thấy tài liệu cụ thể về thành phần hóa học của loài địa y này. 2.3 Cơ sở lý thuyết của một số phương pháp thực nghiệm 2.3.1 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (chiết rắn ­ lỏng) Kỹ thuật chiết ngâm dầm d ùng để lấy các hợp chất tự nhiên ra khỏi thực vật thô ban đầu. Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ có nắp đậy. Rót dung môi tinh khiết v ào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ y ên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chiết bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bung ra làm dung dịch chiết trào ra ngoài). Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn. Chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng MeO OH Me O O OH COOH Me 23 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: T ỔNG QUAN T ÀI LIỆU 11 dung môi. Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau [13]. 2.3.2 Kỹ thuật chiết lỏng ­ lỏng Kỹ thuật chiết lỏn g – lỏng áp dụng để phân chia cao chiết thô ban đầu (thường là cao alcol thô) thành các phân đoạn cao có tính phân cực khác nhau. Nguyên tắc: dung môi có tính phân cực khác nhau sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực tương ứng với nó. Phương pháp này dựa trên sự phân bố của chất tan vào hai pha và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau, thực hiện bằng bình lóng. Cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào nước. Việc chiết được thực hiện lần lượt bằng các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần. Chiết nhiều lần với mỗi loại dung môi, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, đến khi chiết kiệt mới chuyển sang dung môi khác. Thu hồi dung môi được các cao phân đoạn tương ứng [13]. 2.3.3 Phương pháp sắc ký cột (sắc ký cột hở) Sắc ký cột dùng để phân đoạn cao ban đầu thành những phân đoạn cao nhỏ hơn có độ phân cực khác nhau, hoặc cô lập hợp chất tinh khiết từ một phân đoạn cao nhỏ. Sắc ký cột được tiến hành ở áp suất khí quyển. Pha tĩnh là chất hấp phụ được nhồi trong cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được nạp lên đầu cột, phía trên pha tĩnh. Pha động là dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ với tỉ lệ xác định, di chuyển qua lớp chất hấp phụ dưới tác động của trọng lực, tùy theo ái lực với pha tĩnh và pha động mà mỗi chất sẽ giải ly ra khỏi cột trước hoặc sau. 2.3.3.1 Chọn chất hấp phụ và nhồi cột Thường sử dụng silica gel pha thường với cỡ hạt phù hợp cho phân đoạn cao hay hỗn hợp chất cần tách, còn silica gel pha đảo dùng khi cần cô lập các hợp chất phân cực mạnh. Muốn tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp phụ phải lớn hơn 25 – 50 l ần trọng lượng của mẫu chất (tùy vào mục đích của cột) và tỷ lệ chiều cao chất hấp thu : đường kính trong của cột vào khoảng 10 : 1 [13]. Cấu trúc mạng silica gel pha thường: Si OO O O Si O Si O O O O O H H H Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: T ỔNG QUAN T ÀI LIỆU 12 Có hai cách nhồi cột: nhồi cột ướt (dùng cho các chất hấp phụ có khả năng trương phình như silica gel, sephadex) và nhồi cột khô (dùng cho các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như Al2O 3, CaCO 3). Cột cần đặt thẳng đứng trên giá, dưới đáy có lớp bông gòn giữ chất hấp phụ. Cột nạp xong phải đồng nhất, mặt cột bằng phẳng. 2.3.3.2 Nạp mẫu chất cần phân tích vào cột Mẫu chất phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột và bằng phẳng thì việc phân tách mới hiệu quả. Có hai cách nạp mẫu chất: ­ Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch: hòa tan mẫu chất bằng một lượng tối thiểu dung môi khởi đầu giải ly nhưng phải hòa tan hoàn toàn. Khi toàn bộ mẫu chất ngấm hết vào cột, mới cho tiếp dung môi mới. ­ Nạp mẫu chất ở dạng bột khô: trộn mẫu chất với một lượng chất hấp phụ thật đều, sấy hoặc cô quay cho đến khi khô tơi rồi cho vào cột bằng cách rải thành một lớp đều đặn trên mặt cột. 2.3.3.3 Chọn dung môi và giải ly cột [13] Dùng sắc ký lớp mỏng dò tìm dung môi phù hợp để bắt đầu giải ly cột. Đối với mẫu cao thô chiết từ cây cỏ, dung môi giải ly đầu tiên là dung môi đẩy vết ít phân cực nhất lên vị trí có R f = 0,5 và dung môi ch ấm dứt sắc ký cột là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên vị trí có R f = 0,2. Gi ải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần độ phân cực cho dung môi giải ly một cách từ từ để tránh gãy cột: thêm từ từ mỗi lần vài phần trăm dung môi mới có tính phân cực cao hơn vào dung môi cũ đang sử dụng. Dung môi sử dụng phải tinh khiết. Với pha tĩnh là silica gel pha thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất càng phân cực giải ly ra càng sau, còn silica gel pha đảo thì ngược lại. Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần: hydrocarbon → alkene → ether → halocarbon → hợp chất thơm → ketone → aldehyde → ester → alcohol → amine → carboxylic acid → các hợp chất kiềm mạnh. Vận tốc dung môi giải ly không quá nhanh cũng không được quá chậm, thường ở khoảng 5 – 50 gi ọt/phút hoặc 1 – 2 cm/phút. Tùy theo chất hấp phụ đã dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột, có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc bằng áp suất nén: ­ Gi ải ly cột bằng áp suất thường: có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ có kích thước hạt lớn. Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: T ỔNG QUAN T ÀI LIỆU 13 ­ Gi ải ly cột bằng áp suất nén: cho một dòng khí nén (khí nitơ hoặc không khí) vào đầu cột với tốc độ dòng khí có thể điều chỉnh. 2.3.3.4 Theo dõi quá trình giải ly cột [13] Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được theo dõi bằng mắt thường. Tuy nhiên, đa số hợp chất hữu cơ tự nhiên đều không màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột thường bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. 2.3.4 Sắc ký lớp mỏng [13] Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography ­ TLC) còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp phụ. Trong đó, pha động là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển ngang qua pha tĩnh là một lớp chất hấp phụ trơ như silica gel hoặc aluminium oxide được tráng thành lớp mỏng, đều và phủ lên một nền phẳng như tấm kính, nhôm hoặc plastic. Quá trình sắc ký diễn ra khi đặt bản mỏng trong bình sắc ký là hũ, lọ bằng thủy tinh có nắp đậy kín để bão hòa hơi dung môi. ­ Pha tĩnh với chất hấp phụ là silica gel hoặc Al2O 3: hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và hợp chất càng phân cực sẽ di chuyển càng chậm hoặc không di chuyển. Độ dày của pha tĩnh thường là 0,25 mm. ­ Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển chậm dọc theo tấm lớp mỏng nhờ vào lực mao quản và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau sau mực dung môi, tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh níu giữ lại, ái lực với pha tĩnh, pha động và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. ­ Mẫu chất cần phân tích: thường là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau, dùng vi quản để chấm thành một điểm gọn nằm trên pha tĩnh ở vị trí cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng (pha động) đang chứa trong bình sắc ký. Sau đó cho pha động di chuyển ngang qua. Vị trí của mỗi thành phần cấu tử trên bản mỏng được tính bằng giá trị R f : R = a b = khoảng cách di chuyển của chất khoảng cách di chuyển của dung môi Các chất khác nhau thường sẽ có giá trị R f khác nhau trong cùng điều kiện thử. Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị R f không đổi trong một hệ dung môi xác định. Luận văn tốt nghiệp Sắc ký lớp mỏng d sơ bộ về tính chất của mẫu chất hữu cơ, cô lập hợp chất (sắc ký lớp mỏng điều chế), giống nhau hay không 2.3.4.1 Các kỹ a. Sắc ký lớp m nhiều lần từ đầu dưới l vết mẫu chấm trên b ký vì mẫu chất sẽ bị b. Sắc ký lớp mỏng hai chiều sắc ký một chiều không th chiều để kết quả tách r 20 cm, chấm mẫu chất ở góc bản rồi cho v thứ nhất, quay góc 90 c. Sắc ký lớp mỏng điều chế chất với lượng nhỏ v chiều với bản mỏng 20 x 20 cm, độ d Hỗn hợp cần tách đ Sau đó nhúng bản mỏng các chất trong hỗn hợp gần nhau có chạy phải sấy khô bản mỏng. đèn UV ho ặc phun thuốc thử hiện h dung môi thích hợp để lấy ri B ản mỏng chưa khai tri Hình 2.4: Minh h CHƯƠNG 2: T ỔNG QUAN T 14 ùng để khảo sát hệ dung môi cho sắc ký cột, , theo dõi diễn tiến của một phản ứng tổng hợp kiểm tra hai hợp chất có thuật sắc ký lớp mỏng ỏng một chiều: dung môi chạy cùng m ên đầu trên bản mỏng với một hay vài h ản mỏng không được ngập vào dung môi trong bình s khuếch tán ngay lập tức ra dung môi làm các v : nếu mẫu chất có nhiều cấu tử th ể thấy rõ sự tách, tiến hành thêm k õ ràng hơn. Dùng bản mỏng hình vuông c ào bình sắc ký chạy hệ dung môi o, tiếp tục cho vào bình sắc ký chạy hệ dung môi thứ hai. (kỹ thuật sắc ký chế hóa): à có R f xa nhau. Dùng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng một ày chất hấp phụ từ 0,5 – ược chấm lên bản mỏng thành một đ vào dung môi khai triển thích hợp. Tr thể chạy lại nhiều lần nh Đánh dấu vùng muốn tách chất bằng cách soi ình ở mép bản, cạo riêng t êng mẫu chất khỏi chất hấp phụ. ển và đã khai triển sắc ký hoàn tất. ọa cách tính R f. Vạch dưới: vạch xuất phát Vạch trên: vạch dung môi ÀI LIỆU tìm hiểu ột chiều, một hay ệ dung môi. Các ắc ết bị lem. ì kỹ thuật ỹ thuật sắc ký hai ạnh khoảng dùng để tách các 1 mm. ường liên tục. ường hợp R f ưng trước mỗi lần ừng vùng, dùng Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: T ỔNG QUAN T ÀI LIỆU 15 2.3.4.2 Cách hiện hình vết sau khi giải ly bản mỏng [13] Các vết trên bản mỏng có thể có màu hoặc không màu vì vậy cần áp dụng các phương pháp hiện hình vết: a. Phương pháp vật lý: thường dùng tia tử ngoại (UV). Các vết dưới tia UV có màu tối sẫm. ­ Đèn chiếu tia UV 254 nm: ánh sáng này đ ể phát hiện các hợp chất có thể hấp thu tia UV. ­ Đèn chiếu tia UV 365 nm: ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp chất có thể phát huỳnh quang. Các vết của mẫu chất có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu. b. Phương pháp hóa học: phát hiện các vết bằng thuốc thử. Hòa thuốc thử vào dung môi thích hợp rồi phun xịt lên bản mỏng hoặc nhúng nhanh bản mỏng vào dung dịch thuốc thử. Thuốc thử sẽ kết hợp với các hợp chất để tạo ra các dẫn xuất có màu. B ảng 2.1: Một vài thuốc thử hiện hình trong sắc ký lớp mỏng. Thuốc thử Màu của vết Hợp chất Hơi iod Vàng hoặc nâu Hợp chất hữu cơ nói chung, hợp chất bất bão hòa. 2,7­Fluoresceine Lục ­ vàng Đa số các hợp chất hữu cơ. Nihydrin Tím ­ hồng Amino acid, amine. 2,4­ Dinitrophenylhydrazine Đỏ ­ cam Aldehyde, ketone. Antimony trichloride Màu đặc trưng Steroid, hợp chất chi hoàn. Vitamin, carotenoid. Diphenyl carbazide Màu đặc trưng Kim loại. Bromophenol blue; Bromocresol green Vàng Carboxylic acid. H2SO 4 đậm đặc Vàng đậm đến da cam Flavon, flavonol. Màu đỏ hoặc xanh dương ­ đỏ Chalcon, auron. Màu cam đến đỏ Flavonoid. FeCl3 Xanh lục đến xanh đen Sesquiterpen. Mayer Màu vàng nhạt Alkaloid. Dragendorff Màu đỏ cam Alkaloid. Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: T ỔNG QUAN T ÀI LIỆU 16 2.3.5 Sự kết tinh lại (Recrystallization) Các hợp chất cô lập được sau quá trình sắc ký cột, khi quan sát bằng mắt thường ta thấy chúng ở dạng bột trắng hay tinh thể không màu, khi sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau vẫn cho một vết tròn, gọn đẹp nhưng thực ra độ tinh khiết của chúng cũng chỉ từ 90 ­ 95% mà thôi . Vì thế, việc xác định cấu trúc bằng các phương pháp hóa lý sẽ kém hiệu quả. Do vậy, việc kết tinh lại hợp chất là rất cần thiết. Một hợp chất có độ tinh khiết lớn hơn 95% m ới có thể khảo sát bằng các phương pháp hoá lý. 2.3.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp thử nghiệm sử dụng gốc tự do DPPH 2.3.6.1 Giới thiệu về gốc tự do G ốc tự do là những nguyên tử, phân tử hay ion có các điện tử độc thân ở lớp ngoài cùng, do đó chúng kém bền vững, thời gian tồn tại ngắn (1/1000 giây) và hoạt tính cao. Vì vậy mà chúng dễ dàng tham gia phản ứng với các phân tử khác bằng cách lấy đi một điện tử của phân tử đó nhằm bền vững hoá lớp vỏ điện tử của mình nhưng đồng thời sinh ra một gốc tự do mới, gốc tự do mới lại tiếp tục phản ứng với phân tử khác và tạo thành phản ứng dây chuyền. Một số gốc tự do có vai trò quan trọng trong cơ thể, là những chất chuyển hóa trung gian có hoạt tính mạnh, tuy nhiên khi số lượng vượt quá sự kiểm soát của cơ thể thì chúng sẽ tấn công vào hệ thống các mô, cơ quan, các base trong nucleic acid, các amino acid trong chuỗi protein, các acid béo chưa bão hoà và gây ra hàng loạt biến đổi có hại cho cơ thể. 2.3.6.2 Giới thiệu về gốc tự do DPPH và nguyên tắc của thử nghiệm Phương pháp DPPH được giới thiệu lần đầu tiên bởi Marsden Blois v ào năm 1958 . DPPH (1,1­diphenyl­2­picrylhydrazyl ) là gốc tự do ổn định, bền ở nhiệt độ thường, dạng bột màu đen ở điều kiện thường, có màu tím đặc trưng trong dung môi (thường dùng methanol, ethanol). G ốc DPPH có bước sóng hấp thu cực đại ở 517 nm và độ hấp thu của nó giảm tương ứng khi nguyên tử N mang một điện tử lẻ nhận một điện tử hoặc hydro từ các chất chống oxy hóa (dung dịch DPPH từ màu đen tím chuyển sang màu vàng). Do đó, DPPH được sử dụng rộng rãi và là thử nghiệm cơ bản để đánh giá hiệu quả hoạt động làm sạch gốc tự do của các chất chống oxy hóa dựa trên sự thay đổi độ hấp thu của dung dịch DPPH ở 517 nm [14]. Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: T ỔNG QUAN T ÀI LIỆU 17 1,1­Diphenyl­2­picrylhydrazyl 1,1­Diphenyl­2­picrylhydrazine Hình 2.5: Ph ản ứng trung hòa gốc tự do DPPH. 2.3.6.3 Biểu diễn kết quả thử nghiệm DPPH Khả năng khử gốc tự do DPPH của một cao chiết (hoặc chất chống oxy hóa) ở nồng độ xác định được biểu diễn thông qua phần trăm ức chế (I%) được tính theo công thức: I% = A − A A x 100 Với Ac là giá trị mật độ quang của mẫu trắng (không có chất chống oxy hóa ­ control) và As là giá trị mật độ quang của mẫu thử (có chất chống oxy hóa ­ sample). Kết quả thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa của một chất bằng phương pháp DPPH được báo cáo bằng IC50 (half maximal Inhibitory Concentration). IC50 được định nghĩa là nồng độ của chất mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme. IC 50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp. Cách tính IC50 : ­ Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau và tính I% của từng nồng độ. Với những mẫu có phần trăm ức chế I% biến thiên tuyến tính với nồng độ, vẽ đường thẳng y = ax + b biểu diễn mối liên hệ giữa I% và nồng độ mẫu (với y là I% và x là nồng độ mẫu). Tìm phương trình tuyến tính, xác định hệ số a và b của phương trình. ­ Thay y = 50 vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x, đó chính là nồng độ ức chế được 50% gốc tự do (IC50 ). N N NO2O2N NO2 + RH N NH NO2O2N NO2 + R Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 18 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện 3.1.1 Địa điểm và thời gian Đề tài luận văn “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa Sinh 1, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ. Đề tài được thực hiện từ tháng 06/2014 đến tháng 11/2014. 3.1.2 Dụng cụ ­ Máy cô quay chân không. ­ Máy UV – Vis Jenway 6800. ­ Cột sắc ký, đèn soi UV, cân phân tích bốn số lẻ, tủ sấy, tủ hút, bếp điện, hũ bi, ống đong, ống vi quản, bình định mức, bình lóng 3.1.3 Hóa chất ­ Các dung môi: petroleum ether, ethyl acetate, chloroform, methanol ­ DPPH (Sigma­Aldrich) và các hóa chất khác. ­ Silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm). ­ B ản mỏng tráng sẵn (Merck). ­ Na2SO 4 dùng để làm khan dung môi. ­ Thuốc thử H2SO 4 20% chứa vanillin dùng để hiện hình bản mỏng. 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp chiết tách hợp chất tự nhiên từ thực vật Địa y sau khi thu hái, phơi thật khô, nghiền thành bột mịn, sau đó ngâm chiết đến kiệt với methanol. Cô quay dịch chiết thu được cao methanol tổng. Từ cao methanol tổng ban đầu, sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng với các dung môi petroleum ether, ethyl acetate, cô quay thu hồi dung môi được cao petroleum ether, cao ethyl acetate và cao nước. 3.2.2 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao chiết Những phương pháp được sử dụng để phân lập hợp chất tinh khiết từ cao chiết bao gồm: ­ Phương pháp sắc ký cột: chủ yếu. Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 19 ­ Phương pháp sắc ký lớp mỏng: song song với sắc ký cột để khảo sát các phân đoạn, hợp chất được giải ly ra khỏi cột cũng như kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất phân lập được. ­ Phương pháp kết tinh lại: để loại các chất bẩn, nâng cao độ tinh khiết của hợp chất phân lập được. 3.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất tinh khiết phân lập được Tiến hành đo phổ hợp chất tinh khiết phân lập được. Phổ 1H­NMR, 13C­ NMR, DEPT, HMBC được đo tại trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Các dữ liệu phổ dùng để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất. 3.3 Thực nghiệm điều chế các loại cao 3.3.1 Thu hái và xử lí mẫu địa y Mẫu địa y được thu tại khuôn viên trường Đại học Cần Thơ, TP. Cần Thơ. Mẫu cây được định danh là Dirinaria Applanta (Fée) D. D. Awasthi bởi ThS.Nguyễn Thị Kim Huê – bộ môn Sinh học, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ. Mẫu cây hiện được lưu giữ tại phòng thí nghiệm Hóa Sinh 1, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ. Mẫu sau khi thu hái, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Sau đó nghiền mịn, cho mẫu vào túi vải, buộc kỹ v à đặt vào lọ thủy tinh dung tích 10 L. 3.3.2 Điều chế cao methanol tổng Cao methanol tổng được điều chế bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm. Khối lượng bột địa y đem ngâm là 1,28 kg, sử dụng hết 20 L methanol để chiết kiệt. Mỗi lần chiết với lượng methanol ngập túi vải trong 24 giờ. Lọc loại bỏ bã và cô quay thu hồi dung môi dịch chiết thu cao tổng với khối lượng là 210 g. Hiệu suất điều chế cao methanol tổng: H = 210 1280 x 100 = 16,4% 3.3.3 Điều chế cao petroleum ether Hòa tan cao methanol tổng vào lượng tối thiểu nước cất, lọc qua giấy lọc để loại cặn. Chiết lỏng ­ lỏng dịch cao methanol tổng với petroleum ether, mỗi lần chiết dùng khoảng 200 ­ 300 mL dung môi, lắc nhẹ và đều trong 15 phút rồi tách lấy lớp trên. Chiết nhiều lần bằng bình lóng đến khi lớp trên không Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 20 màu thì kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, nếu không còn vết thì ngưng. Gom dung dịch lớp trên cô quay thu được cao petroleum ether với khối lượng 88 g. Hiệu suất điều chế cao petroleum ether: H = 88 210 x 100 = 41,9% 3.3.4 Điều chế cao ethyl acetate Phần lớp dưới khi trích với petroleum ether tiếp tục được chiết lỏng ­ lỏng với ethyl acetate. Tiến hành tương tự như chiết với petroleum ether với lớp trên là dịch chiết của ethyl acetate. Vẫn chiết tới khi lớp trên không màu, kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Cô quay thu hồi dung môi được cao ethyl acetate với khối lượng là 76 g. Hiệu suất điều chế cao ethyl acetate: H = 76 210 x 100 = 36,2% 3.3.5 Điều chế cao nước Phần lớp dưới sau khi chiết với ethyl acetate đem cô quay thu hết nước, thu được cao nước. Khối lượng cao nước là 46 g. Hiệu suất điều chế cao nước: H = 46 210 x 100 = 21,9% Quy trình điều chế các loại cao chiết được tóm tắt trong sơ đồ: Hình 3.1: Quy trình điều chế các loại cao chiết. B ột địa y (1,28 kg) Cao tổng methanol (210g) Chiết kiệt với methanol Cô quay thu hồi dung môi Thêm nước cất để hòa tan Chiết với petroleum ether (lớp trên) Cô quay thu hồi dung môi Cao petroleum ether (88 g) Dung dịch nước Chiết với ethyl acetate (lớp trên) Cô quay thu hồi dung môi Cao nước (46 g) Cao ethyl acetate (76 g) Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 21 3.4 Khảo sát và phân tích cao petroleum ether 3.4.1 Sắc ký cột cao petroleum ether Đầu tiên, dùng sắc ký lớp mỏng để khảo sát tính phân cực của cao cũng như dò tìm hệ dung môi để bắt đầu quá trình giải ly cột. Thử nghiệm với nhiều hệ dung môi khác nhau, nhận thấy với hệ dung môi petroleum ether : ethyl acetate (95:5) các v ết chính khá tách nhau và tròn đẹp, vì vậy petroleum ether (100%) được chọn là dung môi đầu tiên giải ly cột. Từ kết quả sắc ký bản mỏng cho thấy cao petroleum ether có chứa các hợp chất có tính phân cực từ thấp đến cao với một số vết khá rõ, tiếp tục khảo sát có thể phân lập được hợp chất tinh khiết. Tiến hành sắc ký cột cao petroleum ether (88 g) với pha tĩnh là 400 g silica gel Himedia (cỡ hạt 230 ­ 400 mesh, tương đương 0,063 ­ 0,037 mm). Cột có đường kính 5 cm . Dung môi giải ly cột là hệ dung môi petroleum ether : ethyl acetate (tỉ lệ từ 100:0 đến 50 :5 0) với độ phân cực tăng dần. Dung dịch ra khỏi cột được hứng lại bằng các hũ bi có thể tích bằng nhau. Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng để gom các hũ bi chứa dung dịch giống nhau. Tổng cộng thu được 7 phân đoạn được trình bày ở bảng 3.1, trong đó phân đoạn III có vết chính rõ, đậm và có ít vết tạp hơn so với các phân đoạn khác nên được chọn tiếp tục khảo sát. a b Hình 3.2: SKLM cao petroleum ether với hệ dung môi petroleum ether : ethyl acetate (95:5). a: hiện hình dưới đèn UV λ = 254 nm. b: hiện hình bằng dung dịch H2SO 4 20% có chứa vanillin. Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 22 B ảng 3.1: Tổng hợp kết quả sắc ký cột cao petroleum ether. Phân đoạn Khối lượng Dung môi giải ly cột SKLM (thuốc thử hiện hình là dd H2SO 4 có vanillin, nướng trên bếp điện) I 4,47 g PE Nhiều vết dính nhau, mờ. II 5,93 g PE : EtOAc (95:5) Vết kéo dài không có vết chính. III 3,02 g PE : EtOAc (9:1) Có vết chính màu vàng với lượng lớn cùng vài vết khác. Tiếp tục khảo sát. IV 6 ,6 5 g PE : EtOAc (8:2 ) Có 1 vết chính tròn rõ màu đỏ ở khoảng giữa bản chiếm lượng lớn và có ít vết khác. Tiếp tục khảo sát. V 27,48 g PE : EtOAc (7:3) G ần giống phân đoạn IV nhưng có thêm nhiều vết phân cực mạnh dính nhau hơn. VI 14,19 g PE : EtOAc (6:4 ) Có vệt phân cực mạnh kéo dài cùng các vết ít phân cực hơn nhưng không rõ. VII 10,19 g PE : EtOAc (5:5 ) Nhiều vết tạp kéo dài cả bản. 3.4.2 Khảo sát phân đoạn III Phân đoạn III sau khi để bay hơi dung môi tự nhiên xuất hiện tinh thể kết tủa thành một lớp dưới đáy bình chứa, có màu trắng với dạng hình kim nhỏ. Tinh thể còn hơi vàng do bẩn, t iến hành xử lý tinh thể này. Đầu tiên, thử tính chất hòa tan của tinh thể trong các loại dung môi, nhận thấy tinh thể tan rất tốt trong chloroform, rất khó tan trong các loại dung môi hữu cơ khác. Đặc biệt với methanol, tinh thể không tan nhưng các chất tạp bẩn bám trên tinh thể đều tan và bị rửa trôi. Vì vậy, rửa tinh thể thật nhiều lần với methanol thu được tinh thể màu trắng không còn dính bẩn màu vàng. Sau đó, tiến hành kết tinh lại tinh thể trong chloroform để đảm bảo độ tinh khiết, thu được lượng tinh thể trắng hình kim nhỏ với khối lượng 371 mg. Ký hiệu tinh thể thu được là hợp chất HP1. Khảo sát mức độ tinh khiết của hợp chất bằng sắc ký lớp mỏng, kết quả trình bày trong hình 3.3. Với dung môi phân cực yếu đến mạnh đều chỉ có 1 vết tròn màu vàng trên bản, vậy có thể kết luận HP1 đã khá tinh khiết. Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 23 3.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết địa y cùng hợp chất HP1 bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH 3.5.1 Cách tiến hành tổng quát ­ Cao chiết (hay hợp chất) được hòa tan trong methanol ở nồng độ nhất định, lấy từng lượng thể tích tăng dần (ứng với nồng độ tăng dần trong mẫu thử) cho vào từng tuýp eppendorf, mỗi tuýp là một mẫu thử. ­ Hòa tan DPPH bằng methanol ở nồng độ thích hợp. Cho vào mỗi mẫu thử một lượng thể tích dung dịch DPPH như nhau ở tất cả các mẫu thử. ­ Làm đầy từng tuýp eppendorf bằng methanol đến 2 mL, lắc nhẹ. Ủ các tuýp trong tối trong 30 phút ở nhiệt độ thường, không đổi. ­ Tiến hành đo độ hấp thu của mỗi mẫu thử trong tuýp eppendorf. Chú ý rằng với dung dịch cao chiết (hay hợp chất) có độ hấp thu riêng, cần pha các dung dịch cao cùng nồng độ với nồng độ của nó trong các mẫu thử nhưng không có DPPH và đo độ hấp thu, sau đó lấy độ hấp thu của mẫu thử trừ độ hấp thu của dung dịch trên để tìm ra độ hấp thu chính xác của mẫu thử. Tính phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của từng mẫu thử, dựng đường thẳng tuyến tính theo phần trăm ức chế và nồng độ cao chiết, từ đó tính IC50 để đánh giá khả năng kháng oxy hóa. 3.5.2 Chuẩn bị dung dịch DPPH DPPH dạng bột màu đen được pha trong methanol ở nồng độ 1000 µM (tương đương 0,4 mg/mL), trữ trong tối. Thể tích dung dịch DPPH ở nồng độ 1000 µM được sử dụng trong các mẫu thử luôn là 0,1 mL, và thể tích của mỗi mẫu thử luôn là 2 mL trong tuýp eppendorf. Vậy nồng độ DPPH trong các 1 2 3 Hình 3.3: SKLM khảo sát hợp chất HP1 (hiện hình bằng dd H2SO 4 20% có vanillin). 1: Dung môi giải ly là PE 100%, R f = 0,18. 2: Hệ dung môi giải ly là PE : EtOAc (95:5), R f = 0,57. 3: Dung môi giải ly là chloroform (100%), R f = 0,89. Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 24 mẫu thử trở thành 50 µM, nằm trong khoảng nồng độ đảm bảo độ chính xác cho việc đo độ hấp thu của máy quang phổ UV ­Vis là 25 ­ 70 µM [15]. 3.5.3 Mẫu đối chứng dương ascorbic acid (vitamin C) Để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các loại cao chiết địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi, so sánh với ascorbic acid là một chất chống oxy hóa mạnh. Khả năng kháng oxy hóa của ascorbic acid thể hiện qua thí nghiệm sau. Ascorbic acid dạng bột trắng được pha trong methanol ở nồng độ 1000 µM (tương đương 0,18 mg/mL) đ ể dùng trong thí nghiệm. Thể tích dung dịch ascorbic acid dùng trong các mẫu thử tăng dần (ứng với nồng độ tăng dần). Thí nghiệm được tiến hành như bảng 3.2. B ảng 3.2: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của ascorbic acid. Mẫu thử Thể tích DPPH (1000 µM) Dd ascorbic acid (1000 µM) Thể tích MeOH (mL) Thể tích (mL) Nồng độ tương ứng trong mẫu thử (µM) 1 0,1 mL 0 0 1,90 2 0,01 5 1,89 3 0,02 10 1,88 4 0,03 15 1,87 5 0,04 20 1,86 6 0,05 25 1,85 3.5.4 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng methanol Thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng được tiến hành như sau: cân 0,1 g cao tổng, hòa tan trong 10 mL methanol được dung dịch cao tổng có nồng độ 104 µg/mL. Lấy 1 mL dung dịch này pha loãng thành 10 mL bằng methanol, được dung dịch cao tổng có nồng độ 1000 µg/mL. Thể tích dung dịch cao tổng dùng trong các mẫu thử tăng dần (ứng với nồng độ tăng dần). Thí nghiệm được tiến hành như bảng 3.3. Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 25 B ảng 3.3: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng. 3.5.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao petroleum ether và cao nước Thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của 2 loại cao này tiến hành như nhau: cân 0,1 g cao, hòa tan trong 10 mL methanol được dung dịch cao có nồng độ 104 µg/mL. Lấy 1 mL dung dịch này pha loãng thành 10 mL bằng methanol, được dung dịch cao có nồng độ 1000 µg/mL. Thể tích dung dịch cao dùng trong các mẫu thử tăng dần (ứng với nồng độ tăng dần). Thí nghiệm được tiến hành như bảng 3.4. B ảng 3.4: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao PE và cao nước. Mẫu thử Thể tích DPPH (1000 µM) Dd cao tổng (1000 µg/mL) Thể tích MeOH (mL) Thể tích (mL) Nồng độ tương ứng trong mẫu thử (µg/mL) 1 0,1 mL 0 0 1,9 2 0,1 50 1,8 3 0,2 100 1,7 4 0,3 150 1,6 5 0,4 200 1,5 6 0,5 250 1,4 7 0,6 300 1,3 Mẫu thử Thể tích DPPH (1000 µM) Dd cao (1000 µg/mL) Thể tích MeOH (mL) Thể tích (mL) Nồng độ tương ứng trong mẫu thử (µg/mL) 1 0,1 mL 0 0 1,9 2 0,2 100 1,7 3 0,4 200 1,5 4 0,6 300 1,3 5 0,8 400 1,1 6 1,0 500 0,9 7 1,2 600 0,7 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 26 3.5.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethyl acetate Cân 0,1 g cao ethyl acetate, hòa tan trong 10 mL methanol được dung dịch cao có nồng độ 104 µg/mL. Lấy 1 mL dung dịch này pha loãng thành 10 mL bằng methanol, được dung dịch cao có nồng độ 1000 µg/mL. Thể tích dung dịch cao dùng trong các mẫu thử tăng dần (ứng với nồng độ tăng dần). Thí nghiệm được tiến hành như bảng 3.5 . B ảng 3.5 : Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao EtOAc. 3.5.7 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất HP1 Cân 10 mg hợp chất HP1, hòa tan trong 10 mL methanol được dung dịch HP1 có nồng độ 1000 µg/mL. Thể tích dung dịch HP1 dùng trong các mẫu thử tăng dần (ứng với nồng độ tăng dần). Thí nghiệm được tiến hành như bảng 3.6 . B ảng 3.6 : Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của HP1. Mẫu thử Thể tích DPPH (1000 µM) Dd cao EtOAc (1000 µg/mL) Thể tích MeOH (mL) Thể tích (mL) Nồng độ tương ứng trong mẫu thử (µg/mL) 1 0,1 mL 0 0 1,9 0 2 0,04 20 1,8 6 3 0,08 40 1,82 4 0,12 60 1,78 5 0,16 80 1,74 6 0,20 100 1,70 7 0,24 120 1,66 Mẫu thử Thể tích DPPH (1000 µM) Dd HP1 (1000 µg/mL) Thể tích MeOH (mL) Thể tích (mL) Nồng độ tương ứng trong mẫu thử (µg/mL) 1 0,1 mL 0 0 1,90 2 0,04 20 1,86 3 0,08 40 1,82 4 0,12 60 1,78 5 0,16 80 1,74 6 0,20 100 1,70 7 0,24 120 1,66 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 4: K ẾT QUẢ V À THẢO LUẬN 27 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát thành phần hóa học địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi Từ quá trình sắc ký cột cao petroleum ether của địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi, đã phân lập được 1 hợp chất tinh khiết, ký hiệu là HP1. Tiến hành gửi mẫu, xác định cấu trúc bằng phổ 1H­NMR, 13C­ NMR , DEPT và HMBC , đã xác định được hợp chất HP1 là methyl haematommate. Hợp chất HP1 là chất rắn màu trắng hơi vàng nhẹ, tinh thể hình kim. Thu được 371 mg hợp chất này. Tan tốt trong chloroform tạo dung dịch trong suốt, tan rất kém hoặc không tan trong các dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, khi tan trong chloroform, sau một thời gian ngắn nó thường bị phân hủy tạo thành dung dịch màu vàng nhạt. Nhiệt độ nóng chảy: 146 ­147 °C. 4.1.1 Biện luận cấu trúc hóa học của hợp chất HP1: methyl haematommate 4.1.1.1 Phân tích phổ 1H­NMR của HP1 (500 MHz, CDCl3) Dựa vào phổ 1H­NMR (phụ lục 1), phân tử hợp chất HP1 có 10 hydro với 6 tín hiệu khác nhau. ­ Hai tín hiệu ở vùng trường cao δH: 12,86 (1 H, s) và δH: 12,39 (1 H, s) đều là mũi đơn, là của hydro nhóm –OH. Hai nhóm –OH này đều tạo liên kết hydro với oxy của nhóm carbonyl ở vị trí kế cận trên nhân thơm (liên kết hydro nội phân tử) nên tín hiệu xuất hiện ở vùng trường δH > 12. Hình 4.1: Tinh thể hợp chất tinh khiết HP1. Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 4: K ẾT QUẢ V À THẢO LUẬN 28 ­ Tín hiệu mũi đơn ở vùng trường cao δH: 10,32 (1H, s) là của hydro nhóm –CHO. ­ Tín hiệu mũi đơn ở vùng trường δH: 6,27 (1 H, s) là của hydro trên nhân thơm. ­ Tín hiệu mũi đơn ở vùng trường thấp δH: 3,95 (3 H, s) là của 3 hydro nhóm –OCH 3. ­ Tín hiệu mũi đơn ở vùng trường thấp δH: 2,51 (3 H, s) là của 3 hydro nhóm –CH3 gắn trên nhân thơm. Nếu không gắn trên nhân thơm thì tín hiệu này ở vùng trường δH < 1. 4.1.1.2 Phân tích phổ 13C­NMR và DEPT của HP1 (125 MHz, CDCl3) Dựa vào phổ DEPT (phụ lục 2) và 13C­NMR (ph ụ lục 3): phân tử hợp chất HP1 có 10 carbon. Trong đó, có 2 tín hiệu của carbon loại =CH– (δC: 194 và δC: 112,2), 2 tín hiệu của carbon loại –CH3 (δC: 52 ,4 và δC: 25,3 ), 6 tín hi ệu của carbon tứ cấp (δC: 172,1; δC: 168, 4; δC: 166,8 ; δC: 155, 5; δC: 108,6 và δC: 104). ­ Sáu tín hiệu trong vùng trường cao từ δC: 100 đến δC: 170 là của 6 carbon nhân thơm. Trong đó có 1 carbon loại =CH– và 5 carbon t ứ cấp, vậy đây là vòng benzene có 5 nhóm ch ức gắn trên vòng. ­ Tín hiệu ở vùng trường cao δC: 194 là c ủa carbon nhóm –CHO . ­ Tín hiệu ở vùng trường cao δC: 172,1 là của carbon nhóm –COO –. ­ Tín hiệu ở vùng trường thấp δC: 52,4 là của carbon nhóm –OCH 3. ­ Tín hiệu ở vùng trường thấp δC: 25,3 là của carbon nhóm –CH3. 4.1.1.3 Phân tích phổ HMBC (phụ lục 4) ­ Tại δH: 12,86 (hydro nhóm –OH) và δH: 12,39 (hydro nhóm –OH) cùng có tín hiệu giao nhau tại δC: 108,6 (carbon vòng benzene) mà không cùng có tín hiệu giao nhau tại δC nào khác chứng tỏ 2 nhóm –OH này ở vị trí meta với nhau trên vòng benzene , carbon ở vùng trường δC: 108,6 ở giữa. ­ Tại δH: 12,86 (hydro nhóm –OH) có các tín hiệu giao nhau tại δC: 168,4 ; δC: 108,6 ; δC: 104 và δH: 12,39 (hydro nhóm –OH) có tín hi ệu giao nhau tại δC: 166,8 ; δC: 108,6 ; δC: 112,2 (các carbon vòng benzene) . Do là nhóm đẩy điện tử mạnh nên 2 nhóm –OH gắn với 2 carbon ở vùng trường cao δC: 168,4 (kề bên là carbon ở vùng trường δC: 104) và δC: 166,8 (kề bên là carbon ở vùng trường δC: 112,2). Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 4: K ẾT QUẢ V À THẢO LUẬN 29 ­ Tại δH: 10,32 (hydro nhóm –CHO) có các tín hiệu giao nhau tại δC: 168,4 ; δC: 166,8 (2 carbon vòng benzene gắn nhóm –OH) và δC: 108,6; nên nhóm –CHO g ắn với carbon ở vùng trường δC: 108,6 . ­ Tại δH: 2,51 (hydro nhóm –CH3) có các tín hiệu giao nhau tại δC: 152, 5; δC: 112,2 và δC: 104 (3 carbon kề nhau của vòng benzene). Carbon ở vùng trường δC: 152,3 ở giữa 2 carbon kia nên nhóm –CH3 gắn với carbon này. ­ Proton trên vòng benzene ở vùng trường δH: 6,27 ch ỉ có thể gắn với 1 trong 2 carbon chưa có nhóm thế còn lại trên vòng ở vùng trường δC: 112,2 và δC: 104; nhưng do không có tín hiệu giao nhau tại δC: 112,2 nên proton gắn với carbon ở vùng trường δC: 112,2. ­ Tại δH: 3,95 (hydro nhóm –OCH 3) có tín hiệu giao nhau duy nhất tại δC: 172,1 (carbon nhóm –COO –) nên đây là nhóm ester –COOCH 3. Nhóm –COOCH 3 gắn với carbon còn lại trên vòng ở vùng trường δC: 104. 4.1.2 Kết luận Tổng hợp dữ liệu từ các phổ 1H­NMR, 13C­NMR, DEPT, HMBC c ủa hợp chất HP1, công thức cấu tạo của hợp chất HP1 được xác định là methyl haematommate (methyl 3­formyl­2,4­dihydroxy­6 ­methylbenzoate ), công thức phân tử là C10H10O 5 . Methyl haematommate đã được báo cáo có hoạt tính kháng một số loại nấm ngoài da và vi khuẩn [16]. So sánh số liệu phổ NMR của HP1 với hợp chất methyl haematommate trong tài liệu tham khảo [16,17] đều trùng khớp với nhau. Vậy công thức cấu tạo của HP1 là: B ảng 4.1: Số liệu phổ 1H­NMR (CDCl 3, 500 MHz) và 13C­NMR (CDCl 3, 125 MHz) của hợp chất HP1. Vị trí C Loại carbon 13C­NMR δC ppm 1H­NMR δH ppm HMBC (1H → 13C) 1 =C< 104,0 2 =C< 168,4 12,86 (1H, s, –OH ) H→C1,C2,C3 3 =C< 108, 6 4 =C< 166,8 12,39 (1H, s, –OH) H→C3,C4,C5 5 =CH– 112,2 6,27 (1H, s , =CH–) H5 →C1,C3,C4,C8 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 4: K ẾT QUẢ V À THẢO LUẬN 30 6 =C< 152, 5 –CHO 194,0 10,32 (1H, s, –CHO ) H→ C2,C3,C4 –COO – 172,1 –OCH 3 52,4 3,95 (3H, s , –OCH 3) H→C7 –CH3 25,3 2,51 ( 3H, s, –CH3) H→ C1,C5 ,C6 B ảng 4.2: So sánh số liệu phổ 1H­NMR và 13C­NMR c ủa hợp chất HP1 và methyl haematommate trong tài liệu [17]. Vị trí C Loại carbon 13C­NMR (CDCl3) δC ppm 1H­NMR (CDCl 3) δH ppm HP1 (500 MHz) [17] (400 MHz) HP1 (125 MHz) [17] (100 MHz) 1 =C< 104,0 103,9 2 =C< 168,4 168,3 12,86 (1H, s, –OH) 12,89 (1H, s, –OH) 3 =C< 108, 6 108,4 4 =C< 166, 8 166,6 12,39 (1H, s, –OH) 12,41 (1H, s, –OH) 5 =CH– 112,2 111,2 6,27 (1H, s, =CH –) 6,29 (1H, s, =CH –) 6 =C< 152, 5 152,3 –CHO 194, 0 194,0 10,32 (1H, s, –CHO) 10,34 (1H, s, –CHO) –COO – 172,1 172,0 –OCH 3 52,4 52,3 3,95 (3H, s, –OCH 3) 3,96 (3H, s, –OCH 3) –CH3 25,3 25,2 2,51 (3H, s, –CH3) 2,53 (3H, s, –CH3) 4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết địa y và hợp chất HP1 đánh giá bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH Nồng độ DPPH trong mẫu thử luôn là 50 µM. 4.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa của ascorbic acid (vitamin C) B ảng 4.3: Phần trăm ức chế của ascorbic acid theo nồng độ trong từng mẫu thử. Nồng độ ascorbic acid trong mẫu thử (µM) Độ hấp thu mẫu thử % Ức chế (I%) 0 0,2190 0,00 5 0,2109 3,70 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT QU Ả VÀ THẢO LU ẬN 31 10 0,18 45 15 ,75 15 0,15 9 5 27,17 20 0,1230 43,8 4 25 0,08 9 7 5 9 ,04 Từ phương trình tuyến tính, ta có IC5 0 của ascorbic acid là: IC = 50 + 11,73 2,775 = 22,25 μM tương đương IC = 3,92 μg/mL 4.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng B ảng 4.4: Phần trăm ức chế của cao tổng theo nồng độ trong từng mẫu thử. Nồng độ cao tổng trong mẫu thử (µg/mL) Độ hấp thu mẫu thử Độ hấp thu dd cao cùng nồng độ mẫu thử Độ hấp thu đã trừ độ hấp thu của cao % Ức chế (I%) 0 0,219 3 0 0,219 3 0 5 0 0,1743 0,001 0,1733 20,9 8 100 0,146 2 0,005 0,1412 35 ,6 1 15 0 0,128 7 0,008 0,1207 44,9 6 200 0,108 2 0,011 0,09 72 5 5 ,6 8 25 0 0,08 37 0,013 0,0707 6 7,76 300 0,06 71 0,017 0,05 01 77,15 y = 2,775 x ­ 11,73 R ² = 0,9 9 3 0 10 20 30 40 5 0 6 0 70 0 5 10 15 20 25 30 I% Nồng độ ascorbic acid (µM) Hình 4.2: Bi ểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ ascorbic acid. Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT QU Ả VÀ THẢO LU ẬN 32 Từ phương trình tuyến tính, ta có IC5 0 của cao tổng là: IC = 50 − 11,55 0,221 = 173,98 µg/mL IC5 0 của cao tổng gấp 44 lần so với ascorbic acid, hay khả năng khử gốc tự do DPPH của ascorbic acid mạnh hơn cao tổng khoảng 44 lần. 4.2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao petroleum ether B ảng 4.5 : Phần trăm ức chế của cao PE theo nồng độ trong từng mẫu thử. Nồng độ cao PE trong mẫu thử (µg/mL) Độ hấp thu mẫu thử Độ hấp thu dd cao cùng nồng độ mẫu thử Độ hấp thu đã trừ độ hấp thu của cao % Ức chế (I%) 0 0,218 4 0 0,218 4 0,00 100 0,178 0,0021 0,175 9 19 ,46 200 0,15 3 0,0040 0,149 31,78 300 0,130 0,005 8 0,1242 43,13 400 0,109 0,0076 0,1014 5 3,5 7 5 00 0,09 2 0,009 0 0,08 3 6 2,00 6 00 0,072 0,0109 0,06 11 72,02 y = 0,221x + 11,5 5 R ² = 0,9 9 6 0 20 40 6 0 8 0 100 0 100 200 300 400 I% Nồng độ cao tổng (µg/mL) Hình 4.3: Bi ểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ cao tổng. Hình 4.4: B iểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ cao PE. y = 0,104x + 10,6 0 R ² = 0,9 9 6 0 20 40 6 0 8 0 0 100 200 300 400 5 00 6 00 700 I% Nồng độ cao PE (µg/mL) Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT QU Ả VÀ THẢO LU ẬN 33 Từ phương trình tuyến tính, ta có IC5 0 của cao petroleum ether là: IC = 50 − 10,60 0,104 = 378,85 µg/mL IC5 0 của cao PE gấp 9 7 lần so với ascorbic acid, hay khả năng khử gốc tự do DPPH của ascorbic acid mạnh hơn cao PE khoảng 9 7 lần. 4.2.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethyl acetate B ảng 4.6 : Phần trăm ức chế của cao EtO Ac theo nồng độ trong từng mẫu thử. Từ phương trình tuyến tính, ta có IC5 0 của cao ethyl acetate là: IC = 50 + 0,843 0,641 = 79,32 µg/mL IC5 0 của cao EtO Ac gấp 20 lần so với ascorbic acid, hay khả năng khử gốc tự do DPPH của ascorbic acid mạnh hơn cao EtO Ac khoảng 20 lần. Cao EtO Ac có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất trong các loại cao chiết từ địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi. Nồng độ cao EtO Ac trong mẫu thử (µg/mL) Độ hấp thu mẫu thử Độ hấp thu dd cao cùng nồng độ mẫu thử Độ hấp thu đã trừ độ hấp thu của cao % Ức chế (I%) 0 0,215 1 0 0,215 1 0,00 20 0,19 5 3 0,0034 0,19 19 10,79 40 0,16 8 0 0,0103 0,15 77 26 ,6 9 6 0 0,149 0 0,0147 0,1343 37,5 6 8 0 0,128 3 0,0215 0,106 8 5 0,35 100 0,1073 0,025 7 0,08 16 6 2,06 120 0,08 19 0,0319 0,05 00 76 ,76 y = 0,6 41x ­ 0,8 43 R ² = 0,9 9 7 0 20 40 6 0 8 0 100 0 5 0 100 15 0 I% Nồng độ cao EtOAc (µg/mL) Hình 4.5 : B iểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ cao EtO Ac. Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT QU Ả VÀ THẢO LU ẬN 34 4.2.5 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao nước B ảng 4.7: Phần trăm ức chế của cao nước theo nồng độ trong từng mẫu thử. Từ phương trình tuyến tính, ta có IC5 0 của cao nước là: IC = 50 + 1,651 0,105 = 491,91 μg/mL IC5 0 của cao nước gấp 125 lần so với ascorbic acid, hay khả năng khử gốc tự do DPPH của ascorbic acid mạnh hơn cao nước khoảng 125 lần. Nồng độ cao nước trong mẫu thử (µg/mL) Độ hấp thu mẫu thử Độ hấp thu dd cao cùng nồng độ mẫu thử Độ hấp thu đã trừ độ hấp thu của cao % Ức chế (I%) 0 0,218 8 0 0,218 8 0,00 100 0,2037 0,004 0,19 9 7 8 ,73 200 0,18 22 0,008 5 0,1737 20,6 1 300 0,16 79 0,0125 0,15 5 4 28 ,9 8 400 0,148 6 0,015 1 0,1335 38 ,9 9 5 00 0,1239 0,019 5 0,1044 5 2,29 6 00 0,1079 0,0233 0,08 46 6 1,33 Hình 4.6 : B iểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ cao nước. y = 0,105 x ­ 1,6 5 1 R ² = 0,9 9 6 0 10 20 30 40 5 0 6 0 70 0 100 200 300 400 5 00 6 00 700 I% Nồng độ cao nước (µg/mL) Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT QU Ả VÀ THẢO LU ẬN 35 4.2.6 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất HP1: methyl haematommate B ảng 4.8 : Phần trăm ức chế của hợp chất HP1 theo nồng độ trong từng mẫu thử. Từ phương trình tuyến tính, ta có IC5 0 của hợp chất methyl haematommate là: IC = 50 − 2,311 0,123 = 387,72 μg/mL IC5 0 của methyl haematommate gấp 9 9 lần so với ascorbic acid, hay khả năng khử gốc tự do DPPH của ascorbic acid mạnh hơn HP1 khoảng 9 9 lần. Nồng độ HP1 trong mẫu thử (µg/mL) Độ hấp thu mẫu thử % Ức chế (I%) 0 0,219 8 0,00 20 0,208 8 5 ,00 40 0,2044 7,01 6 0 0,19 9 1 9 ,42 8 0 0,19 19 12,6 9 100 0,18 74 14,74 120 0,18 23 17,06 Hình 4.7: B iểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ HP1. y = 0,123x + 2,311 R ² = 0,9 9 5 0 5 10 15 20 0 20 40 6 0 8 0 100 120 140 I% Nồng độ HP1 (µg/mL) Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 5 : KẾT LU ẬN VÀ KIẾN NG HỊ 36 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thời gian thực hiện đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi”, đã đạt được một số kết quả sau: ­ Từ lượng địa y thu được đã điều chế được các loại cao có độ phân cực khác nhau: cao tổng, cao petroleum ether, cao ethyl acetate, cao nước. ­ Từ cao petroleum ether, đã phân lập được 1 hợp chất tinh khiết, ký hiệu là HP1. Xác định cấu trúc hóa học của nó bằng phổ 1H­NMR , 13C­NMR , DEPT, HMB C, đã xác định được đây là hợp chất methyl 3­formyl­2,4­dihydroxy­6 ­ methylbenzoate (methyl haematommate) (24). ­ Khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH: cao tổng, cao petroleum ether, cao ethyl acetate, cao nước và hợp chất tinh khiết HP1. Kết quả cho thấy không có cao hay hợp chất nào kháng oxy hóa mạnh hơn ascorbic acid (vitamin C), chỉ có cao ethyl acetate có hoạt tính kháng oxy hóa khá với IC5 0 = 79 ,32 µg/mL (tốt nhất trong các loại cao) so với IC5 0 = 3,9 2 µg/mL của vitamin C. 5.2 Kiến nghị ­ Tiếp tục khảo sát thành phần hóa học các phân đoạn còn lại của cao petroleum ether và cao ethyl acetate, cao nước từ địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi. ­ Tiến hành khảo sát các hoạt tính sinh học khác như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư của các loại cao chiết cũng như các hợp chất phân lập được. 24 Luận văn tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Aptroot, A. and Sparrius, B .L. (2006 ). Additions to the Lichen Flora of Vietnam, with an annotated checklist and bibliography. The B ryologist, 109 (3): 35 8 ­371. [2]. Karunaratne, V., B ombuwela, K., Kathirgamanathar, S. and Thadhani, V. (2005 ). Lichens: A Chemically Important B iota. Journal of the National Science Foundation of Sri Lanka, 33(3): 16 9 . [3]. Huneck, S. and Yoshimura, I. (19 9 6 ). Identification of Lichen Substances. Springer. Verlag B erlin Heidelberg, G ermany. pp. 1­9 . [4]. Mitrović, T., Stamenković, S., Cvetković, V., Nikolić, M., Tošić, S. and Stojičić, D. (2011). Lichens as source of versatile bioactive compounds. B iologica Nyssana, 2(1): 1­5 . [5 ]. Le Hoang Duy (2012). Chemical study of common lichens in the South of Vietnam. Doctoral thesis. Kobe Pharmaceutical U niversity. Kobe, Japan. pp. 1. [6 ]. Nash, H. T. III. (2008 ). Lichen B iology. 2nd. Cambrigde U niversity Press. New york, U nited States of America. pp. 8 8 ­9 3, 29 9 ­300. [7]. Hale, E. M. (19 79 ). How to know the lichens. 2nd. Wm. C. B rown Company. U nited States of America. pp. 2. [8 ]. Nash, H. T. III. (2008 ). Lichen B iology. 2nd. Cambrigde U niversity Press. New york, U nited States of America. pp. 130­133. [9 ]. Le Hoang Duy (2012). Chemical study of common lichens in the South of Vietnam. Doctoral thesis. Kobe Pharmaceutical U niversity. Kobe, Japan. pp. 2. [10]. Müller, K. (2001). Pharmaceutically relevant metabolites from lichens. Appl Microbiol B iotechnol, 5 6 : 9 ­16 . [11]. Huneck, S. and Yoshimura, I. (19 9 6 ). Identification of Lichen Substances. Springer. Verlag B erlin Heidelberg, G ermany. [12]. Elix, J. A. (2009 ). Dirinaria. Fl. Australia, 5 7: 5 09 ­5 17. [13]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. Nhà xuất bản Đại Học Quốc G ia TP.Hồ Chí Minh. TP.Hồ Chí Minh, Việt Nam. [14]. Kedare, B . S. and Singh, P. R . (2011). G enesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J Food Sci Technol, 48 (4): 412–422. [15 ]. Sharma, P. O . and B hat, K. T. (2009 ). DPPH antioxidant assay revisited. Food Chemistry, 113: 1202­1205 . Luận văn tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 [16 ]. Hickey, B . J., Lumsden, A. J., Cole, A. L. J. and Walker, J. R . L. (19 9 0). Antibiotic compounds from New Zealand plants: Methyl haematommate, an anti­fungal agent from Stereocaulon ramulosum. New Zealand Natural Sciences, 17: 49 ­5 3. [17]. Seo, C., HanYim, J., Lee, H. K. and O h, H. (2011). PTP1B inhibitory secondary metabolites from the Antarctic lichen Lecidella carpathica. Mycology, 2(1): 18 ­23. Luận văn tốt nghiệp Phụ lục 1: Phổ 1H­NMR 39 PHỤ LỤC của hợp chất HP1. PHỤ LỤC Luận văn tốt nghiệp PHỤ LỤC 40 Phụ lục 2: Phổ DEPT của hợp chất HP1. Luận văn tốt nghiệp PHỤ LỤC 41 Phụ lục 3: Phổ 13C­NMR của hợp chất HP1. Luận văn tốt nghiệp PHỤ LỤC 42 Phụ lục 4: Phổ HMB C của hợp chất HP1. Luận văn tốt nghiệp PHỤ LỤC 43