Khóa luận Nghiên cứu kỹ thuật bào chế, đánh giá khả năng kháng khuẩn trên in vitro của chế phẩm kem Silver sulfa 1%

TrÇn v¨n quang nghiªn cøu kü thuËt bµo chÕ, ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng kh¸ng khuÈn trªn in vitro cña chÕ phÈm kem Silver sulfa 1% Ng­êi h­íng dÉn :  TS. NguyÔn ThÞ Léc §Æt vÊn ®Ò Báng lµ mét bÖnh ngo¹i khoa kh¸ quan träng §Ó ®iÒu trÞ báng c¸c chÕ phÈm cña sulfadiazin b¹c cã nhiÒu ­u ®iÓm ®· ®­îc chøng minh trong l©m sµng. Viªc cung øng thuèc cã khã kh¨n. C¸c môc tiªu cô thÓ cña khãa luËn :1. Nghiªn cøu kü thuËt bµo chÕ kem Silver sulfa 1%.2. Nghiªn cøu ®é gi¶i phãng ho¹t chÊt cña chÕ phÈm.3. Nghiªn cøu t¸c dông kh¸ng khuÈn trªn in vitro cã so s¸nh víi víi chÕ phÈm Silvirin 1% (Ên §é). PhÇn ITæng quan tµi liÖu 1. Tû lÖ m¾c bÖnh báng.Thêi b×nh : 1,8% - 10% so víi chÊn th­¬ng ngo¹i khoa.Trong chiÕn tranh : 3% - 10% tæng sè th­¬ng binh vµ cã thÓ lªn tíi 70% - 85%.2. Thuèc mì s¸t khuÈn ®iÒu trÞ vÕt báng t¹i chç* Kem maduxin;* Mì cao vµng;* Damcream .* ChÕ phÈm chøa ho¹t chÊt sulfadiazin b¹c nh­ : Sivadene (Mü), Flammazin (Ph¸p), Silvirin (Ên §é), Slivin (Pakistan)… 3. chÕ phÈm thuèc mì cã ho¹t chÊt sulfadiazin b¹c.3.1. C«ng thøc ho¸ häc.Sulfadiazin b¹c lµ muèi b¹c cña N1- pyrimidin - 2 - yl - sulfanilamid (AgC10H9N4O2S)KLPT = 357,1. §é hoµ tan trong n­íc < 1/10.000. H×nh 1 : C«ng thøc ho¸ häc cña sulfadiazin b¹c * sulfadiazin cã t¸c dông k×m khuÈn: do c¹nh tranh øc chÕ víi PABA.* Ion b¹c: Ion b¹c chuyÓn cÇu nèi gi÷a 2 nit¬ thuéc 2 nh©n purin ®èi diÖn .Do vËy ®· lµm mÊt kh¶ n¨ng sinh s¶n ph©n ®«i cña vi khuÈn. Phèi hîp: nh©n pyrimidin sÏ dÔ dµng lµm vËn chuyÓn ion b¹c qua mµng vi khuÈn.* C¬ chÕ t¸c dông kh¸c víi c¸c hîp chÊt b¹c kh¸c, kh¸c víi sulfadiazin ®¬n ®éc. 3.2 C¬ chÕ t¸c dông. 3.3. T¸c dông kh¸ng khuÈn.B¶ng 1: Kh¶ n¨ng kh¸ng khuÈn trªn invitro cña sulfadiazin b¹c 3.4. HÊp thu thuèc.* C¸c nghiªn cøu vÒ hÊp thu víi Ag111 cho thÊy hÇu hÕt thuèc tÝch tô ë líp biÓu b× (cã t¸c dông t¹i chç). Kho¶ng 10% l­îng sulfadiazin b«i t¹i chç ®­îc hÊp thu.. §Ó ®o sulfadiazin vµ c¸c chÊt chuyÓn ho¸ ®Æc hiÖu cÇn dïng ph­¬ng ph¸p HPLC. * L­îng b¹c ®­îc hÊp thu trong c¬ thÓ kho¶ng d­íi 1%. §o b»ng quang phæ hÊp phô nguyªn tö.3.5. Nh÷ng ­u ®iÓm trong ®iÒu trÞ l©m sµng.- Cã phæ kh¸ng khuÈn réng- Cã thÓ lµm mÒm m« báng ®«ng cøng.- Kh«ng g©y ®au khi b«i.- Kh«ng g©y rèi lo¹n ®iÖn gi¶i hay kiÒm toan.- Kh«ng lµm bÈn y phôc hay v¶i tr¶i gi­êng. 1. VËt liÖu trang thiÕt bÞ. 1.1. VËt liÖu ho¸ chÊt.- B¹c sulfadiazin ®¹t tiªu chuÈn USP 24. - C¸c t¸ d­îc cÇn thiÕt ®¹t tiªu chuÈn D§VN III.- C¸c chÊt b¶o qu¶n, c¸c chÊt chèng «xy ho¸ ®¹t tiªu chuÈn D§VN III. - C¸c dung m«i dïng cho SKLM, HPLC-pp.- Mµng nh©n t¹o cellophan.- C¸c ho¸ chÊt kh¸c cÇn thiÕt. PhÇn IIVËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 1.2. Dông cô, trang thiÕt bÞ.- C©n ph©n tÝch ®é chÝnh x¸c 0,1mg cña Trung Quèc .- M¸y ly t©m cña NhËt B¶n. - Tñ ®iÒu nhiÖt gi÷ ®­îc nhiÖt ®é ë 400C, Trung Quèc - B¶n máng Silicagel 60 F254 ,VKN cung cÊp.- §Ìn huúnh quang soi ë b­íc sãng 254 nm.- Th¹ch Muller - Hinton.- C¸c chñng vi khuÈn: S. aureus, P. aeruginosa, E. coli.- Dông cô nghiªn cøu kh¶ n¨ng gi¶i phãng d­îc chÊt ra khái t¸ d­îc thuèc mì.- M¸y s¾c ký láng cao ¸p hiÖu n¨ng cao Shimadzu.- C¸c dông cô cÇn thiÕt kh¸c trong phßng thÝ nghiÖm. 2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu.2.1. §Þnh tÝnh ho¹t chÊt .*§Þnh tÝnh Sulfadiazin- Theo D§VN I:Dïng ph­¬ng ph¸p SKLM :+ HÖ dung m«i triÓn khai : Methanol : NH4OH®Æc = 100 : 1,5 .+ThÓ tÝch chÊm 10l.+ Soi ®Ìn huúnh quang ë b­íc sãng 254nm.+ Gi¸ trÞ Rf chuÈn : 6,4. 2.2. *§Þnh l­îng sulfadiazin b¹c trong kem.Ph­¬ng ph¸p ®o nitrit : 1 ml natri nitrit 35,71mg sunfadiazin b¹c.  2.3. C¸c b­íc nghiªn cøu m« h×nh kem Silver sulfa 1%. H×nh 4: C¸c b­íc nghiªn cøu m« h×nh kem Sliver sulfa 1% 2.3.1 (B­íc 1): X©y dùng c¸c c«ng thøc bµo chÕ.* X©y dùng c¸c c«ng thøc cèt t¸ d­îc + Trong tÊt c¶ c¸c c«ng thøc sö dông chÊt b¶o qu¶n lµ hçn hîp nipagin: nipason =95: 5. + C¸c t¸ d­îc phèi hîp trong c«ng thøc ph¶i ®em l¹i gi¸ trÞ HLB thÝch hîp (8 - 18) HLB hçn hîpHLBc = sum @ (f x HLBn)HLB yªu cÇu%A = [100 (X - HLBb)] / (HLBa - HLBb)%B = 100 - %A. * Nghiªn cøu t×m chÊt chèng «xy ho¸ Ion b¹c trong c«ng thøc ho¹t chÊt rÊt dÔ bÞ «xy ho¸. -Nghiªn cøu víi 4 chÊt chèng «xy ho¸ sau:Natri sulfit ,natri bisulfit,natri metasulfit,hydro quinon.- Hµm l­îng : 0,05%; 0,10% vµ 0,15%. - Thêi ®iÓm:t0: ngay sau khi bµo chÕ t1 sau khi bµo chÕ 1 ngµy, t2 sau khi bµo chÕ 3 ngµy, t3 sau khi bµo chÕ 7 ngµy.- Ph­¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ : xem xÐt sù thay ®æi mµu s¾c. H×nh 5: S¬ ®å quy tr×nh bµo chÕ kem Silver sulfa 1% 2.3.2. (B­íc 2): Nghiªn cøu s¬ bé ®é bÒn v÷ng.- §iÒu kiÖn 1: Ly t©m thuèc mì míi bµo chÕ trong vßng 5 phót víi tèc ®é 600v/phót ë nhiÖt ®é 20  10C. Quan s¸t sù ph©n líp cña thuèc mì.- §iÒu kiÖn2: §Æt thuèc mì ë 40  10C trong vßng 1 ngµy ®ªm. Quan s¸t sù thay ®æi cña thuèc mì.-Lùa chän ba c«ng thøc bÒn v÷ng nhÊt nghiªn cøu ®é gi¶i phãng ho¹t chÊt 2.3.3. (B­íc 3): Nghiªn cøu ®é gi¶i phãng ho¹t chÊt qua mµng cellophan*KhuÕch t¸n thuèc qua mµng:- Ng¨n trªn : 3g thuèc mì - M«i tr­êng khuÕch t¸n : 25ml dung dÞch NH4OH 2,5%- Thêi gian t1, t2, t3, t4 ®· ®Þnh s½n.* §Þnh tÝnh ho¹t chÊt gi¶i phãng: SKLM(D§VN I)®Ó x¸c ®Þnh ®· cã ho¹t chÊt gi¶i phãng vµ x¸c ®Þnh t1.*§Þnh l­îng nång ®é : ph­¬ng ph¸p HPLC.- Víi mçi CT, ë 1 thêi ®iÓm t, khuÕch t¸n 5 mÉu ®Ó tÝnh l­îng ho¹t chÊt gi¶i phãng qua mµng b»ng ph­¬ng ph¸p HPLC. - X©y dùng ®­êng chuÈn: b»ng ph­¬ng ph¸p b×nh ph­¬ng tèi thiÓu. - C¸c th«ng sè cña ph­¬ng ph¸p HPLC:+ Pha ®éng lµ mét hÖ dung m«i A: B = 28 : 72 víi . Dung m«i A lµ hçn hîp : Acetolnitrile cã H3PO4 (1/900). . Dung m«i B lµ hçn hîp : N­íc cÊt cã H3PO4 (1/900).+ ThÓ tÝch mÉu tiªm 50 l.+ Tèc ®é dßng 1ml/phót.+ Cét: RP18, Sopam (250 x 4,6mm,5m).+ §o ë b­íc sãng 266nm. 2.3.4. (B­íc 4): Nghiªn cøu ®é kh¸ng khuÈn.Sö dông ph­¬ng ph¸p khuÕch t¸n trªn gel th¹ch:Th¹ch Muller - Hinton ®æ ®Üa ®­êng kÝnh 9cm, ®ôc 2 lç ®èi xøng cã ®­êng kÝnh 1cm, 1 lç cho Silver sulfa 1% (c«ng thøc cã ®é gi¶i phãng ho¹t chÊt tèt nhÊt t×m ®­îc ë b­íc 3), lç cßn l¹i cho thuèc ®èi chøng Silvirin 1%. Sö dông 3 ®Üa th¹ch cho 3 chñng vi khuÈn. S. aureus; P. aeruginosa; E. coli (theo quy ®Þnh cña D§VN). C¸c chñng vi khuÈn thuÇn ®­îc lµm thµnh hçn dÞch 108 VK/ml cÊy l¸ng trªn bÒ mÆt th¹ch, ®îi kh« mÆt th¹ch cho thuèc vµo lç thö vµ lç chøng t­¬ng øng. C¸c ®Üa th¹ch ®­îc ñ 370C trong 24 giê.§äc kÕt qu¶ b»ng c¸ch ®o ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn xung quanh lç thö vµ lç chøng. 1. KÕt qu¶ x©y dùng c«ng thøc bµo chÕ.X©y dùng c«ng thøc:CT 1: Sulfadiazin b¹c 1,0gAcid stearic 24,0gTriethanolamin 1,0gGlycerin 13,0gChÊt b¶o qu¶n 0,50gN­íc tinh khiÕt v® 100ml PhÇn IIIKÕt qu¶ vµ bµn luËn CT 2 Sulfadiazin b¹c 1,0g Sorbitan stearat 1,4gPolysorbat 80 0,6gAlol cetostearic 6,5g Triglycorides 11,0gGlycrol 0,4gChÊt b¶o qu¶n 0,5gN­íc tinh khiÕt v® 100mlCT 3: Sulfadiazin b¹c 1,0gAlcol cetostearic 8,0gGlycerin monostearat 0,4gVaselin 6,0gParaffin 0,5gTween 60 0,6gChÊt b¶o qu¶n 0,2gN­íc tinh khiÕt v® 100ml CT 4: Sulfadiazin b¹c 1,0gAlcol stearylic 15,0gS¸p ong 8,0gTween 80 3,8gSpan 80 1,2g Sorbitol 8,0gChÊt b¶o qu¶n 0,2gN­íc tinh khiÕtv® 100mlCT 5:Sulfadiazin b¹c 1,0gAlcol cetylic 3,0gDÇu paraffin 20,0gGlycerol stearat 2,9gPolysorbat 80 3,1gGlycol propylen 7,0gChÊt b¶o qu¶n 0,2gN­íc tinh khiÕt v® 100ml Lùa chän chÊt chèng oxy ho¸.B¶ng 2: HiÖu lùc b¶o vÖ chèng «xy ho¸ cña natri bisulfit. Chän chÊt chèng «xy ho¸ lµ natri bisulfit , hµm l­îng 0,15%, 2. KÕt qu¶ nghiªn cøu s¬ bé ®é bÒn v÷ng.B¶ng 3: KÕt qu¶ nghiªn cøu s¬ bé ®é æn ®Þnh Chän c¸c c«ng thøc: CT2, CT3, CT5 ®Ó ®o gi¶i phãng ho¹t chÊt qua mµng. 3. KÕt qu¶ ®o gi¶i phãng ho¹t chÊt 3.1. KÕt qu¶ ®Þnh tÝnh ho¹t chÊt gi¶i phãng qua mµng: B¶ng 4: KÕt qu¶ ®Þnh tÝnh b»ng SKLM Chän c¸c thêi ®iÓm t1 = 90phót, t1 =120phót, t3 =180phót, t 4=360 phót ®Ó ®o l­îng ho¹t chÊt gi¶i phãng qua mµng b»ng HPLC. 3.2.KÕt qu¶ ®Þnh l­îng d­îc chÊt gi¶i phãng qua mµng .3.2.1. KÕt qu¶ x©y dùng ®­êng chuÈn.- S¾c ký ®å dung m«i cña cèt t¸ d­îc.- C¸c ®­êng chuÈn:+ ChuÈn 1: nång ®é ho¹t chÊt 2,12g/ml.+ ChuÈn 2: nång ®é ho¹t chÊt 5,30g/ml.+ ChuÈn 3: nång ®é ho¹t chÊt 10,60g/ml.KÕt qu¶ ®­îc ph­¬ng tr×nh tuyÕn tÝnh  y = 5,9118.e - 0,06.x + 0.HÖ sè t­¬ng quan r = 0,999833 1.Cho thÊy cã sù t­¬ng quan kh¸ chÆt chÏ gi÷a diÖn tÝch pic vµ nång ®é. 3.2.2.NhËn biÕt pic cña sulfadiazin b¹c.Sö dông hÖ thèng HPLC kÕt hîp detecter diode array:- Thêi gian l­u tR.- HÖ sè Match =1.3.2.3. TÝnh nång ®é d­îc chÊt gi¶i phãng qua mµng.*KÕt qu¶ tÝnh nång ®é d­îc chÊt gi¶i phãng qua mµng: B¶ng 5: Nång ®é d­îc chÊt gi¶i phãng qua mµng theo thêi gian cña CT3(n = 5;SD = 0,0018) *TÝnh tû lÖ% d­îc chÊt gi¶i phãng qua mµng: C«ng thøc tÝnh tû lÖ% d­îc chÊt gi¶i phãng qua mµng: B¶ng 6: Tû lÖ % ho¹t chÊt ®­îc gi¶i phãng qua mµng cña c¸c CT theo thêi gian H×nh 6: §å thÞ so s¸nh tû lÖ % ho¹t chÊt ®­îc gi¶i phãng qua mµng cña c¸c CT theo thêi gian (c¸c tû lÖ % ®Òu ®­îc gÊp lªn 10 lÇn)Chän CT3 ®Ó x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng kh¸ng khuÈn trªn invitro. B¶ng 7: Tû lÖ % ho¹t chÊt ®­îc gi¶i phãng qua mµng cña Silvirin 1% theo thêi gian(n = 5;SD = 0,0018) B¶ng 8: So s¸nh tû lÖ % ho¹t chÊt ®­îc gi¶i phãng qua mµng cña CT3 víi Silvirin 1% theo thêi gian Kh¶ n¨ng gi¶i phãng ho¹t chÊt qua mµng cña CT3 vµ Silvirin 1% lµ t­¬ng ®­¬ng 5. KÕt qu¶ ®o kh¸ng khuÈn trªn invitro.B¶ng 9:So s¸nh kh¶ n¨ng khuÈn trªn invitr« gi÷a CT3 vµ Silvirin 1% KÕt qu¶ kh¸ng khuÈn trªn invitr« gi÷a CT3 vµ Silvirin 1% lµ t­¬ng ®­¬ng KÕt luËn - §· x©y dùng ®­îc c«ng thøc kem Silver sulfa 1% (CT3) cã h×nh thøc c¶m quan ®¹t yªu cÇu, cã ®é æn ®Þnh bÒn v÷ng trong ®iÒu kiÖn b×nh th­êng v× ®· æn ®Þnh trong ®iÒu kiÖn kh¾c nghiÖt.- Kh¶ n¨ng gi¶i phãng ho¹t chÊt qua mµng cña CT3 vµ Silvirin 1% lµ t­¬ng ®­¬ng nhau. Nh­ vËy kem Silver sulfa 1% cã ®é gi¶i phãng ho¹t chÊt tèt, cèt t¸ d­îc kh«ng c¶n trë kh¶ n¨ng gi¶i phãng ho¹t chÊt cña kem - Kh¶ n¨ng kh¸ng khuÈn cña CT3 lµ t­¬ng ®­¬ng víi Silvirin 1% trªn invitro. KiÕn nghÞ. TiÕp tôc nghiªn cøu c¸c tÝnh chÊt kh¸c cña kem Silver sulfa 1%:* Nghiªn cøu ®é æn ®Þnh l©u dµi.* Nghiªn cøu ®é gi¶i phãng ho¹t chÊt vµ kh¸ng  khuÈn trªn invivo.* Nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ tr­êng diÔn.* Nghiªn cøu hiÖu lùc ®iÒu trÞ cña kem. Xin ch©n thµnh c¶m ¬n c¸c quý vÞ ®¹i biÓu c¸c thÇy c« gi¸o vµ toµn thÓ c¸c b¹n sinh viªn!