Khóa luận Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa lactobacillus acidophilus

ể ngoài môi trường 30 phút, mẫu vẫn giữ nguyên thể chất, dễ lấy khỏi đĩa. Hạt cứng, giảm xốp, đồng đều, kích thước lớn hơn, giữ được dạng cầu và giảm nhăn nhúm hơn so với không thêm TB. Nồng độ alginat càng thấp hạt càng nhỏ và nhăn nhúm hơn. 23 Hình 3.1: Vi nang Ca-alginat (2%) sau đông khô Hình 3.2: Vi nang Ca-alginat (2%)-TB (10%) sau đông khô  Nhận xét: Các mẫu đông khô Lactobacillus acidophilus tạo nguyên liệu dạng bột, các mẫu tạo thành đều có hạn chế là thể chất xốp, kết thành mảng, rất khó làm nhỏ thành dạng bột mịn. Mẫu đông khô với tá dược là dung dịch alginat 2%, nguyên liệu tạo thành lớp mỏng, bám dính vào đĩa petri. Sau 30 phút, mẫu hút ẩm rất khó lấy ra khỏi đĩa gây thất thoát nguyên liệu. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoa (2013) [3]. Khi thêm tinh bột, nguyên liệu ít hút ẩm, không dính đĩa, dễ lấy ra hơn. Mẫu đông khô với nguyên liệu dạng hạt vi nang đã cải thiện hơn về thể chất so với dạng bột. Nói chung dạng hạt ít hút ẩm nên tương đối dễ lấy khỏi đĩa hơn. Nguyên nhân có thể do dạng vi nang tạo thành lớp màng bao làm giảm diện tích tiếp xúc của mẫu với môi trường hơn ở dạng bột, ngoài ra lớp màng này cũng góp phần ngăn ẩm từ môi trường khuếch tán vào mẫu. Các mẫu dạng hạt dễ làm nhỏ hơn vì không có cấu tạo dạng mảng. Các hạt vi nang sử dụng alginat không thêm tinh bột, hạt tạo thành màu vàng nhạt, nhẹ, có thể chất xốp. Nhìn chung, các hạt nhỏ, nhăn nhúm, không cầu, không đều. Khi thêm tinh bột, thể chất hạt được cải thiện rõ ràng. Hạt cứng hơn, giảm xốp, rất dễ làm nhỏ, hạt ít hút ẩm nên dễ lấy ra 24 khỏi đĩa. Hạt có kích thước lớn hơn, đồng đều, bề mặt hạt giảm nhăn nhúm và giữ được độ cầu tốt hơn, màu sắc trắng đẹp. Tiến hành tạo hạt bằng kim tiêm, kích thước đầu kim (đường kính trong 900µm, đường kính ngoài 1400µm), với các nồng độ alginat khác nhau có hoặc không thêm tinh bột. Với nồng độ alginat 1% hoặc 2% (có hoặc không thêm tinh bột), hỗn dịch có độ nhớt vừa phải, khả năng nhỏ giọt tương đối dễ dàng. Tuy nhiên, hạt tạo thành sau đông khô ở nồng độ 1% thể chất kém hơn. Khi không thêm tinh bột, hạt nhỏ, nhăn nhúm, kém cầu và kém đều hơn so với ở nồng độ 2%. Khi phối hợp tinh bột, hạt ở nồng độ 1% vẫn nhăn nhúm và kém đều hơn nồng độ 2%. Với nồng độ alginat 3% không phối hợp tinh bột, khả năng nhỏ giọt rất khó do hỗn dịch có độ nhớt cao. Khi thêm tinh bột, hầu như không thể nhỏ được và hạt tạo thành có kích thước rất lớn. Do đó, ta lựa chọn nồng độ alginat 2% phối hợp với tinh bột để tiến hành tạo hạt cho thể chất tốt nhất. Mẫu đông khô sử dụng alginat để tạo nguyên liệu dạng bột có thể chất xốp, khó làm nhỏ có thể giải thích: Alginat thực chất là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α-L-guluronic (G) và acid β-D- mannuronic (M) [42]. Trong quá trình hấp tiệt khuẩn, do tác động của nhiệt độ cao (>70ºC) nên các chuỗi polyme này một phần bị đề polyme hóa, làm giảm độ nhớt của dung dịch polyme trước khi kết hợp với sinh khối. Vì vậy, nguyên liệu sau đông khô sử dụng alginat không có cấu trúc mảng dài mà chỉ có cấu trúc dạng mảng xốp, ngắn. Cấu trúc dạng chuỗi polyme làm nguyên liệu khó làm nhỏ thành dạng bột mịn. Khi phối hợp tinh bột như một tá dược độn rắn, thể chất của nguyên liệu dạng hạt được cải thiện là do: các hạt vi nang Ca-alginat có cấu trúc bên trong dạng đường viền trong đó các mạng lưới hydrogel tạo thành các lớp đồng tâm dày đặc tại bề mặt với khoảng trống ở giữa các mạng lưới (Rastello De Boisseson và cộng sự, 2004; Nussinovitch và Zvitov-Marabi, 2008) [43] [48]. Khi xảy ra quá trình gel hóa, cấu trúc đường viền kết hợp với liên kết ngang có hướng tỏa tròn từ bề mặt về lõi bên trong hạt tạo thành các hạt vi nang có dạng hình cầu. Sự thăng hoa của nước ở 25 thể đá từ mạng lưới hydrogel alginat trong quá trình đông khô để lại khoảng trống trong cấu trúc hạt và trên bề mặt hạt vi nang (Sriamornsak và cộng sự, 2007; Tal, Van Rijn và Nussinovitch, 1997) [54] [56]. Kết quả là tạo ra một số đặc tính không mong muốn, chẳng hạn như hình dạng méo mó, bề mặt hạt thô, kích thước không đều, độ bền cơ học kém và độ xốp cao. Khi thêm tinh bột, cấu trúc bên trong của các hạt ít xốp vì các hạt tinh bột chiếm khoảng không gian kẽ giữa các lớp đồng tâm. Chúng cũng giúp hỗ trợ cấu trúc mạng gel làm tăng độ bền cơ học của hạt. Việc bổ sung tá dược độn tinh bột còn giúp bề mặt hạt sau đông khô nhẵn, phẳng. Dù vậy, chất lượng bề mặt cũng phụ thuộc vào tính chất của tá dược độn. Theo Rassis, Saguy, Nussinovitch (2002) và Zohar – Perez, Chet, Nussinovitch (2004), sử dụng tá dược độn với kích thước hạt càng nhỏ thì bề mặt vi nang tạo thành càng nhẵn hơn [47] [61]. 3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi nang sau đông khô Việc phối hợp tinh bột với alginat đã được chứng minh cải thiện đáng kể thể chất vi nang tạo thành sau đông khô. Tuy nhiên, ta cũng cần lựa chọn nồng độ tinh bột phù hợp để tạo vi nang dễ dàng và cho thể chất vi nang tốt nhất.  Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến một số đặc tính của hạt vi nang tạo thành sau đông khô và lựa chọn nồng độ tinh bột phù hợp nhất để tạo vi nang.  Tiến hành: Nuôi cấy VSV trong bình nón (phương pháp nêu trong mục 2.3.2). Thu sinh khối của 20ml dịch lên men. Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng hạt vi nang với thành phần gồm sinh khối phối hợp với 20ml dung dịch alginat 2% và các nồng độ khác nhau của tinh bột (phương pháp nêu trong mục 2.3.3). Mẫu 1: Tinh bột 0% (không thêm tinh bột). Mẫu 2: Tinh bột 2%. Mẫu 5: Tinh bột 8%. Mẫu 3: Tinh bột 4%. Mẫu 6: Tinh bột 10%. 26 Mẫu 4: Tinh bột 6%. Mẫu 7: Tinh bột 20%. Các dung dịch và tá dược thêm vào đều được tiệt khuẩn bằng phương pháp nhiệt ẩm ở 115 ºC trong 20 phút. Tiến hành đông khô các mẫu trên (phương pháp nêu trong mục 2.3.4). Kết thúc quá trình, lấy mẫu ra khỏi đĩa petri, bảo quản trong túi polyme đựng trong lọ nhựa PE kín ở 4ºC. Tiến hành đo đường kính, hàm ẩm (phương pháp nêu trong mục 2.3.5) và so sánh thể chất của các mẫu ngay sau đông khô. Mỗi thí nghiệm, tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.  Kết quả: Đường kính, hàm ẩm và thể chất của các mẫu sau đông khô được thể hiện trong bảng 3.2. Bảng 3.2: Đường kính, hàm ẩm và thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus ngay sau đông khô khi thay đổi nồng độ tinh bột Nồng độ tinh bột Khả năng giữ độ cầu, giảm nhăn nhúm Đường kính trung bình (mm) Hàm ẩm sau đông khô (%) 0% + 1,50 4,87 2% ++ 1,55 3,93 4% +++ 1,84 3,87 6% ++++ 2,01 3,75 8% +++++ 2,05 2,70 10% ++++++ 2,11 2,03 20% ++++++ 2,58 1,82 27 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm ẩm và đường kính vào nồng độ tinh bột của các mẫu sau đông khô  Nhận xét: Tiến hành tạo vi nang Ca-alginat-tinh bột với các nồng độ tinh bột tăng dần từ 2% đến 10% bằng kim tiêm, kích thước đầu kim (đường kính trong 900µm, đường kính ngoài 1400µm) ta thấy: Hỗn dịch gel có độ nhớt phù hợp, quá trình tạo vi nang tương đối dễ dàng. Các mẫu đông khô với nồng độ tinh bột càng cao, hạt vi nang tạo thành sau đông khô càng giữ được độ cầu và giảm nhăn nhúm, thể chất của hạt cứng và giảm xốp. Khi tăng nồng độ tinh bột từ 2% đến 10%, hàm ẩm của hạt giảm dần (từ 3,93% xuống 2,03%), kích thước hạt tăng dần (đường kính từ 1,55 lên 2,11mm) và hạt tạo thành đồng đều hơn do giảm hiện tượng co rút của hạt trong quá trình đông khô. So sánh với mẫu đông khô không sử dụng tinh bột tiến hành trong cùng điều kiện, ta thấy: hạt vi nang không chứa tinh bột có thể chất xốp, nhăn, không cầu, không đều, kích thước nhỏ (đường kính 1,50mm), hàm ẩm cao (4,87%). Với nồng độ tinh bột 10%, vi nang tạo thành giữ được độ cầu, bề mặt ít nhăn nhúm nhất. Hạt vi nang tạo thành có màu trắng, đường kính khoảng 2,11mm, kích thước tương đối đồng đều. Hạt cứng, giảm xốp, cấu trúc hạt bền vững, tạo lớp vỏ bảo vệ vi sinh vật tốt. Độ ẩm của hạt vi nang ở nồng độ này thấp (2,03%). Độ ẩm có 0 1 2 3 4 5 6 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0% 2% 4% 6% 8% 10% 20% H àm ẩ m ( % ) Đ ư ờ n g k ín h (m m ) Nồng độ tinh bột Đường kính Hàm ẩm sau đông khô 28 liên quan đến khả năng sống sót của VSV sau đông khô, tỉ lệ sống sót của VSV càng cao khi độ ẩm càng thấp. Trong quá trình tạo vi nang, nồng độ tinh bột càng cao thì hỗn dịch gel càng sánh nhớt, quá trình nhỏ giọt càng trở nên khó khăn. Khi tăng nồng độ tinh bột trên 10%, hỗn dịch gel có độ nhớt cao, không thích hợp để tạo vi nang. Tại nồng độ tinh bột 20%, hạt vi nang tạo thành giữ được độ cầu, bề mặt tương đối nhẵn tuy nhiên không có sự cải thiện độ cầu rõ rệt hơn so với khi sử dụng ở nồng độ 10%. Hạt cứng, hàm ẩm rất thấp (1,82%). Tuy nhiên, nồng độ tinh bột cao khiến hỗn dịch gel nhớt, dễ gây tắc kim, hầu như không thể nhỏ giọt và vi nang tạo thành có kích thước rất lớn (đường kính 2,58mm) ảnh hưởng đến thẩm mỹ của sản phẩm. Từ những kết quả trên, ta lựa chọn nồng độ tinh bột 10% để tiến hành tạo vi nang. Kết quả nghiên cứu có thể được giải thích như sau: Quá trình đông khô làm thăng hoa các phân tử nước dẫn đến giảm kích thước của hạt. Mức độ co rút của hạt càng cao thì kích thước hạt càng giảm. Mức độ co rút của hạt phụ thuộc vào nồng độ tinh bột. Nồng độ tinh bột càng tăng thì mức độ co rút càng giảm, kích thước hạt sau đông khô càng tăng. Đường kính của các hạt vi nang trước đông khô của các mẫu với nồng độ tinh bột khác nhau là tương đương nhau (khoảng 3mm). Khi tăng dần nồng độ tinh bột từ 2% lên 20%, đường kính của hạt vi nang sau đông khô tăng dần từ 1,55 lên 2,58mm. Nguyên nhân do có sự tương tác giữa các phân tử tinh bột và alginat cùng khả năng tương thích tốt của chúng [23]. Các phân tử tinh bột hỗ trợ cấu trúc mạng gel và ngăn chặn sự sụp đổ hoặc co rút của cấu trúc hạt trong quá trình đông khô [21]. Việc bổ sung tá dược độn không tan có hiệu quả kiểm soát mức độ co rút, kết quả này phù hợp với các công trình nghiên cứu trước đó (Rassis, Saguy và Nussinovitch, 2002; Zohar - Perez, Chet và Nussinovitch, 2004) [47] [61]. Hình dạng của các hạt alginat được đại diện bằng yếu tố cầu thể. Trước đông khô, hình dạng của tất cả các hạt alginat đều cầu bất kể nồng độ tinh bột. Sau đông khô, hình dạng của các hạt là không đều. Các hạt có nồng độ tinh bột tăng dần từ 2% lên 10% có độ cầu tăng dần. Quá trình đông khô xảy ra hiện tượng thăng hoa của các phân tử nước làm biến dạng cấu trúc hạt, sự biến dạng này dẫn đến thay đổi 29 hình dạng các hạt, hiện tượng cũng được quan sát thấy trong các nghiên cứu trước đó (Rassis và cộng sự, 2002; Zohar - Perez và cộng sự, 2004) [47] [61]. Việc bổ sung tinh bột góp phần duy trì độ cầu của hạt sau đông khô. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ tinh bột trên 10% (ở 20%) không cho thấy cải thiện hơn nữa độ cầu của hạt. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đó của Eng-Seng Chan và cộng sự, 2011[21]. Một nghiên cứu tương tự chứng minh rằng, việc sử dụng chất độn không hòa tan khác chẳng hạn như cao lanh, bentonit (Ribeiro, Barrias Barbosa, 2004; Zohar - Perez và cộng sự, 2004) [50] [61] cũng giúp duy trì độ cầu của hạt sau đông khô. Nguyên nhân có thể giải thích tương tự là do tá dược độn có khả năng hỗ trợ, làm bền vững cấu trúc mạng gel, bảo vệ cấu trúc vi nang trong quá trình đông khô. Vật liệu đông khô rất nhạy cảm với độ ẩm. Sự nhạy cảm này có thể dẫn đến sự giảm nhanh chóng tế bào sống sót khi lưu trữ trong điều kiện không thuận lợi. Các hạt không thêm tinh bột có độ ẩm cao nhất (4,87%), việc bổ sung tinh bột nói chung làm giảm tỷ lệ hấp thụ ẩm và lượng nước ở trạng thái cân bằng. Độ ẩm cao của hạt Ca-alginat có thể là do bản chất ưa nước của alginat (Rhim, 2004; Olivas và cộng sự, 2008) [44] [49]. Tuy nhiên, khi phối hợp với tinh bột, độ ẩm của hạt giảm so với khi không thêm tinh bột. Nồng độ tinh bột càng cao thì độ ẩm của hạt càng thấp. Tại nồng độ tinh bột 20%, độ ẩm của hạt là 1,82%. Nguyên nhân có thể do cấu trúc của tinh bột chứa các vùng vô định hình và các vùng tinh thể. Khu vực vô định hình chủ yếu là amylose và khu vực tinh thể chủ yếu là amylopectin. Chính cấu trúc đặc biệt này đã đem lại những tính chất hóa học đặc trưng của tinh bột, giúp giải thích sự giảm độ ẩm của hạt vi nang khi có sự phối hợp tinh bột. Ngoài ra, hạt tinh bột cũng chứa một lượng nhỏ chất béo giúp ngăn chặn sự hấp thụ độ ẩm [21]. Kết luận: Nồng độ alginat 2% và tinh bột 10% cho nguyên liệu có thể chất tốt nhất được lựa chọn để tạo vi nang trong những thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản 3.2.1. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột trong quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic 30 Để được coi là có tác dụng bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus acidophilus thì trước tiên tinh bột phải cho thấy khả năng cải thiện được lượng vi sinh vật sống sót sau quá trình đông khô ít nhất là so với các mẫu nguyên liệu đông khô không sử dụng tinh bột ở cùng điều kiện. Vì vậy, thí nghiệm tiếp theo được tiến hành nhằm xác định số lượng vi sinh vật sống sót của các mẫu ngay sau quá trình đông khô.  Mục tiêu: Đánh giá ảnh hưởng của tinh bột lên lượng VSV sống sót trong mẫu nguyên liệu probiotic sau đông khô, so sánh với mẫu không sử dụng tinh bột và mẫu đông khô VSV với nước cất.  Tiến hành: Nuôi cấy VSV trong bình nón (phương pháp nêu trong mục 2.3.2). Thu sinh khối của 20ml dịch lên men. Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng bột với thành phần gồm sinh khối phối hợp với 20ml dung dịch tá dược bảo vệ khác nhau như sau (phương pháp nêu trong mục 2.3.4). Mẫu 1: Nước cất. Mẫu 2: Dung dịch alginat 2%. Mẫu 3: Dung dịch alginat 2% + tinh bột 10%. Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng hạt vi nang với thành phần gồm sinh khối phối hợp với 20ml dung dịch alginat 2% có hoặc không thêm tinh bột (phương pháp nêu trong mục 2.3.3). Mẫu 4: Không thêm tinh bột. Mẫu 5: Thêm tinh bột 10%. Tiến hành đông khô các mẫu trên (phương pháp nêu trong mục 2.3.4). Kết thúc quá trình, lấy hết mẫu ra khỏi đĩa, tiến hành xác định số lượng vi sinh vật sống sót trong các mẫu trên bằng phương pháp pha loãng liên tục (phương pháp nêu trong mục 2.3.6). Tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.  Kết quả: 31 Số lượng VSV Lactobacillus acidophilus có trong 1ml dịch nuôi cấy trước đông khô đạt 1,42×109 VSV/1ml. Kết quả các mẫu được thể hiện trong bảng 3.3. Bảng 3.3: Số lượng vi khuẩn sống sót trong 5 mẫu sau đông khô Tá dược bảo vệ Nước cất Alginat 2% Alginat 2% + TB 10% Alginat 2% Alginat 2% + TB 10% Dạng nguyên liệu Bột Bột Bột Hạt Hạt Lượng VSV sau ĐK (cfu/ml) 9,02×105 2,79×107 7,92×107 1,04×108 3,16×108 Tỉ lệ VSV so với mẫu nước cất (lần) 1 30,93 87,80 115,30 350,33 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của 5 mẫu sau đông khô  Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy, việc phối hợp tinh bột làm tăng lượng VSV sống sót sau đông khô so với khi không thêm tinh bột. Với nguyên liệu dạng bột, khi sử 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 Nước cất (bột) Alginat (bột) Alginat-TB (bột) Alginat (hạt) Alginat-TB (hạt) S ố lư ợ n g V S V ( lg C F U /g ) Mẫu nguyên liệu đông khô 32 dụng tá dược bảo vệ alginat, lượng VSV sống sót sau đông khô đạt 2,79×107 cfu/ml gấp 30,93 lần so với mẫu sử dụng nước cất. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoa (2013) [3]. Khi thêm tinh bột, lượng VSV sống sót cao hơn đạt 7,92×107 cfu/ml gấp 87,80 lần so với mẫu sử dụng nước cất. Khi tạo nguyên liệu dạng bột, lượng VSV sống sót sau đông khô khi thêm tinh bột đạt 3,16×108 cfu/ml tăng hơn so với mẫu không thêm tinh bột chỉ đạt 1,04×108 cfu/ml. Ngoài ra, tạo nguyên liệu dạng hạt không chỉ cải thiện về mặt thể chất mà còn tăng khả năng sống sót VSV sau đông khô so với nguyên liệu dạng bột. Trong cùng điều kiện và sử dụng các tá dược độn giống nhau, với nồng độ và thể tích như nhau thì lượng VSV sống sót sau đông khô của dạng hạt vi nang đều lớn hơn so với dạng bột. Khi sử dụng alginat phối hợp tinh bột để tạo nguyên liệu dạng vi nang cho kết quả bảo vệ VSV trong đông khô tốt nhất. Lượng VSV sống sót sau đông khô đạt 3,16×108 cfu/ml gấp 350,33 lần so với mẫu nguyên liệu dạng bột sử dụng nước cất. Như vậy, việc tạo nguyên liệu dạng vi nang đã góp phần làm tăng lượng VSV sống sót sau đông khô so với nguyên liệu dạng bột và việc phối hợp tinh bột cũng góp phần bảo vệ VSV trong quá trình đông khô. Kết quả trên có thể giải thích như sau: Đông khô là phương pháp loại nước được sử dụng rộng rãi để bảo quản tế bào. Tuy nhiên, đã có một số báo cáo liên quan đến việc tác dụng phụ của đông khô trên cấu trúc và chức năng của tế bào, cuối cùng dẫn đến giảm lượng tế bào sống sót [25]. Một trong số các tác động của quá trình đông khô là sự biến tính protein và tổn thương tế bào và màng tế bào. Quá trình vi nang hóa tạo ra lớp màng bao bảo vệ tế bào VSV khỏi điều kiện bất lợi của môi trường trong quá trình đông khô. Vì vậy, nguyên liệu dạng vi nang cải thiện khả năng sống sót của tế bào VSV hơn so với nguyên liệu ở dạng bột. Tuy nhiên, Champagne và các cộng sự (1992) đã phát hiện ra rằng chỉ sử dụng mạng lưới hydrogel Ca- alginat không đủ để bảo vệ các tế bào đóng gói [20]. Vì vậy, việc phối hợp tá dược để tăng khả năng bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô là cần thiết. Sau đông khô, tế bào đóng gói trong vi nang không sử dụng tinh bột có tỉ lệ sống thấp đạt 1,04×108 cfu/ml. Trong khi đó, sử dụng tinh bột làm tăng lượng tế bào 33 đóng gói sống sót sau đông khô lên 3,16×108 cfu/ml. Việc sử dụng phối hợp tinh bột giúp cải thiện khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic trong hạt vi nang sau đông khô, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Eng-Seng Chan và cộng sự (2011); M.J. Martin và cộng sự (2013) [21] [40]. Sự khác biệt về khả năng sống sót của tế bào đóng gói hạt Ca-alginat có và không sử dụng tinh bột sau đông khô có thể do các nguyên nhân sau: - Các hạt không sử dụng tinh bột có mức độ co rút cao hơn, gây ra các tác động vật lý lên tế bào. Ngoài ra, hạt không phối hợp tinh bột có độ xốp cao hơn nên diện tích tiếp xúc của tế bào với môi trường trong quá trình đông khô cao hơn. Chính sự tiếp xúc này là nguyên nhân làm giảm lượng tế bào sống sót, kể từ khi có báo cáo rằng xác suất tử vong trong đông khô tỷ lệ thuận với diện tích bề mặt tiếp xúc (Bozo Glu và cộng sự, 1987) [19]. - Việc bổ sung các chất độn tạo môi trường có mật độ dày đặc làm tăng khả năng bảo vệ các tế bào chống lại các yếu tố ảnh hưởng của quá trình đông khô. - Tinh bột cũng là một trong số tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô. Cơ chế bảo vệ của tinh bột là làm giảm lượng nước liên kết trong mẫu [41]. Ngoài ra, hạt vi nang có sử dụng tinh bột có độ ẩm sau đông khô thấp hơn giúp VSV ổn định hơn trong quá trình bảo quản. 3.2.2. Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic dạng vi nang Hiệu quả điều trị của chế phẩm probiotic thường phụ thuộc vào lượng vi sinh vật sống có trong chế phẩm. Liên đoàn Sữa quốc tế (IDF) đã đề nghị cần tối thiểu 107 tế bào vi sinh vật sống vào thời điểm tiêu thụ mỗi gam sản phẩm [28] [34]. Vì vậy, chỉ tiêu vi sinh vật dự kiến của nguyên liệu probiotic ngay sau đông khô là khoảng 1010 cfu/g. Để đảm bảo yêu cầu trên, ta tiến hành tạo chế phẩm đông khô dạng vi nang với lượng sinh khối đầu vào khác nhau và lựa chọn lượng sinh khối phù hợp để tạo nguyên liệu.  Mục tiêu: 34 Khảo sát ảnh hưởng của lượng sinh khối đến chất lượng của nguyên liệu sau đông khô và lựa chọn lượng sinh khối phù hợp để tiến hành tạo nguyên liệu.  Tiến hành: Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng hạt vi nang với thành phần gồm sinh khối của các thể tích dịch lên men khác nhau và 100ml hỗn dịch alginat 2% phối hợp tinh bột 10% như sau (phương pháp nêu trong mục 2.3.3). Mẫu 1: Sinh khối của 100ml dịch lên men. Mẫu 2: Sinh khối của 200ml dịch lên men. Tiến hành đông khô các mẫu trên (phương pháp nêu trong mục 2.3.4). Kết thúc quá trình, lấy hết mẫu ra khỏi đĩa, tiến hành xác định số lượng vi sinh vật sống sót trong các mẫu trên bằng phương pháp pha loãng liên tục (phương pháp nêu trong mục 2.3.6). Tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.  Kết quả: Kết quả các mẫu được thể hiện trong bảng 3.4. Bảng 3.4: Số lượng vi khuẩn sống sót và hàm ẩm của các mẫu sau đông khô Thời điểm Tiêu chí đánh giá Mẫu 1 Mẫu 2 Trước ĐK Khối lượng sinh khối (g) 1,58 3,28 Tổng khối lượng hạt (g) 77,28 79,26 Lượng VSV trong 1g hạt (cfu/g) 6,83×109 1,36×1010 Sau ĐK Lượng VSV trong 1g hạt (cfu/g) 6,42×109 1,43×1010 Hàm ẩm (%) 2,06 1,95 35 Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của các mẫu sau đông khô  Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy, khi ta thay đổi lượng sinh khối, giá trị hàm ẩm của các mẫu thay đổi không đáng kể. Hàm ẩm của các mẫu vi nang phối hợp 10% tinh bột đều tương đối thấp, khoảng 1,95 – 2,06% (dưới 5%). Hàm ẩm của mẫu phụ thuộc vào quá trình đông khô và lượng tá dược độn rắn thêm vào chứ không phụ thuộc vào lượng sinh khối đầu vào. Khi ta tăng gấp đôi thể tích dịch nuôi cấy (từ 100ml lên 200ml), khối lượng sinh khối thu được cũng tăng (từ 1,58 lên 3,28g). Lượng vi sinh vật được vi gói trong 1g hạt trước đông khô tăng (từ 6,83×109 lên 1,36×1010 cfu/g), sau đông khô tăng (từ 6,42×109 lên 1,43×1010 cfu/g). Từ kết quả trên cho thấy, khi ta tăng thể tích dịch nuôi cấy nghĩa là tăng số lượng vi sinh vật đầu vào để tạo nguyên liệu dạng vi nang. Kết quả là số lượng tế bào được vi gói tăng lên trong cùng điều kiện thực nghiệm, do đó hiệu quả vi gói cao hơn. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu của Lê Thị Thu Hiền (2012) [13]. Khi tăng thể tích dịch nuôi cấy lên 200ml, thì khối lượng sinh khối ban đầu là 3,28g, lượng vi sinh vật trong 1g hạt sau đông khô là 1,43×1010 cfu/g đạt yêu cầu của nguyên liệu probiotic đề ra, hàm ẩm của hạt là 0 2 4 6 8 10 12 14 100ml 200ml S ố l ư ợ n g V S V ( .1 0 9 c fu /g ) Thể tích dịch lên men (ml) Trước đông khô Sau đông khô 36 1,95% (dưới 5%). Vì vậy, ta tiến hành vi nang hóa tạo nguyên liệu đông khô với thể tích dịch nuôi cấy ban đầu là 200ml bằng phương pháp như đã nêu trên. Kết quả trên có thể giải thích như sau: Acid alginic có cấu trúc là một heteropolyme saccharid mạch thẳng, cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α-L-guluronic và acid β-D-mannuronic nối với nhau bằng liên kết 1-4-glucosid. Tuy nhiên, chúng không liên kết một cách ngẫu nhiên mà tạo thành 3 loại block: block homopolymeguluronic gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau tạo thành đoạn mạch GGGG có dạng gấp nếp, block homopolymemannuronic gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau tạo thành đoạn mạch MMMM có dạng dải hẹp và block liên hợp MGMG. Khi có mặt ion Ca2+ ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra. Các phân tử alginat sắp xếp song song nhau, đoạn mạch GGGG gấp nếp như vỉ trứng, khoảng không gian các vỉ xếp lên nhau như chỗ đặt quả trứng. Các ion khớp vào các khoảng trống này liên kết với các nhóm carboxyl và các nguyên tử oxy ở mỗi đoạn song song hình thành khoang rỗng có cấu tạo không gian ba chiều [42]. Trong cùng điều kiện thể tích cũng như nồng độ alginat và Ca2+, số lượng hạt vi nang tạo thành cũng như khoang trống trong mỗi hạt là tương đương nhau. Khi ta tăng số lượng vi sinh vật đầu vào, chúng bị giam giữ hết trong các khoang rỗng nên lượng tế bào được vi gói cũng tăng, hiệu quả vi gói tăng. Tuy nhiên, khi lượng tế bào đã đủ lớn để lấp đầy tất cả các khoang thì dù có tăng thêm lượng vi sinh vật đầu vào, hiệu quả vi gói cũng không tiếp tục tăng lên được nữa. Lúc này, nếu muốn tăng hiệu quả vi gói cần thay đổi một số yếu tố như nồng độ alginat, nồng độ Ca2+ Mục tiêu của nghiên cứu này là lựa chọn lượng sinh khối thích hợp để tạo nguyên liệu sau đông khô chứa khoảng 1010 cfu/g, vì vậy ta lựa chọn thể tích dịch lên men đầu vào là 200ml để tiết kiệm sinh khối. 3.2.3. Khảo sát độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản Một trong những yêu cầu quan trọng của nguyên liệu probiotic là phải giữ được thể chất cũng như lượng vi sinh vật sống phù hợp trong quá trình bảo quản. Hàm ẩm có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sống sót của vi khuẩn lactic [32], vì 37 vậy cần thiết phải tiến hành đánh giá hàm ẩm và lượng vi sinh vật sống của nguyên liệu trong thời gian bảo quản.  Mục tiêu: Theo dõi hàm ẩm và lượng vi sinh vật sống của nguyên liệu probiotic trong thời gian bảo quản.  Tiến hành: Tạo mẫu nguyên liệu vi nang từ sinh khối của 200ml dịch lên men (phương pháp như trong thí nghiệm 3.2.2). Tiến hành đông khô các mẫu trên (phương pháp nêu trong mục 2.3.4). Nguyên liệu sau khi lấy ra khỏi đĩa petri được bảo quản trong túi polyme đựng trong lọ nhựa PE kín ở 4ºC. Tiến hành đo hàm ẩm và xác định số lượng vi sinh vật sống sót tại các thời điểm: ngay sau đông khô, sau 1 tuần, 2 tuần, 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần (làm 3 lần để lấy kết quả trung bình).  Kết quả:  Kết quả đo hàm ẩm của mẫu được thể hiện trong bảng 3.5. Bảng 3.5: Hàm ẩm của nguyên liệu trong thời gian bảo quản Thời gian Sau ĐK Sau 1 tuần Sau 2 tuần Sau 4 tuần Sau 8 tuần Sau 12 tuần Hàm ẩm (%) 2,03 2,99 2,38 2,65 2,86 3,24 Hàm ẩm tăng so với mẫu ngay sau ĐK (%) 0 0,96 0,35 0,62 0,83 1,21  Nhận xét: Từ kết quả thu được ta thấy, trong quá trình bảo quản, hàm ẩm của mẫu nói chung là tăng dần (từ 2,03% lên 3,24%), nguyên nhân là do ẩm của không khí khuếch tán qua bao bì và được sản phẩm hấp thụ. Hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu tương đối ổn định theo thời gian, sau 12 tuần, ở điều kiện bảo quản, hàm ẩm của mẫu tăng 1,21% so với mẫu ngay sau đông khô, đạt 3,24% (<5%). Khả năng hút ẩm của mẫu có thể giải thích là do cấu trúc đặc biệt của tinh bột có chứa các vùng vô định hình và các vùng tinh thể làm cho hạt vi nang tinh bột ít hút ẩm trong điều kiện bảo quản. Ngoài ra, hạt vi nang tinh bột có cấu tạo ít xốp, tinh bột tạo lớp màng bảo 38 vệ vững chắc và hạt tinh bột cũng chứa một lượng nhỏ chất béo có thể là nguyên nhân giúp ngăn chặn sự hấp thụ ẩm của hạt [21]. Trong quá trình bảo quản, hàm ẩm của mẫu sau 1 tuần tăng mạnh, sau đó lại giảm. Nguyên nhân có thể một phần là do sai số của thiết bị đo. Tuy nhiên, nguyên nhân chính có thể được giải thích là do tinh bột có cấu trúc xốp, nên khi tiếp xúc với độ ẩm không khí thì khả năng hút ẩm của tinh bột là khá lớn. Khi độ ẩm tương đối của không khí là 75% thì khả năng hút ẩm của tinh bột là 10,33%, còn khi độ ẩm tương đối của không khí là 100% thì khả năng hút ẩm của tinh bột lên đến 20,92% [11]. Do đó, trong quá trình lấy mẫu ra chuẩn bị đo hàm ẩm, khi tiếp xúc với độ ẩm cao của không khí, hạt tinh bột có thể hút ẩm làm cho hàm ẩm của mẫu nguyên liệu tăng mạnh. Hàm ẩm của mẫu phụ thuộc đáng kể vào độ ẩm tương đối của không khí và thời gian mẫu tiếp xúc với môi trường. Chính vì khả năng hút ẩm cao của tinh bột khi tiếp xúc với không khí nên nguyên liệu đông khô dạng hạt vi nang có sử dụng tinh bột làm tá dược độn rắn cần bảo quản kín trong bao bì ngăn khuếch tán của ẩm và không khí.  Lượng vi sinh vật sống của mẫu nguyên liệu trong thời gian bảo quản được thể hiện trong bảng 3.6. Bảng 3.6: Lượng vi sinh vật sống của nguyên liệu trong thời gian bảo quản Thời gian Sau ĐK Sau 1 tuần Sau 2 tuần Sau 4 tuần Sau 8 tuần Sau 12 tuần Lượng VSV sống sót (cfu/g) 1,48×1010 1,15×1010 5,99×109 2,94×109 1,18×109 3,78×108  Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy, số lượng vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu giảm dần trong quá trình bảo quản. Lượng vi sinh vật ngay sau đông khô đạt 1,48×1010 cfu/g. Sau 12 tuần, số lượng vi sinh vật sống giảm xuống 3,78×108 cfu/g, nhưng vẫn đạt trên 108 cfu/g. Như vậy, với sự phối hợp 10% tinh bột, ta đã tạo thành công 39 nguyên liệu đông khô dạng vi nang với thể chất thích hợp và lượng vi sinh vật phù hợp. Sau 3 tháng, nguyên liệu vẫn giữ được độ ổn định và đạt các yêu cầu của nguyên liệu probiotic. Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn lượng vi sinh vật sống và hàm ẩm của nguyên liệu trong thời gian bảo quản Lượng vi sinh vật giảm dần trong quá trình bảo quản có thể được giải thích như sau: Khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố: pH, nồng độ oxy hòa tan, nhiệt độ, độ ẩm Trong đó, do Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn kị khí không bắt buộc (vi hiếu khí) nên nồng độ oxy hòa tan đóng vai trò đáng kể trong việc hạn chế sự sống sót của vi khuẩn [32]. Trong quá trình bảo quản, oxy và ẩm từ môi trường khuếch tán qua bao bì nên thời gian bảo quản càng dài thì lượng vi sinh vật càng giảm. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 2 4 6 8 10 12 Ngay sau đông khô 1 tuần 2 tuần 4 tuần 8 tuần 12 tuần H àm ẩ m ( % ) S ố l ư ợ ng V S V ( lg C F U /g ) Thời gian bảo quản Hàm ẩm 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Đề tài đã hoàn thành được mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả như sau: - Việc phối hợp tinh bột đã cải thiện thể chất của nguyên liệu đông khô dạng vi nang. Khi phối hợp tinh bột, hạt vi nang có kích thước lớn hơn, đồng đều, bề mặt hạt giảm nhăn nhúm và giữ được độ cầu tốt hơn, màu sắc trắng đẹp. Hạt cứng, giảm xốp, rất dễ làm nhỏ, ít hút ẩm. Ta lựa chọn nồng độ alginat 2% và tinh bột 10% để tạo hạt cho thể chất tốt nhất. - Phối hợp tinh bột để tạo nguyên liệu đông khô dạng vi nang làm tăng lượng vi sinh vật sống sót sau đông khô so với khi không sử dụng tinh bột trong cùng điều kiện. Tiến hành tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus dạng vi nang sử dụng alginat 2%, tinh bột 10% và sinh khối của 200ml dịch lên men. Nguyên liệu được bảo quản trong túi polyme đựng trong lọ PE kín tại 4ºC và theo dõi độ ổn định. Sau 12 tuần, hàm ẩm của nguyên liệu là 3,24% và lượng vi sinh vật trong nguyên liệu là 3,78×108 (cfu/g) vẫn đạt tiêu chuẩn nguyên liệu đông khô probiotic. 2. Kiến nghị - Tiếp tục theo dõi độ ổn định của nguyên liệu probiotic đông khô dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus có phối hợp tinh bột trong thời gian bảo quản về các chỉ tiêu độ ẩm và số lượng vi sinh vật - Đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật của nguyên liệu probiotic đông khô dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus có phối hợp tinh bột trong môi trường dạ dày nhân tạo. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Đỗ Quốc Cường (2009), Nâng cao chất lượng sữa chua bằng phương pháp vi gói vi khuẩn lactic, Trường Đại Học Kỹ thuật công nghệ TP HCM, TP HCM. 2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. 3. Nguyễn Thị Hoa (2013), Khảo sát tác dụng bảo vệ vi khuẩn của alginat trong quá trình tạo nguyên liệu Probiotic chứa Lactobacilus acidophilus, Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội. 4. Nguyễn Văn Long (2005), Một số chuyên đề về bào chế hiện đại, NXB y học, Hà Nội. 5. Biền Văn Minh, Kiều Hữu Ảnh, Phạm Ngọc Lan, Đỗ Thị Bích Thủy (2008), Giáo trình điện tử Vi sinh vật học công nghiệp, Huế. 6. Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), Bào chế và sinh dược học, NXB Giáo dục, Hà Nội. 7. Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng, Đà Nẵng. 8. Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan, Trần Cát Nông, Võ Thị Mại (2002), "Nghiên cứu phối hợp Bifidobacterium bifidum với Lactobacillus acidophilus trong sản xuất chế phẩm loạn khuẩn đường ruột", Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh, 6, pp. 142-144. 9. Quách Thu Trang (2010), Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp vi nang hóa bằng alginat tới tỉ lệ sống sót của Lactobacillus acidophilus, Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội. 10. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm quốc Thăng, NguyễnThị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Biên (2000), Hoá sinh công nghiệp, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 11. Lê Ngọc Tú, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cẩn (1999), Hóa học thực phẩm, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội. 12. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội. 13. Đàm Thanh Xuân, Lê Ngọc Khánh, Lê Thị Thu Hiền (2012), "Nghiên cứu sử dụng tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cố định trên chất mang alginat trong lên men sản xuất calci lactat", Tạp chí hóa học, 50(5A), pp. 117-121. Tài liệu tiếng Anh 14. Abadias M., Benabarre A., Teixido N., Usall J., Vinas I. (2011), "Effect of freeze drying and protectants on viability of the biocontrol yeast Candida sake", International Journal of Food Microbiology, 65, pp. 173-182. 15. Agnihotri N., et al. (2012), "Microencapsulation - a novel approach in drug delivery: a review", Indo Global Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(1), pp. 1-20. 16. Amir Mortazavian, Seyed Hadi Razavi, Mohammad Reza Ehsani, Sara Sohrabvandi (2007), "Principles and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms", Iranian journal of biotechnology, 5(1), pp. 1-17. 17. Anindya Kishore Maiti, Amal Kumar Dhara, Arunabha Nanda (2012), "Preparation and Evaluation of Starch coated Alginate Microsphere of Diclofenac potassium", International Journal of PharmTech Research, 4(2), pp. 630-636. 18. Arnauld J.P., Laroix C., Choplin L. (1992), "Effect of agitation rate on cell release raye and metabolism during continues fermentation with entrapped growing Lactobacillus casei subsp. casei", Biotech Tech, pp. 261-265. 19. Bozoglu T.F., Ozilgen M., Bakir U. (1987), "Survival kinetics of lactic acid starter cultures during and after freeze-drying", Enzyme and Microbial Technology, 9, pp. 531–537. 20. Champagne C.P., Morin N., Couture R., Gagnon C., Jelen P., Lacroix C. (1992), "The potential of immobilized cell technology to produce freeze- dried, phageprotected cultures of Lactococcus lactis", Food Research International, 25(6), pp. 419-427. 21. Chan Eng-Seng, et al. (2011), "Effects of starch filler on the physical properties of lyophilized calcium–alginate beads and the viability of encapsulated cells", Carbohydrate Polymers, 83, pp. 225-232. 22. Filomena Nazzaro, Florinda Fratianni, Raffaele Coppola, Alfonso Sada, Pierangelo Orlando (2009), "Fermentative ability of alginat-prebiotic encapsulated Lactobacillus acidophilus and survival under simulated gastrointestinal conditions", Journal of Functional Food, 1, pp. 319-323. 23. Gislene Mari Fujiwara, et al. (2013), "Production and characterization of alginate-starch-chitosan microparticles containing stigmasterol through the external ionic gelation technique", Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 49(3), pp. 537-546. 24. Gomes A.M.P., Malcata F.X. (1990), "Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics", Trends in Food Science & Technology, 10(4), pp. 139-157. 25. Guergoletto Karla Bigetti (2012), "Dried Probiotics for Use in Functional Food Applications", Food Industrial Processes-Methods and Equipment, pp. 227-247. 26. Halász Anna (2007), "Lactic Acid Bacteria", Food Quality and Standards, 3, pp. 70-82. 27. Harry W. Leach, L.D. MeCowen, Thomas J. Schoch (1959), "Swelling and Solubility Patterns of Various Starches", In Structure of grannle, 56, pp. 534- 543. 28. Hekmat S., et al. (1992), "Survival of Lactobacillus and Bifidobacterium bifidum in ice cream for use as a probiotic food", Journal of Dairy Science, 75, pp. 1415–1422. 29. Jankowski T., Zielinska M. (1997), "Encapsulation of lactic and bacteria with alginate/starch capsules", Biotechnol Technol, pp. 31-34. 30. José Luis Parada, Carolina Ricoy Caron, Adriane Bianchi P. Medeiros, Carlos Ricardo Soccol (2007), "Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria: Purification, Properties and use as Biopreservatives", Brazilian Archives of Biology and Technology, 50(3), pp. 521-542. 31. Kaewkaukul Naparat (1998), Development of mixed culture Lactobacillus products, Thesis of master of science, Mahidol University, Thailand. 32. Kailasapathy Kaila (2002), "Microencapsulation of Probiotic Bacteria: Technology and Potential Applications", Horizon Scientific Press, pp. 39-48. 33. Kailasapathy Kaila, James Chin (2000), "Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp", Immunology and Cell Biology, 78, pp. 80-88. 34. Kailasapathy Kaila, Sultana K. (2003), "Survival and b-D-galactosidase activity of encapsulated and free Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis in ice cream", Australian Journal of Dairy Technology, 58(3), pp. 223–227. 35. Kebary K.M.K., Hussein, S.A., Badawi , R.M. (1998), "Improving viability of bifidobacteria and their effect on frozen milk", Egyptian J. Dairy Sci. , 26, pp. 319-337. 36. Khalida S., et al. (2000), "Encapsulation of probiotic bacteria with alginate- starch and evaluation of survival in simulated gastro-intestinal conditions and in yoghurt", Int. Food Microbiol, 62, pp. 47-55. 37. Latha Sabikhi, Dabu R., D.K. Thompkinson, Suman Kapila (2008), "Resistance of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus LA1 to Processing Treatments and Simulated Gut Conditions", Food Bioprocess Technol, 3, pp. 586-593. 38. Laurent Verschuere, Geert Rombaut, Parich Sorgeloos, Willy Verstraete (2000), "Probiotic bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture", Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(4), pp. 655-671. 39. Lim Chi Minh, Raha Abd Rahim, Ho Yin Wan, Arbakariya B. Ariff (2009), "Formulation of Protective Agents for Improvement of Lactobacillus salivarius I 24 Survival Rate Subjected to Freeze Drying for Production of Live Cells in Powderized Form", Food Bioprocess Technol, 2, pp. 431-436. 40. Martin M.J., Lara-Villoslada F., Ruiz M.A., Morales M.E. (2013), "Effect of unmodified starch on viability of alginate-encapsulated Lactobacillus fermentum CECT5716", Food Science and Technology, 53, pp. 480-486. 41. Morgan C., Vesey G. (2009), Freeze-Drying of Microorganisms, Elsevier, Australia, pp. 162-173. 42. Murtaza G., et al. (2011), "Alginat microparticles for biodelivery: a review", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5(25), pp. 2726-2737. 43. Nussinovitch A., Zvitov-Marabi R. (2008), "Unique shape, surface and porosity of dried electrified alginate gels", Food Hydrocolloids, 22, pp. 364- 372. 44. Olivas G.I., Barbosa-Canovas G.V. (2008), "Alginate–calcium films: Water vapor permeability and mechanical properties as affected by plasticizer and relative humidity", Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 41, pp. 359– 366. 45. Patil J.S., et al. (2010), "Ionotropic gelation and polyelectrolyte complexation: the novel techniques to design hydrogel particulate sustained, modulated drug delivery system: a review", Digest Journal of Nanomaterial and Biostructures, 5(1), pp. 241-248. 46. Pramod Kumar Singh, Parneet Kaur Deol, Indu Pal Kaur (2011), "Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginat beads for the effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer", Food Funct, 3, pp. 83-90. 47. Rassis D.K., Saguy I.S., Nussinovitch A. (2002), "Collapse, shrinkage and structural changes in dried alginate gels containing fillers", Food Hydrocolloids, 16, pp. 139-151. 48. Rastello De Boisseson, et al. (2004), "Physical alginate hydrogels based on hydrophobic or dual hydrophobic/ionic interactions: Bead formation, structure, and stability", Journal of Colloid and Interface Science, 273, pp. 131-139. 49. Rhim J. (2004), "Physical and mechanical properties of water resistant sodium alginate films", Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 37, pp. 323–330. 50. Ribeiro C.C., Barrias C.C., Barbosa M.A. (2004), "Calcium phosphate– alginate microspheres as enzyme delivery matrices", Biomaterials, 25, pp. 4363–4373. 51. Robert S. Breed, Murray E.G.D., Nathan R. Smith (1957), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Baillierek Tilldall and Cox Ltd., The United States of America, pp. 541-552. 52. Savadogo Aly, Ouattara Cheik A.T., Bassole Imael H.N., Traore S. Alfred (2006), "Bacteriocins and lactic acid bacteria - a minireview", African Journal of Biotechnology, 5(9), pp. 678-683. 53. Sheu T.Y., Marshall, R.T. (1993), "Microentrapment of lactobacilli in calcium alginate gels", J. Food Sci. , 58, pp. 557-561. 54. Sriamornsak P., Thirawong N., Cheewatanakornkool K., Burapapadh W., Sae-Ngow W. (2007), "Cryo-scanning electron microscopy (cryo-SEM) as a tool for studying the ultrastructure during bead formation by ionotropic gelation of calcium pectin", International Journal of Pharmaceutics, 352, pp. 115-122. 55. Swarbrich J., et al. (2007), Encyclopedia of pharmaceutical technology, Informa Healthcare, NewYork, pp. 2315-2327. 56. Tal Y., Van Rijn J., Nussinovitch A. (1997), "Improvement of structural and mechanical properties of denitrifying alginate beads by freeze-drying", Biotechnology Progress, 13, pp. 788-793. 57. Tal Y., Van Rijn J., Nussinovitch A. (1999), "Improvement of mechanical and biological properties of freeze-dried denitrifying alginate beads by using starch as a filler and carbon source", Appl Microbiol Biotechnol, 51, pp. 773- 779. 58. Vilaichone R.K., Mahachai V., Tumwasorn S., Nunthapisud P., Kullavanijaya P. (2002), "Inhibitory effect of Lactobacillus acidophilus on Helicobacter pylori in peptic ulcer patients: in vitro study", Chotmaihet Thangphaet, 85, pp. 79-84. 59. Vivek K.B. (2013), "Use of encapsulated probiotic in dairy based foods", International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences ISSN: 2277-209X (Online), 3(1), pp. 188-199. 60. Wood B.J., Holzapfel W.H.N. (1995), The Genera of Lactic Acid Bacteria, Blackie Academic and Professional, London UK. 61. Zohar-Perez, C. Chet I., Nussinovitch A. (2004), "Irregular textural features of dried alginate-filler beads", Food Hydrocolloids, 18, pp. 249-258. PHỤ LỤC Tiêu chuẩn chất lượng dự kiến của nguyên liệu đông khô dạng hạt vi nang có kết hợp tinh bột chứa Lactobacillus acidophilus 1. YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1. Tính chất: Hạt vi nang màu trắng, hình cầu, tương đối đồng đều, đường kính khoảng 2mm. 1.2. Định tính: Chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của Lactobacillus acidophilus. 1.3. Kim loại nặng: Không quá 20 phần triệu. 1.4. Nước: Không quá 5,0%. 1.5. Định lượng: Chế phẩm phải chứa Lactobacillus acidophilus không dưới 108 cfu/g. 1.6. Độ nhiễm khuẩn: - Tổng số Enterobacteria và vi sinh vật Gram âm: không quá 500 cfu/g; - Nấm men và nấm mốc: không quá 100 cfu/g; - Không được có: E. coli, Salmonella sp., P. aeruginosa và S. aureus trong 1g. 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Tính chất: Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu. 2.2. Định tính: 2.2.1. Thuốc thử: Theo DĐVN III. 2.2.2. Cách thử: Sau khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường thạch đặc ta thu được các khuẩn lạc đặc trưng (mô tả trong mục định lượng). Lựa chọn một khuẩn lạc đặc trưng, tách biệt và cấy chuyển sang ống nghiệm chứa 5,0 ml môi trường MRS lỏng đã tiệt khuẩn và làm nguội. Ủ ống nghiệm đã được cấy giống trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ ở 37±1°C. a. Sự phát triển của vi sinh vật: Vi sinh vật phát triển tốt trong điều kiện kị khí. b. Nhuộm Gram: Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi với vật kính dầu có độ phóng đại 1.000 lần: Vi sinh vật bắt màu tím, hình que, xếp thành đôi, chuỗi ngắn hoặc đứng đơn độc (Trực khuẩn Gram dương). c. Phản ứng catalase: Li tâm 2ml hỗn dịch sinh khối thu được ở tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch, thu sinh khối. Thêm vào sinh khối khoảng 2ml dung dịch oxy già 3%, phải không thấy có bọt khí nổi lên (phản ứng catalase âm tính). d. Định danh vi sinh vật bằng kit API 50 CH: - Nguyên tắc: Mỗi vi sinh vật thuộc chi Lactobacillus có khả năng lên men carbon hydrat khác nhau. Môi trường API 50 CHL chứa chất dinh dưỡng thích hợp và chất chỉ thị tía bromocresol. Mỗi giếng của kit API 50 CH chứa một loại carbon hydrat khác nhau. Nếu vi sinh vật lên men carbon hydrat trong giếng thì sinh acid lactic và làm giảm pH môi trường, kết quả là làm đổi màu của môi trường. - Độ đục chuẩn McFarland số 2: Hút chính xác 2,0ml dung dịch bari clorid 0,048M vào bình định mức dung tích 100ml và pha loãng bằng dung dịch acid sulfuric 0,18M vừa đủ đến vạch, trộn đều. Độ hấp thụ của độ đục chuẩn số 2 khi đo ở bước sóng 625nm, cốc đo dày 1cm, sử dụng dung dịch acid sulfuric 0,18M làm mẫu trắng, phải nằm trong khoảng 0,32 - 0,40. Độ đục chuẩn chỉ dùng trong vòng 3 tháng kể từ ngày pha. - Hỗn dịch gốc: Li tâm hỗn dịch vi sinh vật nuôi cấy trong 24 giờ trong môi trường MRS lỏng như đã mô tả ở trên với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút. Loại dịch, thu sinh khối. Rửa sinh khối bằng cách thêm 5ml dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vào, đồng nhất hóa bằng máy lắc. Tiếp tục li tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch và thu sinh khối. Thêm 1ml nước cất vô trùng, phân tán đều sinh khối bằng máy lắc. - Môi trường API 50 CHL (BioMérieux, Pháp): Công thức: Polypepton 10,0g Cao nấm men 5,0g Tween 80 1,0ml Dikali hydrophosphat 2,0g Natri acetat 5,0g Diamoni citrat 2,0g Magie sulfat 0,20g Mangan sulfat 0,05g Bromocresol tía 0,17g Nước cất vừa đủ 1.000ml pH sau tiệt trùng 6,7-7,1 - Tiến hành: Nhỏ từ từ từng giọt hỗn dịch gốc ở trên vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 5ml nước cất vô trùng đến khi độ đục trong ống tương đương với độ đục chuẩn McFarland số 2 (so sánh bằng mắt thường). Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc đã cho vào ống nghiệm trên. Cho vào 10ml môi trường API 50 CHL số giọt hỗn dịch gốc gấp đôi số giọt đã cho vào ống nghiệm trên và lắc đều. Nhỏ khoảng 20µl môi trường API 50 CHL đã cấy vi sinh vật vào các giếng của kit, bắt đầu từ giếng số 0 đến giếng 49, chú ý tránh tạo bọt khí trong giếng. Sau đó nhỏ dung dịch dầu parafin vô trùng lên trên bề mặt giếng và ủ ở 37±1°C. Đọc kết quả sau 24 và 48 giờ nuôi cấy. - Cách đọc kết quả: Giếng âm tính nếu có màu tím giống giếng chứng âm tính số 0. Giếng dương tính nếu môi trường trong giếng chuyển từ màu tím sang màu vàng. Riêng giếng số 25, nếu môi trường chuyển từ tím sang đen là dương tính. Ghi kết quả vào phiếu theo dõi kết quả sau 24 giờ và 48 giờ. Nhập số liệu vào phần mềm Apiweb để định danh chính xác vi sinh vật trong chế phẩm. 2.3. Kim loại nặng: Thử theo DĐVN III – Phụ lục 7.4.7. Dùng 1,0g chế phẩm và tiến hành thử theo phương pháp 3. Dùng 2,0ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu để chuẩn bị mẫu đối chiếu. 2.4. Nước: Thử theo DĐVN III – Phụ lục 6.6. 2.5. Định lượng: 2.5.1. Thuốc thử: Theo DĐVN III. Công thức môi trường MRS lỏng: Glucose 20g Natri acetat 5g Pepton 10g K2HPO4 2g Cao thịt 10g MgSO4.7H2O 0,2g Cao nấm men 5g MnSO4.4H2O 0,05g Triamoni citrat 2g Nước máy vđ 1.000ml pH 6,8-7,0 Môi trường MRS đặc = Môi trường MRS lỏng + thạch agar (25g/1.000ml môi trường). 2.5.2. Cách thử: Phương pháp pha loãng liên tục. - Chuẩn bị: Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng. Hòa tan các thành phần tan trong nước, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp. Đậy kín bằng nút bông (bông không thấm nước). Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Lấy bình ra khỏi nồi hấp và phân phối môi trường lên các đĩa Petri đã rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô. Lớp thạch dày khoảng 2mm, bề mặt nhẵn, phẳng. Chờ thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín. Chuẩn bị các ống nghiệm sạch, mỗi ống chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% (kl/tt), đậy kín, hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37 – 40°C. - Phá hạt: Chuẩn bị bình nón chứa 100ml dung dịch Natri citrat 2% (kl/tt), hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội. Cân chính xác khoảng 1,00g hạt vi nang Ca-alginat-tinh bột cho vào bình nón trên, khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút trong khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng đến khi vi nang rã hoàn toàn, phân tán đồng nhất. - Đếm số lượng tế bào: Hút chính xác 1,00ml dịch chứa vi khuẩn cần đếm số lượng tế bào, pha loãng vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng thứ nhất, lắc đều. Sau đó lại hút chính xác 1,00ml dịch đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ hai, lắc đều. Tiếp tục pha loãng như vậy cho đến nồng độ pha loãng cuối cùng. Cấy trải lên mỗi đĩa Petri 0,5ml dịch trong các ống tại ba nồng độ pha loãng cuối cùng, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa. Ủ các đĩa trong tủ ấm 5% CO2 ở 37±1°C. Sau 48 giờ đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa Petri và lấy giá trị trung bình số khuẩn lạc của các đĩa ở cùng nồng độ pha loãng (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 30 - 300). - Tính kết quả: Số lượng VSV trong 1g nguyên liệu được tính theo công thức: = × × + × + × × Trong đó: X: số VSV có trong 1g hạt. An: số khuẩn lạc trung bình trong các đĩa petri cấy nồng độ pha loãng 10n. m: khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng (g). 2.6. Độ nhiễm khuẩn: Thử theo DĐVN III – Phụ lục 10.7. 3. ĐÓNG GÓI, GHI NHÃN VÀ BẢO QUẢN Nguyên liệu được đóng gói kín, ghi nhãn đầy đủ và bảo quản ở 4°C.