Khóa luận Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa chất lượng miền Nam bằng chỉ thị SSR

*Nguyên lý của RAPD: RAPD (đa hình các đoạn gen khuếch đại ngẫu nhiên) là một trong những phương pháp nghiên cứu đa hình dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR do William (1990), Wesh và cs. phát minh [33]. Nguyên lý của phương pháp là: sử dụng một đoạn oligonucleotide có kích thước 8 – 12 (thông thường là 10) nucleotide không cần biết trước trình tự làm mồi cho phản ứng PCR. Các đoạn oligonucleotide đó do vậy có thể làm mồi xuôi, hoặc có thể là mồi ngược. Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở bất kì vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó. Theo tính toán một mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotide thì xắc suất bắt cặp của nó là:1/410 =1/1.048.576, có nghĩa là một đoạn ADN khuôn có 1.048.576 cặp nucleotide thì có 1 trình tự bắt cặp với mồi. Giả sử một hệ genome đơn bội của lúa có kích thước 550.000.000 bp thì với loại mồi ngẫu nhiên trên có thể có 524 vị trí bắt cặp với mồi, nghĩa là có thể có 262 đoạn ADN được nhân lên. Trong thực tế số lượng các đoạn được nhân bội nhỏ hơn nhiều vì nó phụ thuộc vào độ dài đoạn được nhân và sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trên ADN của bộ gen. Khi phân tích đa hình di truyền bằng phương pháp RAPD, nếu 2 cá thể có bộ gen hoàn toàn giống nhau thì khi tiến hành phản ứng PCR – RAPD với bất kì mồi nào cũng cho các băng ADN giống nhau. Nếu chúng ít nhiều có sự khác nhau về bộ gen thì với một số mồi sẽ cho những băng khác nhau giữa chúng. Sự khác nhau này thể hiện sự đa hình di truyền của các cá thể cần nghiên cứu. Do đó, nó được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm di truyền phân tử. Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 16 Lớp K34SP - Sinh *Ứng dụng của phương pháp: ngoài ứng dụng trong phân tích đa hình di truyền, RAPD còn được sử dụng cho các mục đích sau: - Phân tích con lai F1giữa bố mẹ đa hình với một mồi nào đó. Khi đó con lai F1 sẽ có tất cả các băng ADN của bố và mẹ; - Lập bản đồ gen liên kết; - In dấu vân tay ADN; - Phân tích di truyền của các quần thể. d. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) Trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, chỉ thị SSR là một trong những chỉ thị được dùng phổ biến nhất bởi kỹ thuật đơn giản và cho độ chính xác cao. SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự ADN đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm 1 - 6bp. (Litt and Luty, 1989) [20]. Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn. Thông thường có các kiểu lặp lại: - Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau. - Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác. - Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau. Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật. Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 17 Lớp K34SP - Sinh Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn ADN nhờ phản ứng PCR. Kích thước của sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp). Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lượng (QTL). - Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR Thuận lợi to lớn của sự phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn sự đa hình. Hơn nữa, khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gel, xác định cây trồng và phân tích mối quan hệ di truyền. SSR được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu cấu trúc di truyền lúa trồng O. sativa, nghiên cứu quá trình tiến hóa, làm rõ độ thuần của vật liệu lai tạo giống..., do đây là chỉ thị đồng trội cho đa hình cao và ổn định. Hiện nay, hơn 15.000 chỉ thị SSR đã được thiết lập [35], phủ kín trên bản đồ liên kết di truyền của lúa (Giarrocco và ctv, 2007) [16]. Trong những năm gần đây, nhiều công trình sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền và ADN fingerprinting để nhận dạng giống ở lúa đã được công bố (Kalyan và ctv, 2006) [19] ; Navraj và ctv, 2009 [23]. Đã có khoảng 2740 chỉ thị SSR cho toàn bộ Bộ gen lúa và như vậy trung bình cứ 157kp của phân tử ADN có một chỉ thị SSR (Akagi và ctv, 1996 [9]; Chen và ctv, 1997 [11]; Chen và ctv, 2002 [12]; Cho và ctv, 2000 Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 18 Lớp K34SP - Sinh [13]; Paunaud và ctv, (1996) [27] ; Temnykh, 2000 [30]; Temnykh, 2001 [29]). SSR là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm. Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker khác như AFLP và RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gel trở nên dễ dàng hơn. SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền. Chẳng hạn, tác giả Parasnis phát hiện đoạn lặp lại GATA kích thước 5kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ cái bằng marker SSR. Hạn chế của kỹ thuật SSR là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau. 1.4. Tổng quan về lúa chất lượng 1.4.1. Tính trạng mùi thơm Ahn và cs., (1992) [8] báo cáo chỉ thị RG 28 liên kết với gel điều kiển mùi thơm cây lúa fgr nằm trên NST số 8 của giống lúa Della và Basmati 370. Theo Lorieux và cs., (1995) [21] có 4 loại chỉ thị phân tử (RFLP, RAPD, STS, izozym) được sử dụng lập bản đồ chỉ thị phân tử cho gel điều khiển mùi thơm, kết quả xác định, có nhiều chỉ thị trên nhiễm sắc thể số 8 liên kết chặt chẽ với gel điều khiển sự hiện diện của 2-AP (2 – axetyl – 1 – pyroline), hợp chất chính tạo ra mùi thơm của lúa. Jin và cs., (1996) [18] dùng 300 RAPD điều tra đa hình tính trạng thơm của con lai từ giống bố mẹ Khao Dawk Mali 105 (thơm) và CT 9993 (không thơm), kết quả cho thấy tính đa Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 19 Lớp K34SP - Sinh hình giữa hai giống khá cao (64,1%). Neelu Jain và cs., (2003) [26] sử dụng 15 chỉ thị SSR đã được sắp xếp trên nhiễm sắc thể số 8. Garland và cs., (2000) [15] phân tích sự đa dạng về chất lượng gạo của 12 giống lúa Basmati trên thị trường sử dụng các chỉ thị SSR cho mật độ đa hình cao giữa giống Basmati thơm và không thơm. Shu Xia Sun và cs., (2008) [28] tiến hành kiểm tra gel thơm và không thơm trên lúa ở nhiễm sắc thể số 8 bằng kỹ thuật SSR với tám cặp mồi. Kết quả cho thấy rằng cặp mồi Ch - 29B và R2 không đa hình mà chỉ cặp mồi Aro7 đa hình, kích thước của cặp mồi Aro7 được xác định 302 bp. Ngoài ra, cũng xác định được mồi RM23097 liên kết với locus hương thơm với khoảng cách là 0,71 cM. Các gen thơm (fgr) được thể hiện giữa marker Aro7 (0,57 cM) và RM515 (0,71 cM). Dựa trên cơ sở liên kết phân tử và BAC (bacterial artificial chromosome) trên nhiễm sắc thể số 8 được xây dựng (hình 1) [27]. Hình 1.1: Vi trí gen thơm trên nhiễm sắc thể số 8 1.4.2. Các tính trạng chất lượng Ngoài tính trạng của mùi thơm, chất lượng của lúa phụ thuộc nhiều yếu tố như hàm lượng amyloza, hàm lượng protein, dạng nội nhũ Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 20 Lớp K34SP - Sinh a. Tính trạng amyloza Nhiều nghiên cứu cho thấy, hàm lượng amyloza có liên quan mật thiết đến độ hóa hồ. He và cs., (1999), sử dụng chỉ thị CT 201 – RZ 450 để nghiên cứu hệ di truyền độ hóa hồ trên con lai F1 ZY Q8 (O.indica) và ZX 17 (O.japodica) kết quả cho thấy cả gen chính và gel phụ của độ hóa hồ đều nằm trên nhiễm sắc thể số 6. Thực tế về kiểu hình cho thấy, khả năng hóa hồ quyêt định rất lớn hàm lượng amyloza (Trương Bá Thảo, 2006) [7]. b. Tính trạng hàm lượng protein Đặc điểm di truyền về hàm lượng protein do đa gel kiểm soát phân bố trên các nhiễm sắc thể số 1, 2, 4, 6, 9, 12, (các thành phần của glutein) nhiễm sắc thể 7, 11, (protein dự trữ trong nội nhũ) nhiễm sắc thẻ 5, 7, 12, (các thành phần của prolamin). Hàm lượng protein biến đổi mạnh mẽ do tác động của môi trường từ 0,130 đến 0,372. Kết quả nghiên cứu của Shenoy và cs., (1991), chứng tỏ rằng hệ số di truyền hàm lượng protein đạt 71%. Một số cặp lai nghiên cứu cho thấy hệ số di truyền hàm lượng protein rất thấp 11,1%. Từ những biến động đó cần phải phân nhóm di truyền trên các nhóm khác của các giống lúa địa phương, xem như là nguồn vật liệu lai phục vụ cho chương trình chọn giống lúa tốt hơn. 1.4.3. Nghiên cứu chọn tạo lúa chất lượng Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế bắt đầu phát triển giống lúa thơm Basmati năng suất cao vào đầu năm 1970. Nghiên cứu được thực hiện trên những cặp lai đầu tiên, giữa giống lúa Basmati 370 và các dòng lúa Indica cải tiến có hàm lượng amyloza trung bình và nhiệt độ hóa hồ trung bình. Những dòng thấp cây từ quần thể con lai được chọn lọc, những dòng này có mức độ hữu thụ khác nhau và dạng cây khác nhau. Sau khi tiến hành lai chéo các dòng này Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 21 Lớp K34SP - Sinh thu được các dạng cây và độ hữu thụ khác nhau. Những cây có dạng khỏe và độ hữu thụ cao được chọn ra để phân tích hàm lượng amyloza, nhiệt độ hóa hồ và hương thơm. Những dòng có dạng cây xấu, độ hữu thụ thấp, chất lượng hạt kém và độ thơm thấp được loại bỏ qua các thế hệ. Sau một số chu kỳ lai và chọn lọc những dòng có dạng cây khỏe, thấp cây, đáp ứng được các đặc điểm về chất lượng như Basmati được chọn lọc và tiến hành khảo nghiệm tại IRRI, Ấn Độ và Pakistan [11]. Tác giả Song và cộng sự tiến hành nghiên cứu hương thơm lá lúa giữa lúa thơm nhị bội thể và lúa không thơm tứ bội thể, kết quả cho thấy tỷ lệ giữa các cây không có hương thơm và cây có hương thơm là 35:1 ở thế hệ F1 và 3:1 ở thế hệ F2. Ren và cộng tác viên khi lai giữa dòng lúa thơm bất dục đực tế bào chất (dòng A) với dòng phục hồi không thơm (dòng R) thì thu được hạt không thơm ở thế hệ F1, hạt ở F2 phân ly theo tỷ lệ không thơm và thơm là 15:1. Hạt thu được ở F1 và F2 đều có hương thơm khi lai giữa bố và mẹ là những giống lúa thơm. Với sự phát hiện ra cây lúa dại có hạt phấn bất thụ vào 1970, các nhà khoa học Trung Quốc, Ấn Độ và IRRI đã tạo ra một số dòng CMS - bất dục đực thuộc tế bào chất (A), dòng bảo tồn thích ứng (B), và dòng phục hồi (R) thích hợp để sản xuất ra những tổ hợp lúa lai đa dạng. Những tổ hợp lai 3 dòng đầu tiên của Trung Quốc gồm có Wei-you 2, Wei-you 3, Wei-you 6, Shan-you 2, Shan-you 3, Shan-you 6, Nam-you 2, Nam-you 3, Si-you 2, Si- you 3 và Si-you 6 [22]. Sau khi tạo ra những dòng CMS với loại WA (wild - abortive), những dòng CMS khác cũng lần lượt được tạo ra như Zhenshan 97A, V20A, Erjiu Ai 4A, Erjiu Nan 1A, V41A [22]. Ở Philippines, IRRI đã dùng các CMS từ V20A, Kaliya 1. ARC, Gambiaka, v.v. để tạo ra các CMS thích hợp với khí hậu nhiệt đới, như: IR8025A, IR68275A, IR68281A, IR68273A, IR68888A, Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 22 Lớp K34SP - Sinh IR68891A, IR68893A, v.v. Tương tự, dòng CMS được tạo ra từ các nguồn tế bào chất của O. perennis (IR66707A) và O. rufipogon (OMS1) [31], [24]. Như vậy, nền tảng di truyền của các dòng CMS đã được đa dạng hóa và gia tăng ngày càng nhiều hơn. Các loại lúa lai được đưa ra đồng ruộng đầu tiên của Trung Quốc có năng suất cao, nhưng chất lượng kém. Gần đây, các tổ hợp 3 dòng như Boyou 64, Xieyou 63 và Xieyou 64 có chất lượng cao. Các tổ hợp You I63 và You I64 có hạt gạo dài và trung bình. Các CMS có gạo thơm cũng được tạo ra, như Xiang A và B và các tổ hợp thơm như XiangA/PH 137, Xiang A/F50 và Xiang A/F 117 có năng suất tương tự như các tổ hợp không thơm và được đưa ra sản xuất [32]. Các tổ hợp lai của IRRI, Ấn Độ, Philippines, Bangladesh, Indonesia và Việt Nam đều có chất lượng tương đối cao. Dựa trên đặc tính quang cảm và nhiệt cảm của cây lúa để tạo lúa lai 2 dòng. Những giống lúa quang cảm trở nên bất thụ đực khi được trồng trong những ngày dài có ánh sáng từ 14 giờ trở lên, được gọi dòng PGMS (Photoperiod-sensitive genic male sterility). Những giống lúa trở nên bất thụ đực khi được trồng ở những nơi có nhiệt độ hơi thấp, từ 28oC trở xuống, được gọi là dòng TGMS (Temperature-sensitive genic male sterility). Năm 1983, dòng PGMS được tìm thấy ở tỉnh Hubei, Trung Quốc và trong 1987 gen tương hợp lúa dại giữa lúa Japonica và lúa Indica được nghiên cứu ở Nhật Bản. Trong thời gian qua, các nghiên cứu về kỹ thuật tạo lúa lai 2 dòng đã có những kết quả khả quan, chủ yếu là ở Trung Quốc. Lúa lai một dòng hay còn gọi apomixis (sinh sản vô tính) có thể giúp nông dân sử dụng chính hạt giống của mình cho vụ mùa kế tiếp, mà không bị ảnh hưởng phân ly của lúa lai 2 hoặc 3 dòng. Tuy nhiên, công tác nghiên cứu lúa lai một dòng trong 3 thập niên qua chưa có triển vọng nhiều. Một phương pháp lai tạo giống khác đã được các nhà chọn giống Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 23 Lớp K34SP - Sinh Myanma và Thái Lan thực hiện đó là phương pháp chọn lọc liên kết với chỉ thị phân tử (MAS). Để cải tiến giống lúa Manawthukha, một giống không thơm và hàm lượng amyloza cao được trồng với một diện tích lớn ở Myanma. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng giống Basmati 370 là dòng bố mẹ để lai nhập các gen mùi thơm vào giống Manawthukha bằng phương pháp Marker Assisted Backcrossing (MAB). Bốn dòng lai nghịch và một dòng gốc được làm vật dẫn truyền để chuyển các alen badh2 và Wx từ giống Basmati vào giống Manawthukha. Hai mươi dòng lúa ở thế hệ BC4F2 đã chọn lọc mang các alen đồng hợp của giống Basmati, được trồng ở các địa điểm khác nhau ở Myanma và Thái Lan và được kiểm tra các đặc điểm nông học, chất lượng gạo. Lúa thu hoạch được ở các dòng cải tiến đã có đặc tính mùi thơm và chất lượng gạo tương tự như giống Basmati nhưng có đặc điểm nông học giống như giống Manawthukha ban đầu. Các dòng lúa cải tiến có đặc điểm cây cao trung bình, đẻ nhánh tốt, bông dày, chống đổ và có năng suất cao. Ở Việt Nam, chương trình lúa lai được bắt đầu thực hiện vào những năm 1980 dưới sự chỉ đạo trực tiếp của Bộ Nông nghiệp. Một số tổ hợp lai của Trung Quốc như Sán Ưu 63 (Shanyou 63), Sán Ưu Quế (Shanyou gui 99), Nhị Ưu 63 (Jinyou 63), Nhị Ưu 838, Bác Ưu 64 (Boyou 64), Bác Ưu 693, Bồi Tạp Sơn Thanh (Peiai 64S/Sơn Thanh) và Bồi Tạp dòng 49 (Peiai 64S/Dòng 49), Trang Nông 15 đã được trồng đại trà trong nước. Những tổ hợp lai tạo bản xứ như HR1, HYT56, HYT57, VN01/D212, AMS24A/Que99, MS24A/IR9761-19, v.v. cũng được trồng rộng rãi ở miền Bắc. Các nhà chọn giống Việt Nam đã cố gắng lai tạo giống cao sản có hương thơm với các vật liệu bố mẹ cho gen thơm từ giống Basmati và Khao Dawk Mali, tuy nhiên chưa thành công. Một số ứng dụng đột biến gel trên giống Nàng thơm Chợ Đào, Tám thơm, hoặc sử dụng chúng làm bố mẹ trong lai tạo. Có thể do khả năng kết hợp kém nên việc chọn lọc con lai rất khó Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 24 Lớp K34SP - Sinh khăn. Đặc biệt trong trường hợp tổ hợp lai OM1262 = MTL61/Basmati 370, OM1277 = OM86-9/Basmati, OM1262 = IR66/Basmati, con lai được chọn ở thế hệ thứ 10, 11 vẫn chưa cho quần thể ổn định, mặc dù dạng hình chấp nhận (PACP) khá tốt, hàm lượng amyloza trung bình, gạo hạt thon dài [6]. Trong năm 2002, khoảng 500.000 ha lúa lai được trồng ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam. Trong đó, sử dụng khoảng 80% hạt giống lai nhập nội từ Trung Quốc, Việt Nam chỉ tự túc được 20% nhu cầu hạt giống lúa lai trong nước. Đến nay, Việt Nam cũng chưa có chính sách và quy hoạch tích cực cho việc tự cung đối với nguồn hạt giống lai. Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 25 Lớp K34SP - Sinh CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu thực vật Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu là tập đoàn bao gồm 11 giống lúa chất lượng được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, đang được lưu giữ và bảo tồn tại Ngân hàng gen hạt của Trung tâm Tài Nguyên Thực vật và ngân hàng gen Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long (Bảng 2.1) Bảng 2.6: Danh sách các giống lúa thu thập dùng trong nghiên cứu TT Tên giống Nguồn gốc Kí hiệu 1 Mao chệt Quảng Ngãi C39 2 Nếp ông táo Long An C40 3 Nàng thơm đặc sản TPHCM C41 4 Nàng thơm chợ đào Long An C42 5 OM 3536 Vĩnh Long C44 6 Nàng Nhen An Giang C45 7 Thơm Lài An Giang C46 8 Thơm mắn Lâm Đồng C47 9 Thơm lùn mùa Cần Thơ C48 10 Vàng Ba Danh Bạc Liêu C49 11 Huyết rồng 4 Bạc Liêu C50 2.1.2. Hoá chất Các hoá chất sinh học phân tử cần thiết: các hoá chất tách chiết ADN, hoá chất làm PCR, hoá chất chạy gel agarose, gel polyacrylamide Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 26 Lớp K34SP - Sinh  Hoá chất tách chiết ADN - Hoá chất tách chiết ADN bao gồm các loại như: Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, Ethanol của các hãng Sigma, Merck, Prolabo, ICN, Labscan. - Đệm tách chiết ADN của mẫu lá: - Đệm CTAB (pha 100ml) 28 ml NaCl 5M 10 ml Tris HCl 1M(pH 8) 20 l EDTA 0,1M(pH 8) 2g CTAB 0,5g Natri bisulfit 2g PVP - Phenol : chloroform : isoamyl acohol 70% (25:24:1) - Ethanol 100% (hoặc Isopropanol) và Ethanol 70%  Hoá chất dùng để chạy phản ứng PCR: - Đệm PCR 1X (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2 , 5 mM KCl) hoặc đệm PCR 1X của Quiagen hoặc Invitrogen. - MgCl2 của Fermentas hoặc Invitrogen. - dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP (hoặc dUTP)) của Fermentas, Invitrogen. - Mồi, ADN Ultralow marker của hãng Fermentas, Invitrogen. - Taq polymerase của Fermentas  Hoá chất chạy điện di: - Điện di gel agarose gồm các hoá chất: TAE, Chất nhuộm Bromophenol blue, Ethidium bromide, agarose - Điện di gel polyacrylamide gồm các hóa chất: Dung dịch acrylamide, APS, Temed, Chất nhuộm Bromophenol blue, Ethidium bromide Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 27 Lớp K34SP - Sinh  Các mồi SSR dùng trong nghiên cứu: Trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng 15 cặp mồi SSR để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 NST khác nhau đã được McCouch và cs công bố (McCouch etal; 2002) (Bảng 2.7): Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 28 Lớp K34SP - Sinh Bảng 2.7: Thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu TT Tên mồi Trình tự mồi NST Kích thước (bp) 1 RM 13 3’-TCCAACATGGCAAGAGAGAG-5’ 5’-GGTGGCATTCGATTCCAG-3’ 5 124-154 2 RM 30 3’-GGTTAGGCATCGTCACGG-5’ 5’-TCACCTCACCACACGACACG-3’ 6 171-183 3 RM 282 3’-CTGTGTCGAAAGGCTGCAC-5’ 5’ –CAGTCCTGTGTTGCAGCAAG-3’ 3 128-151 4 RM 135 3’-CTCTGTCTCCTCCCCCGCGTCG-5’ 5’-TCAGCTTCTGGCCGGCCTCCTC-3’ 3 119-131 5 RM 142 3’-CTCGCTATCGCCATCGCCATCG-5’ 5’-TCGAGCCATCGCTGGATGGAGG-3’ 4 235-238 6 RM 143 3’-GTCCCGAACCCTAGCCCGAGGG-5’ 5’-AGAGGCCCTCCACATGGCGACC-3’ 3 195-207 7 RM 270 3’-GGCCGTTGGTTCTAAAATC-5’ 5’-TGCGCAGTATCATCGGCGAG-3’ 12 104-117 8 RM 153 3’-GCCTCGAGCATCATCATCAG-5’ 5’-ATCAACCTGCACTTGCCTGG-3’ 5 196-234 9 RM 162 3’ –CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG-5’ 5’GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG-3’ 6 201-238 10 RM 171 3’-AACGCGAGGACACGTACTTAC-5’ 5’-ACGAGATACGTACGCCTTTG-3’ 10 310-356 11 RM 172 3’-TGCAGCTGCGCCACAGCCATAG-5’ 5’-CAACCACGACACCGCCGTGTTG-3’ 7 159-165 12 RM 174 3’-AGCGACGCCAAGACAAGTCGGG-5’ 5’-TCCACGTCGATCGACACGACGG-3’ 2 207-222 13 RM 224 3’-ATCGATCGATCTTCACGAGG-5’ 5’-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3’ 11 120-152 14 RM 245 3’-ATGCCGCCAGTGAATAGC-5’ 5’-CTGAGAATCCAATTATCTGGGG-3’ 9 136-146 15 RM 515 3’-TAGGACGACCAAAGGGTGAG-5’ 5’-TGGCCTGCTCTCTCTCTCTC-3’ 8 205-231 Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 29 Lớp K34SP - Sinh 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số và đo độ tinh sạch 2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số Mẫu lá của từng dòng được thu thập riêng rẽ và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến [25]. 1. Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 600C. 2. Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn. 3. Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS 10%. 4. Ủ mẫu ở 650C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút. 5. Bổ sung hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu. Lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới. 6. Tiếp tục chiết lần 2 bằng hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1). Thu được dịch chiết chứa ADN. 7. Tủa ADN bằng ethanol đã làm lạnh. Để ở -200C trong 1 giờ. 8. Ly tâm thu tủa 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. 9. Rửa tủa bằng etanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE. 10. Độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1%. Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 30 Lớp K34SP - Sinh 2.2.1.2. Kiểm tra nồng độ ADN tổng số Sau khi tách chiết, độ tinh sạch và nồng độ của ADN được đánh giá bằng phương pháp điện di trên agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5X (108g Tris base (MW = 121,10); 27,5g Axít boric (MW = 61,83); 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) và dùng ADN  biết trước nồng độ (50 ng/µl), trong 30 phút, 100V. Sau khi chạy điện di, tiến hành nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm ethidium bromide. Việc chụp mẫu và đo nồng độ được thực hiện bằng máy Molecular imager FX. 2.2.2. Thành phần phản ứng PCR với mồi SSR Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Mastercycler - personal. Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần được trình bày ở bảng 2.3. Bảng 2.8: Thành phần của một phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất hai lần khử ion 3,2 2 Đệm PCR 10X + MgCl2 25mM 1 3 dNTPs 10mM 1,0 4 Taq DNA polymerase 1U/µl 0,8 5 Mồi xuôi 5µM 1,5 6 Mồi ngược 5µM 1,5 7 DNA 10g/µl 1 Tổng thể tích của một phản ứng 10,0 Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 31 Lớp K34SP - Sinh 2.2.3. Chương trình chạy PCR Sau khi các ống eppendof đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành xếp ống vào máy và đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR được đặt như sau: Bảng 2.9: Các bước phản ứng trong máy PCR Các bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ I 94 5 phút 1 II 94 1 phút 35 56 45 giây 72 1 phút III 72 7 phút 1 Giữ mẫu ở 40C 2.2.4. Kiểm tra kết quả trên gel Polyacrylamide Sản phẩm thu được từ phản ứng PCR được kiểm tra trên gel polyacrylamide 12%, trong môi trường đệm TBE 1X. Việc kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR được tiến hành cụ thể như sau: - Chuẩn bị gel polyacrylamide: Bảng 2.10: Thành phần gel polyacrylamide 12%. (thể tích 20 ml/2 bản gel) Acrylamide/ Bis- acrylamide (29: 1) 40% TBE 1X APS 10% TEMED 6ml 300l 15l Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 32 Lớp K34SP - Sinh Chuẩn bị khay gel và lược để ghép, (tất cả phải được vệ sinh sạch sẽ trước khi tiến hành ghép hay đổ gel). Chuẩn bị hóa chất như ở bảng 2.4 (chú ý cho đệm TBE1X vào trước để tạo môi trường, và phải cho TEMED vào sau cùng. Sau khi cho TEMED, phải thao tác thật nhanh để đổ gel. Tránh hiện tượng gel bị polymer hoá, phải trộn đều các thành phần trước khi đổ gel). - Điện di sản phẩm: Khi gel đông lại (sau khoảng 30-60 phút), rút lược ra, vệ sinh bản gel bằng TBE1X, cho khay chứa gel vào máy điện di có sẵn dung dịch đệm TAE 1X. Lấy 3µl mẫu (chứa sản phẩm của quá trình PCR), trộn đều với 3µl dung dịch loading 1,5X và tra vào các giếng. Để đo kích thước băng chúng tôi sử dụng ladder 50bp làm chuẩn. Sau đó, đặt máy điện di ở chế độ 250V trong thời gian 3 phút, tiếp theo, đặt 70V trong thời gian 3 giờ 20 phút. - Nhuộm gel và ghi nhận kết quả: Sau khi điện di, tiến hành nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide (0,5 ng/ml) trong 30 phút. Soi và chụp ảnh băng sản phẩm điện di trên máy soi UV của hãng UVP, dựa vào đó xác định sản phẩm PCR thu được. 2.2.5. Phân tích và xử lí số liệu Kết quả được thống kê dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN (các alen). Số liệu được xử lý, phân tích bằng chương trình Exel version 5.0 và phần mềm NTSYSpc 2.1. Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau: PIC =1 - Pi2 (trong đó Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i). Tỷ lệ dị hợp (H) của mỗi mẫu được tính theo công thức: YM X H  % Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 33 Lớp K34SP - Sinh Trong đó: X: là tổng số mồi có xuất hiện 2 alen/1 locus SSR. M: là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu. Y: là tổng số mồi SSR có xuất hiện băng ADN. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) được tính bằng công thức: M Z M % Trong đó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng DNA. M là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu. Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 34 Lớp K34SP - Sinh CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp CTAB của Obara và kako (1998) [25] (đã được cải tiến) để tách chiết ADN hệ gel từ lá của các giống lúa nghiên cứu. Nguyên lý cơ bản của phương pháp này là sử dụng cetyl-trimethyl-amonium-bromid (CTAB), chất này có khả năng hòa tan các chất giải phóng ra từ màng tế bào sau khi màng của chúng bị phá vỡ, ADN dễ hòa tan hơn nhiều so với các chất khác. Vì vậy, CTAB đóng vai trò là chất chính trong tách chiết axit nucleic. Sau khi thu được ADN, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng ADN bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, trong thời gian 30 phút (dùng 3µl và 5 µl ở nồng độ 50ng/µl làm chuẩn để đo nồng độ ADN), sau đó nhuộm bằng ethidium bromide. Sử dụng máy chuyên dụng (Molercular imager FX) để xác định nồng độ và chụp ảnh. Ảnh điện di (hình 3.1) cho thấy các băng gọn sắc nét, ADN không bị đứt gẫy, có độ tinh sạch cao đảm bảo cho thực hiện các phản ứng PCR và các thí nghiệm tiếp theo. Hình 3.2: ADN tổng số của 11 giống lúa nghiên cứu Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 35 Lớp K34SP - Sinh 3.2. Hệ số PIC, số allele và tổng số băng DNA thể hiện trên từng cặp mồi Qua nghiên cứu các cặp mồi của tập đoàn 11 giống lúa chất lượng thu được tần số kích thước các alen của các mồi thể hiện qua bảng 3.1 có giá trị như sau: - RM13 gồm 2 loại alen khác nhau có kích thước là 120bp và 135bp - RM30 gồm 2 loại alen khác nhau kích thước là 125bp và135bp - RM282 gồm 4 loại alen khác nhau kích thước là 85, 95,105 và 110bp - RM135 chỉ có 1 loại alen kích thước là 120bp - RM142 chỉ có 1 alen kích thước là 235bp - RM143 gồm 4 loại alen khác nhau có kích thước lần lượt là 235, 250, 275 và 280bp - RM270 gồm 3 loại alen khác nhau có kích thước là 105, 110 và 120bp - RM153 gồm 2 loại alen khác nhau có kích thước là 180 và 190bp - RM162 gồm 2 loại alen khác nhau có kích thước là 210 và 230bp - RM171 gồm 2 loại alen khác nhau có kích thước là 310 và 320bp - RM172 gồm 3 loại alen khác nhau có kích thước là160, 155 và 150bp - RM174 chỉ có 1 alen kích thước là 205bp - RM224 gốm 3 loại alen khác nhau có kích thước là 150, 135 và 130bp - RM245 chỉ có 1 alen kích thuớc là 140 bp - RM515 gồm 7 loại alen khác nhau có kích thước lần lượt là 200, 210, 220, 230,240,250,260 và 270bp Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 36 Lớp K34SP - Sinh Bảng 3.11: Tần số các alen Tên mồi Kích thước (bp) Số alen f f2 1- sumf2 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 RM13 135 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 8 0,8 0,64 120 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 2 0,2 0,04 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 10 0,68 0,32 RM30 130 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 2 0.18 0,03 125 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 9 0,82 0,67 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0,70 0,30 RM282 110 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0,09 0,01 105 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 2 0,18 0,03 95 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 7 0,64 0,40 85 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0,09 0,01 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0,45 0,55 Bảng 3.11: Tần số các alen (tiếp) Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 37 Lớp K34SP - Sinh RM135 120 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 11 1,00 1,00 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 11 1,00 0,00 RM142 235 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1,00 1,00 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1,00 0,00 RM143 280 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0,09 0,01 275 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 4 0,36 0,13 250 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 4 0,36 0,13 235 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0,18 0,03 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0,31 0,69 RM270 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0,09 0,01 110 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 9 0,82 0,67 105 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0,09 0,01 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0,69 0,31 Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 38 Lớp K34SP - Sinh Bảng 3.11: Tần số các alen (tiếp) RM153 190 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 3 0,27 0,07 180 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 3 0,27 0,07 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0,15 0,85 RM162 230 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0.09 0,01 210 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 10 0,91 0,83 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0,83 0,17 RM171 320 1 1 1 1 0,5 1 1 1 1 1 1 10,5 0,95 0,91 310 0 0 0 0 0,5 0 0 0 0 0 0 0,5 0,05 0,00 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0,91 0,09 RM172 160 0 0 0 0 0 0 0 0,5 0 0 0 0,5 0,05 0,00 155 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 3 0,30 0,09 150 0 0 1 1 0 1 0 0,5 1 1 1 6,5 0,65 0,42 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 10 0,43 0,49 Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 39 Lớp K34SP - Sinh Bảng 3.11: Tần số các alen (tiếp) RM174 205 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1,00 1,00 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1,00 1,00 RM224 150 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,5 0,05 0,00 135 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 8 0,73 0,53 130 0,5 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 2,5 0,23 0,05 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0,58 0,42 RM245 140 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1,00 1,00 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1,00 0,00 Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 40 Lớp K34SP - Sinh Bảng 3.11: Tần số các alen (tiếp) RM515 270 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 3 0,27 0,07 260 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0,5 0 3,5 0,32 0,10 250 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0,09 0,01 240 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,5 0,05 0,00 230 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0,09 0,01 210 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1,5 0,14 0,02 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,5 0 0,5 0,05 0,00 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0,21 0,79 y 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 M% 0,00 6,67 0,00 6,67 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6,67 0,00 x 2 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 15-x 13 15 15 15 14 15 15 14 15 14 15 H% 15,38 0,00 0,00 0,00 7,14 0,00 0,00 7,14 0,00 7,14 0,00 ( TM: Tên mồi; x: Tổng số alen dị hợp; y: Tổng số alen khuyết) Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 41 Lớp K34SP - Sinh Hình 3.3: Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi RM245 (ADN UltraLow marker ) Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 42 Lớp K34SP - Sinh Số alen thu được và hệ số Pic của 15 cặp mồi được trình bày ở bảng 3.12: Bảng 3.12: Số alen thể hiện và hệ số PIC của 15 cặp mồi SSR TT Tên Mồi Vị trí trên NST Số alen PIC 1 RM13 5 2 0,32 2 RM30 6 2 0,30 3 RM282 3 4 0,55 4 RM135 3 1 0,00 5 RM142 2 1 0,00 6 RM143 3 4 0,69 7 RM270 12 3 0,31 8 RM153 5 2 0,85 9 RM162 6 2 0,17 10 RM171 10 2 0,09 11 RM172 7 3 0,49 12 RM174 2 1 0,00 13 RM224 11 3 0,42 14 RM245 9 1 0,00 15 RM515 8 7 0,79 Tổng 38 4,98 Trung bình 2,5 0,33 Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 43 Lớp K34SP - Sinh Qua kết quả thu được ở bảng 3.12 chúng tôi thấy 15 cặp mồi SSR được sử dụng trong nghiên cứu đều cho kết quả đa hình. Tổng số allele thống kê được trên 15 cặp mồi SSR là 38 alen, trung bình 2,5 alen/cặp mồi. Trong đó: - Số mồi thể hiện 7 alen: 1 mồi (RM 515) - Số mồi thể hiện 4 alen: 2 mồi (RM282 và RM143) - Số mồi thể hiện 3 alen: 3 mồi (RM270, RM172 và RM224) - Số mồi thể hiện 2 alen: 5 mồi (RM13, RM30, RM153, RM162 và RM 171) - Số mồi chỉ có 1 alen: 4mồi (RM135, RM142, RM174 và RM245) Hệ số PIC trung bình của 15 cặp mồi nghiên cứu là 0,33. Trong đó, có 4 cặp mồi chỉ thể hiện một allele có hệ số PIC = 0, hệ số PIC đạt giá trị cao nhất (0,85) ở cặp mồi RM153 với 2 allele thể hiện. 3.3. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa chất lượng nghiên cứu Tỷ lệ dị hợp tử (H) và tỷ lệ số liệu khuyết (M) của các giống lúa Chất lượng nghiên cứu dựa trên kết quả phân tích với 15 cặp mồi SSR được trình bày ở bảng 3.13. Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 44 Lớp K34SP - Sinh Bảng 3.13: Số liệu tỷ lệ khuyết (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa chất lượng nghiên cứu TT Kí hiệu Tên giống M% H% 1 C1 Mao chệt 0 15,38 2 C2 Nếp ông táo 6,67 0 3 C3 Nàng thơm đặc sản 0 0 4 C4 Nàng thơm chợ đào 6,67 0 5 C5 OM 3536 0 7,14 6 C6 Nàng Nhen 0 0 7 C7 Thơm Lài 0 0 8 C8 Thơm mắn 0 7,14 9 C9 Thơm lùn mùa 0 0 10 C10 Vàng Ba Danh 6,67 7,14 11 C11 Huyết rồng 4 0 0 Tổng 20 36,8 Trung bình 1,82 3,35 Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy: Tỷ lệ khuyết số liệu (M) cao nhất ở giống là C2 (Nếp ông táo), C4 (Nàng thơm chợ đào), C10 (Vàng Ba Danh) khuyết số liệu ở một cặp mồi ương ứng với tỷ lệ 6,67%. Các giống còn lại không bị khuyết số liệu. Tỉ lệ khuyết số liệu trung bình của 11 giống là 1,82 không có giống nào có tỷ lệ khuyết số liệu lớn hơn 15%. Như vậy, cả 11 giống nghiên cứu đều có ý nghĩa phân tích thống kê. Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 45 Lớp K34SP - Sinh Tỷ lệ đồng hợp và dị hợp ở các giống lúa nghiên cứu rất khác biệt và rõ ràng. Tỷ lệ dị hợp tử (H) cao nhất ở giống lúa C1 (Mao chệt) cao nhất là 15,38%. Tiếp đến là giống lúa C5 (OM3536), C8 (Thơm mắn), C10 (Vàng Ba Danh) tỷ lệ dị hợp tử là 7,14%. Còn lại 7 giống có tỷ lệ dị hợp tử 0% có nghĩa là trong phạm vi 15 mồi nghiên cứu các giống này đều thể hiện đồng hợp (chỉ có một băng ADN duy nhất/mồi). Tỷ lệ dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn là 3,35. Hình 3.4: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM515 (ADN UltraLow marker) Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 46 Lớp K34SP - Sinh Hình 3.5: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM270 (ADN UltraLow marker) 3.5. Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của các giống lúa Chất lượng nghiên cứu Số liệu thu được từ tiêu bản điện di sản phẩm PCR của 15 cặp mồi SSR với tập đoàn 11 giống lúa chất lượng nghiên cứu được thống kê và phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, từ đó thiết lập được bảng hệ số tương đồng di truyền (Bảng 3.14) và sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa Chất lượng (hình 3.6). Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 47 Lớp K34SP - Sinh Hình 3.6: Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa Chất lượng nghiên cứu Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 48 Lớp K34SP - Sinh Bảng 3.14: Mối quan hệ di truyền giữa 11 giống lúa chất lượng C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C1 1,00 C2 0,53 1,00 C3 0,36 0,71 1,00 C4 0,32 0,65 0,71 1,00 C5 0,43 0,45 0,58 0,38 1,00 C6 0,36 0,61 0,76 0,53 0,50 1,00 C7 0,43 0,61 0,50 0,45 0,43 0,58 1,00 C8 0,36 0,45 0,43 0,38 0,25 0,50 0,58 1,00 C9 0,43 0,53 0,50 0,45 0,30 0,58 0,67 0,88 1,00 C10 0,26 0,40 0,38 0,40 0,26 0,38 0,38 0,45 0,38 1,00 C11 0,50 0,71 0,76 0,71 0,50 0,67 0,58 0,50 0,58 0,45 1,00 Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 49 Lớp K34SP - Sinh Qua kết quả thu được ở bảng 3.14 và hình 3.6 cho thấy: Hệ số tương đồng di truyền của 11 giống lúa Tám nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,25 (C5 – OM3536, C8 – Thơm mắn) đến 0,88 (C8 – Thơm mắn, C9 – Thơm lùn mùa) Dựa vào sơ đồ mối quan hệ di truyền của 11 giống lúa, xét ở mức tương đồng di truyền 0,58% chúng tôi chia 11 mẫu giống lúa nghiên cứu thành 5 nhóm: * Nhóm I: Chỉ có giống C1 (Mao chệt) * Nhóm II: Chỉ có giống C5 (OM3536) * Nhóm III: Gồm các giống C2 (Nếp ông táo), C3 (Nếp thơm đặc sản), C6 (Nàng Nhen), C11 (Huyết rồng 4) và C4 (Nếp thơm chợ đào), có hệ số di truyền giao động trong khoảng từ 0,65% - 0,78%. Xét tại vị trí có hệ số tương đồng di truyền 0,65% được chia làm 2 nhóm phụ: + Nhóm III.1. Gồm các giống lúa C2 (Nếp ông táo), C3 (Nếp thơm đặc sản), C6 (Nàng Nhen), C11 (Huyết rồng 4). + Nhóm III.2. Có giống lúa C4 (Nếp thơm chợ đào). * Nhóm IV: Gồm các giống C7 (Thơm Lài), C8 (Thơm mắn) và C9 (Thơm lùn mùa), có hệ số di truyền giao động trong khoảng từ 0,62% - 0,88%. Xét tại vị trí có hệ số tương đồng di truyền 0,62% được chia làm 2 nhóm phụ: + Nhóm phụ IV.1. Có giống lúa C7 (Thơm Lài) + Nhóm phụ IV.2. Gồm có các giống lúa C9 (Thơm lùn mùa) và C8 (Thơm mắn) * Nhóm V: Chỉ có một giống C10 (Vàng Ba Danh) Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 50 Lớp K34SP - Sinh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Tập đoàn lúa chất lượng bản địa của miền Nam nghiên cứu khá đa dạng về các thành phẩn alen. Kết quả phân tích với 15 cặp mồi SSR thu được tổng số 38 loại alen, trung bình 2,5 alen/cặp mồi. Hệ số PIC trung bình của 15 cặp mồi nghiên cứu là 0,33. Hệ số PIC đạt giá trị cao nhất (0,85) ở cặp mồi RM153 với 2 alen thể hiện. Các giống lúa nghiên cứu có độ thuần di truyền khác nhau dao động từ 0% đến 15,38% (tỉ lệ dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn khá cao là 3,35%). Tập đoàn 11 giống lúa chất lượng nghiên cứu rất đa dạng, hệ số tương đồng di truyền giữa các giống trong tập đoàn dao động từ 0,25 - 0,88. Ở mức tương đồng di truyền 0,58%, 11mẫu giống lúa nghiên cứu được chia thành thành 5 nhóm cách biệt di truyền khác nhau. Như vậy, sử dụng các chỉ thị SSR không những có thể đánh giá được mức độ đa dạng, xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa chất lượng mà các kết quả thu được rất hữu ích trong việc xác định nguồn gen phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu quả các nguồn gen lúa chất lượng của Việt Nam. Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu xác định các alen đặc trưng, alen hiếm để nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa thơm chất lượng ở mức phân tử. Tiếp tục nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lúa chất lượng ở mức hình thái nông học kết hợp với chỉ thị SSR nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa chất lượng có hiệu quả cao. Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 51 Lớp K34SP - Sinh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Mạnh Cường, (2007), Công nghệ sinh học trong chọn giống ngô, NXB Nông nghiệp. 2. Trịnh Đình Đạt, (2007), Công nghệ sinh học tập 4, NXB Giáo dục. 3. Nguyễn Văn Đồng, (1998), nghiên cứu phát hiện và lập bản đồ phân tử gen bất dục đực nhạy cảm với nhiệt độ (TGMS) ở lúa – Luận án tiến sĩ nông nghiệp. 4. Đào Xuân Tân, (2003), đặc điểm hình thái và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng lúa đột biến từ giống IR – 64 và A20 ở thế hệ thứ 3, thông báo khoa học Đại học sư phạm Hà Nội 2. 5. Trần Duy Quý, (1997), các phương pháp trong chọn tạo giống cây trồng, NXB Nông nghiệp. 6. Lê Vĩnh Thảo, Bùi Chí Bửu, Lưu Ngọc Trình, Nguyễn Văn Vương (2004), Các giống lúa đặc sản, giống lúa chất lượng cao và kỹ thuật canh tác, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 7. Trần Bá Thảo, (2006), Ứng dụng chỉ thị phân tử trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để chọn tạo giống lúa (Oryza sativaL.), Luận văn tiến sĩ nông nghiệp, Cần Thơ – 2006. Tiếng anh 8. Ahn, SN, Bollich CN, Tanksley SD, (1992), RFNP tagging of a gen for aroma in rice, Theor, Appl. 9. Akagi H, Yokozeki Y, Inagaki A, Fujimura T (1996), Microsatellite DNA markers for rice chromosomes, Theor Appl Genet 93:1071. Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 52 Lớp K34SP - Sinh 10. Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW (1980) Construction of a genetic map in man using restriction fragment length polymorphisms. Amer J Hum Genet 32:314–331 11. Chen X, Temnykh S, Xu Y, Cho YG, McCouch SR (1997), "Development of a microsatellite framework map providing genome- wide coverage in rice (Oryza sativa L.)", Theor Appl Genet, 95:553.10 12. Chen X, Cho Y, McCouch S (2002), Sequence divergence of rice microsatellites in Oryza and other plant species, Mol Gen Genomics, 268: 331-343.11 13. Cho YG, Ishii T, Temnykh S, Chen X, Lipovich L, McCouch SR, Park WD, Ayres N, Cartinhour S (2000), Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and GenBank sequences in rice (Oryza sativa L.), Theor Appl Genet 100:713.12 14. De Datta, SK (1981), Principles and practices of rice production. John Wiley & Son Inc Canada 15. Garland S, Lewin L, Blakeney A, Reinke R, Henry R (2000) PCR- based molecular markers for the fragrance gene in rice (Oryza sativa. L.). Theoretical and Applied Genetics 101: 364-371 16. Giarrocco LE, Marassib MA and Salernoa GL. 2007. Assessment of the Genetic diversity in Argentine Rice Cultivars with SSR Markers. Crop Sci 47: 853-858.13 17. IRRI (International Rice Research Institute) (1997). Rice almanac, second edition IRRI, Los Banos, Philippines. 181 pp 18. J in QS, Vanvichi TA and Trackoonrung S, (1996), Indentifitcation and potential use of a RAPD maker for in rice, J.Gent.Breed Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 53 Lớp K34SP - Sinh 19. Kalyan Chakravarthi B and Rambabu Naravaneni (2006). SSR marker based DNA fingerprinting and diversity study in rice (Oryza sativa L.). AJB 5 (9): 684-688.16 20. Litt M, Luty JA (1989) A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Amr J Hum Genet 44: 397–401 21. Lorieux M, Gofinet B, Perrier X, Gonzalex de Leon D., Lannaud C., (1995), Maximun – likelihood models for mapping genertic makers showing segregation,1, Backcrocss populations, Theor, Appl, Genet. 90. 22. Mao CX (1993) Hybrid rice production in China - New successes, challenges and strategies. Paper presented at the FAO Regional Expert Consultation on Hybrid Seed Production, Development and Security of Major Cereal Crops, Bangkok, Thailand, 9-12 23. Navraj và ctv, 2009 Navraj KS, Yogesh Vikal, Kuldeep Singh, Monika AJ and Sharma RC. 2009. SSR marker-based DNA fingerprinting and cultivar 24. Nguyen Tri Hoan (2002), Recent progress in hybrid rice research in Viet Nam. In Adoption of Hybrid Rice in Asia - Policy Support. FAO, Rome, p 135-153. 25. Neelu Jain, Navinder Saini, Poonam Rana, sunita jain and Rajinder K.J (2003), microsatellite diversity for chromosome number 8 in Basmati rice, rice Genetics New sletter, vol. 19 26. Obara OP and Kako S (1998), Genetic diversity and identification of Cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers, Euphytica, 99: 95-1001. Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 54 Lớp K34SP - Sinh 27. Panaud O, X Chen, SR McCouch (1996), Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism (SSLP) in rice (Oryza sativa L.), Mol Gen Genet 252:597.30 28. Shu Xia Sun , Fang Yuan Gao , Xian Jun Lu , Xian Jun Wu , Xu Dong Wang , Guang Jun Ren, Hong Luo (2008) Genetic analysis and gene fine mapping of aroma in rice (Oryza sativa L. Cyperales, Poaceae) Genetics and Molecular Biology, 31, 2, 532-538 29. Temnykh S., G DeClerck., A Lukashova., L Lipovich., S Cartinhour., S McCouch (2001),Computational and experimental analysis of microsatellites in rice (Oryza sativa L.):Frequency, length variation, transposon associations, and genetic marker potential, Genome Res 11:1441.28 30. Temnykh S., WD Park, N Ayres, S Cartinhour, N Hauck (2000), "Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice (Oryza sativa L.)", Theor Appl Genet 100: 697.29 31. Virmani SS (1996) Hybrid Rice. In Advanced Agronomy, 47:377-462. 32. Zhou., K L (1995). The latest achievements in hybrid rice research and extension in China. China National Hybrid Rice Research and Development Centre, Changsha, Hunan, China, 5 p (monograph 33. Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucl Acids Res 18:6531–6535 Website 34. 35. www.gramene.org Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 55 Lớp K34SP - Sinh MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1 2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2 3. Ý nghiã khoa học và thực tiễn của đề tài ...................................................... 2 3.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ................................. 3 1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị kinh tế của cây lúa ................................... 3 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại cây lúa .................................................................. 3 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa ở Việt Nam ................................................... 4 1.2. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và Việt Nam ............................... 5 1.2.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới .................................................. 5 1.2.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam .................................................. 6 1.3. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền ................................ 11 1.3.1. Chỉ thị sinh hoá ..................................................................................... 11 1.3.2. Chỉ thị di truyền .................................................................................... 12 1.3.3. Các chỉ thị dựa trên phản ứng PCR ....................................................... 13 1.4. Tổng quan về lúa chất lượng .................................................................... 18 1.4.1. Tính trạng mùi thơm ............................................................................. 18 1.4.2. Các tính trạng chất lượng ...................................................................... 19 1.4.3. Nghiên cứu chọn tạo lúa chất lượng ..................................................... 20 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 25 2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 25 2.1.1. Vật liệu thực vật ..................................................................................... 25 2.1.2. Hoá chất ................................................................................................. 25 Khóa luận tốt nghiệp Đào Thị Kim Dung Khoa Sinh – KTNN 56 Lớp K34SP - Sinh 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số và đo độ tinh sạch ........................................ 29 2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số ..................................................................... 29 2.2.1.2. Kiểm tra nồng độ ADN tổng số ......................................................... 30 2.2.2. Thành phần phản ứng PCR với mồi SSR ............................................. 30 2.2.3. Chương trình chạy PCR ........................................................................ 31 2.2.4. Kiểm tra kết quả trên gel Polyacrylamide ............................................. 31 2.2.5. Phân tích và xử lí số liệu ....................................................................... 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 34 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số .............................................................. 34 3.2. Hệ số PIC, số allele và tổng số băng DNA thể hiện trên từng cặp mồi ... 35 3.3. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa chất lượng nghiên cứu ............................................................................................ 43 3.5. Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của các giống lúa Chất lượng nghiên cứu .................................................................................... 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 50 1. Kết luận ....................................................................................................... 50 2. Kiến nghị ..................................................................................................... 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 51