Khóa luận Sản xuất lycopene từ gấc với quy mô công nghiệp̣

ất tan, bản chất của dung môi, bản chất của mẫu nguyên liệu, kích thước mẫu, Sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình [23]. Ưu điểm: - Tiết kiệm dung môi,chỉ cần môṭ ít dung môi mà trích kiệt được mẫu. - Không tốn các thao tác lọc và châm dung môi mới như các kỹ thuật khác. - Chỉ cần cắm điện mở nước hoàn lưu là máy sẽ thực hiện quá trình trích ly. - Trích kiệt được hợp chất mong muốn. d. Phương pháp trích ly bằng dung môi hữu cơ Trích ly b ằng dung môi hữu cơ thường được sử dụng trong các ngành công nghiệp là những hổn hợp dung môi như hexan, ethanol, tetrahydrofuran, chloroform Quy trình trích ly gồm 5 g bột gấc, 120 mg CaCO3 và 35 ml hỗn h ợp dung môi ethanol/hexan ( 4/3, v/v ) có chứa 0,1% BHT được trộn lẫn với nhau và đồng hóa trong thời gian 5 phút với tốc độ 5000 vòng/phút. Hỗn hợp dung dịch được tiến hành lọc chân không qua phêũ th ủy tinh số 4,35 ml hỗn hợp dung môi ethanol/hexan ( 4/3, v/v ) có chứa 0,1% BHT lại được thêm vào phêũ, sau đó toàn bộ dung dịch sau khi lọc được chuyển vào phêũ phân tách pha dưới chứa ethanol/nước và pha trên có màu vàng sáng chứa carotenoid và hexan. Pha dưới được loại bỏ 2 lần 50 ml Nacl 10% và 3 lần nước cất được liên tục dùng để rửa giải toàn bộ trong quá trình lọc. Pha trên cuối cùng được thu hồi và Na2SO4 được cho vào để loại bỏ phần nước dư. Hỗn hợp trên tiếp tục được đưa vào máy bốc hơi chân không và 500 µl Methyl-tert-butyl-ether (MTBE)/ methanol ( 80/20 ) + 500 µl CH2Cl2 được dùng để hòa tan chất khô Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 26 sau quá trình bốc hơi. Dịch thu được chứa trong lọ màu nâu, lưu ở nhiệt độ - 20 0 C và phân tách trong vòng 48 giờ [23]. Trích ly bằng dung môi hữu cơ cho năng suất trích ly cao, đơn giản, chi phí thấp, nhưng việc làm bay hơi dung môi gây nên sự thất thoát hàm lượng carotenoid cũng như sự thay đổi tỉ lệ đồng phân hóa học tran, cisảnh hưởng đến hàm lượng và tính chất dinh dưỡng của carotenoid và đặc biệt là dư lượng dung môi hữu cơ còn sót lại trong mẩu được trích ly sau trích ly gây ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe con người. e. Phương pháp trích ly xà phòng hóa bột gấc bằng kiềm Bôṭ gấc của công ty Gac Viet được bảo quản kỹ ở ngăn mát tủ lạnh dưới 5°C, mỗi lần sử dụng lấy nhanh và đậy kín và dùng hết trong vòng 1 tháng sau khi mở nắp. Lycopene và β-carotene là các chuỗi hydrocacbon chưa no, có nhiều liên kết đôi nên rất dễ bị oxy hoá dưới các tác nhân nhiệt, các chất có khả năng oxy hoá cao và ánh sáng nên quá trình thí nghiệm cần phải thực hiện nhanh. Quy trình trích ly bôṭ lycopene từ bôṭ gấc đươc̣ thể hiêṇ trong hình 3.8 ở phụ lục. Cân 50 g bôṭ gấc vào môṭ beaker 500 ml, beaker đươc̣ đăṭ vào máy khuấy từ sau khi thêm 2,5 g KOH 2M và khuấy với tốc độ 400 vòng/phút ở 50 0 C trong 60 phút. Sau 60 phút, tạo thành hỗn hợp đồng nhất bắt đầu lọc lấy chất rắn và rửa chất rắn cho đến khi pH = 7 bằng hỗn hơp̣ dung dic̣h Ethanol : NaCl (tỉ lệ 7:3). Chất rắn thu đươc̣ đươc̣ ngâm trong dung môi diethyl ether để trích ly lycopene ra khỏi chất rắn . Sau đó đem loc̣ lấy dic̣h loc̣ và tiến hành trích ly bằng thiết bị cô quay khép kín để cho bay dung môi để ngưng tụ lại làm hòa tan lycopene trong mẫu rắn . Sau khi thu đươc̣ bôṭ lycopene thì ta thổi nitơ và để làm khô bôṭ lycopene và tiến hành đo UV -Vis trong dung môi n- hexane. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 27 1.3.2. Từ màng gấc tiến hành sấy khô và ép dầu taọ dầu để trích ly lycopene Trong trái gấc trung bình, lớp thịt màu vàng dưới vỏ chiếm 53 %, tiếp theo là hạt màu đen, màng đỏ bao quanh hạt và vỏ mỏng chiếm lần lượt 17 %, 16 % và 14 %. Thành phần chính của màng đỏ gồm khoảng 85,57 % nước, 6,92 % chất béo, 3,93 % carbohydrate, 1,95 % protein, 0,83 % sợi và 0,80 % tro [24]. Để trích ly lycopene từ gấc, chúng ta cần loại bỏ nước bằng cách các cách sấy khác nhau như dung khí, dùng vi sóng, hồng ngoại. Sau đó dầu gấc được ép từ bột gấc khô. Lycopene và carotenoid khác là các chất rắn tan trong chất hữu cơ không phân cực mà không tan trong pha nước nên được tách khỏi dầu bằng cách xà phòng hoá với ethanol và KOH. Một cách tổng quát, ngoài trích ly dầu gấc bằng dung môi hữu cơ hoặc CO2 siêu tới hạn, hai phương pháp sản xuất dầu thường được sử dụng trong công nghiệp là ép áp lực nước hoặc ép đùn với hiệu suất trung bình khoảng 70 %. Phương pháp ép cho hiệu suất cũng như giá thành hợp lý, không để lại tồn dư hoá chất so với phương pháp trích ly bằng dung môi, hoặc không phải đầu tư máy móc kỹ thuật hiện đại và đắt tiền như phương pháp CO2 siêu tới hạn. Các carotenoid cùng với dầu trong màng hạt gấc bị bao bởi các mô và chất xơ có thể được tách ra dưới áp lực lớn của máy ép. Để cải thiện hiệu suất ép dầu, màng lụa bao hạt gấc có thể được xử lý trước để các mô tế bào bị vỡ bung ra nhiều hơn và dễ giải phóng dầu, các carotenoid hơn. Nhóm tác giả Kha và cộng sự năm 2013 [41] sử dụng phương pháp sấy khô bằng vi sóng ở công suất 630 W trong 65 phút sau đó hấp trong hơi nước 20 phút để độ ẩm đạt 8 - 11 % thì hiệu suất ép dầu có thể tăng lên đến 93 %. Bảng 1.4 tổng kết một số kết quả về hiệu suất trích ly và thành phần lycopene, β-carotene thu được trong dầu gấc. Rõ ràng phương pháp trên đã làm tăng 1,73 lần lycopene và 2,55 lần β-carotene. Ngoài ra, nhóm tác giả Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 28 Mai và cộng sự năm 2013 [20] thử nghiệm sử dụng lần lượt và hỗn hợp 4 loại enzyme gồm postease, cellulose, pectinase, α-amylase, cho thấy nếu trộn vào màng gấc thêm 14,6 % enzyme tổng hợp từ cả 4 loại trên với tỉ lệ như nhau và ủ trong 127 phút ở 58 °C, với tốc độ trộn 162 vòng/phút, thì hiệu suất thu hồi dầu có thể đạt 79,5 %, hàm lượng carotenoid tổng là 5,3 mg/g. Bảng 1.4. Hiệu suất (%), thành phần (mg/100mL) của lycopene và β- carotenetrong trích ly dầu gấc Mâũ dầu Hiêụ suất Lycopene β-carotene TLTK Sấy vi sóng và hấp hơi 93 ± 1 414 ± 25 140 ± 7 [25] Enzyme 79,5 530 [26] Sấy khi ́ 68 ± 3 240 ± 29 55 ± 7 [25] Sấy lò 60 °C - 302 271 [38] Hiện nay ở Việt Nam quy trình sản xuất dầu gấc trong công nghiệp ở một số công ty thường gồm các giai đoạn chọn lọc quả gấc đạt tiêu chuẩn về độ chín, kích thước, độ an toàn thực phẩm, giai đoạn rửa trái gấc bằng nước Clo đạt chuẩn, sau đó cắt quả và lấy màng đỏ hạt gấc thủ công. Màng đỏ có thể được đồng hoá và tiệt trùng ở nhiệt độ 80-90 °C rồi làm lạnh đột ngột về nhiệt độ môi trường để không làm mất chất lượng carotenoid, sau đó ép để thu dầu. Dầu thô được trộn với nước ấm rồi tách nước khoảng 2 đến 3 lần đến khi thu được dầu sạch. Dầu được bảo quản trong túi bạc, hút chân không và thổi nitơ vào để tránh ánh sáng và không khí. Qua phân tích ưu nhươc̣ điểm của các phương pháp trích ly , trong đồ án này, chúng tôi tiến hành trích ly bôṭ lycopene từ dầu gấc bằng phương pháp xà phòng hóa với kiềm. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 29 Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất, dụng vụ và thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Hóa chất Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1. Các chất này được sử dụng làm thực nghiệm mà không qua giai đoạn tinh chế thêm. Bảng 2.1. Hóa chất Hóa chất Số lươṇg/1 TN Đơn vi ̣ Số TN Tổng số lươṇg Nhà cung cấp Dầu gấc 20 G 25 500 Gac Viet PG 12 ml 25 300 Ethanol 80 ml 25 2000 KOH 8 ml 25 200 Merck NaCl 9‰ 80 ml 25 2000 Tween 80 1 ml 25 25 Dầu gấc của công ty Gac Viet được bảo quản kỹ ở ngăn mát tủ lạnh dưới 5 °C, mỗi lần sử dụng lấy nhanh và đậy kín và dùng hết trong vòng 1 tháng sau khi mở nắp. Lycopene và β-carotene là các chuỗi hydrocacbon chưa no, có nhiều liên kết đôi nên rất dễ bị oxy hoá dưới các tác nhân nhiệt, các chất có khả năng oxy hoá cao và ánh sáng. Các hoá chất dùng cho quá trình xà phòng hoá gồm KOH của Merck, propylene glycol của Scharlau, ethanol thực phẩm 95 %, nước đã loại ion (DI) được sản xuất tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai thuộc khu Công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh, và khí nitơ (công ty TNHH Air Liquide Việt Nam) đạt tiêu chuẩn phòng sạch, muối ăn được hoà tan trong nước DI rồi lọc. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 30 Quá trình lọc rửa tinh thể carotenoid sử dụng màng lọc Whatman Nylon 0,2 μm, đường kính 47 mm. 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: - Máy khuấy từ IKA RW 20 Digital với cánh khuấy dài 35 cm nhựa Teflon để chống bị ăn mòn bởi KOH. - Cánh khuấy. - Máy hút chân không. - Bình thổi khí nitơ lỏng để làm khô mẫu. - Máy đo UV-Vis, Visco Spectrophotometer V670. - Bể điều nhiêṭ. - Bếp gia nhiêṭ. - Cân phân tích. - Giá đỡ. - beaker 250 ml. - Pipet 5, 10 ml. - Erlen 250 ml. - Bô ̣loc̣ thủy tinh, phêũ loc̣. - Giấy loc̣ 0,2 µm. - Nhiêṭ kế thủy ngân , hệ được ổn nhiệt cách thuỷ thông thường sử dụng nhiệt kế thuỷ ngân chính xác 1 °C. - Ống nhỏ giọt. - Bóp cao su. - Giấy quỳ tím. - Các chai nâu nhỏ tối màu để đựng mẫu và chai sáng màu để đo UV - Vis. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 31 2.2. Thưc̣ nghiêṃ Quy trình t rích ly lycopene từ dầu gấc bằng phương pháp xà phòng hóa đươc̣ thể hiêṇ trong hình 3.9 trong phu ̣luc̣ và được mô tả như sau. 20 g dầu gấc được rót vào một beaker phù hợp khoảng 250 ml, bên ngoài beaker được bao giấy nhôm cẩn thận để có thể truyền nhiệt được nhưng hạn chế tối đa ánh sáng lọt vào (Hình 3.3). Beaker được đặt trong bể chưng cách thủy ở nhiệt độ 50°C sau đó thêm 12 g PG và khuấy đều với tốc độ 400 vòng/phút trong 60 phút. Quá trình xà phòng hoá được tiến hành chậm ở nhiệt độ 55 °C bằng cách thêm từ từ 8 mL dung dịch KOH 12 M trong 30 phút trong khi vẫn tiếp tục khuấy với tốc độ như trên trong vòng 90 phút. Ở giai đoạn này có thể xà phòng được tạo ra làm độ nhớt tăng nhiều, do đó thỉnh thoảng cần lưu ý để hỗn hợp luôn được khuấy đều. Hình 2.1. Quá trình khuấy từ xà phòng hóa dầu gấc [ảnh chụp] Để giảm độ nhớt của hỗn hợp trước khi lọc, 120 ml ethanol được thêm vào và khuấy đều trong vòng 15 phút cho đến khi hỗn hợp trong suốt. Beaker được lấy ra và bao kín bằng bao phim và giấy nhôm rồi để trong ngăn mát tủ Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 32 lạnh ở nhiệt độ 5-10°C trong 2-3 giờ để các chất rắn lycopene và β-carotene có thể lắng dần xuống đáy. Lúc này màu của dung dịch ở trên ít đỏ hơn, và ở gần đáy có thể quan sát thấy một lớp chất rắn lắng đọng màu đỏ hồng. Khuấy thật nhẹ hỗn hợp rồi lọc toàn bộ bằng màng lọc 0,2 μm, có hỗ trợhút chân không. Chất rắn còn lại trên màng được rửa với hỗn hợp dung dịch ethanol:NaCl 0,9 % với tỉ lệ 1V:1V cho đến khi độ PH = 7 và nước rửa không còn bọt, không có màu. Hình 2.2. Quá trình lọc lycopene [ảnh chụp] Chất rắn carotenoid và giấy lọc được bảo quản bằng cách đặt trong chai nâu và sấy khô bằng dòng khí nitơ. Xác định khối lượng của tổng chất rắn thuđược (cân khối lượng giấy lọc trước và sau khi có thêm carotenoid) rồi đo phổ để xác định nồng độ lycopene và β-carotene. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 33 Hình 2.3. Hòa tan lycopen vào dung môi n-hexan đo UV-Vis [ảnh chụp] 2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng đô ̣KOH đến hiêụ suất trích ly lycopene Mục đích : Khảo sát ảnh hưởng của nồng đô ̣KOH đến hiêụ suất trích ly để tìm ra nồng đô ̣KOH tối ưu tại đó hiệu suất trích ly là cao nhất. Kế hoạch thí nghiệm: Phản ứng được thực hiện bằng phương pháp khuấy từ gia nhiệt trong điều kiện cố định nhiêṭ đô ̣phản ứng , thời gian xà phòng hóa, tốc đô ̣khuấy, và lượng dung môi PG. Cơ sở dữ kiêṇ để cố điṇh các yếu tố dưạ vào những khảo sát của các chuyên gia , chúng tôi chỉ khảo sát các thông số quanh đó và kiểm tra laị [21]. Khảo sát phản ứng lần lượt ở các nồng độ 8M, 10M, 12M, 14M, 16M và 18M. Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hàn h như trong quy trình hình 3.9 trong phu ̣luc̣ và mô tả quy trình. 2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc đô ̣khuấy đến hiệu suất trích ly lycopene Mục đích : Khảo sát ảnh hưởng của tốc đô ̣khuấy đến hiệu suất trích ly để tìm ra tốc đô ̣khuấy tối ưu tại đó hiệu suất trích ly là cao nhất. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 34 Kế hoạch thí nghiệm: Phản ứng được thực hiện bằng phương pháp khuấy từ gia nhiệt trong điều kiện cố định nhiêṭ đô ̣phản ứng , thời gian xà phòng hóa, nồng đô ̣KOH, và lượng dung môi PG. Khảo sát phản ứng lần lượt ở các thể tích KOH sử duṇg 4 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml,12 ml và 14 ml. Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hàn h như trong quy trình hình 3.9 trong phu ̣luc̣ và mô tả quy trình. 2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xà phòng hóa đến hiêụ suất trích ly lycopene Mục đích : Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xà phòng hóa đến hiêụ suất trích ly để tìm ra thời gian tối ưu tại đó hiệu suất trích ly là cao nhất. Kế hoạch thí nghiệm: Phản ứng được thực hiện bằng phương pháp khuấy từ gia nhiệt trong điều kiện cố định nhiê ̣ t đô ̣phản ứng, nồng đô ̣KOH, tốc đô ̣ khuấy, và lượng dung môi PG. Khảo sát phản ứng lần lượt ở các thời gian 30, phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút và 180 phút. Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hàn h như trong quy trì nh hình 3.9 trong phu ̣luc̣ và mô tả quy trình. 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất trích ly lycopene Mục đích : Khảo sát ảnh hưởng của nhiêṭ đô ̣phản ứng đến hiêụ suất trích ly để tìm ra nhiêṭ đô ̣tối ưu tại đó hiệu suất trích ly là cao nhất. Kế hoạch thí nghiệm: Phản ứng được thực hiện bằng phương pháp khuấy từ gia nhiệt trong điều kiện cố định thời gian xà phòng hóa, nồng đô ̣KOH , tốc đô ̣khuấy, và lượng dung môi PG. Khảo sát phản ứng lần lượt ở các nhiêṭ đô ̣40 0C, 50 0C, 60 0C, 70 0C và 80 0C. Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành như trong quy trình hình 3.9 trong phu ̣luc̣ và mô tả quy trình. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 35 2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của lươṇg dung môi PG đến hiệu suất trích ly lycopene Mục đích : Khảo sát ảnh hưởng của lươṇg dung môi PG đến hiêụ suất trích ly để tìm ra lượng dung môi PG tối ưu tại đó hiệu suất trích ly là cao nhất. Kế hoạch thí nghiệm: Phản ứng được thực hiện bằng phương pháp khuấy từ gia nhiệt trong điều kiện cố định thời gian xà phòng hóa, nồng đô ̣KOH , tốc đô ̣khuấy, và nhiệt độ phản ứng . Khảo sát phản ứng lần lượt ở các thể tích dung môi 0 ml, 6 ml, 12 ml, 18 ml và 24 ml. Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hàn h như trong quy trình hình 3.9 trong phu ̣luc̣ và mô tả quy trình. 2.3. Phương pháp phân tích sản phẩm Phương pháp xác định nồng độ với UV-Vis Mục đích: Phương pháp này nhằm xác điṇh nồng đô ̣của lycopene sau khi trích ly. Nguyên tắc:Khi chiếu môṭ chùm bức xa ̣đơn sắc có bước sóng từ 300 – 800 nm và cường đô ̣I đi qua cuvet có đưṇg mâũ lycopene se ̃xảy ra hiêṇ tươṇg hấp thu ̣phân tử. Kết quả đươc̣ thể hiêṇ bằng phổ đồ biểu diêñ sư ̣tương quan giữa cường đô ̣hấp thu theo bước sóng. Thưc̣ nghiêṃ:Phổ UV-Vis của lycopene đươc̣ đo taị Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai thuộc khu Công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh bằng thiết bi ̣ máy đo UV-Vis Visco Spectrophotometer V670. Các carotenoid được hoà tan trong n-hexane và xác định thành phần dựa trên phương pháp của tính phổ hấp thụ đồng thời của Zechmeister [30], [31]. Phổ hấp thụ vùng khả kiến của hai thành phần carotenoid chính trong màng gấc là lycopene và β-carotene chồng lên nhau một phần nhưng thứ tự vị trí Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 36 các đỉnh theo bước sóng có khác nhau. Vì tính cộng được của độ hấp thụ các chất khác nhau tại mỗi bước sóng, trong trường hợp này chúng ta thiết lập hệ phương trình liên hệ các độ hấp thụ ở hai bước sóng khác nhau để suy ra nồng độ của từng chất một cách đồng thời. Lycopene trong n-hexane có các đỉnh hấp thụ lần lượt tại 503 nm, 472 nm, và 445 nm. Còn β-carotene có hai đỉnh ở 478 nm và 452 nm. Vị trí các đỉnh phổ trong ether dầu hỏa , diethyl ether, methanol, ethanol và acetonitrile gần như trùng với các giá trị trên, trong khi đó các đỉnh dịch về phía bước sóng dài khoảng 2–6 nm trong acetone, từ 10-20 nm trong chloroform và dichloromethane, 18 – 24 nm trong toluene [31]. Nếu sử dụng đơn vị tính nồng độ là mg/l và kết hợp với giá trị các hệ số hấp thụ (đơn vịl/mg) của các chất ở các bước sóng 503 nm của lycopene và 450 nm của β-carotene, hệ phương trình độ hấp thụ tại hai bước sóng này là: 𝐴503 = 0,320𝐶𝐿𝑦𝑐 + 0,043𝐶𝑏−𝑐𝑎𝑟 , (1) 𝐴450 = 0,216𝐶𝐿𝑦𝑐 + 0,258𝐶𝑏−𝑐𝑎𝑟 . (2) Hình 2.4 thể hiện phổ hấp thụ của lycopene và β-carotene chuẩn với nồng độ 1,0 mg/l trong acetonitrile [18]. Tại bước sóng 450 nm, đỉnh của hai phổ có độ cao tương đương nhau, trong khi đó, tại bước sóng 503 nm, phổ β- carotene rất bé. Điều này phù hợp với giá trị hệ số hấp thụ trong hệ phương trình trên. Từ hệ phương trình này, giá trị nồng độ của lycopene và β-carotene có thể suy ra đồng thời [43] 𝐶𝐿𝑦𝑐 = 3.521𝐴503 − 0.587𝐴450 , (3) 𝐶𝑏−𝑐𝑎𝑟 = 4.367𝐴450 − 2.947𝐴503 . (4) Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 37 Hình 2.4. Phổ hấp thu ̣khả kiến trong acetonitrile của lycopene (liền nét), β-carotene (liền mảnh) Có nhiều phương pháp xác định thành phần của các carotenoid trong đó hai phương pháp phổ biến nhất là phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Phương pháp HPLC vừa có thể phân tách các carotenoid vừa có thể xác định được thành phần một cách chính xác.Tuy nhiên cũng chính vì thế nó khá đắt, cần các kỹ thuật phức tạp, tốn kém thời gian và dùng nhiều hoá chất khá độc hại. Với chi phí thông thường và quy trình xác định đơn giản hơn nhiều, phương pháp UV-Vis đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu cho phép thu thập các thông số nhanh và khá chính xác. Thật vậy, Fish 2012 [43] trong khảo sát các phương pháp khác nhau để xác định thành phần carotenoid đã chứng minh sự chênh lệch giữa hai phương pháp nêu trên đối với lycopene là 7,8 % và đối với β-carotene là 5,0 %. Trong đồ án này, tôi giới hạn xác định thành phần hai carotenoid chủyếu của sản phẩm dựa trên phổ UV-Vis và suy ra từ hai phương trình (3) và (4). Kết quả cũng được dùng để đánh giá hiệu suất của quá trình trích ly. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 38 2.4. Những lưu ý khi tiến hành thí nghiêṃ Lycopene dê ̃bi ̣ nhiêṭ phân hủy khi nhiêṭ đô ̣lớn hơn 60 0 C. Vì vậy , cần quan sát và điều chỉnh nhiêṭ đô ̣trong quá trình xà phòng hóa . Ethanol se ̃hòa tan môṭ phần lycopene khi ở nhiêṭ đô ̣cao , nên tránh đun ethanol và lycopene trên bếp nhiêṭ. Lycopene se ̃bi ̣ oxy hóa ngoài không k hí khi tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng, trong suốt quá trình làm thí nghiêṃ nên tránh ánh sáng bằng cách dùng giấy nhôm bao beaker chứa mâũ khi xà phòng hóa và bỏ bôṭ carotenoid vào chai nâu kín sau khi xà phòng hóa trước khi tiến hành đo UV-Vis. Để làm khô bôṭ carotenoid bằng khí nitơ , khi thổi khí vào chai chứa bôṭ carotenoid không đươc̣ để ống thổi quá sâu se ̃làm bay mất bôṭ carotenoid. Quá trình thí nghiệm cần phải thực hiện nhanh, không để dầu gấc, các sản phẩm trung gian và bột lycopene (carotenoid) bị quá nhiệt, phơi sáng, phơi khí hoặc nhiễm khuẩn. Khi tiến hành đo UV-Vis, để đo chính xác thì cần phải đo nhanh vì dung môi hexane bay hơi rất cao . Khi đo base chuẩn cần đo cả 2 cuves chứa dung môi hexane khi phổ đồ ra môṭ đường thẳng song song với truc̣ hoành là chính xác. Lưu ý, dung môi hexane rất đôc̣ nên cần thu hồi mâũ thải để xử lý sau , không đổ bừa baĩ. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 39 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả trích ly lycopene từ dầu gấc bằng phương pháp xà phòng hóa Hình lần lượt mô tả quá trình và kết quả chủ yếu của thí nghiệm. Ở hình 3.1, sau khi thiết lập thí nghiệm, phía trên beaker cũng được che ánh sáng bằng giấy nhôm chỉ để khoảng trống vừa đủ cho cánh khuấy và nhiệt kế. Trong hình 3.1. b, hỗn hợp sản phẩm của quá trình xà phòng hoá trở nên cô đặc có độ nhớt cao. Hình 4.1.c cho thấy các carotenoid lắng đọng dần ở đáy trong dung dịch sản phẩm sau khi rửa với ethanol ở nhiệt độ thấp. Bột carotenoid thu được có màu đỏ khá đậm, tan trong n-hexane nhưng không tan trong nước (hình 2.5.d). Quá trình tách bột carotenoid trong chất béo thường được tiến hành bằng phương pháp thủy phân. Vương và cộng sự năm 2006 [29] sử dụng quy trình điều chỉnh từ đề xuất của Khachik 1992 [17] trong đó carotenoid trích ly từ các nguồn thực phẩm sấy lạnh sử dụng tetrahydrofurane (THF), sau đó được thuỷ phân với KOH 10 % trong methanol 75 % trong 150 phút rồi được rửa bằng dung dịch NaCl 13 g/L và lặp lại trích ly 3 lần với hexane. Pha hexane sau đó được tách khỏi pha nước rồi sấy khô bằng nitơ. Carotenoid thu được từ phương pháp này cũng như rất nhiều phương pháp tương tự khác có độ tinh khiết cao, có thể loại bỏ được các tạp chất rắn nhưng lại sử dụng nhiều dung môi hữu cơ nên có thể tồn tại vết trong sản phẩm. Do đó quy trình này phù hợp cho các phân tích chính xác như HPLC. Nếu ứng dụng trong thực phẩm hoặc mỹ phẩm thì cần phải khảo sát và hạn chế tồn dư dung môi ở giới hạn an toàn. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 40 a. Dầu gấc ban đầu b. Hôñ hơp̣ sau xà phòng hóa c. Carotenoid lắng đoṇg d. Bôṭ carotenoid trong sau xà phòng hóa hexane và nước Hình 3.1. Quá trình tiến hành thí nghiệm xà phòng hóa dầu gấc Ausich và Sanders [37] đã tổng quát được một quy trình đơn giản an toàn để cô lập và lọc tinh thể lycopene cũng như carotenoid từ các oleoresin (gồm nhựa, sáp ong, chất béo và dầu). Ban đầu oleoresin được trộn đều với một hỗn hợp gồm PG, nước và alkali (thường là KOH), để tạo nên phản ứng xà phòng Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 41 hoá ở nhiệt độ 50-80 °C trong 30 phút. Hỗn hợp sản phẩm sau đó pha loãng với nước để giảm độ nhớt rồi lọc và rửa với nước ấm để làm sạch lycopene. Ưu điểm của quá trình trên là tính đơn giản, kinh tế và an toàn vì chỉ sử dụng thêm PG, có thể tiến hành ở quy mô công nghiệp. Mặt khác, lycopene có thể đủ tinh khiết, sử dụng được ngay trong thực phẩm. Tuy nhiên khi thực hiện rửa và lọc bằng nước như đề nghị, hỗn hợp tuy đã bớt cô đặc nhưng rất nhớt vì có mặt xà phòng và KOH dư, nên lọc khá lâu với giấy lọc 0,2 μm (giấy lọc lớn hơn không phù hợp vì các hạt lycopene khá bé, sẽ lọt qua hết). Ngoài ra, nếu sử dụng bơm chân không hỗ trợ thì nhiệt độ ở phêũ lọc và bề mặt giấy lọc giảm nhanh, tạo thành lớp sáp xà phòng ngăn cản quá trình lọc dù có thêm nhiều nước ấm. Nếu sử dụng nước nóng thì làm giảm chất lượng lycopene. So với phương pháp trích ly từ bôṭ gấc thì trích ly từ dầu gấc không dùng các dung môi độc hại , do đầu vào là dầu ép từ màng gấc , quá trình ép dầu cũng không sử dụng hóa chất độc hại gì để ép dầu và nguyên liệu thì sẵn có . Trong dầu có c hứa những acid béo no và không no , acid béo không no nhiều hơn làm cho những chất trong dung dic̣h chứa xà phòng thu đươc̣ sau khi xà phòng hóa có thể được trung hòa để thu hồi xà phòng ứng dụng trong mỹ phẩm. Gần đây nhất có nhóm tác giả Mai [21] cũng dựa trên phương pháp này để tách lycopene, trong đó hỗn hợp sản phẩm được rửa với dung dịch NaCl, rồi lần lượt với ethanol, sau đó là hỗn hợp NaCl:ethanol,và trung hoà bằng axit HCl. Tuy nhiên khi thêm nước và trung hoà bằng axit thì dung dịch cũng bị nhờn như phương pháp trên nên khó lọc. Ngoài ra, Tween 80 được sử dụng với mục đích làm tăng hiệu suất lại có thể tạo ra nhũ tương trong hệ xà phòng- nước và do đó khó tách pha lycopene rắn. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 42 Trong quy trình chúng tôi khảo sát, nồng độ KOH được điều chỉnh để hệ không quá nhớt, tốc độ quay của cánh khuấy phù hợp với khả năng của máy và độ nhớt của hệ. Mặc dù vậy, hệ quá lỏng có thể làm giảm tiếp xúc giữa KOH với dầu, và tăng khả năng tạo nhũ tương. KOH thêm vào dần dần để xà phòng hoá hết dầu gấc. Nhiệt độ và thời gian phù hợp để xà phòng hoá hoàn toàn. Nhiệt độ thấp làm chậm quá trình xà phòng hoá nhưng nếu quá cao sẽ làm giảm lượng lycopene. Ethanol có khả năng làm giảm khả năng tạo nhũ tương trong hệ xà phòng.Và vì lycopene gần như không tan trong ethanol ở nhiệt độ thấp, chúng ta có thể dùng ethanol để rửa hỗn hợp sản phẩm và làm lắng lycopene. Lượng ethanol đủ để giảm độ nhớt đến mức thuận lợi cho quá trình nhưng cũng không quá nhiều sẽ tốn thời gian lọc. Dung dịch NaCl thêm vào để rửa các tạp chất rắn còn lại trên màng lọc. Bảng 3.1. Tỉ lệ phần trăm (%) các loại axit trong màng gấc Axit Nhóm Tỉ lệ Axit Nhóm Tỉ lệ Oleic C18:1 59,50 Myristic C14:0 0,22 Palmitic C16:0 17,31 Palmitoleic C16:1 0,18 Linoleic C18:2 13,98 Eicosa-11-enoic C20:1 0,17 Stearic C18:0 7,45 Margaric C17:0 0,14 α-linoleic C18:3 0,52 Erucic C22:1 0,10 Arachidic C20:0 0,32 Lauric C12:0 0,04 Các axit béo không bão hoà là thành phần chính của axit béo trong màng gấc.Bên cạnh đó cũng có các axit bão hoà như axit palmitic, axit mysistic và axit lauric (Bảng 3.1) [36]. Quá trình xà phòng hoá được điều chỉnh từ quy trình của Ausich và Sanders năm 1999 [37] và của Mai cùng cộng sự năm 2016 [33], gồm giai đoạn khuấy đều dầu gấc trong propylene glycol (PG) ở 50°C để thuỷ phân một phần các chất béo. Hỗn hợp sau đó tác dụng từ từ với KOH để quá trình xà phòng hoá xảy ra hoàn toàn ở 55 °C. Sản phẩm được Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 43 khuấy đều với ethanol để dung dịch bớt độ nhớt và trở nên trong suốt, sau đó giữ ở nhiệt độ dưới 10°C trong khoảng 2-5 giờ để lycopene và các carotenoid rắn kết tụ dần rồi lắng xuống đáy. Sau giai đoạn lọc và rửa với ethanol và dung dịch NaCl 0,9 %, chất rắn sản phẩm được bảo quản ở nhiệt độ thấp trong chai nâu có thổi khí nitơ. Hiệu suất của quy trình suy ra từ nồng độ và khối lượng các chất trong sản phẩm so với khối lượng tương đương có trong 20 g dầu. Hiệu suất trích ly lycopene thường thấp hơn do hoạt tính oxy hoá cao của nó so với carotenoid (Bảng 3.2). Bảng 3.2. Hiệu suất của quy trình trích ly tối ưu Thành phần Khối lượng ban đầu Khối lượng trong sản phẩm Hiệu suất Lycopene 0,0394 0,0242 61,42 β-carotene 0,1201 0,0796 66,27 Tổng cộng 0,1595 0,1038 65,07 Đơn vị đo khối lượng g, hiệu suất %. Kết quả lấy trung bình 3 lần thí nghiệm. Tổng lượng chất rắn thu được 0,1166 g. Hiệu suất trích ly chất rắn là 73,11%. Độ tinh khiết đạt 89,02 %, được tính bằng tỉ lệ carotenoid tổng cộng trong chất rắn lọc được. Hiệu suất chung của quá trình là 65,07 %. Tỷ lệ lycopene và β-carotene chỉ thay đổi nhẹ so với lúc đầu chứng tỏ các điều kiện thí nghiệm ở trên giúp bảo vệ tốt lycopene cũng như các carotenoid khác [21]. Hiệu quả kinh tế của quá trình trích ly bột carotenoid từ gấc tươi sử dụng phương pháp ép đùn màng gấc rồi xà phòng hoá thường đạt khoảng 70,0 % x 65,1 % = 45,5 %. Hiệu suất này có thể tăng lên đến 60,5 % nếu sử dụng các phương pháp xử lý sơ chế màng gấc ở điều kiện phù hợp để màng gấc vỡ Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 44 bung ra hết trước khi ép, nhưng cũng phải lưu ý để đảm bảo an toàn cho các carotenoid đã giải phóng. Tỷ lệ lycopene trong sản phẩm có thể tăng lên khi sử dụng thêm một số dung môi để tái kết tinh (recystalize) và lọc lycopene (như trường hợp Mẫu A bảng phụ lục 3.9). Tuy nhiên sản phẩm có thể có một số tồn dư hợp chất hữu cơ và hiệu suất giảm đi. Do đó chúng ta không cần thiết phải thêm giai đoạn tái kết tinh vì các carotenoid khác cũng rất có ích cho cơ thể [21]. Ngoài ra trong một số nghiên cứu, một số chất có thể được thêm vào bảo vệ các carotenoid vừa được giải phóng, như chất hoạt động bề mặt NaCMC (Sodium carboxymethyl cellulose), Tween 80 [18]hoặc chất kháng oxy hoá khác như BHT (Butylated hydroxytoluene), α-tocopherol. Chúng tôi sẽ khảo sát vai trò và ảnh hưởng của những chất này trong quá trình trích ly cũng như quá trình ứng dụng vào sản phẩm cụ thể trong những nghiên cứu tiếp theo. Ngoài phương pháp trích ly từ các loại thực vật, vi khuẩn, men hoặc nấm, các carotenoid còn có thể được tổng hợp từ 2, 6, 11, 15 - tetramethyl 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 – hexadecaheptaene - 1, 16 - dial và triphenyl - (3, 7 - dimethyl - 2 ,6 - octadien - 1 - ylidene) - phosphine (US. Pat. No. 2,842,599) hoặc từ 3, 7, 11, 15 - tetramethylhexadeca - 2, 4, 6, 8, 10, 14 - hexaen - 1 - yl - triphenylphosphonium bisulfate (US. Pat. No. 4,105,855) và hiện nay rất phổ biến trong thương mại. Tuy nhiên, quá trình tổng hợp tốn thời gian, phức tạp với nhiều bước khác nhau và thiết bị hiện đại; lycopene tổng hợp lại khó hấp thu hơn so với lycopene trong tự nhiên [37]. Với ưu thế trong phân bố trái gấc - “trái cây từ trên thiên đường”, cũng như vai trò quan trọng của lycopene với hàm lượng lớn trong gấc, việc đầu tư nghiên cứu sản xuất và ứng dụng nhiều hơn các sản phẩm từ gấc tại Việt Nam hứa hẹn tiềm năng to lớn trong tương lai gần. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 45 3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiêụ suất trích ly lycopene 3.2.1 Ảnh hưởng của nồng đô ̣KOH Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến thu hồi lycopene đươc̣ thể hiêṇ trong hình 3.2 và bảng 3.3. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất trích ly lycopene Nồng đô ̣KOH (M) Hiêụ suất (%) 8 25,70 10 40,41 12 69,32 14 60,12 16 45,08 18 37,60 Đơn vị đo nồng đô ̣M, hiệu suất %. Kết quả lấy trung bình 3 lần thí nghiệm. Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất trích ly lycopene Kết quả hình 3.2 cho thấy, khi nồng đô ̣KOH tăng từ 8M đến 12M thì hiêụ suất thu hồi lycopene tăng và đ ạt hiệu suất cao nhất ở 12M. Sau đó, tiếp tục tăng nồng độ thì hiệu suất thu hồi giảm dần . Qua kết quả cho thấy , nồng 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 5 10 15 20 H iệ u s u ất ( % ) Nồng độ KOH (M) Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 46 đô ̣KOH có ảnh hưởng đáng kể đến hiêụ suất thu hồi lycopene . Thí nghiệm đưa ra 6 căp̣ thông số để so sánh mức đô ̣ảnh hưởng của nồng đô ̣KOH đến hiêụ suất trích ly lycopene có sư ̣khác nhau đáng ở mỗi căp̣ thông số , điều này có thể giải thích được bởi thời gian xà phòng hóa kéo dài khi tăng nồng độ xảy ra hiện tượng đóng rắn , gây khó khăn trong viêc̣ t ách carotenoid . Lấy nồng đô ̣KOH 12M cho các thí nghiêṃ tiếp theo. 3.2.2 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đươc̣ thể hiêṇ trong hình 3.3 và bảng 3.4. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hiệu suất trích ly lycopene Tốc đô ̣khuấy (vòng/phút) Hiêụ suất (%) 200 41,85 300 54,79 400 65,07 500 65,58 600 65,01 700 64,03 Đơn vị đo tốc đô ̣khuấy vòng /phút, hiệu suất %. Kết quả lấy trung bình 3 lần thí nghiệm. Hình 3.3. Ảnh hưởng của tốc đô ̣khuấy đến hiêụ suất trích ly lycopene 0 10 20 30 40 50 60 70 0 100 200 300 400 500 600 700 800 H iệ u s u ất ( % ) Tốc độ khuấy (vòng/phút) Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 47 Kết quả hình 3.3 và bảng 3.4 cho thấy hiêụ suất thu hồi lycopene tăng và đaṭ hiêụ suất cao nhất ở 500 vòng/phút. Khi tăng tốc đô ̣khuấy thì hiêụ suất thu hồi có xu hướng giảm nhe ̣ . Kết quả cho thấy tốc đô ̣khuấy cũng có ảnh hưởng đáng kể đến hiêụ suất thu hồi lycope ne. Tuy nhiên, hiêụ suất thu hồi giữa tốc đô ̣khuấy 500 rpm, 600 rpm và 700 rpm laị không đáng kể . Tốc đô ̣ khuấy cao làm tăng khả năng tiếp x úc giữa các chất , do đó , phản ứng xà phòng hóa cho hiệu suất thu hồi cao hơn . Lấy tốc đô ̣khuấy 500 vòng/phút cho các thí nghiêṃ tiếp theo. 3.2.3 Thời gian xà phòng hóa Kết quả ảnh hưởng của thời gian xà phòng hóa đươc̣ thể hiện trong hình 3.4 và bảng 3.5. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian xà phòng hóa đến hiệu suất trích ly lycopene Thời gian xà phòng hóa (Phút) Hiêụ suất (%) 30 38,03 60 59,27 90 65,07 120 57,43 150 55,97 180 52,10 Đơn vị đo thời gian phút , hiệu suất %. Kết quả lấy trung bình 3 lần thí nghiệm. Kết quả cho thấy rằng thời gian phản ứng có ảnh hưởng đáng kể trong viêc̣ thu hồi hiêụ suất lycopene . Hiêụ suất đaṭ cao nhất ở 90 phút. Thí nghiệm cho thấy sư ̣khác biêṭ đáng kể giữa các thời gian từ 30 phút đến 90 phút nhưng hiêụ suất thu hồi với 120 phút và 150 phút là không đáng kể . Trong phản ứng xà phòng hóa , khi tăng thời gian phản ứng , các chất sẽ có đủ thời gian để pha trôṇ và phản ứng với nhau . Phản ứng xà phòng hóa có thể xảy ra Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 48 hoàn toàn và làm giảm các acid béo có trong dầu. Lấy thời gian xà phòng hóa 90 phút cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian xà phòng hóa đến hiệu suất trích ly lycopene 3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất của phản ứng hóa học là nhiệt độ.Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất thu hồi đươc̣ thể hiêṇ trong hình 3.5 và bảng 3.6. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất trích ly lycopene Nhiêṭ đô ̣phản ứng (0C) Hiêụ suất (%) 30 15,72 40 22,38 50 51,65 60 68,20 70 58,70 80 12,50 Đơn vị đo nhiêṭ đô ̣ 0 C, hiệu suất %. Kết quả lấy trung bình 3 lần thí nghiệm. 0 10 20 30 40 50 60 70 0 50 100 150 200 H iệ u s u ất ( % ) Thời gian xà phòng hóa (Phút) Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 49 Kết quả cho thấy hiêụ suất tăng từ 40 0C đến 60 0C, hiêụ suất tăng nhanh, đaṭ cao nhất ở 60 0C và hiệu suất thu hồi khác nhau đáng kể so với các nhiệt đô ̣khác . Khi nhiêṭ đô ̣tăng đến 70 0C và 80 0C thì hiệu suất thu hồi giảm . Trong phản ứng xà phòng hóa , nhiêṭ đô ̣cao rất cần thiết cho phản ứng , nhiêṭ đô ̣cao hơn thì phản ứng xảy ra nhanh hơn , loại bỏ dễ dàng hơn các acid béo có trong dầu làm tăng nồng độ lycopene thu đươc̣. Tuy nhiên, khi nhiêṭ đô ̣ quá cao, nó sẽ phân hủy các carotenoid , làm giảm hiệu suất thu hồi lycopene . Vì vậy , khi tăng nhiêṭ đô ̣cao phải bổ sung thêm môṭ lươṇg nhỏ chất chống oxy hóa vì nó có thể làm giảm tác đôṇg nhi ệt và làm tăng hiệu suất thu hồi lycopene. Lấy nhiêṭ đô ̣phản ứng 60 0C cho các thí nghiêṃ tiếp theo. Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất trích ly lycopene 3.2.5 Ảnh hưởng của lươṇg dung môi PG Ảnh hưởng của lươṇg dung môi đươc̣ thể hiêṇ tro ng hình 3.6 và bảng 3.7. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 20 40 60 80 100 H iệ u s u ất ( % ) Nhiệt độ phản ứng (0C) Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 50 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của lượng dung môi PG đến hiệu suất trích ly lycopene Lươṇg dung môi PG (ml) Hiêụ suất (%) 0 21,60 6 29,12 12 65,80 18 61,10 24 60,70 30 59,90 Đơn vị đo thể tích ml , hiệu suất %. Kết quả lấy trung bình 3 lần thí nghiệm. Kết quả cho thấy hiêụ suất tăng thu hồi tăng và đaṭ cao nhất ở 12 ml. tăng lươṇg PG từ 14 ml đến 24 ml thì hiêụ suất thay đổi không đáng kể . Thí nghiêṃ cho thấy hiêụ suất không có sư ̣khác biêṭ đáng kể giữa 12 ml, 18 ml và 24 ml. Vì vậy, để giảm chi phí, 12 ml PG đươc̣ sử duṇg cho các thí nghiêṃ và khi lượng PG sử dụng làm hiệu suất đạt tối đa thì thêm lượng PG cũng không có nhiều tác dụng. Lấy lươṇg dung môi 12 ml cho các thí nghiêṃ tiếp theo. Hình 3.6. Ảnh hưởng của lượng dung môi PG đến hiệu suất trích ly lycopene 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 5 10 15 20 25 30 H iệ u s u ất ( % ) Dung môi PG (ml) Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 51 Bảng 3.8. Khảo sát hiệu suất quy trình theo thông số thí nghiệm Thông số 1 2 3 4 Khối lươṇg KOH 12M (g) 0 4 8 12 0 29,15 65,07 65,21 Thời gian xà phòng hoá (Phút) 60 90 120 150 59,27 65,07 57,43 55,97 Tốc độ quay (Vòng/phút) 200 300 400 500 41,85 54,79 65,07 65,58 Thời gian lắng (Giờ) 0 1 2 3 32,43 51,38 65,07 66,19 Đơn vị đo khối lượng g, hiệu suất %. Kết quả lấy trung bình 3 lần thí nghiệm. Bảng 3.8 tổng hợp kết quả khảo sát hiệu suất của quá trình trích ly theo các thông số thí nghiệm chứng minh sự phù hợp của những giải thích trên. Các thông số như tốc độ khuấy, thời gian lắng, và lượng KOH khi tăng so với mức chuẩn 3 (tối ưu) sẽ làm tăng hiệu suất nhưng không đáng kể. Tốc độ khuấy cũng không thể tăng nhiều do khả năng của máy và do độ nhớt của hệ. Lượng KOH tăng và dư sau xà phòng hoá quá nhiều là không cần thiết, vừa tốn kém hoá chất, vừa khó rửa và lọc. Thời gian lắng có thể ảnh hưởng đến khả năng nâng công suất của quá trình này trong công nghiệp. 3.3 Phổ UV của lycopene Từ phổ UV-Vis, hàm lượng của các carotenoid được suy ra từ các phương trình trên. Phương pháp xác định đồng thời nồng độ carotene và lycopene cho giá trị chính xác hơn phương pháp chỉ dùng riêng rẽ giá trị đỉnh hấp thụ của lycopene (473 nm) và của carotenoid (450 nm) vì phổ của hai chất này chồng chập nhau ở hai bước sóng trên [39]. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 52 Hình 3.7. Phổ UV-Vis trong n-hexane của các mâũ bôṭ carotenoid thu đươc̣ với tỉ lê ̣lycopene:β-carotene khác nhau Hình 3.7. thể hiện phổ UV - Vis của 3 mẫu bột carotenoid khác nhau, đưa ra 3 mâũ để so sánh dưạ trên phổ đồ , trong đó Mẫu C (mâũ dưạ trên khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trên chọn ra các thông số tối ưu nhất để thực hiện mâũ, là một trong 3 sản phẩm thu được bởi quy trình xà phòng hoá tối ưu. Mẫu A (là mẫu chuẩn [21]) có nồng độ lycopene cao và ta có thể quan sát rõ 3 đỉnh đặc trưng của lycopene phù hợp với kết quả của các tác giả khác [39], [23]. Ở Mẫu B (mâũ thử nghiệm thời gian lọc và sấy lâu trong hơn không khí) đỉnh ở vị trí thứ 4 không còn (Bảng 3.9 trong phu ̣luc̣ ) mà đỉnh đặc trưng ở 450 nm trở nên trội hơn. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Trích ly được bột lycopene bằng phương pháp xà phòng hóa với kiềm sử duṇg propylene glycol. 2. Đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng (nồng đô ,̣ tốc đô ̣khuấy , nhiệt độ, thời gian và lượng dung môi ) đến hiêụ suất trích ly lycopene . Các kết quả thu được cho thấy phản ứng đạt hiệu suất tối ưu khi thực hiện ở điều kiện KOH 12 M, khuấy với tốc đô ̣ 500 vòng/phút, ở 55 0C trong 90 phút với hiệu suất 61,42%. 3. Quy trình trích ly carotenoid mà chủ yếu là lycopene từ dầu gấc bằng phương pháp xà phòng hoá chỉ dùng KOH và PG là một phương pháp khả thi, an toàn và ít tốn kém. Sản phẩm có thể sẵn sàng sử dụng ngay trong thực phẩm hoặc mỹ phẩm.Tuy nhiên khi áp dụng quy trình này vào sản xuất công nghiệp, các thiết bị và quá trình lọc cần điều chỉnh phù hợp để có thể đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, chúng tôi có một số kiến nghị như sau: 1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và trích ly bột lycopene từ bột gấc bằng các phương pháp khác nhau như sử duṇg dung môi hữu cơ hay Soxhlet, đăc̣ biêṭ là phương pháp CO 2 siêu tới haṇ để tăng hiệu suất thu hồi lycopene và rút ngắn thời gian phản ứng. 2. Từ bôṭ lycopene đa ̃đươc̣ trích ly, tiến hành làm Nano lycopene để ứng dụng rộng rãi và chất lượng lycopene, nâng giá thành sản phẩm. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Trần Đức Ba (2000). Lạnh đông rau quả xuất khẩu , NXB Nông Nghiêp̣ , Tp. HCM. [2]. Nguyêñ Hứa Đảng (2000). Cây thuốc nam – phòng và chữa bệnh , NXBVăn hóa dân tôc̣, Tp. HCM. [3]. Đinh Ngoc̣ Lâm (1989). Cây gấc, NXB Nông Nghiêp̣ Hà Nôị, Hà Nội. [4]. Phan Thanh Sơn Nam (2008). Hóa học xanh trong tổng hợp hữu cơ, NXB ĐHQG Hà Nôị, Hà Nội. [5]. Nguyêñ Thi ̣ Kim Phuṇg (2007). Phương pháp cô lâp̣ hơp̣ chất hữu cơ , NXB ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh, Tp. HCM. [6]. Lê Đức Trần (1998). Cây thuốc Viêṭ Nam , NXB KH & KT Hà Nôị , Hà Nôị. [7]. Auisakchaiyoung, T. and *Rojanakorn, (2015). Effect of foam-mat drying conditions on quality of dried Gac fruit (Momordica cochinchinensis ) aril, InternationalFood Research Journal, 2027- 2029. [8]. A.V. Rao, L.G. Rao, (2007). Carotenoids and human health,Pharmacol. Res., 55, 3, 207–216. [9]. Bailey, (2015). Lycopene extraction properties and usage, Food science and technology, 4, 13-20. [10]. Barberan, (2012). Improving the health-promoting properties of fruit and vegetable products, Woodhead publishing in foood science, technology and nutrition, 5, 7, 21-29. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 55 [11]. B.K. Ishidaet al., (2004). Fatty Acid and Carotenoid Composition of Gac (Momordica cochinchinensis Spreng) Fruit,J. Agric. Food Chem., 52, 2, 274– 279. [12]. Bott, K.a., (1993). Extraction of Natural products using near critical solvents, Chapman & Hall, London, UK. [13]. C. Rosatiet al., (2000).Metabolic engineering of beta-carotene and lycopene content in tomato fruit, Plant J., 24, 3, 413–419. [14]. Ciriminna, (2016). Lycopene: Emerging production methods and applications of a valued carotenoid, Chemistry and Engineering, 2-7. [15]. D. Cvetkovic D. Markovic, (2008). Stability of carotenoids toward UV- irradiation in hexane solution, J.Serbian Chem. Soc., 73, 1, 15-27. [16]. Enriquez, (2013). Carotenoids extraction and quantification, RSC Publishing, 3-8. [17]. F. Khachiket al.,(1992). Carotenoids Part A: Chemistry, Separation, Quantitation and Antioxidation, Elsevier, 213. [18]. F.A. De Sousaet al., (2014). Influence of ripening stages of tomatoes in the analysis of pesticides by gas chromatography,J. Braz. Chem. Soc.,25, 8,1431–1438. [19]. H. Aokiet al., (2002). Carotenoid Pigments in GAC Fruit (Momordica cochinchinensis SPRENG),Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 11, 2479–2482. [20]. H.C. Mai et al., (2013). Optimization of enzyme-aided extraction of oil rich in carotenoids from gac fruit (Momordica cochinchinensis Spreng.),Food Technol. Biotechnol., 51, 4, 488–499. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 56 [21]. H.C. Mai, V. Truong, F. Debaste, (2016). Carotenoids purification from gac (Momordica cochinchinensis Spreng) fruit oil,J. Food Eng., 172, 2–8. [22]. Helgason, (2009). Beta Carotene encapsulated within solid lipid nanoparticles, Food chem, 1-7. [23]. I.M. Soroka et al., (2012). Spectroscopy analysis for simultaneous determination of lycopene and b-carotene in fungal biomass of blakeslea trispora,Acta Biochim. Pol., 9, 1, 65–69. [24]. J.R. Bailey, (2012). Lycopene-Food sources, potential role in human health and antioxidant effects, Food scien., New York: Nova Science. [25]. Kaur, (2008). Effect of extraction conditions on lycopene extractions from tomato processing waste skin using response surface methodology, [26]. Lilwani, (2015). Extraction and isolation of lycopene form various natural sources, IOSR Journal of Biotechnology and Biochemistry, 1-3. [27]. Liana Maria Alda, (2012). Lycopene content of tomatoes and tomato products, Journal of Agroalimentary Processes and Technologies, 2, 3. [28]. L.T. Vuong, J.C. King, (2003). A method of preserving and testing the acceptability of gac fruit oil, a good source of b-carotene and essential fatty acids,Food Nutr. Bull., 24, 2, 24–230. [29]. L.T. Vuonget al., (2006). Momordica cochinchinensis Spreng.(gac) fruit carotenoids reevaluated, J. FoodCompos. Anal., 19, 6–7, 664–668. [30]. L. Zechmeister, A. Polgár, (1943). Cis-trans Isomerization and Spectral Characteristics of Carotenoids and Some Related Compounds, J. Am. Chem. Soc., 65, 8, 1522–1528. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 57 [31]. L. Zechmeisteret al.,(1943). Spectral Characteristics and Configuration of Some Stereoisomeric Carotenoids Including Prolycopene and Pro-γ- carotene,J. Am. Chem. Soc., 65, 10, 1940–1951. [32]. M. Kristensonet al, (1997).Antioxidant state and mortality from coronary heart disease in lithuanian and swedish men: concomitant cross sectional study of men aged 50, BMJ, 314, 7081. [33]. P. Lvetal., (2015). Changes in carotenoid profiles and in the expression pattern of the genes in carotenoid metabolisms during fruit development and ripening in four watermelon cultivars,Food Chem., 174, 52–59. [34]. P.M. Choksi, V.Y. Joshi, (2007). A Review on Lycopene – Extraction, Purification, Stability and Applications,Int. J. Food Prop., 10, 2, 289–298. [35]. P. Singhet al., (2012). Lycopene antioxidant activity in cosmetics meadow, Inter. Research J ofPha., 3, 1,46–47. [36]. Rizvi, S.S.H., (1994). Supecritical fluid Processing of food and biomaterial,. Chapman & Hall, London, UK. [37]. R.L. Ausich, D.J. Sanders, (1999). Process for the isolation and purification of lycopene crystals,US. Pat.5858700. [38]. R. Filipcikovaet al., (2015). Lycopene improves the distorted ratio between AA/DHA in the seminal plasma of infertile males and increases the likelihood of successful pregnancy,Biomed. Pap., 159, 1, 77–82. [39]. S.Machmudah, M. Goto, (2013). Methods for extraction and analysis of carotenoids, Nature, 188. [40]. Saima haroon, (2014). Extraction of Lycopene from Tomato Paste and its Immobilization for Controlled Release, Food Chem, 3, 13, 20-35, 50-107. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 58 [41]. T.C. Kha et al., (2013). Effects of Gac aril microwave processing conditions on oil extraction efficiency, and β-carotene and lycopene contents, J. Food Eng., 117, 4, 486–491. [42]. W. Angkananon, V. Anantawat, (2015). Effects of Spray Drying Conditions on Characteristics, Nutritional Value and Antioxidant Activity of Gac Fruit Aril Powder, Rev. Integr. Bus. Econ. Res., 4. [43]. W.W. Fish, (2012). Refinements of the attending equations for several spectral methods that provide improved quantification of beta-carotene and/or lycopene in selected foods,Postharvest Biol. Technol.,66. [44]. Waikato, (2014). Extraction lycopene from tomato waste, Food Chem, 13, 25-67, 89-107. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 59 PHỤ LỤC 50 g bôṭ gấc Hỗn hơp̣ A Khuấy từ ở 500C trong 60 phút, 400 rpm Thêm 2.5g KOH Chất rắn B Lọc lấy chất rắn và rửa cho đến pH=7 Rửa với 3V Ethanol và 1V Ethanol:NaCl tỷ lệ (7:3) Hỗn hơp̣ C Ngâm vào dung môi Diethyl ether Dung dic̣h D Lọc lấy dịch Lycopene Cô quay với hệ khép kín Thổi N2 lỏng làm khô bột Đo UV-Vis Hình 3.8. Quy trình trích ly lycopene từ bôṭ gấc Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 60 20 g dầu gấc Dung dic̣h A Khuấy từ 60 phút ở 500C, 400 rpm Dung dic̣h B Khuấy từ 90 phút ở 550C, 400 rpm 8ml KOH 12M Dung dic̣h C Khuấy từ đến trong dung dịch, 400 rpm 4M Ethanol Chất rắn D Lọc với giấy lọc 0.2µm, rửa cho đến pH=7 Thổi N2 lỏng làm khô Rửa với 1V hỗn hợp Ethanol:NaCl tỷ lệ (1:1) Bột Lycopene Đo UV-Vis Thêm 5ml n-Hexane Hình 3.9. Quy trình trích ly lycopene từ dầu gấc Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng 61 Bảng 3.9. Đỉnh phổ hấp thụ và thành phần lycopene, carotene trong các mẫu ở hình 3.7. Mẫu Vị trí 1 Vị trí 2 Vị trí 3 Vị trí 4 A_450 A_503 C_lyc C_bcar C_bcar +C_lyc C_bcar /C_lyc A 422* 445 471 502 0,487 0,566 1,706 0,457 2,164 0,268 B 424* 450 475 - 0,853 0,254 0,392 2,979 3,371 7,593 C 423* 449 472 503* 0,722 0,340 0,773 2,151 2,924 2,782 *: Sounder – vị trí vai, Đơn vị đo nồng độ mg/l, bước sóng nm.