Khóa luận Nghiên cứu phương pháp tạo đa chồi để nhân nhanh cây Ngưu tất (Achyranthes bidentata blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

rằng: chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt. + Tuổi và sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa và tuổi của sinh lý. Có nhiều nghiên cứu khác nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy. Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già. + Mẫu in vitro: Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm như cây Azalea. + Sức sống của mẫu: Điều cần nhận thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro, cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là đối với những cây bị bệnh,nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn mẫu cây bị bệnh được nhân lên [13]. Điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là từ 20-27oC. Theo Murashige (1974) nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng và phát triển trong quá trình nuôi cấy in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào cơ quan. Cường độ ánh sáng: Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng có liên hệ đến các loài, có loài chịu ánh sáng cao, có loài chịu ánh sáng thấp hay tối, có loài chịu ánh sáng trung bình. Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng từ 1000-3000lux [12]. Môi trường nuôi cấy Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô tế bào là rất cần thiết. Vì mỗi loại cây trồng khác nhau đều cần một hàm lượng chất dinh dưỡng khác nhau. Mặt khác môi trường cũng thay đổi tùy thuộc vào sự phân hóa cua mô cấy, tùy theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo chồi hay tái sinh cây hoàn chỉnh. Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy hoặc thăm dò một số môi trường đã cho để xác định môi trường cho mẫu nuôi cấy. Chất kích thích sinh trưởng thực vật (KTSTTV) Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò rất quan trọng trong kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích ở một mức hợp lý thì chúng ta có thể điều khiển được quá trình phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Auxin và Cytokinin là hai nhóm chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác trong môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với nhóm Cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ Auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: + Kiểu tăng trưởng và phát triển của mẫu cần nghiên cứu. + Hàm lượng Auxin nội sinh có trong mẫu nuôi cấy. + Sự tác động qua lại giữa Auxin nội sinh và Auxin ngoại sinh. Đặc tính của Auxin Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Đặc điểm chung của các Auxin là kích thích sự phân chia tế bào. Các hoocmon của nhóm này có các hoạt tính như tăng trưởng chiều dài thân, gióng, tính hướng đất, tính ưu thế ngọn và phân hóa mạch dẫn. Auxin cũng kích thích sự hình thành rễ bất định và sự giãn của tế bào làm cho kích thước tế bào tăng lên. Các Auxin thường liên quan đến độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật, Auxin được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những Auxin được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy ô tế bào thực vật: + IBA (3-indol Butyric Axit) + IAA (Indol-3-Axetic Axit) + NAA (α-Naptalen Axetic Axit) + 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxy Axetic Axit) Đặc tính của Cytokinin Cytokinin là hoocmon phân bào, là dẫn xuất của Ađênin, có ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các Cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là: + BAP (6-Benzyl Amino Purin) + Kinetin (N-(2-Furfurylamin)-1-H-6- Amin) + Zeatin Hàm lượng của các loại Cytokinin có tác dụng kích thích từ rễ đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh mẽ sự tạo thành rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại Cytokinin nói trên thì BAP và Kinetin là hai loại hay được sử dụng nhiều nhất. Ngoài hai nhóm Auxin và Cytokinin, trong nuôi cấy mô tế bào thực vật người ta cũng sử dụng thêm Gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào, qua đó làm tăng kích thước của chồi nuôi cấy. GA (Gibberellic axit) là loại Gibberellin được sử dụng thường xuyên nhất. Tuy nhiên, GA vẫn mẫn cảm với nhiệt độ, nó mất hoạt tính đến 90% sau khi hấp vô trùng. Vì vậy, muốn sử dụng GA ta thường phải lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó đưa vào môi trường nuôi cấy [16]. 1.2.4. Các phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kĩ thuật nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành,chiết cành, ghép cành, tách dòng… Nhân giống in vitro hay vi nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật (làm sạch virus, nhân nhanh các giống cây quý, sản xuất và chuyển hóa sinh học các hợp chất tự nhiên và cải biến về mặt di truyền các giống cây trồng) và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất [1]. Có ba phương thức để tạo cây in vitro: a. Hoạt hóa chồi nách Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì sự hoạt hóa của chồi nách diễn ra theo hai cách: - Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi cấy loài cây hai lá mầm như khoai tây, hoa cúc, cây thuốc lá,… ) - Cách 2: Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra với cây một lá mầm như lúa, mía…). b. Tạo chồi bất định Chồi bất định là chồi mọc ra rừ các cơ quan, các bộ phận khác của cây, không phải là phôi. Ví dụ: Chồi hình thành từ callus (mô sẹo). Tạo chồi bất định ta thường sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá, giẻ hành,… Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và quá trình phân hóa để tế bào soma hình thành trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo. c. Tạo phôi vô tính Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình hành từ các tế bào soma gọi là phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo. Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện hai quá trình phản phân hóa và quá trình phân hóa để tách các tế bào soma hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển của mô sẹo. Sự hình thành phôi trải qua hai bước chính: Bước 1: Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Trong quá trình này cần môi trường giàu Auxin, vì Auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các tế bào phôi, đồng thời nó còn giúp kích thích cho quá trình phát triển số lượng tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein và ARN thông tin. Bước 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành. Môi trường nuôi cấy của giai đoạn này phải nghèo hoặc không có Auxin, với nồng độ Auxin cao thích kích thích sự tạo thành phôi nhưng ức chế quá trình phân hóa và quá trình phát triển tiếp theo của phôi này. Như vậy, với nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lý là rất quan trọng để có các phản hồi thích hợp. Nếu nồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng, nếu nồng độ cao quá sẽ gây ức chế hoặc gây độc [12]. Các bước chính trong nhân giống in vitro Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước sau: Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và đang ở giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ. Việc trồng các cây mệ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng bệnh hợp lý sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng khi tra đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Bước 2: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng mẫu, giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tăng tỷ lệ mẫu tái sinh, mô tồn tại, sinh trưởng và phát triển tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển tốt của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách, đỉnh chồi hoa và sau đó là đoạn thân, mảnh lá. Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo phôi vô tính, tạo chồi bất định… Vấn đề là cần xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung, môi trường có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi (Auxin/Cytokinin < 1: thì kích thích tạo chồi). Chế độ nuôi cấy thường là 25-27oC và 16h chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-3000lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy khác nhau đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau. Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi người ta cấy chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung thêm một lượng nhỏ Auxin. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay cả khi ta không bổ sung Auxin. Bước 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm Để đưa được cây ra bên ngoài vườn ươm phát triển tốt ta cần phải đảm bảo một số yêu cầu sau: - Cây đảm bảo về chiều cao, số rễ, số lá. - Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt. - Phải điều chỉnh độ ẩm, chế độ chiếu sáng vườn ươm, cũng như chế độ dinh dưỡng thích hợp. 1.2.5. Phương pháp nhân đa chồi Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi ngọn và các chồi bên từ các nách lá cấy vào môi truờng có chứa Cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của Cytokinin lúc này là ức chế quá trình ưu thế ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển. Các chồi bên này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới có bổ sung Cytokinin để tiếp tục tạo ra các chồi khác. Sau đó các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh. Phương pháp có ý nghĩa quan trọng trong thực tế vì: - Phương pháp này đơn giản hơn so với các phương pháp khác. - Tốc độ nhân giống cao. - Các cây đồng đều về mặt di truyền. - Cây con tăng trưởng rất tốt. Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi: - Hàm lượng Cytokinin (loại và nồng độ). - Nhu cầu về nồng độ Cytokinin thay đổi theo từng giai đoạn nuôi cấy, những mô cấy còn non thì cần ít Cytokinin hơn các mẫu đã trưởng thành. - Thông thường trong quá trình tạo chồi, người ta sử dụng Auxin với nồng độ thấp phối hợp cùng Cytokinin ở nồng độ cao, tỷ lệ Auxin/Cytokinin thường 1/10. - Đôi khi nên để chồi ngọn phát triển trước khi tăng nồng độ Cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi bên. - Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắt bỏ ngọn của chồi để các chồi bên phát triển. - Không nên cảm ứng sự tạo thành mô sẹo với nồng độ Cytokinin quá cao vì có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến. - Trong một số trường hợp có thể kích thích sự tạo thành chồi bên bằng cách cấy vào môi trường lỏng. Môi trường lỏng này cần lắc hay không lắc tùy thuộc vào cây được làm thí nghiệm. - Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh trưởng sinh khối bị thay đổi. Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp dụng cho nhiều loài thực vật, quy trình nhân chồi thường được thực hiện theo các bước như sau [5]. Trồng cây ngoài tự nhiên Trồng cây trong bầu Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Nhân đa chồi Khử trùng mẫu Cây tự nhiên Sơ đồ tổng quát nhân nhanh trong phòng thí nghiệm 1.2.6. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm một loạt các kỹ thuật khác nhau và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực bao gồm [12]. Kỹ thuật Ứng dụng Nuôi cấy hạt giống (Seed culture) - Tăng khả năng nảy mầm của các hạt khó nảy mầm trong điều kiện bình thường. - Thúc đẩy quá trình nảy mầm bằng cách bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng. - Tạo ra cây con dùng cho nuôi cấy mô phân sinh hoặc các bộ phận khác. Hoa cái (Bầu quả, noãn) - Thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa. - Tạo cây đơn bội. - Tạo đa phôi. Hoa đực (Bao phấn và hạt phấn) - Tạo mô sẹo và cây đơn bội. - Tạo đột biến ở mức đơn bội. - Tạo dòng đồng hợp tử. Phôi hợp tử - Nuôi cấy cứu phôi khi lai xa. - Nhân các dòng lai xa. - Phá sự ngủ, nghỉ của hạt. Mô sẹo - Tạo phôi vô tính. - Nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trần. - Tạo cây có biến dị soma. Tế bào - Tạo đột biến ỏe mức độ tế bào. - Tạo tế bào trần để lai vô tính. - Biến nạp gen. - Nuôi cấy tế bào đơn. Đỉnh chồi (Đỉnh sinh trưởng) - Tạo và nhân nhanh dòng đồng nhất về di truyền. - Làm sạch virus. - Nghiên cứu sinh lý phát triển. Phân hóa phôi vô tính (Somatic embryogenesis) - Là đường hướng tái sinh chủ yếu ứng dụng: + Nhân nhanh + Sản xuất hạt nhân tạo - Cung cấp vật liệu để tạo các protoplast có khả năng tạo phôi. - Cho phép cơ khí hóa quá trình nuôi cấy và sử dụng bioreactor. Đột biến soma - Phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tưởng song cũng thiếu một số tính trạng mong muốn. - Phân lập các biến dị có ích để sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp. - Phân lập các biến dị có ích với khả năng kháng bệnh, chống chịu ngoại cảnh tốt hơn. - Tạo các biến dị di truyền không qua lai hữu tính ở những dòng ưu tú. 1.3. Thành tựu và các phương pháp bảo tồn nguồn gen thực vật in vitro 1.3.1 Thành tựu Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trở thành một trong những phương thức quan trọng để nhân nhanh, đặc biệt là đối với những cây khó nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống. Đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen thực vật. Trong nước: Tác giả Nguyễn Thanh Danh và cs (2005) đã nghiên cứu thành công nhân nhanh in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte) ở VQG Cúc Phương, nghiên cứu này đã sử dụng phôi hạt xanh của quả Vù hương để nuôi cấy và tạo đa chồi bằng kỹ thuật tách phôi hạt xanh, các cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô đã được trồng trở lại rừng tự nhiên và cây con phát triển bình thường. Cây Vù hương có tên trong danh sách các loài bị đe dọa ở Việt Nam [2]. Tác giả Hoàng Thị Nga (2011), nghiên cứu xây dựng thành công quy trình nhân nhanh cây hoa Đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [8]. Những nghiên cứu của Trần Văn Minh và cs cũng đã thành công trong việc nhân giống và bảo tồn nhiều loài cây quý hiếm như: Cây Trầm hương, cây Giá tỵ (Tectona grandis Linn F) và cây Lát hoa Côn Đảo (Chukrasia tabularis A. Juss). Thành công trong việc nhân giống in vitro cây Trầm hương có ý nghĩa hết sức to lớn, nó cho phép phục hồi, phát triển cho những khu vực trồng Trầm hương thuận lợi. Hơn thế nữa, việc sử dụng cây giống có nguồn gốc từ nuôi cấy mô có chất lượng cao sẽ giúp cho người trồng rừng Trầm hương tốt và đồng nhất về kiểu gen [6] [7]. Tác giả Nguyễn Thị Quỳnh và cs (2003) đã nuôi cấy cây Lõi thọ (Gmelina arborea Roxb) bằng phương pháp quang tự dưỡng. Đặc diểm chính của phương pháp này là không sử dụng đường, vitamin và hạn chế sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong môi trường nhân giống. Đồng thời tạo điều kiện tối đa cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng khí CO2 có sẵn trong không khí làm nguồn cacbon chính cho quá trình tăng trưởng và phát triển của cây. Cây Lõi thọ đã phát triển rất tốt trong điều kiện quang tự dưỡng [10]. Viện nghiên cứu và bảo tồn nguồn gen ở VQG Bạch Mã đã nghiên cứu thành công và bảo tồn một số loài quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng như: - Hoàng Đàn giả (Dacrydyum elatum (Roxb) Wallich ex Hooker) là đối tượng quý hiếm có trong sách đỏ Việt Nam, phân bố trên các đỉnh núi cao ở VQG Bạch Mã. - Cây Hồi hoa nhỏ (Illicium parvifolium Merr) là loài thực vật quý hiếm có trong sách đỏ Việt Nam, thuộc dạng nguy cấp. Đây là loài có giá trị trong sản xuất tinh dầu hồi, đã có chương trình khoanh vùng bảo vệ nghiêm ngặt những khu vực có sự phân bố của cây này theo hướng bảo tồn in situ ở VQG Bạch Mã [4]. - Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L) được sử dụng như là một vị thuốc trong việc phòng và chữa trị một số loại ung thư. Cây Trinh nữ hoàng cung có củ giống củ hành, chùm hoa giống chùm hoa cây láng trắng, thường được trồng làm cảnh hoặc làm thuốc. Trong lĩnh vực làm thuốc, người ta dùng lá cây Trinh nữ hoàng cung thái nhỏ rồi sao vàng sắc uống để đề phòng và chữa trị ung thư tử cung, u tiền liệt tuyến. Tác giả Lưu Trường Sinh và cs đã nhân giống thành công cây Trinh nữ hoàng cung theo phương pháp in vitro có chất lượng tương đương với cây trồng theo phương pháp truyền thống [11]. - Berberin được chiết xuất từ cây Hoàng liên gai (Berberis wallichiama DC) để làm thuốc điều trị các bệnh đường ruột và đau mắt hột nhưng do khai thác quá mức nguồn nguyên liệu này trong tự nhiên đã bị cạn kiệt. Vì vậy, các nhà khoa học Viện công nghệ sinh học đã lấy quả xanh của cây Hoàng liên gai ở vùng núi Sapa, tách lấy phôi và đưa vào nuôi cấy đẻ tạo mô sẹo và thu sinh khối. Sau một thời gian ngắn, sinh khối thu được từ rễ cây Hoàng liên gai tăng gấp 10 lần so với số lượng mẫu ban đầu. Đặc biệt khối mô tế bào này chứa berberin có chất lượng tương đương với rễ cây Hoàng liên gai trong tự nhiên. Vì vậy các kết quả nghiên cứu thành công này của Viện Công nghệ sinh học (Viện khoa học và công nghệ Việt Nam) không chỉ giúp các cơ quan sản xuất chủ động nguồn dược liệu mà còn góp phần bảo tồn nguồn gen cây thuốc quý của nước ta [1] [2]. Thế giới: - Tác giả Pereira AM và cs (2003) đã nhân và bảo tồn cây thuốc Anemopaegma arvense, nghiên cứu này đã nuôi cấy để bảo tồn cây A. arvense trong ống nghiệm trên môi trường MS có chứa 4% đường sorbitol, kết quả cho thấy sau 6 tháng mới cần phải cấy chuyển một lần [28]. - Các nhà khoa học Đức đã ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong việc phục tráng và nhân giống một số loài thuộc chi Grevillea, trong đó có một số loài gần như là tuyệt chủng: Grevillea scapgera, Grevillea banksii, Grevillea batrachioides [26]. - Tác giả Joshi và cs đã nhân giống thành công giống cây Saussurea obvallata, một loại dược thảo quý hiếm bằng việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật . Sau thời gian 15 ngày nuôi cấy và 12 ngày thích nghi với điều kiện môi trường bên ngoài có 66,7% cây đã thích nghi với môi trường tự nhiên [22]. - Các nhà khoa học Ấn Độ đã xây dựng thành công quy trình tái sinh một số giống tre quý như: Dendrocalamus asper (tre Mạnh tông), Bambusa multiplex (cây Hóp) thông qua nuôi cấy hạt hoặc chồi bên [27]. - Năm 2003, Bedir E và cs đã nhân giống in vitro thành công giống Hydrastis canadensis, một loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng ở miền Bắc nước Mỹ [18]. - Gần đây các tác giả Balaraju và cs (2008) cũng đã nhân giống và tái sinh in vitro thành công cây thuốc Vitex agnuscastus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường 1/2 MS có bổ sung 0,1mg/l IBA [17]. - Các tác giả Nishritha B và cs (2008) đã nhân giống in vitro thành công loài Asparagus racemosus Willd, đem lại nhiều giá trị kinh tế lớn. Cùng năm đó Mukherjee và cs cũng đã nhân giống in vitro loài Aloe vera sp [26]. - Bên cạnh đó tác giả Park SU và cs (2009) cũng đã tái sinh thành công loài Rehmannia glutinosa L quý hiếm đang bị khai thác quá mức [27]. - Ngoài ra vẫn còn nhiều loại cây dược liệu quý hiếm khác cũng đã được nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen trong ống nghiệm như: Lawsonia inermis Linn, Saussurea lappa… [19] 1.3.2. Phương pháp bảo tồn thực vật quý hiếm Hai phương pháp bảo tồn cơ bản được áp dụng là: in situ và ex situ. Bảo tồn in situ Đây là biện pháp bảo tồn huữ hiệu nhất, đặc biệt với những loài cây bản địa có sự phân bố tập chung và có khả năng tái sinh tự nhiên. Bảo tồn in situ được đề xuất cho hầu hết các loại cây rừng nhiệt đới ở nước ta, bởi vì các loài cây này thường là khó tạo thành rừng khi trồng đơn loài hoặc khó tái sinh ngoài môi trường sống tự nhiên [25]. Bảo tồn in situ còn bao hàm các quần thể tái sinh nhân tạo bằng nguồn hạt giống thu hái tại chỗ từ nhiều cây mẹ mà không áp dụng có định hướng. Điều này có ý nghĩa lớn đối với việc xây dựng rừng giống cho các loài cây có phân bố rải rác. Như vậy, quần thể bảo tồn được dùng làm nguồn cung cấp vật liệu giống cho tái sinh nhân tạo, cho trồng rừng, làm giàu rừng và cải thiện di truyền. Hầu hết các loài cây bản địa đều cần được ưu tiên bảo vệ theo hình thức bảo tồn in situ, song có hai vấn đề được quan tâm: - Có quy hoạch cụ thể và xác định các vùng cần bảo vệ cho các loài sao cho các cá thể vẫn giữ được toàn bộ biến dị di truyền của loài. - Kết hợp bảo tào với việc thu hái hạt giống phục vụ tái sinh tự nhiên, tái sinh nhân tạo, xây dựng quần thể bảo tồn mới (in situ và ex situ), xây dựng giống và phục vụ trồng rừng [1]. Bảo tồn ex situ Bảo tồn ex situ được thực hiện bằng cách tách rời cây hoặc vật liệu nhân giống ra khỏi vùng phân bố tự nhiên để đưa vào các bộ sưu tập cây sống (Vườn thực vật), rừng trồng với mục đích bảo tồn (quần thể bảo tồn ex situ, ngân hàng hạt giống, phấn hoa hay nuôi cấy mô). Ba nhiệm vụ chính của bảo tồn ex situ là: - Thu thập các mẫu gen tiêu biểu - Duy trì chúng ở điều kiện tốt trong thời gian dài - Làm tăng số lượng mẫu thu thập Bảo tồn ex situ được áp dụng cho các loài cây trồng chủ yếu, các loài cây đó đã biết rõ giá trị của chúng hoặc khi các quần thể tự nhiên không được bảo vệ an toàn do tác động của sâu bệnh, lửa rừng và sự phá hoại của động vật hoặc con người hoặc do bị tạp giao với các quần thể ngoại lai khác [19] [21]. PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu Giống cây Ngưu tất do Trung tâm nuôi cây mô thực vật Thanh Hóa cung cấp. Dụng cụ, hóa chất: Dụng cụ nghiên cứu là các dụng cụ như panh, dao, kéo, box cấy vô trùng, đèn UV, cân kĩ thuật, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống giàn đèn, nồi hấp tiệt trùng, máy đo pH, máy khuấy từ… Hóa chất: Môi trường cơ bản MS sử dụng trong nghiên cứu gồm các muối đa lượng, muối vi lượng, các chất hữu cơ và vitamin theo Murashige và Skoog (1962) [24], đường saccharose, agar, các chất kích thích sinh trưởng như BAP, IAA, NAA, Kinetin, IBA,… Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25-27oC, chế độ chiếu sáng 12/12h với cường độ chiếu sáng là 2000lux. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Trại Thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đề tài nghiên cứu này được thực hiện từ 5/2010 - 5/2011, theo đơn đặt hàng của Trung tâm nuôi cấy mô thực vật Thanh Hóa, Sở Khoa học và Công nghệ Thanh Hóa. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Các nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệm khác nhau, có công thức đối chứng; - Số mẫu của mỗi công thức đủ lớn; - Thí ngiệm được lập lại ít nhất ba lần; 2.2.1. Khử trùng mẫu Khử trùng mẫu gồm các bước sau: - Tách lớp vỏ hạt cây Ngưu tất; - Rửa sạch hạt bằng nước cất khử trùng; - Khử trùng hạt bằng dung dịch javen có nồng độ 75% trong vòng 10 phút; - Rửa nước cất khử trùng 4 lần; - Thấm khô bằng giấy thấm đã khử trùng; Thu mẫu: Mẫu sau khi được khử trùng ta cấy vào môi trường MS. Sau khoảng 25 ngày cây con mọc lên và được sử dụng làm nguyên liệu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.2. Nhân nhanh bằng phương pháp nhân đa chồi Môi trường được sử dụng trong các thí nghiệm này là: MS + 20g/l đường saccharose + 8,5g/l agar và bổ sung thêm các chất kích thích sinh trưởng với các nồng độ khác nhau và có nồng độ pH là 5,8. Tất cả các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện: Nhiệt độ 25-27oC, thời gian chiếu sáng 12/12h, cường độ chiếu sáng 2000lux. Nhân đa chồi cây Ngưu tất Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo chồi CT môi trường Nồng độ BAP (mg/l) ĐC 0 NTA1 0,01 NTA2 0,03 NTA3 0,05 NTA4 0,07 NTA5 0,09 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất CT môi trường Nồng độ Kinetin (mg/l) ĐC 0 NTB1 0,2 NTB2 0,4 NTB3 0,6 NTB4 0,8 NTB5 1,0 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng nồng độ BAP và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất CT Môi trường Nồng độ chất KTST BAP (mg/l) NAA (mg/l) ĐC 0 0 NTC1 0,2 0,1 NTC2 0,4 0,1 NTC3 0,6 0,1 NTC4 0,8 0,1 NTC5 1,0 0,1 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng nồng độ Kinetin và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất CT Môi trường Nồng độ chất KTST Kinetin (mg/l) NAA (mg/l) ĐC 0 0 NTD1 0,2 0,1 NTD2 0,4 0,1 NTD3 0,6 0,1 NTD4 0,8 0,1 NTD5 1,0 0,1 2.2.3. Tạo cây Ngưu tất in vitro hoàn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để có thể chuyển ra trồng ngoài tự nhiên. Cây con đưa ra ngoài tự nhiên phải khỏe mạnh, sức đề kháng tốt nhằm nâng cao sức sống của cây khi ra môi trường bên ngoài. Các chất kích thích sinh trưởng tạo chồi được thay thế bởi các chất kích thích tạo rễ như: IBA, NAA… Môi trường được sử dụng trong các thí nghiệm này là: MS + 20g/l đường saccharose + 8,5g/l agar và bổ sung thêm các chất kích thích sinh trưởng với các nồng độ khác nhau và có nồng độ pH là 5,8. Tất cả các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện: Nhiệt độ 25-27oC, thời gian chiếu sáng 12/12h, cường độ chiếu sáng 2000lux. Thí ngiệm 5: Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ cây Ngưu tất CT môi trường Nồng độ NAA (mg/l) ĐC 0 NTE1 0,1 NTE2 0,2 NTE3 0,3 NTE4 0,4 NTE5 0,5 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ cây Ngưu tất CT môi trường Nồng độ IBA (mg/l) ĐC 0 NTG1 0,5 NTG2 0,6 NTG3 0,7 NTG4 0,8 NTG5 0,9 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng nồng độ IBA và Kinetin đến khả năng tạo rễ cây Ngưu tất CT Môi trường Nồng độ chất KTST Kinetin (mg/l) IBA (mg/l) ĐC 0 0 NTH1 0,1 0,2 NTH2 0,1 0,4 NTH3 0,1 0,6 NTH4 0,1 0,8 NTH5 0,1 1,0 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng nồng độ NAA và Kinetin đến khả năng tạo rễ cây Ngưu tất CT Môi trường Nồng độ chất KTST Kinetin (mg/l) NAA (mg/l) ĐC 0 0 NTN1 0,1 0,2 NTN2 0,1 0,4 NTN3 0,1 0,6 NTN4 0,1 0,8 NTN5 0,1 1,0 2.2.4. Trồng cây trong bầu Đây là một trong những giai đoạn quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro. Giai đoạn này cây con cần sự thích nghi dần dần với điều kiện bên ngoài phòng thí nghiệm. Quá trình thích nghi ở đây được hiểu là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lý thực vật và giải phẫu của bản thân cây non. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần, trong thời gian này phải được chăm sóc và bảo vệ trước những yếu tố bất lợi như: - Mất nước nhanh làm cây bị héo khô; - Nhiễm vi khuẩn và nấm gây ra hiện tượng thối nhũn; - Cháy lá do nắng; - Các loài côn trùng tấn công; Mục đích của thí nghiệm này là tìm ra giá thể thích hợp cho cây phát triển. Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của các giá thể đến tỷ lệ sống cây Ngưu tất Công thức Thành phần giá thể Tỷ lệ 1 Đất trồng cây 1 2 Đất trồng cây : Trấu hun 1 : 1 3 Cát 1 4 Cát : Trấu hun 1 : 1 5 Trấu hun 1 2.2.5. Thu thập và xử lý số liệu Để đánh giá và tìm được môi trường tạo đa chồi, tái sinh cây tốt nhất chúng tôi sử dụng chỉ tiêu: Số chồi/mẫu. Để đánh giá khả năng ra rễ chúng tôi sử dụng các chỉ tiêu sau: số rễ, số chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, tỷ lệ sống ngoài vườn ươm. Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) = Tổng số cây con / Tổng số hạt gieo x 100 Số chồi / mẫu = Tổng số chồi / Tổng số mẫu nuôi cấy Tỷ lệ số chồi ra rễ = Tổng số chồi ra rễ / Tổng số mẫu nuôi cấy x 100 Số rễ / mẫu = Tổng số rễ / Tổng số chồi ra rễ Các số liệu được tính toán theo phương pháp thống kê toán học. Quá trình xử lý được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình Excel 5,0 và được mô phỏng bằng các bảng biểu và hình. PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo nguyên liệu vô trùng cây Ngưu tất Trước khi tiến hành thí nghiệm, hạt cây được khử trùng cẩn thận. Sau khi khử trùng hạt được gieo vào trong môi trường MS. Kết quả sau 25 ngày nuôi cấy các cây con vô trùng mọc lên và làm nguyên liệu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Tạo đa chồi Trong môi trường nuôi cấy in vitro, bên cạnh các chất đa lượng, vi lượng, vitamin còn bổ sung nhiều loại kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, Cytokinin, Gibberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan cung cấp dinh dưỡng cho mẫu phát triển. Tuy nhiên yêu cầu với những chất này thay đổi tùy theo loài cây, loại mô, mục đích nghiên cứu. Đặc biệt, việc sử dụng tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy tỏ ra hiệu quả hơn so với khi sử dụng từng chất riêng biệt. Mặt khác trong các hệ thống nuôi cấy, tỷ lệ Auxin/Cytokinin có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Việc tìm ra công thức môi trường với nồng độ và tỷ lệ chất kích thích sinh trưởng phù hợp cho từng loại cây, từng giai đoạn nuôi cấy là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo và quyết định sự thành bại của quá trình nhân giống cây trồng in vitro. 3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất Chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin có vai trò quan trọng trong quá trình tạo chồi của mẫu nuôi cấy. Bảng 1: Nồng độ BAP ảnh hưởng đến khả năng tạo chồi của cây Ngưu tất CTMT BAP (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi / mẫu Mô sẹo ĐC 0 100 2,00 + NTA1 0,01 100 3,25 + NTA2 0,03 100 3,67 + NTA3 0,05 100 4,58 + + NTA4 0,07 100 4,31 + + NTA5 0,09 100 4,16 + + Ghi chú: +: Mô sẹo nhỏ; + +: Mô sẹo trung bình Kết quả ở bảng 1 cho ta thấy tất cả các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu tạo chồi là 100%. Ở môi trường NTA4, NTA5 kết quả tỷ lệ chồi đạt được lần lượt là: 4,31 và 4,16 (chồi). Còn ở môi trường NTA1, NTA2 thì cho hiệu quả tạo chồi là: 3,25 và 3,67 (chồi). Hình 2: Tạo đa chồi cây Ngưu tất trên công thức môi trường NTA3 Riêng đối với môi trường NTA3 thì cho hiệu quả tạo chồi cao hơn là: 4,58 (chồi). Vì vậy trong thí nghiệm này chúng tôi chọn môi trường thích hơp tạo chồi là: NTA3 (MS có bổ sung thêm 0,05mg/l BAP). Hình 3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất 3.2.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất Thân được cắt thành từng đoạn nhỏ có chứa mắt ngủ kích thước từ 1 -1,5cm được cấy vào môi trường MS có bổ sung Kinetin với các nồng độ khác nhau. Sau khi nuôi cấy 1 tháng thu được kết quả như bảng 2. Bảng 2: Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi của cây Ngưu tất CTMT Kinetin (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi / mẫu Mô sẹo ĐC 0 100 2,00 + NTB1 0,2 100 3,17 + NTB2 0,4 100 3,48 + NTB3 0,6 100 3,76 + NTB4 0,8 100 4,12 + NTB5 1,0 100 3,25 + Ghi chú: +: Mô sẹo nhỏ Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi của cây Ngưu tất. Nồng độ Kinetin được từ 0,2 mg/l đến 1,0 mg/l trong các môi trường nuôi cấy. Kết quả ở bảng 2 cho thấy tất cả các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu tạo chồi là 100%. Sau 3 tháng nuôi cấy, tỷ lệ số chồi tế bào thu được lần lượt trên các môi trường NTB1, NTB2, NTB3, NTB5 là 3,17; 3,48; 3,76; 3,25 (chồi), các chồi phát triển bình thường, mô sẹo nhỏ. Riêng môi trường NTB4 cho số chồi / mẫu đạt cao nhất là 4,12 (chồi), các chồi phát triển bình thường, mô sẹo nhỏ. Do đó chúng tôi chọn công thức môi trường thích hợp nhất tạo đa chồi cây Ngưu tất ở thí nghiệm này là NTB4 (MS + 0,8 mg/l Kinetin). Hình 5: Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất 3.2.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi cây Ngưu tất Thân cây được cắt nhỏ thành từng đoạn có chiều dài từ 1 - 1,5 cm có chứa chồi nách và được cấy vào môi trường MS có bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau và NAA ở nồng độ 0,1mg/l. Sau 1 tháng nuôi cấy kết quả thu được trình bày ở bảng 3, hình 6 và hình 7. Bảng 3: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất CTMT BAP (mg/l) NAA (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi / mẫu Mô sẹo ĐC 0 0 100 2,0 + NTC1 0,2 0,1 100 3,45 + NTC2 0,4 0,1 100 3,79 + + NTC3 0,6 0,1 100 4,56 + + NTC4 0,8 0,1 100 4,84 + + NTC5 1 0,1 100 4,12 + + Ghi chú: +: Mô sẹo nhỏ; + +: Mô sẹo trung bình Kết quả cho thấy tất cả các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu tạo chồi là 100%. Số chồi tạo thành thấp nhất ở môi trường NTC1 là 3,45 (chồi), các chồi phát triển bình thường, mô sẹo quanh gốc nhỏ. Ở các môi trường còn lại NTC2, NTC3, NTC5 có số chồi lần lượt là 3,79; 4,56; 4,12 (chồi). Chồi ở các môi trường này phát triển bình thường, mô sẹo trung bình. Riêng môi trường NTC4 cho số chồi cao nhất là 4,84 (chồi), chồi phát triển bình thường, mô sẹo trung bình. Chúng tôi chọn môi trường NTC4 (MS + 0,6mg/l BAP và 0,1mg/l NAA) là môi trường thích hợp tạo chồi trong thí nghiệm này. Hình 7: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất 3.2.4. Ảnh hưởng của Kineitn và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất Cũng như các thí nghiệm trên ta lấy đoạn thân có chứa chồi nách cấy vào môi trường MS có bổ sung Kinetin và NAA ở các nồng độ khác nhau. Bảng 4: Ảnh hưởng của Kinetin và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất CTMT Kinetin (mg/l) NAA (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu Mô sẹo ĐC 0 0 100 2,00 + NTD1 0,2 0,1 100 2,68 + NTD2 0,4 0,1 100 3,11 + NTD3 0,6 0,1 100 3,73 + NTD4 0,8 0,1 100 3,21 + NTD5 1,0 0,1 100 2,57 + Ghi chú: +: Mô sẹo nhỏ Qua quá trình nghiên cứu cho thấy tất cả các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu tạo chồi là 100% . Số chồi tạo thành lần lượt ở các môi trường NTD1, NTD2, NTD4, NTD5 là 2,68; 3,11; 3,21; 2,57 (chồi), các chồi đều phát triển bình thường và có mô sẹo tạo thành nhỏ (Bảng 4, hình 8). Môi trường NTD3 ra nhiều chồi nhất là 3,73 (chồi), chồi phát triển bình thường và mô sẹo nhỏ. Do đó chúng tôi lựa chọn môi trường NTD3 (MS + 0,6mg/l Kinetin và 0,1mg/l NAA) là môi trường thích hợp để tạo chồi cây Ngưu tất trong thí nghiệm này. Qua bốn thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất, chúng tôi tổng hợp được kết quả được thể hiện ở bảng 5. Bảng 5: Tổng hợp khả năng tạo chồi trên các loại môi trường CTMT Số tế bào / mẫu Mô sẹo NTA3 4,58 + + NTB4 4,12 + NTC4 4,84 + + NTD3 3,73 + Theo bảng 5 chúng ta thấy rằng số chồi/mẫu cao nhất là ở môi trường NTC4 (MS + 0,6mg/l BAP và 0,1mg/l NAA) là 4,84 chồi và mô sẹo hình thành ở mức trung bình, các chồi phát triển bình thường. Các môi trường còn lại có số chồi thấp hơn, đặc biệt môi trường NTD3 chỉ có 3,73 chồi / mẫu. Qua đó chúng tôi lựa chọn môi trường NTC4 (MS + 0,6mg/l BAP và 0,1mg/l NAA) là môi trường thích hợp nhất để tạo đa chồi cây Ngưu tất. 3.3. Tạo cây hoàn chỉnh Ra rễ là khâu cuối cùng của giai đoạn nghiên cứu in vitro. Chất kích thích sinh trưởng được dùng chủ yếu ở giai đoạn này thuộc nhóm Auxin. IBA và NAA là những chất kích thích chủ yếu tác động lên quá trình phân chia tế bào và sự hình thành rễ. 3.3.1. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của cây Ngưu tất Các chồi đỉnh của cây Ngưu tất được nuôi cấy trong môi trường có chứa NAA ở các nồng độ khác nhau để nghiên cứu sự ảnh hưởng của nó đến sự hình thành rễ. Kết quả thu được được thể hiện ở bảng 6 và hình 9 dưới đây. Bảng 6: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của cây Ngưu tất CTMT NAA ( mg/l ) Tỷ lệ chồi ra rễ ( % ) Tổng số rễ/mẫu Chất lượng rễ ĐC 0 100 5,59 + NTE1 0,1 100 6,35 + + NTE2 0,2 100 6,84 + + NTE3 0,3 100 7,98 + + + NTE4 0,4 100 7,31 + + + NTE5 0,5 100 6,67 + + Ghi chú: +: Rễ mảnh, ngắn; + + : Rễ mảnh, dài; + + +: Rễ mảnh, dài và nhiều Tất cả các môi trường đều ra rễ đạt 100% và không có hiện tượng xuất hiện mô sẹo quanh gốc cây. Trên các môi trường NTE1, NTE2, NTE5 có tỷ lệ rễ tạo thành lần lượt là 6,35; 6,84; 6,67 (rễ/mẫu), các rễ mảnh và dài. Còn ở môi trường NTE3, NTE4 các rễ hình thành nhiều, mảnh và dài. Nhưng ở môi trường NTE3 có số rễ hình thành nhiều nhất là 7,98 (rễ). Do đó chúng tôi lựa chọn môi trường NTE3 là môi trường tạo rễ thích hợp cho cây Ngưu tất. 3.3.2. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của cây Ngưu tất Cũng như thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành thí nghiệm sự ảnh hưởng của IBA với các nồng độ khác nhau đến khả năng hình thành rễ của cây Ngưu tất, kết quả thu được như bảng 7 và hình 10. Bảng 7: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Ngưu tất CTMT IBA ( mg/l) Tỷ lệ chồi ra rễ ( % ) Tổng số rễ/mẫu Chất lượng rễ ĐC 0 100 5,58 + + NTG1 0,5 100 6,87 + + NTG2 0,6 100 7,84 + + NTG3 0,7 100 7,23 + + NTG4 0,8 100 7,07 + + NTG5 0,9 100 6,73 + + Ghi chú: + +: rễ dài, mảnh Kết quả trình bày ở bảng 7 cho thấy, tất cả các môi trường đều hình thành rễ và cây con phát triển bình thường, mô sẹo hình thành nhỏ. Các môi trường NTG1, NTG3, NTG4, NTG5 lần lượt có tổng số rễ là 6,87; 7,23; 7,07; 6,73 (rễ). Riêng môi trường NTG2 có tổng số rễ/mẫu lớn nhất là 7,84; rễ hình thành nhiều và có nhiều rễ phụ xung quanh. Vì vậy chúng tôi chọn môi trường NTG2 (MS + 0,6mg/l IBA) trong thí nghiệm này là môi trường thích hợp để tạo rễ cây Ngưu tất. 3.3.3. Ảnh hưởng của tổ hợp IBA và Kinetin đến khả năng tạo rễ của cây Ngưu tất Hai nhóm Auxin và Cytokinin rất quan trọng trong nuôi cấy invitro. Hai nhóm này tác động qua lại với nhau ảnh hưởng tới quá trình hình thành chồi và rễ của cây. Vì thế mà chúng tôi sẽ tiến hành thí nghiệm với IBA và Kinetin đến sự hình thành rễ cây Ngưu tất. Sau quá trình nuôi cấy chúng tôi quan sát và thu thập số liệu được kết quả sau: Bảng 8: Ảnh hưởng của IBA và Kinetin đến khả năng tạo rễ của cây Ngưu tất CTMT IBA (mg/l) Kinetin (mg/l) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Tổng số rễ/mẫu Chất lượng rễ ĐC 0 0 100 5,02 + NTH1 0,2 0,1 100 5,07 + + NTH2 0,3 0,1 100 5,12 + + NTH3 0,4 0,1 100 5,53 + + + NTH4 0,5 0,1 100 5,23 + + NTH5 0,6 0,1 100 5,10 + + Ghi chú: +: Rễ mảnh và dài; + +: Rễ ngắn, to; + + +: Rễ ngắn, to, nhiều Theo kết quả bảng 8 cho ta thấy, tất cả các môi trường đều hình thành rễ, cây con phát triển bình thường. Các môi trường NTH1, NTH2, NTH4, NTH5 có tổng số rễ trung bình lần lượt là: 5,07: 5,12; 5,23; 5,10 (rễ). Riêng môi trường NTH3 có tổng số rễ tạo thành lớn nhất là 5,53 (rễ) và các rễ hình thành to. Chính vì thế mà chúng tôi lựa chọn môi trường NTH3 (MS + 0,4mg/l IBA và 0,1mg/l Kinetin) là môi trường thích hợp để tạo rễ cây Ngưu tất. Qua ba thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các chất kích thích lên quá trình tạo rễ của cây Ngưu tất kết quả được tổng hợp như bảng 9. Bảng 9: Ảnh hưởng của các chất kích thích lên quá trình tạo rễ của cây Ngưu tất CTMT Tổng số rễ/mẫu Chất lượng rễ NTE3 7,98 + + NTG2 7,84 + NTH3 5,53 + + + Ghi chú: +: Rễ mảnh, dài; + +: Rễ mảnh, dài và nhiều; + + +: Rễ to, ngắn Theo bảng kết quả bảng 9 cho thấy ở môi trường NTE3 và NTG2 có số lượng rễ tạo thành rất nhiều nhưng ở dạng sợi mảnh, dài. Còn ở môi trường NTH3 tuy có số lượng rễ ít nhưng các rễ tạo thành lại to rất tốt cho quá trình ra vườn ươm. Chính vì thế mà chúng tôi quyết định chọn môi trường NTH3 (MS + 0,1mg/l Kinetin và 0,4mg/l IBA) là môi trường thích hợp nhất cho quá trình tạo rễ cây Ngưu tất. 3.4. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trồng trong bầu Đây cũng là một trong những giai đoạn quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được nuôi trong điều kiện ổn định về nguồn dinh dưỡng, ánh sánh, nhiệt độ… Khi chuyển ra ngoài môi trường tự nhiên hoàn toàn khác cây nên con dễ bị chết do mất nước, nhiệt độ cao… Vì thế ta phải tiến hành làm cho cây con thích nghi dần với điều kiện ngoài tự nhiên. Quá trình thích nghi là sự thay đổi những đặc điểm sinh lý và hình thái của cây. Thời gian tối thiểu để cây con có thể thích nghi được với điều kiện bên ngoài là khoảng 2-3 tuần. Trong thời gian này cây con cần được chăm sóc và bảo vệ cẩn thận Tiến hành trồng trong bầu chúng tôi thử nghiệm trên năm loại giá thể khác nhau: 1. Đất trồng cây 2. Đất trồng cây : Trấu hun 3. Cát đen 4. Cát đen : Trấu hun 5. Trấu hun Sau khi tạo được cây con hoàn chỉnh ta tiến hành trồng vào các loại giá thể trên. Các bầu này được cho vào các khay và được phủ kín bằng túi nilon trong 1 tuần đầu tiên, đặt nơi có ánh sáng khuyếch tán, thoáng mát, tưới đủ ẩm mỗi ngày để cây con dần thích nghi với điều kiện bên ngoài. Tỷ lệ cây con sống sau 1 tháng trên các loại giá thể khác nhau thu được ở bảng 10. Bảng 10: Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ cây con sống TT Công thức Tỷ lệ Số cây trồng Số cây sống Tỷ lệ Cây sống (%) 1 Đất trồng cây 1 40 26 65 2 Đất trồng cây : Trấu hun 1 : 1 40 30 75 3 Cát đen 1 40 34 85 4 Cát đen : Trấu hun 1 : 1 40 38 95 5 Trấu hun 1 40 18 45 Kết quả ở bảng 10 cho ta thấy rõ sự ảnh hưởng của các loại giá thể đến sự sống của cây con nuôi cấy invitro ngoài tự nhiên. Trong các loại giá thể trên thì giá thể trấu hun cho tỷ lệ cây sống thấp nhất là 45%. Còn trên giá thể Đất trồng cho tỷ lệ cây con sống cao hơn là 65%. Trên giá thể Đất trồng cây : Trấu hun (1:1) và giá thể Cát đen có tỷ lệ cây con sống lần lượt là 75% và 85%. Riêng giá thể Cát đen : Trấu hun (1:1) có tỷ lệ cây con sống cao nhất là 95%. Cây con phát triển tốt, đồng đều. Dựa vào kết quả trên chúng tôi lựa chọn giá thể thích hợp nhất để trồng cây con Ngưu tất ra ngoài môi trường tự nhiên là giá thể Cát PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận - Bước đầu đã nhân giống thành công cây Ngưu tất bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Nồng độ khử trùng mẫu thích hợp là: dung dịch javen nồng độ 75%, trong khoảng 10 phút. - Môi trường thích hợp nhất để tạo chồi cây Ngưu tất là: NTC4 (MS + 20g/l đường Saccharose + 8g/l agar + 0,6mg/l BAP và 0,1mg/l NAA). - Môi trường thích hợp để tạo rễ cây Ngưu tất là: NTH3 (MS + 20g/l đường saccharose + 8g/l agar + 0,4mg/l IBA và 0,1mg/l Kinetin). - Giá thể thích hợp để trồng cây trong bầu là: Giá thể Cát đen : Trấu hun (1:1) với tỷ lệ cây con sống là 95%. 4.2. Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện các điều kiện nuôi trồng cây Ngưu tất từ nuôi cấy in vitro ra ngoài môi trường tự nhiên để đạt hiệu quả kinh tế cao nhất. PHỤ LỤC Các thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) Thành phần khoáng đa lượng Nồng độ (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Thành phần khoáng vi lượng Nồng độ (mg/l) MnSO4.H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO47H2O 27,8 Vitamin Nồng độ (mg/l) Thiamin HCl 0,1 Nicotinic Axit 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glyxine 2,0 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội. Nguyễn Thanh Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân (2005), Kết quả bước đầu nhân giống in vitro cây Vù hương bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học. Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, Hà Nội 03/11/2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 450-453. Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật. Huỳnh Văn Kéo, Ngô Viết Nhơn (2006), Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen thực vật ở vườn quốc gia Bạch Mã. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 1(2): 127-129. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, NXB ĐH Quốc Gia TPHCM. Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phục hồi loài gỗ quý Giá tỵ. Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25-26/7/2003, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 352-357. Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phục hồi loài cây đặc sản Trầm hương. Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25-26/7/2003, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 358-361. Hoàng Thị Nga (2011), Ứng dụng Công nghệ tế bào thực vật vào quy trình nhân nhanh cây hoa Đồng tiền, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Nguyễn Hoàng Nghĩa (1997), Bảo tồn nguồn gen cây trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội. Nguyễn Thị Quỳnh, Phan Vũ Tiên, Trịnh Việt Nga (2003), Nuôi cấy mô quang tự dưỡng cây Lõi thọ (Gmelina arbrea Roxb). Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25-26/7/2003, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 394-397. Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương (2005), Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh cây Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp in vitro. Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, Hà Nội 3/11/2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 722-724. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXb Nông Nghiệp Hà Nội. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Văn Uyển (1996), Những phương Pháp công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông nghiệp TPHCM. Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật và ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội. Vũ Văn Vụ, Vũ Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học (tập 2), NXB Giáo dục Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, Ignaciumthu S (2008), Micropropagation of Vitex agnuscatus (Verbenaceae) - Avaluable medicinal plant. In vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 44(5): 436-411. Bedir E, Lata H, Schaneberg B, Khan IA, Morase RM (2003), Micropropagation of Hydrastis canadensis: Goldenseal a North American endangered species, Planta Med, 86-88. Catherine AO, Joanne LT (1998), Tissue culture of Grevillea species at mount Annan Botanic Gardens. The Grevillea Book (1), Kangaroo Press, Sydney, Australia. George EF (1993), Plant propagation by tissueculture, Exegetics Ltd, Edin. Havens K, Guerrant E, Maunder M (1999), Strategies for survival: Ex situ Plant conservation. Report of a research symposium held at the Chicago Botanic Garden, BG Journal, 3(3). Joshi M, Dhar U (2003), In vitro propagation of Saussurea obvallata Edgew - An endangered ethnoreligious medicinal herb of Himalaya. Plant Cell Rep, 21(10): 933-939. Mukherjee A, Roy Chowdhury B (2008), The In vitro propagation of a high value medicinal plant: Asparagus racemosus wild. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 1(2): 116-119. Murashige T, Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant, 15: 473-497. Nandi SK, Kumar A, and Palni L M S (2002), Role of plant tisue culture in biodiversity conservation and economic development, Gyanodaya Prakashan. Nishritha B, Sanjay S (2008), In vitro propagation of a high value medicinal plant: Asparagus rasemosus Willd. In Vitro Cellular & Developmental Biology-plant, 44(6): 525-532. Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), Improved in vitro plant regeneration and micropropagation of Rehmannia glutinosa L. Journal of Medicial Plants Research, 3(1): 031-034. Pereira AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003), Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered madicinal plant. Plant Med, 69(6): 571-573. Tài liệu trên Internet: LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Xin chân thành cảm ơn Trung tâm nuôi cấy mô thực vật Thanh Hóa, Sở Khoa học và Công nghệ Thanh Hóa đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia chương trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Chu Hoàng Hà, Trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật, cùng toàn thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật và Trại Thực nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Đồng thời, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Công nghệ sinh học, Viện đại học Mở Hà Nội đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên để tôi có tự tin trong học tập và nghiên cứu khoa học. Hà Nội, tháng 5 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Trần Dinh NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN 2,4 D 2,4 - Dichlorophenoxy Axetic Axit ADN Axit Deoxyribonucleic ARN Axit Ribonucleic BAP 6 - Benzyl Amino Purin CTMT Công thức môi trường cs Cộng sự ĐC Đối chứng IAA Indol - 3- Axetic Axit IBA 3 - Indol Butyric Axit K Kinetin KTST Kích thích sinh trưởng MS Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog NAA α- Napthalen Axetic Axit TB Trung bình DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Nồng độ BAP ảnh hưởng đến khả năng tạo chồi của cây Ngưu tất 32 Bảng 2: Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi của cây Ngưu tất 34 Bảng 3: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất 36 Bảng 4: Ảnh hưởng của Kinetin và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất 38 Bảng 5: Tổng hợp khả năng tạo chồi trên các loại môi trường 39 Bảng 6: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của cây Ngưu tất 40 Bảng 7: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Ngưu tất 41 Bảng 8: Ảnh hưởng của IBA và Kinetin đến khả năng tạo rễ của cây Ngưu tất 42 Bảng 9: Ảnh hưởng của các chất kích thích lên quá trình tạo rễ của cây Ngưu tất 43 Bảng 10: Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ cây con sống 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1: Cây con vô trùng sau 25 ngày nuôi cấy 31 Hình 2: Tạo đa chồi cây Ngưu tất trên công thức môi trường NTA3 33 Hình 3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất 33 Hình 4: Tạo chồi cây Ngưu tất trên công thức môi trường NTB4 34 Hình 5: Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất 35 Hình 6: Tạo chồi cây Ngưu tất trên công thức môi trường NTC4 36 Hình 7: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất 37 Hình 8: Tạo chồi cây Ngưu tất trên môi trường NTD3 38 Hình 9: Tạo rễ cây Ngưu tất trên môi trường NTE3 40 Hình 10: Tạo rễ cây Ngưu tất trên môi trường NTG2 41 Hình 11: Tạo rễ cây Ngưu tất trên công thức môi trường NTH3 43 Hình 12: Cây Ngưu tất in vitro trồng trên các loại giá thể 46 MỤC LỤC