Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes

đã sản xuất và thử nghiệm chế phẩm Subcolac (Bacillus subtilis, Lactobacillus) làm giảm tỉ lệ tử vong , giảm tỉ lệ tái phát cho bệnh tiêu chảy so với dùng kháng sinh và heo con tăng trọng tốt (cao hơn đối chứng 0,9 kg/con). Phòng vi sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y trƣờng Đại Học Nông Lâm đã sản xuất thành công chế phẩm Biolactyl, qua sử dụng đã cho hiệu quả tốt trong việc phòng bệnh tiêu chảy cho heo con theo mẹ và hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi. 15 Viện Pasteur Nha Trang cũng đã sản xuất chế phẩm Biosubtyl (Bacillus subtilis) đã sử dụng có hiệu quả trong phòng và trị bệnh tiêu chảy trên ngƣời và gia súc. 2.3.3.2. Thế giới Trên thế giới, trong những thập niên gần đây, ngƣời ta hƣớng vào việc phân lập và chọn các chủng vi sinh vật có tính đối kháng cao đƣa vào đƣờng ruột, nâng cao sức chống đỡ đối với mầm bệnh, phòng trị bệnh đƣờng ruột cho ngƣời, động vật nuôi, nhất là trẻ sơ sinh, ngƣời già và thú non. Hiện nay ở Mỹ, Nhật, Anh và nhiều nƣớc khác trên thế giới đã sản xuất những chế phẩm hỗn hợp nhiều loại enzyme, kết hợp nhiều loài vi sinh vật trong việc phòng trị bệnh, nâng cao khả năng tiêu hoá của ngƣời và vật nuôi nhƣ: Biozim, Rozim F - 3C, Lactopure, NatureFlora,… 2.4. Tổng quan về Lactobacillus sporogenes 2.4.1. Lịch sử phát hiện L. sporogenes lần đầu tiên đƣợc phân lập vào năm 1933 bởi L.M. Horowitz- Wlassowa và N.W. Nowotelnow. Vào thời gian đó, vi khuẩn đƣợc phân loại và mô tả nhƣ sau: tế bào hình que, Gram (+), tạo bào tử, sản xuất acid lactic, hiếu khí hay kị khí tùy ý, phản ứng catalase (+) (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1974). Vi khuẩn còn có tên là Bacillus coagulans [8]. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây, đặc biệt là nghiên cứu dựa trên sự tƣơng đồng về DNA đã khẳng định L. sporogenes gần gũi với Lactobacillus hơn Bacillus. Năm 1967, L. sporogenes đƣợc xếp lại vào giống Lactobacillus. 2.4.2. Đặc điểm phân loại Vi khuẩn L. sporogenes có đặc điểm phân loại nhƣ sau: Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Tộc: Lactobacilleae Loài: Lactobacillus sporogenes 2.4.3. Đặc điểm phân bố Vi khuẩn L. sporogenes có mặt trong các sản phẩm đồ hộp. Chúng phân bố tƣơng đối rộng rãi trong tự nhiên. 2.4.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 16 2.4.4.1. Tế bào sinh dƣỡng Hình thái Vì có quan hệ với hai giống Bacillus và Lactobacillus nên hình thái của L. sporogenes có những nét tƣơng đồng Lactobacillus và khác biệt với Bacillus (xem Bảng 2.1 và 2.2) Bảng 2.1 Những tƣơng đồng về mặt hình thái của L. sporogenes và Lactobacillus [35] Điểm tƣơng đồng Chi tiết Hình dạng khuẩn lạc -Đƣờng kính khuẩn lạc: 2,5 mm -Hình dáng khuẩn lạc: lồi, trơn, lấp lánh, không tạo sắc tố. Hình dạng tế bào -Hình que thon, dài -Kích thƣớc: 0,3 - 0,8 µm 3,0 - 5,0 µm -Tròn ở đầu tận cùng Bảng 2.2 Những khác biệt về hình thái của L. sporogenes so với Bacillus [35] Điểm khác biệt Chi tiết Hình dạng khuẩn lạc -Khuẩn lạc Bacillus có bề mặt nhăn. Hình dạng tế bào -Bacillus luôn có dạng hình que thẳng, trong khi Lactobacillus còn có dạng hình que uốn cong. -Bào tử của Bacillus ở giữa thân còn bào tử của L. sporogenes có ở một đầu tế bào. Các đặc điểm sinh trƣởng phát triển và sinh hóa Tƣơng tự nhƣ hình thái, những điểm tƣơng đồng Lactobacillus và khác biệt Bacillus về mặt sinh trƣởng phát triển và sinh hóa của L. sporogenes đƣợc trình bày ở Bảng 2.3 và 2.4 17 Bảng 2.3 Những tƣơng đồng về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes và Lactobacillus [35] Điểm tƣơng đồng Chi tiết Môi trƣờng nuôi cấy -Khó nuôi cấy, cần những chất hữu cơ phức tạp để phát triển nhƣ: carbonhydrate (để lên men), peptone, chiết thịt, chiết nấm men. -Môi trƣờng nuôi cấy thích hợp: MRSA có bổ sung nƣớc ép cà chua a. pH tối ƣu 5,5 - 6,8 Nhiệt độ tối ƣu 30 - 450C Một số phản ứng sinh hóa -Không thủy phân tinh bột, casein. -Không hóa lỏng gelatine -Indole (-) -Không sinh gas hay H2S -Không có menaquinones Khả năng lên men đƣờng -Sản xuất acid khi lên men các loại đƣờng: lactose, arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, maltose, sucrose và trehalose. -Sản xuất acid lactic khi lên men: glucose, fructose, sucrose, trehalose và lactose. Một số đặc điểm khác -Gram (+) -Hiếu khí hay kị khí tùy ý Lƣu ý: (a) L. sporogenes cũng phát triển tốt trong môi trƣờng GYE (glucose yeast extract agar). Bảng 2.4 Những khác biệt về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes so với Bacillus [35] Điểm khác biệt Chi tiết Môi trƣờng nuôi cấy Dễ nuôi cấy hơn Lactobacillus 18 Một số phản ứng sinh hóa Lactobacillus cho phản ứng oxidase (-) và nitrate (-) trong khi Bacillus luôn cho hai phản ứng này (+) Khả năng lên men đƣờng Bacillus không lên men đƣợc lactose 2.4.4.2. Bào tử Hình thái Lớp vỏ bào tử có cấu tạo là một phức hệ peptidoglycan - acid dipicolinic - calcium. Bào tử hình ellip, nằm ở một đầu của tế bào sinh dƣỡng, có kích thƣớc 0,9 - 1,21,0 - 1,7 µm . Cấu tạo chi tiết của bào tử L. sporogenes đƣợc mô tả theo Hình 2.1. Hình 2.1 Giản đồ cấu tạo bào tử. Gồm: lớp ngoại bào tử (exosporium), màng ngoài (outer coat), màng trong (inner coat), lớp vỏ dƣới màng trong (cortex), màng vỏ của vách tế bào mầm (cortical membrane of the germ cell wall), tế bào chất sát nhập vào tế bào mẹ (incorporated mother cell cytoplasm), nguyên sinh chất (core/protoplast), vật chất nhân (nuclear material) [15, 39]. Khi gặp phải điều kiện bất lợi nhƣ nhiệt độ, pH, môi trƣờng dinh dƣỡng không phù hợp,… L. sporogenes từ dạng tế bào sinh dƣỡng tạo thành bào tử. Đặc tính o In vitro 19 Bào tử L. sporogenes bền với nhiệt và những điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt khác. Chúng vẫn sống ngay cả sau khi đã xử lý ở 100oC trong 20 phút trong dung dịch đệm phosphate ở pH 7. Bào tử nảy chồi trong dịch canh chứa malt ngay cả khi có HCl pha loãng (pH 4,6 – 5,6), dịch NaOH (pH 7,6 – 9,6), dịch muối (nồng độ 5%, 10%, 20%), dịch acid boric 2,5% và nƣớc cất. Bào tử chịu đƣợc kháng sinh 2 – 8 lần so với tế bào dinh dƣỡng [12]. o In vivo Khi qua đƣờng miệng, bào tử đƣợc hoạt hóa và hồi sinh trong môi trƣờng acid của dạ dày - ruột với pH thấp nhờ hoạt động đánh khuấy hóa học của dạ dày và môi trƣờng nƣớc trong dạ dày. Các lớp màng (coat) hút nƣớc và trƣơng phồng lên. Sự gia tăng hàm lƣợng nƣớc làm tăng tỉ lệ trao đổi chất của vi khuẩn trong bào tử, chồi hình thành và ló ra ngoài lớp màng của bào tử. Tại tá tràng, bào tử không còn nữa, các tế bào nảy chồi chuyển thành tế bào sinh dƣỡng. Chúng nhân lên rất nhanh trong ruột non. Thông thƣờng, sự nảy chồi diễn ra khoảng 4 giờ sau khi bào tử đi vào qua đƣờng miệng. Tế bào sinh dƣỡng nhân đôi sau mỗi 30 phút. Các tế bào này cố định trên bộ máy tiêu hóa và tiếp tục hoạt động trao đổi chất, sản xuất acid lactic và bacteriocin. Điều này tạo một môi trƣờng bất lợi cho vi khuẩn có hại trong đƣờng ruột [13]. 2.4.5. Những đặc điểm, chức năng sinh học tƣơng đồng giữa L. sporogenes và các vi khuẩn Lactobacillus khác Vi khuẩn L. sporogenes là một loài thuộc giống Lactobacillus nên mang nhiều đặc tính và chức năng sinh học của Lactobacillus. Những đặc tính và chức năng này đều có ý nghĩa trong ứng dụng sản xuất probiotic. 2.4.5.1. Những đặc điểm trao đổi chất Quá trình trao đổi chất của Lactobacillus có vai trò rất quan trọng trong khả năng chữa bệnh của vi khuẩn. Các nghiên cứu nuôi cấy Lactobacillus trong môi trƣờng sữa đã thể hiện rõ ràng những hoạt tính đáng chú ý sau: Phân giải protein Lactobacillus sản sinh enzyme proteinase phân giải protein thành các polypeptide mạch ngắn. 20 Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein đƣợc cơ thể vật chủ tiêu hóa dễ dàng. Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của Lactobacillus đƣợc đánh giá là nguồn dinh dƣỡng có giá trị cao cho các đối tƣợng: trẻ sơ sinh, ngƣời đang dƣỡng bệnh, ngƣời già hay gia súc non. Phân giải lipid Nhờ có enzyme lipase, Lactobacillus có khả năng phân cắt chất béo ở dạng triglyceride thành các acid béo và glycerol. Điều này cũng có ý nghĩa về mặt dinh dƣỡng đối với ngƣời và vật nuôi. Có những nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng (preclinical) cho rằng Lactobacillus phân giải đƣợc cholesterol trong lipid huyết thanh (serum lipids) [25, 26] và muối mật [14]. Cả hai khả năng này đều có ý nghĩa về mặt lâm sàng. Phân giải đƣờng lactose Lactobacillus mang enzyme beta - galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase (LDH) có tác dụng chuyển hoá đƣờng lactose thành acid lactic. Đây là một acid hữu cơ có những đặc tính sinh học đặc biệt. o Vai trò của acid lactic [5] Về mặt sinh lý học, acid lactic có những ƣu điểm sau:  Tăng cƣờng khả năng tiêu hóa protein sữa thông qua sự đông vón  Tăng cƣờng hoạt tính Ca, P, Fe  Kích thích sự tiết dịch vị  Tăng nhanh cử động đẩy nhanh thức ăn đi xuống dạ dày  Là nguồn năng lƣợng cho quá trình hô hấp Chính những ƣu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc ứng dụng Lactobacillus làm probiotic. Tùy thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, Lactobacillus sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+) acid lactic (xem Hình 2.3). Ở ngƣời, cả hai loại đồng phân này đều đƣợc hấp thu trong đƣờng ruột. 21 D(-) acid lactic L(+) acid lactic Hình 2.2 Hai loại đồng phân acid lactic. L (+) acid lactic: đƣợc chuyển hóa hoàn toàn và nhanh chóng trong quá trình tổng hợp glycogen. D (-) acid lactic: đƣợc chuyển hóa ít hơn và phần không chuyển hóa sẽ đƣợc bài tiết dƣới dạng urine. Sự hiện diện của acid không đƣợc chuyển hóa trong ống tiêu hóa sẽ gây tình trạng nhiễm acid trong trao đổi chất (metabolic acidosis) ở trẻ sơ sinh. Một số loài Lactobacillus, tiêu biểu là L. acidophilus có sản xuất D (-) acid lactic nên lợi ích về mặt lâm sàng là không chắc chắn mặc dù đã sớm đƣợc sử dụng trong nhiều liệu pháp. Vì vậy, xu hƣớng mới trong sản xuất probiotic là tìm những nguồn vi sinh vật có khả năng tạo ra L (+) acid lactic sẽ an toàn hơn cho sức khỏe. Đại diện tiêu biểu thỏa mãn yêu cầu này là Lactobacillus sporogenes. Ngoài ra, acid lactic còn làm hạ pH đƣờng ruột còn 4 – 5. Do đó, sự phát triển của vi sinh vật gây thối và E. coli (thích nghi ở pH 6 – 7) bị ức chế. Sản xuất bacteriocin và các cơ chất kháng khuẩn Bacteriocin là protein hay hợp chất protein do vi khuẩn sản xuất có hoạt tính diệt khuẩn trực tiếp [23, 31]. Cơ chất này giúp vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hoạt tính ức chế đối với các vi sinh vật gây thối trong hệ tiêu hóa. Bảng 2.5 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus Tên bacteriocin Loài sản xuất Acidolin L. acidophilus Acidophilin L. acidophilus Lactacin B L. acidophilus 22 Lactacin F L. acidophilus Bulgarin L. bulgaricus Plantaricin SIK-83 L. plantarum Plantaricin A L. plantarum Lactolin L. plantarum Plantaricin B L. plantarum Lactolin 27 L. helveticus Helveticin J L. helveticus Reuterin L. reuteri Lactobrevin L. brevis Lactobacillin L. brevis Vi khuẩn Lactobacillus còn có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây thối nhờ vào những sản phẩm trao đổi chất khác nhƣ: H2O2, CO2 và diacetyl. Bảng 2.6 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus [33] Sản phẩm trao đổi chất Tác dụng 1.Carbon dioxide Ức chế sự khử nhóm carboxyl? Làm giảm tính thấm của màng tế bào? 2. Diacetyl Tƣơng tác với các protein gắn kết arginine 3. Hydrogen peroxide / Lactoperoxidase Oxi hóa những protein cơ bản 2.4.5.2. Lợi ích trong dinh dƣỡng và trị liệu Các sản phẩm lên men từ sữa đã đƣợc dùng để chữa bệnh trong nhiều nền y học thời xa xƣa ở Trung Cận Đông. Tuy nhiên giá trị về mặt dinh dƣỡng và trị liệu của các vi khuẩn lactic vẫn còn đang đƣợc tranh cãi. Mặc dù vậy, một số nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng đã cho thấy ích lợi của Lactobacillus (xem Sơ đồ 2.1). 23 Các lợi ích về mặt dinh dƣỡng Nghiên cứu trên chuột cho thấy tốc độ phát triển và lƣợng ăn vào tăng lên khi cho ăn sữa chua chứa Lactobacillus [10]. Vài loài Lactobacillus có khả năng tự tổng hợp vitamin B. Hàm lƣợng các loại vitamin nhóm B và K trong sữa chua thƣờng cao hơn trong sữa tƣơi. Ngoài ra, tính chất sinh học tự nhiên của Cu, Fe, Ca, Zn, Mg và P cũng tăng lên khi dùng sữa chua làm thức ăn cho chuột [16]. Các lợi ích về mặt trị liệu Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị vô số những rối loạn và viêm nhiễm bao gồm: viêm ruột kết, táo bón, tiêu chảy, đầy hơi, bệnh hepatic encephalopathy, ung bƣớu, lƣợng cholesterol trong máu cao, đau đầu và viêm Lactobacillus Trị liệu Dinh dƣỡng Phục hồi cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột Giải độc tố Cải thiện tình trạng không dùng đƣợc lactose Tăng cƣờng miễn dịch Loại bỏ carcinogen trong sản phẩm cuối Ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh trong thực phẩm Sản xuất vitamin nhóm B, K. Tăng cƣờng khả năng tiêu hóa các chất trong thực phẩm và tăng cƣờng những hoạt tính sinh học tự nhiên của chất dinh dƣỡng Sơ đồ 2.1 Ích lợi của Lactobacillus về mặt dinh dƣỡng và trị liệu [35] 24 âm đạo không điển hình, cải thiện tình trạng không sử dụng đƣợc lactose (lactose intolerance). Khẩu phần chứa Lactobacillus có tác dụng làm hạ cholesterol trong máu. Cơ chế tác động của Lactobacillus lên quá trình hình thành cholesterol có thể đƣợc biểu diễn nhƣ Hình 2.5. Hình 2.3 Cơ chế ngăn chặn sự hình thành và hấp thụ cholesterol [35] Ngoài ra, có nghiên cứu còn cho rằng Lactobacillus làm giảm lƣợng cholesterol gắn cholesterol vào khoang ruột [17]. Lactobacillus tạo ra enzyme beta – galactosidase (lactase), có tác dụng thủy phân lactose thành acid lactic [21]. Vì vậy, Lactobacillus giúp cải thiện tình trạng không sử dụng đƣợc lactose ở những ngƣời thiếu enzyme lactase. Vi khuẩn Lactobacillus sản xuất acid lactic và các cơ chất khác tạo một môi trƣờng bất lợi cho sinh vật gây thối phát triển trong đƣờng tiêu hóa. Do đó, lƣợng urase trong ruột giảm và kéo theo lƣợng NH3 trong máu. Hơn nữa, pH thấp do acid lactic tạo ra gây trở ngại cho NH3 hấp thu từ ruột vào mô và thúc đẩy việc bài tiết NH3 từ máu vào ruột [24]. Những vi khuẩn gây thối rữa ở ruột kết tạo các enzyme beta-glucuronidase, azoreductase và nitroreductase chuyển hóa procarcinogen thành carcinogen, chất có vai trò trong việc hình thành và phát triển khối u. Bằng cách ức chế cạnh tranh và tạo môi Chất béo trong khẩu phần Nhũ hóa Hấp thụ Tổng hợp cholesterol Muối mật Lactobacillus ức chế enzyme khử hydroxymethyl glutarate CoA, enzyme này hạn chế tốc độ tổng hợp cholesterol Lactobacillus kết hợp với muối mật để ngăn cản muối mật đi vào vòng tuần hoàn máu. 25 trƣờng acid không thuận lợi, Lactobacillus đã kìm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn trong ruột kết. Có lẽ điều này làm giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già [18]. Nhờ vào khả năng sản xuất acid lactic và bacteriocin trong đƣờng ruột, Lactobacillus cải thiện tình trạng tiêu chảy. Acid lactic cũng giúp tăng cƣờng nhu động ruột nên chữa đƣợc chứng táo bón. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy các loài Lactobacillus có thể thúc đẩy khả năng sản xuất anfa-interferon, tính tự vệ của tế bào và hoạt tính của enzyme 2 – 5 A - synthase. Viện Pasteur ở Tokyo đã ghi nhận đƣợc lƣợng interferon tăng 65% ở những ngƣời tham gia thí nghiệm sau 2 tuần tiêu thụ chế phẩm chứa Lactobacillus [22]. Lactobacillus duy trì pH âm đạo ở khoảng 4 – 4,5 nhờ vào hoạt động lên men glycogen thành acid lactic. Đây là môi trƣờng không thích hợp cho mầm bệnh phát triển nhƣ Trichomonas vaginalis (protozoa kí sinh) và Candida albicans (nấm men),… [30] Khi dùng Lactobacillus kèm theo kháng sinh sẽ giúp ngăn ngừa các triệu chứng trên. Lactobacillus thông qua các hoạt động trao đổi chất của mình: tạo acid lactic, bacteriocin để cố định trong đƣờng ruột, âm đạo hay miệng và tạo môi trƣờng không phù hợp cho mầm bệnh phát triển. Lactobacillus có hiệu quả trong phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột và giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ. Nhờ vào sự giảm nồng độ NH3 và hạn chế vi sinh vật gây thối nhiễm vào đƣờng ruột, Lactobacillus có hiệu quả kích thích tăng trƣởng ở thú nuôi [11]. 2.4.6. Các đặc tính giúp L. sporogenes vƣợt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus khác trong ứng dụng làm probiotic Ngoài những chức năng sinh học kể trên, L. sporogenes còn vƣợt trội hơn các vi khuẩn khác làm probiotic nhờ đáp ứng những yêu cầu của một loại probiotic lý tƣởng nhƣ: Có nguồn gốc tự nhiên và thích hợp với cơ thể ngƣời và vật nuôi Không mang độc tính hay bất kỳ một tác dụng phụ nào cho ngƣời và vật nuôi Có khả năng gắn vào tế bào biểu mô ruột và cố định trên trên đƣờng tiêu hóa để ngăn ngừa và chống mầm bệnh xâm nhập 26 Kháng đƣợc acid và mật, vẫn sống sau khi di chuyển từ dạ dày xuống ruột non Lên men và tạo ra L (+) acid lactic, đƣợc chuyển hóa hoàn toàn trong quá trình trao đổi chất nên không gây tình trạng nhiễm acid nhƣ D (-) acid lactic. Tỉ lệ sống cao sau khi trải qua quy trình sản xuất (thu hoạch, sấy khô,…) Tính ổn định cao ở nhiệt độ phòng khi trộn hay không trộn với những thành phần khác Có tác dụng cải thiện sức khỏe vật chủ Ngoài ra, L. sporogenes còn là loài Bacillus duy nhất dùng làm probiotic mang chứng nhận an toàn cho sức khỏe GRAS (Generally Recognise As Safe) do FDA (Food & Drug Administration) cấp. Vì những lý do kể trên giúp L. sporogenes ngày càng đƣợc ƣa chuộng hơn Lactobacillus quen thuộc khác. Điển hình nhất trong số này là L. acidophillus. Đây là loài vi khuẩn rất thông dụng và phổ biến có mặt trong sữa chua, các loại thực phẩm lên men khác và thuốc trị rối loạn tiêu hóa,… và đƣợc con ngƣời tin dùng từ rất lâu. Những đặc điểm vƣợt trội của L. sporogenes so với L. acidophilus đƣợc thể hiện qua Bảng 2.7. Bảng 2.7 Bảng liệt kê những ƣu điểm của L. sporogenes so với L. acidophillus Lactobacillus sporogenes Lactobacillus acidophilus Bào tử vẫn sống sau khi đã xử lý 100 oC/20 phút trong môi trƣờng đệm Tất cả tế bào sinh dƣỡng đều bị tiêu diệt sau khi thanh trùng Pasteur. 27 phosphate. Không yêu cầu phải có vitamin để sinh trƣởng và phát triển. Yêu cầu phải có vitamin cho sự sinh trƣởng. Khi gặp điều kiện bất lợi, tế bào sinh dƣỡng tạo thành bào tử chống chịu tốt với những điều kiện bất lợi: nhiệt độ, pH thấp trong đƣờng tiêu hóa, dịch mật, sấy khô, đông lạnh, bức xạ, hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh. Vi khuẩn không tạo bào tử. Tế bào sinh dƣỡng rất nhạy cảm với nhiệt độ. Lên men đồng hình tạo ra L (+) acid lactic dễ dàng chuyển hóa trong cơ thể [13]. Sản xuất D (-) acid lactic có thể gây chứng nhiễm acid vào quá trình trao đổi chất (tài liệu 159, International Dairy Federeration, 1983) Khả năng tái sinh tốt và tính ổn định của bào tử nên vẫn đạt đƣợc hiệu quả chữa trị dù chỉ dùng một liều nhỏ. Khả năng tái sinh và tính ổn định của tế bào kém nên phải uống một lƣợng lớn. Có hạn dùng đến 3 năm khi trữ ở nhiệt độ phòng Bảo quản ở nhiệt độ 4-10oC để giữ hoạt tính tế bào Tuy nhiên, L. sporogenes có một khuyết điểm duy nhất đó là thời gian tồn tại trong ống tiêu hóa chỉ trong 6 – 7 ngày. Cuối cùng, bào tử theo phân thải ra ngoài. Hiện nay, cơ chế và nguyên nhân của vấn đề này còn đang đƣợc nghiên cứu. 2.4.7. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng L. sporogenes 28 Từ khi đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1933 đến nay, L. sporogenes đã trải qua nhiều nghiên cứu. Những khảo sát về độc tính, khả năng làm giảm cholesterol, trị viêm âm đạo không điển hình, trị rối loạn tiêu hóa,… đã chứng minh dần những đặc tính có lợi và vƣợt trội của vi khuẩn này. Các sản phẩm probiotic chứa L. sporogenes đƣợc sản xuất ngày một nhiều hơn nhƣ: Lactospore®, Sporlac®, SANVITA,…của Sabinsa Corporation, Lactopure của Pharmed Medicare, NaturaFlora® & NaturaFlora Kids Formula-Chewable® của Natura Health,… [35, 36, 37, 38] Một nghiên cứu của Tae-Han Kim và ctv (đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã thành công khi dùng N – methyl – N’ – nitro – N – nitrosoguanidine (NTG) gây đột biến kháng rifampicin cho L. sporogenes [20]. Điều mở ra hƣớng kết hợp L. sporogenes với loại kháng sinh này dùng làm thuốc mà không gây bất hoạt sự phát triển của L. sporogenes. 29 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 3.1.1. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ 2/2005 đến 8/2005 3.1.2. Địa điểm Tại phòng vi sinh khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm, TPHCM 3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Mẫu khảo sát Chế phẩm sinh học (Thorne Research, USA) 3.2.2 Môi trƣờng Môi trƣờng phân lập và giữ giống: GYE (Glucose Yeast Extract) thạch đĩa và thạch nghiêng Môi trƣờng thử sinh hóa: GYE thạch nghiêng và lỏng, NB (Nutrient broth) bán lỏng, các môi trƣờng đƣờng Môi trƣờng khảo sát bào tử: GYE và MRSA thạch đĩa. Môi trƣờng bảo quản: bột đậu nành sấy khô và glycerol 3.2.3. Hóa chất Thuốc nhuộm Gram NaCl 9%0 ; NaOH 0,1N; H2O2 30%; FeCl3 1N; phenol 1% 3.2.4. Thiết bị – dụng cụ Thiết bị: tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp autoclave, bếp nấu, giá đỡ ống nghiệm... Dụng cụ: kính hiển vi, ống nghiệm, đĩa petri... 3.3. Nội dung đề tài Phân lập các chủng L. sporogenes từ các chế phẩm có sẵn Khảo sát khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes phân lập đƣợc Khảo sát các điều kiện hình thành bào tử ở vi khuẩn L. sporogenes 30 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Tổng quan các bƣớc thực hiện đề tài Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng, phát triển của L. sporogenes 3.4.2. Phân lập vi khuẩn Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và định danh L. sporogenes Lấy mẫu Phân lập Khảo sát Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn Đặc điểm sinh hóa Xác định khả năng tạo acid lactic Khảo sát hình thái khuẩn lạc Khả năng tạo bào tử Nhuộm Gram (trực khuẩ n, Gram (+) ), sinh bào tử ở mộ t đầ u. Kiểm tra phản ứng sinh hóa Đánh giá Môi trƣờng GYE, 37 oC/48 giờ Môi trƣờng GYE để giữ giống ở nhiệt độ phòng Mẫu 31 3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào [9, 40]  Hình thái khuẩn lạc Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa [9, 40] Hình dáng khuẩn lạc: lồi, trơn, màu vàng trùng với màu môi trƣờng xung quanh. Đƣờng kính khuẩn lạc: 2,5 mm.  Hình thái tế bào Tế bào đƣợc quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ lục 5.1). Vi khuẩn L. sporogenes có hình que, bắt màu Gram (+), không tạo chuỗi. Bào tử nằm ở một đầu tế bào. Kích thƣớc tế bào: 0,4 – 0,8 µm  2,5 – 4,5 µm.  Hình thái bào tử Bào tử đƣợc quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ lục 5.2). Bào tử L. sporogenes có hình bầu dục, bắt màu hồng, nằm ở một đầu tế bào. Kích thƣớc bào tử: 0,9 – 1,2 µm  1 – 1,7 µm. Mẫu chế phẩm Pha loãng trong 9 ml NaCl 9%0 đến nồng độ 10 -8 Giữ 3 ống nồng độ pha loãng 10-6, 10 -7 , 10 -8 ở 1000C/10 phút Cấy trang trên đĩa GYE Quan sát khuẩn lạc đặc trƣng Giữ giống trên GYE thạch nghiêng Ủ 370C/48 giờ 32 3.4.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa [35] Để định danh L. sporogenes, ngoài hình thái khuẩn lạc và tế bào, còn cần đến những phản ứng sinh hóa đặc trƣng (xem phụ lục 6.1 – 6.3). Sơ đồ 3.4: Quy trình tiến hành thủ nghiệm sinh hóa [35] 3.4.3. Khả năng sinh acid lactic 3.4.3.1. Định tính  Nguyên tắc Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp phát hiện khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes bằng phản ứng với thuốc thử Uffelman  Tiến hành Cấy vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh vào 10 ml canh GYE. Ủ 370C/48 giờ. Ly tâm ống canh khuẩn ở tốc độ 3000 vòng/10 phút. Thu dịch nổi vào bình chiết, thêm 2,5 ml H2SO4 10%, 25 ml diethyl ether và lắc đều. Thu lấy tầng ether và cho bốc hơi thật kỹ trong bồn nƣớc nóng (trong khoảng 60 - 1000C)cho đến khi còn lại một thể tích dung dịch ổn định. Hòa tan phần còn lại này trong 2,5 ml nƣớc cất. Thêm vào 2,5 ml thuốc thử Uffelman màu tím xanh. Đọc kết quả. Kết quả Phản ứng (-): dung dịch không chuyển thành màu vàng Phản ứng (+): dung dịch chuyển thành màu vàng Giống Cấy tăng sinh trong GYE lỏng Ủ 370C/24 giờ Cấy sang các môi trƣờng thử sinh hóa Lên men đƣờng Di động Catalase 33 3.4.3.2. Định lƣợng  Nguyên tắc L. sporogenes lên men đƣờng tạo ra acid nên có cũng có khả năng làm đông vón sữa. Dựa vào đặc điểm này, chúng tôi xác định và đánh giá lƣợng acid lactic (chiếm hơn 85% tổng lƣợng acid đƣợc tạo ra) do các chủng L. sporogenes trong chế phẩm Lactospore ® sản xuất thông qua giá trị độ chua Therner.  Tiến hành o Xác định độ chua 34 Sơ đồ 3.5: Quy trình xác định độ chua Therner Công thức tính độ chua (T) trong 100 ml dịch sữa lên men o Tính lƣợng acid lactic Công thức tính lƣợng acid lactic trong 100 ml dịch lên men dựa vào giá trị độ chua T = n.100/V T: độ chua n: VNaOH 0,1N sử dụng (ml) V: thể tích dịch sữa lên men chƣa pha loãng (ml) 4 ml GYE lỏng Hấp vô trùng Cấy vi khuẩn Ủ 370C/24 giờ Sữa đặc có đƣờng Pha loãng bằng nƣớc cất với tỉ lệ 1:10 Chiết 40 ml vào bình tam giác Ủ 370C/24 giờ Hút 10 ml dịch lên men + 90 ml nƣớc cất + 2-3 giọt phenolphtalein Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi dịch lên men chuyển sang màu hồng nhạt bền trong 5 phút Ghi nhận VNaOH 0,1N Tính giá trị độ chua (T) theo công thức 35 3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử  Nguyên tắc Sự hình thành và hồi sinh của bào tử L .sporogenes chịu ảnh hƣởng lớn bởi những điều kiện môi trƣờng. Thí nghiệm sau đây đƣợc thực hiện nhằm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng tạo bào tử. Đối tƣợng đƣợc lựa chọn để thực hiện thí nghiệm là 3 trong số các chủng giữ giống.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu 3 yếu tố Yếu tố 1: nhiệt độ nuôi cấy Yếu tố 2: môi trƣờng nuôi cấy Yếu tố 3: 3 chủng vi khuẩn L. sporogenes Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử L. sporogenes Yếu tố 3 Yếu tố 1 Yếu tố 2 37 0C/6 ngày [9] 37 0C/2 ngày  500C/2 giờ  700C/2 giờ MRSA GYE MRSA GYE Chủng 1 Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4 2 Nghiệm thức 5 Nghiệm thức 6 Nghiệm thức 7 Nghiệm thức 8 3 Nghiệm thức 9 Nghiệm thức 10 Nghiệm thức 11 Nghiệm thức 12 Chú ý: mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần A = 0,009.n.100/V = 0,009.T A: khối lƣợng acid lactic (g) n : VNaOH 0,1N chuẩn độ (ml) 0,009 : hệ số chuyển 1 ml NaOH 0,1N sang số gam acid lactic V : thể tích dịch sữa lên men chƣa lên men (ml) 36  Quy trình khảo sát Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử L. sporogenes [9, 40] Chọn 3 chủng Cấy tăng sinh trên GYE lỏng Ủ 370C/24 giờ Hút 1ml sinh khối và cấy lên 2 môi trƣờng thạch đĩa MRSA GYE Ủ 370C/6 ngày Ủ 370C/6 ngày Ủ 370C/2 ngày, tiếp tục ủ ở 50 0C/2 giờ và 70 0C/2 giờ Ủ 370C/2 ngày, tiếp tục ủ ở 50 0C/2 giờ và 70 0C/2 giờ Thu sinh khối (a) Thu sinh khối (a) Thu sinh khối (a) Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) So sánh số lƣợng bào tử và đánh giá khả năng hình thành bào tử trong mỗi thí nghiệm bố trí Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) Thu sinh khối (a) 37 Ghi chú: (a) xem phƣơng pháp thu sinh khối (b) xem phƣơng pháp kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối o Phƣơng pháp thu sinh khối  Nguyên tắc Nhằm đảm bảo thu một lƣợng sinh khối đồng đều giữa các đĩa, chúng tôi dùng cùng một lƣợng thể tích dung dịch để đồng nhất sinh khối và thu nhận một thể tích dịch sinh khối nhất định.  Tiến hành Hút 6 ml NaCl 9%0 vào mỗi đĩa. Dùng que cấy trang trộn đều sinh khối trên mặt thạch NaCl 9%0. Chuyển 4 ml dịch sinh khối vào ống nghiệm. o Phƣơng pháp kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối [9,40]  Nguyên tắc Số lƣợng bào tử L. sporogenes trong sinh khối chỉ có thể đếm đƣợc sau khi đã pha loãng nhiều lần và cấy trang trên đĩa. Ngoài ra, để đánh giá chính xác số lƣợng bào tử trƣớc khi cấy trang, chúng tôi gia nhiệt những ống pha loãng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp để tiêu diệt toàn bộ tế bào sinh dƣỡng. Những bào tử còn sống sau quá trình gia nhiệt sẽ hồi sinh trở lại khi cấy trang. Vì vậy, số khuẩn lạc đặc trƣng thu nhận đƣợc cũng tƣơng ứng với số bào tử trong dịch pha loãng.  Tiến hành Từ sinh khối thu đƣợc, hút 1ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9%0 để có nồng độ pha loãng 10-1. Hút tiếp 1 ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9%0 để có nồng độ pha loãng 10-2 . Tiếp tục nhƣ thế cho đến nồng độ pha loãng 10-9 . Giữ 3 ống 10-7 ,10 -8 , 10 -9 bồn nƣớc 1000C/10 phút. Hút 0,1 ml dịch khuẩn ở 3 nồng độ trên và trang trên 2 loại môi trƣờng thạch đĩa GYE và MRSA, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 0C/48 giờ. Đếm số lƣợng khuẩn lạc trong mỗi đĩa và tính số bào tử có trong sinh khối ban đầu.  Tính kết quả Số khuẩn lạc trong 1 g hay 1 ml dịch mẫu ở mỗi độ pha loãng 38 Công thức Số khuẩn lạc trung bình trong 1 g hay 1 ml mẫu ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp khác nhau 3.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics 7.0 để so sánh số lƣợng bào tử khác nhau ở các điều kiện khảo sát V 1 h 1 x N X X: số lƣợng khuẩn lạc trong 1 g mẫu hay 1 ml dịch mẫu N: tổng số khuẩn lạc trong các đĩa cùng nồng độ pha loãng x: số đĩa cùng nồng độ pha loãng h: nồng độ pha loãng (10-7, 10-8, 10-9) V: thể tích dịch mẫu cấy trên 1 đĩa (ml) 3 XXX Y 321 Y: số khuẩn lạc trung bình ở các nồng độ pha loãng X1, X2, X3: số lƣợng khuẩn lạc trung bình có trong 1 g hay 1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng 39 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.4. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes 4.4.1. Kết quả phân lập Từ chế phẩm, chúng tôi phân lập đƣợc 20 chủng L. sporogenes (xem Bảng 4.1) Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn L. sporogenes Số khuẩn lạc nghi ngờ đƣợc chọn Khuẩn lạc có hình thái vi/đại thể phù hợp với L. sporogenes Khuẩn lạc có sinh hóa phù hợp với L. sporogenes 20 Số lƣợng Tỷ lệ (%) Số lƣợng Tỷ lệ (%) 20 100% 20 100% Vì 100% khuẩn lạc nghi ngờ đƣợc chọn đều có hình thái vi thể và đặc điểm sinh hóa phù hợp với L. sporogenes nên chúng tôi kết luận trong chế phẩm của Thorne Research (USA) chỉ thuần một loại vi khuẩn L. sporogenes. 4.4.2. Đặc điểm hình thái của L. sporogenes 4.4.2.1. Quan sát khuẩn lạc Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng GYE ở 370C/48 giờ. Chúng tôi quan sát đƣợc hình dạng khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, lồi, đều, màu vàng, bề mặt mịn; đƣờng kính khuẩn lạc trung bình 2 – 3 mm; vùng môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc chuyển từ màu tím sang màu vàng. 4.4.2.2. Quan sát hình thái tế bào Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn L. sporogenes trên môi trƣờng GYE 40 Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram khuẩn lạc điển hình phân lập đƣợc trên môi trƣờng thạch GYE sau 48 giờ ủ ở 370C. Vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần (100X). Hình thái của tế bào vi khuẩn đƣợc chúng tôi ghi nhận nhƣ sau: hình que, bắt màu Gram (+), 2 đầu hơi tròn, không tạo chuỗi; kích thƣớc tế bào 0,4 – 0,8 µm  2,1 – 4,5 µm; bào tử nằm về một đầu tế bào (xem Hình 4.2). 4.4.2.3. Quan sát hình thái bào tử Chúng tôi tiến hành nhuộm bào tử từ mẫu khuẩn lạc điển hình trên môi trƣờng GYE sau 72 giờ ủ ở 370C. Bào tử quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần có những đặc điểm sau: hình bầu dục; phình to ở một đầu tế bào; bắt màu hồng; kích thƣớc 1 – 1,2 µm  1,2 – 1,8 µm. 4.4.3. Đặc điểm sinh hóa của L. sporogenes Từ 20 chủng L. sporogenes phân lập đƣợc, chúng tôi tiến hành thử phản ứng sinh hóa. Kết quả ghi nhận đƣợc trình bày qua bảng 4.2 Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn L. sporogenes đƣợc phóng đại 1000 lần dƣới kính hiển vi 41 B ả n g 4 .2 : Đ ặ c đ iể m s in h h ó a c ủ a c á c ch ủ n g L . sp o ro g e n es p h â n l ậ p đ ƣ ợ c từ c h ế p h ẩ m G lu co se + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + S u cr o se + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + F ru ct o se + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + M an n it o l + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + M al to se + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + L ac to se + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + S o rb it o l + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + D ex tr in + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + C at al as e + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + D i đ ộ n g + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + S in h h ó a C h ủ n g 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 42 Qua Bảng 4.2, chúng tôi nhận thấy đặc điểm sinh hóa của các chủng phân lập phù hợp với tính chất sinh hóa của vi khuẩn L. sporogenes. 4.5. Khả năng sinh acid lactic 4.5.1. Định tính Từ 20 chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa, chúng tôi tiếp tục tiến hành xác định khả năng sinh acid lactic của chúng. Kết quả ghi nhận đƣợc trình bày ở Bảng 4.3. Bảng 4.3 Khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa Số chủng thử nghiệm Số chủng có khả năng sinh acid lactic 20 Số lƣợng Tỷ lệ (%) 20 100 Dựa vào Bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy 20 chủng phân lập đƣợc đều có khả năng sinh acid lactic. Để đánh giá thêm về lƣợng acid lactic do L. sporogenes sản xuất, chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm đo độ chua Therner và định lƣợng acid lactic. Hình 4.3: Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn L. sporogenes 43 4.5.2. Định lƣợng Sau khi thực hiện nuôi cấy các chủng L. sporogenes phânlập đƣợc trong môi trƣờng sữa đặc có đƣờng, chúng tôi nhận thấy: tất cả 20 chủng đều có khả năng làm đông vón sữa. Từ giá trị độ chua thu nhận đƣợc, chúng tôi tính đƣợc lƣợng acid lactic do các chủng L. sporogenes sản xuất. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 4.4. Bảng 4.4: Giá trị độ Therner và lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sản xuất Chủng Thể tích NaOH 0.1N cần dùng (ml) Độ Therner (T) Số gam acid lactic trong 100ml dịch lên men (g/100ml) Hình 4.4: Thí nghiệm tạo acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes Ghi chú: ĐC (-): 2,5ml nƣớc cất + 2,5 ml thuốc thử Uffelman ĐC (+): 2,5ml acid lactic 96% + 2,5 ml thuốc thử Uffelman Mẫu: 2,5ml dịch lên men (đã qua chiết tách) + 2,5 ml thuốc thử Uffelman 44 1 2,4 24 0,216 2 2 20 0,18 3 2,9 29 0,261 4 2 20 0,18 5 1,9 19 0,171 6 2 20 0,18 7 2 20 0,18 8 2,2 22 0,198 9 1,9 19 0,171 10 2,5 25 0,225 11 2 20 0,18 12 1,9 19 0,171 13 2,1 21 0,189 14 2 20 0,18 15 1,6 16 0,144 16 3 30 0,27 17 1,7 17 0,153 18 1,8 18 0,162 19 3,8 38 0,342 20 3,2 32 0,288 Qua bảng 4.4, chúng tôi nhận thấy độ Therner biến động từ 1,6 - 3,8 tƣơng ứng với lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sinh ra là 0,144 - 0,342 g/100ml. Loài Lactobacillus khác nhƣ L. bulgaricus sản xuất đƣợc 0,684 g acid lactic/100 ml dịch sữa 10% đƣợc lên men ở 370C/5 giờ [1]. Nhƣ vậy, 20 chủng vi khuẩn L. sporogenes chúng tôi đang khảo sát có khả năng sinh acid lactic nhƣng yếu hơn những loài Lactobacillus khác. Nguyên nhân của điều này có thể vì điều kiện nuôi cấy hay lên men chƣa phù hợp hay vì đặc tính di truyền của các chủng L. sporogenes đang khảo sát. Ngoài ra, chúng tôi không tìm thấy một tài liệu nào ghi nhận rõ ràng về lƣợng acid lactic mà vi khuẩn L. sporogenes sinh ra. 45 Trong 20 chủng khảo sát, chúng tôi nhận thấy 3 chủng 16, 19, 20 có khả năng sản xuất acid lactic mạnh nhất. Khả năng tạo acid lactic có ý nghĩa nhất định trong việc ứng dụng vi khuẩn L. sporogenes làm chế phẩm. Acid lactic giúp vi khuẩn L. sporogenes ức chế những vi khuẩn gây bệnh trong đƣờng ruột vật chủ và mang những lợi ích về mặt sinh lý cho vật chủ (xem mục 2.2.5.1. phần 2). Vì vậy, chúng tôi chọn 3 chủng 16, 19, 20 để tiếp tục khảo sát khả năng tạo bào tử, từ đó có thể khảo sát tiếp sự tồn tại của bào tử khi trộn vào chế phẩm. 4.6. Khảo sát khả năng hình thành bào tử Sau khi khảo sát trên 2 loại môi trƣờng, 2 điều kiện nhiệt độ - thời gian hình thành bào tử với 3 chủng khác nhau, chúng tôi thu nhận đƣợc số liệu về lƣợng bào tử trong mỗi nghiệm thức (xem Bảng 4.5) Bảng 4.5 Số lƣợng bào tử L. sporogenes thu đƣợc trong 12 nghiệm thức đƣợc khảo sát Điều kiện nhiệt độ - thời gian 37 0C/6 ngày 500C/2 giờ  700C/2 giờ Môi trƣờng Chủng MRSA GYE MRSA GYE Bào tử /ml (N) LogN Bào tử /ml (N) LogN Bào tử /ml (N) LogN Bào tử /ml (N) LogN 16 X 1,43.10 11 11,14 1,48.10 11 11,16 1,6.10 11 11,20 1,82.10 11 11,23 SD 0,09 0,09 0,05 0,18 CV% 0,83 0,84 0,51 1,64 19 X 2,43.10 11 11,34 1,95.10 11 11,25 2,35.10 11 11,34 2,32.10 11 11,35 SD 0,23 0,21 0,18 0,10 CV% 0,28 1,89 1,58 0,92 20 X 1,74.10 11 11,22 1,99.10 11 11,28 1,93.10 11 11,27 2,13.10 11 11,31 SD 0,13 0,10 0,12 0,12 CV% 1,16 0,95 1,09 1,09 Chú ý: mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần Chúng tôi xử lý thống kê trên số liệu logarit (LogN) đƣợc chuyển đổi từ số bào tử thu đƣợc ở dạng số liệu nguyên (Bào tử/ml). Dựa vào bảng ANOVA (xem phụ lục 7.1), chúng tôi nhận thấy: mức độ ý nghĩa sự khác biệt giữa các chủng là 0,07; giữa các môi trƣờng nuôi cấy là 0,81; giữa các điều kiện nhiệt độ - thời gian là 0,32. Vậy, không có sự khác biệt về ảnh hƣởng của các chủng, các môi trƣờng nuôi cấy và những điều kiện thời 46 gian – nhiệt độ khác nhau lên khả năng hình thành bào tử vi khuẩn L. sporogenes (P>0,05). Tuy nhiên, trong bảng ghi nhận sự khác biệt giữa các chủng (xem phụ lục 7.2), chúng tôi nhận thấy chủng 19 có khả năng tạo bào tử nhiều hơn chủng 16. Sự khác biệt không đáng kể nên có thể quy cho sai số trong lƣợng sinh khối thu đƣợc lúc đầu. Ngoài ra, mức độ ý nghĩa về sự tƣơng tác giữa các yếu tố khảo sát đều lớn hơn 0,05 (xem phụ lục 7.1) nên có thể kết luận rằng không có sự tƣơng tác giữa các yếu tố này lên khả năng hình thành của bào tử. Từ kết quả trên, chúng nhận thấy rằng để sản xuất bào tử vi khuẩn L. sporogenes nhằm trộn vào chế phẩm, có thể sử dụng môi trƣờng GYE hay MRSA đều đƣợc. Tuy nhiên, môi trƣờng GYE có thành phần đơn giản và ít tốn chi phí hơn môi trƣờng MRSA. Ngoài ra, để tiết kiệm thời gian, ta nên sử dụng điều kiện nhiệt độ - thời gian hóa bào tử là 50 0C/2 giờ rồi chuyển qua 700C/2 giờ sau khi đã nuôi sinh khối ở 370C/2 ngày thay vì nuôi cấy tạo bào tử ở 370C/6 ngày. 47 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Chúng tôi phân lập đƣợc 20 chủng với những đặc điểm hình thái vi/đại thể và sinh hóa đặc trƣng của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes. Khả năng sinh acid lactic của 20 chủng đều thấp hơn những loài Lactobacillus khác. Môi trƣờng nuôi cấy (MRSA và GYE) và điều kiện nhiệt độ - thời gian hóa bào tử (37 0C/6 ngày và 370C/2 ngày → 500C/2 giờ → 700C/2 giờ) ảnh hƣởng không có ý nghĩa lên sự hình thành bào tử của các chủng L. sporogenes khảo sát. 5.2. Đề nghị Khảo sát thêm các loại môi trƣờng nuôi cấy, các mức nhiệt độ, pH, thời gian thích hợp cho L. sporogenes sinh acid lactic và tạo sinh khối tối ƣu. Khảo sát thêm môi trƣờng và thời gian bảo quản bào tử trong chế phẩm. 48 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lý Thành Kiệt, 2002. Bước đầu nghiên cứu phân lập và nhân giống 2 chủng vi khuẩn Lactic Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus để cung cấp giống cho chế biến yogurt ở quy mô nhỏ. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ thực phẩm, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Lã Văn Kính, 1998. Những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong công nghệ sản xuất thức ăn gia súc và vai trò của probiotic đối với động vật. Báo cáo khoa học, Trung tâm Thông tin khoa học và công nghệ, Sở khoa học công nghệ và môi trƣờng TPHCM, trang 1 – 9. 3. Lê Thị Tài, 1996. Kết quả thử nghiệm Biosubtyl trong điều trị loạn khuẩn đường ruột gia sức non. Tạp chí Nông nghiệp, Công nghệ thực phẩm. Trang 263 – 264. 4. Trần Thị Thu Thủy, 2003. Khảo sát tác dụng thay thế kháng sinh của Probiotics trong phòng ngừa tiêu chảy do E. coli trên heo con. Luận văn thạc sĩ, khoa Chăn nuôi – Thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 85 trang. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 5. Amer, M.A. and Lammending, A.M., 1983. Health Maintenance benefits of cultured dairy products. Cultured Dairy Products J. 18 : 6-19. 6. Barefoot and Klaehammer, 1984. Purification and characterisation of Lactobacillus acidophillus bacteriocin lactacin B. Antimicrobiological agents chemotheraphy, 26 (3): 324 – 328. 7. Bernet et al., 1994. Lactobacillus acidophillus LA 1 binds to cultured human intestinal cells and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent bacteria, 35: 483 – 489. 8. Buchnan, R.E. & Gibbons, N.E. ed., 1974. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 577. 9. B. P. Dey and C. P. Lattuada, 1998. USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook. 3rd Edition. Volume 2. Pages 33 – 5 and 33 – 6. 10. Friend, B.A. and Shahani, K.M., 1984. Nutritional and therapeutic aspects of lactobacilli. J. Appl. Nutr. 36: 125-33. 49 11. Gandhi, A.B. and Nagarathnam, T., 1990. Probiotics for veterinary use. Poultry Guide, 27(3) : 43-47. 12. Gandhi, A.B., 1995. Personal communication. 13. Gandhi, A.B., 1998. Lactobacillus sporogenes, an advancement in Lactobacillus therapy. The Eastern Pharmacist, 41-43. 14. Gilliland, S.E. and Speck, M.L., 1977. Deconjugation of bile acids by intestinal lactobacilli. Appl. Environ. Microbiol. 33 :15. 15. Gould, G.W. and Hurst, A., 1969. The bacterial spore. Academic Press. 16. Gorbach, S.L., l990. Lactic acid bacteria and human health. Annals of Medicine 22:37-41. 17. Hepner et al., 1979. Hypercholesterolemic effect of yogurt and milk. Am.J. Clin. Nutr. 32:19-24. 18. Hosono et al., 1987. Antimutagenic activity of cellular component of Streptococcus faecalis IFO 12965. Netherlands Milk and Dairy Journal, 41: 239-45. 19. Johansson et al., 1993. Administration of different Lactobacillus strains in fermented oatmeal soup: in vivo colonisation of human intestinal mucosa and effect on the indigenous flora. Applied and Environmental Microbiology, 59: 15 – 20. 20. Kim Tae Han et al, 1989. development of L. sporogenes resistent to Rifampicin, an antituberculosis agent. Kor. Jour. Microbiol, p. 155 – 161. 21. Kim Y.M. et al., 1985. Studies on the production of beta - galactosidase by Lactobacillus sporogenes. Properties and applications of beta - galactosidase. Korean J. Applied Microbiol. Bioeng. 13(4) 355-360. 22. Kishida, T. Interferon and immune function. New Editions Health World. 23. Klaenhammer, T.R., 1988. Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie 70 : 337-349. 24. Macbeth,W.A.A.G. et al., 1965. Treatment of hepatic encephalopathy by alteration of intestinal flora with L. acidophilus, Lancet, i : 399-403. 25. Mohan, J.C et al., 1990. Preliminary observations on effect of L. sporogenes on serum lipid levels in hypercholesterolemic patients. Indian J. Med. Res. [B] 92, 431-432. 50 26. Mohan, J.C. et al., 1990. Short term hypolipedemic effects of oral L. sporogenes therapy in patients with primary dyslipidemias. Indian Heart J. 42(5) : 361-4. 27. Rani and Khetarpaul, 1998. Probiotic fermented food mixture: possible applications in clinial anti – diarrhoea usage. Nutrition Health, 12: 97 – 105. 28. Saarela et al, 2000. Probiotic bacteria: safety, functional and technology properties. Journal of Biotechnology, 84: 197 – 215. 29. Saxelim, 1997. Lactobacillus GG – a human probiotic strain with thorough clinical documentation. Food Review International 13 (2): 293 – 313. 30. Scott et al., 1990. Lactobacillus . The Pharmaceutical Journal Nov. 24 608-610. 31. Shahani, K.M. and Ayebo, A.D., 1980. Role of dietary lactobacilli in gastrointestinal microecology. Am. J. Clin. Nutr. 33,2448-2457. 32. Tannock, 1997. Probiotic properties of lactic acid bacteria: plenty of scope for fundamental R&D. Trends in Biotechnology 15 (7): 270 – 274. 33. Wood, B.J.B, 1992. The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease, Vol. 1, p 394., Elsevier Applied Science. 34. Zamfir et al, 1999. Purification and charaterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophillus IBB. Journal of Applied Microbiology, 87 (6): 923 – 931. 35. www.lactospore.com/back2.htm 36. www.microbax.com/lactobacillus.htm 37. www.natura.org.uk/naturaflora.htm 38. www.pharmedmedicare.com/lactopure.html 39. static.highbeam.com/a/alternativemedicinereview/august012002/lactobacillussporo genesmonograph/index.html 40. Analysis of Lactospore®: Report from Sami Chemicals and Extracts, Bangalore, India, (1995). 51 PHỤ LỤC 1. Thành phần môi trƣờng 1.1. Môi trƣờng GYE agar (Glucose Yeast Extract) Cao nấm men 5.0g Peptone 5.0g D-glucose 5.0g K2HPO4 0.5g KH2PO4 0.5g MgSO4 0.3g Bromocresol purple 1ml Khoáng vi lƣợng 1.0ml Nƣớc vô trùng 1000ml Agar 15g pH 6.3 0,2 Thành phần khoáng vi lƣợng NaCl 500mg FeSO4.7H2O 900mg MnSO4.5H2O 800mg ZnSO4.7H2O 80mg CuSO4.5H2O 80mg CoSO4.7H2O 80mg Nƣớc vô trùng 50ml Đun sôi môi trƣờng cho hòa tan Hấp khử trùng ở 1150C/30 phút 1.2. Môi trƣờng MRSA Cao thịt 8g Peptone 10g Cao nấm men 4g Glucose 10g Acetate Na 5g 52 K2HPO4 2g Triamonium citrate 2g MgSO4 0,2g MnSO4 0,2g Tween 80 1ml Bromocresol purple 1ml CaCO3 2g Agar 16g Nƣớc cất 1000ml Đun sôi môi trƣờng cho hòa tan Hấp khử trùng ở 1150C/30 phút 1.3. Môi trƣờng Nutrient broth (NB) Cao thịt 5g Peptone 10g NaCl 5g Nƣớc cất 1000ml pH 7,0 0,2 Hấp khử trùng ở 1210C/20 phút 1.4. Môi trƣờng lên men đƣờng Cao thịt 5g Peptone 10g NaCl 5g Đƣờng 10g Phenol red 0,01g Nƣớc cất 1000ml 1.5. Môi trƣờng thạch bán lỏng Nutrient broth 13g Agar 5g Nƣớc cất 1000ml pH 7,2 0,2 53 Đun sôi môi trƣờng cho hòa tan Hấp khử trùng ở 1210C/20 phút 2. Hóa chất 2.1. Nƣớc muối sinh lý NaCl 9%0 NaCl 9g Nƣớc cất 1000ml 2.2. NaOH 0,1N NaOH 40g Nƣớc cất 1000ml Cân 40g NaOH tinh thể hòa vào 50ml nƣớc cất lắc đều, để yên 24h, gạn lấy nƣớc trong ở trên rồi bổ sung thêm nƣớc cất cho đủ 1000ml. 3. Thuốc nhuộm 3.1. Crystal violet (a) Crystal violet 0.4g cồn 960 10ml (b) phenol 1g nƣớc cất 100ml Trộn 2 dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc. Thuốc nhuộm đƣợc bảo quản trong chai màu tối. 3.2. Fuchsine kiềm (a) Fuchsine kiềm 0,3g Ethanol 96 0 10ml (b) Phenol 5g Nƣớc cất 35ml Trộn 2 dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc. Thuốc nhuộm phải đƣợc bảo quản trong chai màu tối. Trƣớc khi dùng, pha loãng 5 lần (dịch pha loãng không giữ đƣợc lâu còn dịch đậm đặc có thể giữ trong nhiều tháng). 3.3. Lugol KI 2g 54 Iod tinh thể 1g Nƣớc cất 300ml Hòa tan 2g KI vào 5ml nƣớc cất. Sau đó thêm 1g iod và chờ cho iod tan hết mới thêm nƣớc cho đủ 300ml. 3.4. Methylene blue (a) Methylene blue 1,5g Ethanol 96 0 10ml (b) Acid phenic 1g Nƣớc cất 100ml Trộn 2 dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan. Bảo quản trong chai màu tối. 4. Thuốc thử và chỉ thị màu 4.1. Thuốc thử Ufellman Phenol 1% 10ml FeCl3 1N 2 giọt 4.2. Thuốc chỉ thị Bromocresol purple (BCP) (a) Bromocresol purple 16g Ethanol 96 0 500ml (b) Nƣớc cất 500ml Pha dung dịch a trƣớc, sau đó trộn với b. Giữ hỗn hợp trong chai màu tối. 5. Phƣơng pháp nhuộm 5.1. Phƣơng pháp nhuộm Gram Cố định tiêu bản Đặt giấy lọc lên vết bôi Nhuộm crystal violet 1-2 phút Rửa nƣớc Cố định lugol 1 phút Rửa nƣớc Tẩy ethanol 900 15 giây Rửa nƣớc 55 Nhuộm fuchsine kiềm loãng 1phút rửa nƣớc Để khô Xem kính hiển vi ở vật kính 100X 5.2. Phƣơng pháp nhuộm bào tử Cố định tiêu bản Nhuộm HCl 1% Rửa nƣớc Đặt giấy lọc lên vết bôi Nhuộm fuchsine đậm đặc, hơ nhẹ trên đèn cồn trong 2-4 phút Rửa nƣớc Rửa cồn 900 15 giây Rửa nƣớc Nhuộm Methylene blue 1 phút Rửa nƣớc Để khô Xem kính hiển vi ở vật kính 100X 6. Phƣơng pháp thực hiện các phản ứng sinh hóa 6.1. Khả năng lên men đƣờng  Nguyên tắc Một số vi sinh vật sử dụng và lên men một số lọai đƣờng làm pH môi trƣờng giảm. Khi đó, chỉ thị màu phenol red từ màu đỏ chuyển sang màu vàng, có sinh hơi hay không sinh hơi tùy vào từng lọai vi khuẩn.  Chuẩn bị Môi trƣờng đƣờng: glucose, sucrose, fructose, maltose, mannitol, lactose, sorbitol, dextrin. Giống vi khuẩn: L. sporogenes Ống nghiệm, ống durham  Tiến hành 56 Phân môi trƣờng vào các ống nghiệm có ống durham, đem hấp vô trùng 115 0C/20 phút để nguội, cấy vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh vào, ủ ở 370C/24h, đọc kết quả.  Kết quả Phản ứng (-): môi trƣờng đục và có màu đỏ cam Phản ứng (+): môi trƣờng đục và có màu vàng 6.2. Khả năng di động  Nguyên tắc Một số vi khuẩn có tiêm mao nên có khả năng di động trong môi trƣờng bán lỏng.  Chuẩn bị Môi trƣờng bán lỏng Que cấy thẳng Giống vi khuẩn L. sporogenes  Tiến hành Cấy vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh sang môi trƣờng bán lỏng (cấy chích thẳng từ trên xuống dƣới), ủ 370C/24h. Đọc kết quả.  Kết quả Phản ứng (-): vi khuẩn mọc theo đƣờng cấy Phản ứng (+): vi khuẩn mọc lan ra xung quanh 6.3. Phản ứng catalase  Nguyên tắc Một số vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme catalase phân giải H2O2 thành H2O2 và O2  Chuẩn bị Môi trƣờng GYE thạch nghiêng Giống vi khuẩn L. sporogenes  Tiến hành Cấy ria vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh lên môi trƣờng GYE thạch nghiêng, ủ 37 0C/24h, nhỏ H2O2 lên sinh khối. 57  Kết quả Phản ứng (-): không có hiện tƣợng nào xảy ra Phản ứng (+): có hiện tƣợng sủi bọt khi H2O2 tiếp xúc sinh khối