Khóa luận Tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh trong nọc rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah)

øo con moài [3, 22]. Moät soá phun noïc vaøo maét gaây ñau vaø muø maét. Tuy nhieân, caùch toát nhaát laø ñöa tröïc tieáp vaøo cô theå con moài baèng cuù moå, muïc ñích laøm baát tænh con moài. Raén Hoå mang chuùa thuoäc nhoùm nhôõn kính (Elapidae). Coù hôn 270 loaøi raén thuoäc nhoùm naøy. Noïc raén Hoå mang chuùa coù nhieàu thaønh phaàn coù vaø khoâng coù ñoäc löïc [12, 19]. Ñoäc löïc maïnh nhaát do thaønh phaàn ñoäc toá thaàn kinh alpha ñaûm nhieäm Hình 6: Phaân töû ñoäc toá thaàn kinh alpha [22]. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 14 chieám khoaûng 30% protein trong noïc toaøn phaàn. Ñoäc toá naøy ñöôïc phaân boá theo ñöôøng tuaàn hoaøn con moài ñeå taùc ñoäng vaøo teá baøo ñích (teá baøo cô). Phaân töû ñoäc toá thaàn kinh alpha (hình 6) coù phaân töû löôïng 7000-8000D, chuùng keát hôïp ñaëc hieäu vôùi phaân töû thuï quan haäu khôùp thaàn kinh-cô. AÙi löïc cuûa phaân töû ñoäc toá thaàn kinh alpha vôùi thuï quan raát cao so vôùi chaát daãn truyeàn thaàn kinh Acetylcholine (ACh) ( haèng soá phaân ly cuûa ñoäc toá laø 10-9-10-10M trong khi haèng soá phaân ly cuûa Acetylcholine laø 10-6M) [17]. Ngöôøi ta ñaõ xaùc ñònh raèng chæ caàn moät phaàn ba vò trí thuï quan treân cô hoaønh bò khoùa bôûi ñoäc toá thaàn kinh naøy seõ gaây lieät thôû [22]. Vôùi noïc raén Hoå mang chuùa, quaù trình naøy xaûy ra khoaûng 30 phuùt sau khi bò caén. Tieáp ñoù, oxy khoâng ñöôïc ñöa ñuû vaøo phoåi neân gaây nhieàu haäu quaû beänh lyù daãn ñeán töû vong. Caùch choáng ñoäc ñaëc hieäu duy nhaát hieän nay laø söû duïng ngay khaùng huyeát thanh khaùng noïc caøng sôùm caøng toát sau khi bò caén. Trong tröôøng hôïp khaùng huyeát thanh khaùng noïc khoâng ñöôïc chuaån bò saün thì maïng soáng seõ phaûi ñöôïc giöõ baèng maùy hoâ haáp nhaân taïo cho tôùi khi cô hoaønh hoaït ñoäng laïi bình thöôøng (neáu nhö ñoä nhieãm ñoäc khoâng quaù traàm troïng). 9. Khôùp thaàn kinh-cô Chöùc naêng co cuûa cô ñöôïc ñieàu khieån baèng caùc xung ñoäng thaàn kinh. Caùc xung thaàn kinh naøy nhanh choùng lan truyeàn doïc axon cuûa teá baøo thaàn kinh baèng cô cheá ñaûo cöïc ñieän theá cuïc boä ôû maøng daãn truyeàn ñeán caùc teá baøo ñích (teá baøo cô) ñeå thöïc hieän chöùc naêng nhö co thaét cô hay baøi tieát… [10]. Kieåu lieân laïc noäi baøo naøy xaûy ra theo hai cô cheá: cô cheá ñieän hoaëc/vaø cô cheá hoùa hoïc ngang qua khôùp (synapse) giöõa teá baøo thaàn kinh (teá baøo tieàn khôùp) vaø teá baøo cô (teá baøo haäu khôùp). Cô cheá ñieän xaûy ra do söï tieáp xuùc tröïc tieáp töø teá baøo naøy vôùi teá baøo noái tieáp nhôø vaøo caùc oáng daãn ion cho pheùp ñieän theá hoaït ñoäng ñöôïc daãn truyeàn lieân tuïc töø teá baøo naøy ñeán teá baøo kia. Tuy nhieân, cô cheá daãn truyeàn hoùa hoïc thoâng duïng hôn, söï daãn Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 15 truyeàn coù ñöôïc nhôø vaøo caùc chaát daãn truyeàn thaàn kinh (neurotransmiter) ñöôïc phoùng thích ôû maøng teá baøo tieàn khôùp. Caùc chaát hoùa hoïc naøy sau ñoù khueách taùn tôùi caùc thuï quan ñaëc hieäu gaén treân caùc teá baøo haäu khôùp laø teá baøo cô, caùc thuï quan laø Nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), taïo ra moät ñieän theá hoaït ñoäng môùi. Acetylcholine laø chaát daãn truyeàn thaàn kinh thoâng thöôøng ñöôïc bieát ñeán nhieàu nhaát. Noù ñöôïc toång hôïp trong teá baøo thaàn kinh nhôø enzyme Choline acetyl transferase nhö sau: Choline + Acetyl-CoA Acetylcholine + CoA-SH Khoaûng 103-104 phaân töû ACh ñöôïc ñoùng goùi thaønh moät tuùi goïi laø tuùi chöùa chaát daãn truyeàn thaàn kinh naèm gaàn maøng cuûa axon tieàn khôùp. Söï xuaát hieän ñieän theá hoaït ñoäng cuûa teá baøo tieàn khôùp seõ khôûi ñoäng söï gia taêng lôùn veà tính thaám cuûa maøng tieàn khôùp vôùi ion Ca2+. Doøng ion naøy ñi vaøo trong axoplasm xuoâi theo chieàu gradient hoùa hoïc. Söï hôïp nhaát tuùi chöùa chaát daãn truyeàn thaàn kinh vôùi maøng teá baøo vaø phoùng thích ACh vaøo trong khe khôùp (quaù trình xuaát baøo) ñöôïc taêng cöôøng bôûi söï gia taêng noàng ñoä Ca2+ noäi baøo (hình 7). Hình 7: Söï truyeàn tín hieäu qua khôùp thaàn kinh-cô baèng cô cheá hoùa hoïc [10]. Choline acetyl transferase Löôùi sôïi lieân keát Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 16 Haèng traêm tuùi chöùa chaát daãn truyeàn thaàn kinh ñoå ACh vaøo trong khe khôùp laøm taêng maïnh noàng ñoä ACh noäi taïi vaø ñöôïc caûm nhaän bôûi thuï quan nAChR ñònh vò treân maøng teá baøo haäu khôùp. Söï keát hôïp chaát daãn truyeàn thaàn kinh vôùi nhieàu phaân töû thuï quan seõ khôûi ñoäng moät ñieän theá hoaït ñoäng trong teá baøo haäu khôùp baèng caùch taêng tính thaám ñoái vôùi ion Na+ vaø K+. ACh sau ñoù nhanh choùng bò thuûy phaân thaønh acetate vaø choline bôûi moät enzyme trong khe khôùp laø Acetylcholinesterase. Khi ñoù, ñieän theá nghæ cuûa maøng teá baøo haäu khôùp ñöôïc khoâi phuïc laïi. Acetylcholine + nöôùc Choline + Acetate 10. Khaùng theå choáng ñoäc toá vaø giaûi ñoäc Ngöôøi môû ñaàu cho vaán ñeà taïo huyeát thanh khaùng noïc ñoäc cuûa raén ôû Vieät Nam laø A. Calmette (1894) vaø cuõng laø ngöôøi saùng laäp ra Vieän Pasteur thaønh phoá Hoà Chí Minh (Vieän Pasteur thöù hai treân theá giôùi sau Vieän Pasteur Pari, Phaùp). Nguyeân taéc cô baûn laø gaây mieãn nhieãm ñoäng vaät vôùi noïc ñoäc ñeå saûn xuaát khaùng theå ñaëc hieäu coù khaû naêng trung hoøa noïc ñoäc naøy [4]. Khaùng theå laø saûn phaåm cuûa caùc doøng teá baøo baïch huyeát B tröôûng thaønh (töông baøo) coù tính ñaëc hieäu vôùi khaùng nguyeân [2, 8, 12]. Khaùng theå goàm chuoãi naëng (H) vaø chuoãi nheï (L) gaén keát vôùi nhau baèng caùc caàu noái disulfide (hình 8). Hình 8: Caáu truùc moät phaân töû Immunoglobulin ñieån hình [26]. Acetylcholinesterase Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 17 Coù nhieàu loaïi phaân töû khaùng theå khaùc nhau do söï khaùc bieät ôû caùc chuoãi polypeptide nhö neâu trong baûng 1 sau: Baûng 1: Caùc lôùp khaùng theå vaø noàng ñoä sinh lyù cuûa chuùng trong huyeát thanh. Chuoãi naëng Chuoãi nheï Lôùp KT Noàng ñoä (g/l) µ κ, λ IgM 0,57-3,4 γ κ, λ IgG 6,2-16,5 α κ, λ IgA 0,6-3,7 δ κ, λ IgD 0,6-3,7 ε κ, λ IgE 0,0-0,41 Taïo khaùng huyeát thanh choáng nhieãm chuû yeáu laø taïo IgG coù aùi löïc cao ñoái vôùi ñoäc toá caàn trung hoøa ñoäc löïc. Tuy vaäy, phaàn Fc cuûa IgG seõ ñöôïc loaïi boû do treân nhieàu loaïi teá baøo nhö ñaïi thöïc baøo (macrophage), döôõng baøo (mast cell) coù thuï quan FcγR coù theå ñöôïc hoaït hoùa daãn ñeán tình traïng soác phaûn veä hoaëc hoaït hoùa boå theå taïo phaûn öùng Arthus [2, 8]. Vì theá, chæ F(ab’)2 tinh cheá ñöôïc söû duïng ñeå laøm khaùng huyeát thanh. Vaäy, khi nhieãm ñoäc (raén caén), trong cô theå seõ coù ñoäc toá töï do löu haønh trong maùu tuaàn hoaøn vaø dòch keõ teá baøo. Caùc phaân töû ñoäc toá töï do ñeán gaàn caùc thuï quan ñaëc hieäu vaø taïo thaønh phöùc hôïp Thuï quan-Ñoäc toá ngaên caûn söï tieáp nhaän Acetylcholine. Ñaây laø nguyeân nhaân laøm cho caùc tín hieäu thaàn kinh bò taét ngheõn daãn ñeán söï maát chöùc naêng vaän ñoäng, baøi tieát… cuûa cô quan ñích ñaùp öùng vôùi ñoøi hoûi trong hoaït ñoäng sinh lyù bình thöôøng cuûa cô theå. + Giaûi ñoäc: khi söû duïng khaùng theå laøm nhaân toá giaûi ñoäc (caùch giaûi ñoäc ñaëc hieäu duy nhaát ñöôïc bieát hieän nay), khaùng theå coù hai vai troø nhö sau: Thuï quan töï do Thuï quan-Ñoäc toá Ñoäc toá Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 18 i. Khaùng theå ngaên chaën ñoäc toá töï do baùm vaøo thuï quan n(Khaùng theå) + m(Ñoäc toá töï do) (Khaùng theå)n-(Ñoäc toá)m Phöùc hôïp (Khaùng theå)n-(Ñoäc toá)m khoâng baùm vaøo ñöôïc thuï quan do hoaëc khaùng theå gaén vaøo vò trí gaén thuï quan cuûa ñoäc toá hoaëc phöùc hôïp trôû neân quaù lôùn khoâng keát hôïp ñöôïc vôùi thuï quan. Ñaõ coù nghieân cöùu cho bieát m = 1 vaø n = 4 ñoái vôùi ñoäc toá thaàn kinh alpha. ii. Taùch phöùc hôïp Thuï quan-Ñoäc toá Trong tröôøng hôïp naøy, caùc phaân töû ñoäc toá alpha ñaõ gaén vôùi caùc thuï quan treân caùc teá baøo ñích nhöng khoâng ñoàng trò. Caùc phaân töû khaùng theå ñaëc hieäu (töø khaùng huyeát thanh) seõ gaén vaøo phaân töû ñoäc toá alpha naøy laøm bieán ñoåi caáu truùc cuûa chuùng khieán cho aùi löïc gaén thuï quan bò suy giaûm vaø maát haún. Khi ñoù, caùc thuï quan ñöôïc giaûi phoùng [3]. Thuï quan-Ñoäc toá + Khaùng theå Khaùng theå-Ñoäc toá + Thuï quan Theo cô cheá ñoù, toaøn boä ñoäc toá ñöôïc giaûi phoùng neáu löôïng khaùng theå ñöôïc tieâm vaøo ñaày ñuû cho beänh nhaân. Phöùc hôïp Khaùng theå-Ñoäc toá vaø khaùng theå thöøa tieáp ñoù ñi theo qui trình baøi tieát qua ñöôøng nieäu ra khoûi cô theå. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 19 Phaàn II Vaät lieäu & Phöông phaùp nghieân cöùu Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 20 1. Vaät lieäu 1.1. Ñoái töôïng nghieân cöùu _ Noïc raén Hoå mang chuùa (Ophiophagus hannah), Trung taâm Nuoâi troàng, Cheá bieán vaø Nghieân cöùu döôïc lieäu Quaân khu 9 cung caáp. _ Chuoät nhaét traéng 18-20g, Vieän Pasteur thaønh phoá Hoà Chí Minh cung caáp. _ Thoû 2-2,5kg, Vieän Pasteur thaønh phoá Hoà Chí Minh cung caáp. 1.2. Hoùa chaát vaø dung moâi _ Sephadex G-50 SF, Pharmacia (Thuïy Ñieån). _ Albumine huyeát thanh boø (BSA) (Sigma). _ Moïi hoùa chaát vaø ñeäm ñaït möùc phaân tích. 1.3. Nôi tieán haønh thí nghieäm Thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän taïi Phoøng Mieãn dòch hoïc, Khoa Vi sinh-Mieãn dòch, Vieän Pasteur thaønh phoá Hoà Chí Minh. 2. Phöông phaùp nghieân cöùu Ñeà taøi tieán haønh theo 3 giai ñoaïn, moãi giai ñoaïn bao goàm moät soá kyõ thuaät. Moät quaù trình töø khi tinh cheá ñoäc toá thaàn kinh alpha ñeán khi thu ñöôïc khaùng theå IgG ñaëc hieäu khaùng ñoäc toá naøy ñöôïc toùm taét baèng sô ñoà 1 nhö sau: Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 21 Noïc toaøn phaàn Tinh cheá ñoäc toá thaàn kinh baèng Saéc kyù loïc Xaùc ñònh ñoäc löïc Taïo khaùng theå khaùng ñoäc toá thaàn kinh alpha SDS-PAGE gradient 8-18%T Tinh cheá khaùng theå Ñònh tính khaùng theå Ñònh löôïng khaùng theå Trung hoøa ñoäc löïc noïc toaøn phaàn in vivo (I) (III) (II) Sô ñoà 1: Qui trình thí nghieäm taïo khaùng theå choáng ñoäc toá thaàn kinh alpha. G iai ñoaïn I G iai ñoaïn II G iai ñoaïn III Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 22 A. Giai ñoaïn I: Tinh cheá ñoäc toá thaàn kinh alpha 1. Phöông phaùp Saéc kyù loïc 1.1. Nguyeân taéc Saéc kyù loïc duøng vaät lieäu laø nhöõng vi haït gel coù khaû naêng ngaäm nöôùc raát cao. Caùc haït gel naøy laø nhöõng sôïi polymer (polyoside, polyacrylamide…) daøi, coù nhöõng caàu noái lieân keát ngang ñeå laøm giaûm bôùt ñoä meàm, chòu ñöôïc söùc eùp khi bò neùn maø khoâng bò bieán daïng, vaãn cho pheùp dung moâi löu thoâng. Treân beà maët cuõng nhö ôû phía trong cuûa haït gel, kích thöôùc cuûa caùc keõ khoâng gian troáng giöõa caùc sôïi polymer cho pheùp caùc phaân töû tan trong dung moâi coù theå thaám vaøo khoâng gian trong haït gel vaø do ñoù coù theå di chuyeån quanh co trong caáu truùc cuûa haït gel (hình 9A). Ví duï: moät lôùp moûng dung dòch maãu goàm hai loaïi phaân töû khaùc nhau ñöôïc ñaët raûi treân beà maët ñi vaøo cuûa coät gel, moät loaïi khoâng theå thaám vaøo haït gel do phaân töû quaù lôùn ñoái vôùi keõ giöõa caùc sôïi polymer vaø loaïi phaân töû kia nhoû hôn coù theå ñi qua caùc keõ giöõa löôùi sôïi polymer. Khi lôùp maãu ñaõ vaøo trong gel, dung moâi ñöôïc cho vaøo lieân tuïc ñeå di chuyeån caùc phaàn töû qua coät saéc kyù. Caùch tieán haønh treân nhaèm muïc ñích ñeå taùch hai loaïi phaân töû laãn loän luùc ban ñaàu. Phaân töû tan trong dung moâi khi gaëp pha gel seõ ñöôïc phaân phoái theo cô cheá khueách taùn giöõa pha gel tónh (khoâng di) vaø pha loûng ñoäng (di) phía ngoaøi caùc haït Hình 9: Saéc kyù loïc A B A Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 23 gel. Söï phaân phoái ñoù seõ nhanh choùng ñöôïc caân baèng giöõa hai pha (hai muõi teân treân hình 9B bieåu hieän ñieàu ñoù). Ñeå söï thaám vaøo pha gel ñöôïc hieäu quaû, caàn thöïc hieän toác ñoä di cuûa pha loûng toái öu ñeå khueách taùn cuûa caùc phaân töû ñuû ñaït caân baèng giöõa hai pha ñoäng vaø tónh. Ñoái vôùi moät coät gel, neáu toång khoái cuûa coät gel laø Vt, pha gel chæ chieám moät khoái Vg vaø ngoaøi caùc haït gel, pha loûng chieám khoái Vo. Moät phaân töû thaám ñöôïc vaøo haït gel nhöng khoâng theå phaân phoái ñöôïc vaøo toaøn boä khoái haït gel, maø chæ moät phaàn cuûa khoái haït gel, moät phaân soá cuûa khoái coù theå vaøo ñöôïc, phaân soá Kv. Do ñoù, ñoái vôùi moät phaân töû, sau khi ñaõ ñi qua coät gel, toång khoái cuûa pha gel cho pheùp phaân töû ñoù coù theå thaám vaøo laø Kv x Vg. Ñoái vôùi moät phaân töû khoâng thaám ñöôïc vaøo pha gel, qua toaøn boä quaù trình di qua coät, seõ ra khoûi coät khi moät khoái dung moâi Ve = Vo ñöôïc ñi qua coät. Trong tröôøng hôïp cuûa caùc phaân töû khoâng thaám ñöôïc, Kv = 0. Ñoái vôùi moät phaân töû thaám ñöôïc vaøo thì Ve = Vo + (Kv x Vg). Nhö vaäy: got VVV += ot oe g oe v VV VV V VVK − −=−= Nhö vöøa neâu, ñoái vôùi caùc phaân töû khoâng thaám ñöôïc vaøo pha gel, Kv = 0. Ngöôïc laïi, ñoái vôùi caùc phaân töû (raát nhoû ñoái vôùi keõ giöõa caùc sôïi polymer) thaám ñöôïc toái ña vaøo toaøn boä khoái pha gel Vg, Ve -> Vt, Kv -> 1. Ñoái vôùi caùc phaân töû thaám ñöôïc vaøo haït gel, neáu Kv caøng cao thì phaân töû ra khoûi coät ôû Ve caøng lôùn. 1.2. Tieán haønh Söû duïng vaät lieäu Sephadex G-50 SF. Quaù trình ñöôïc thöïc hieän ôû ñieàu kieän: _ Nhieät ñoä phoøng thí nghieäm: 22oC-30oC. _ Khoái gel trong coät: 27 x 5,5cm. _ Kích thöôùc haït gel: 20-50µm. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 24 Cho vaøo coät 6ml dung dòch noïc raén Ophiophagus hannah (pha trong ñeäm Amonium acetate 0,05M pH7,2) noàng ñoä laø 117mg/ml. Nhö vaäy, coù 702mg noïc khoâ trong 6ml dung dòch noïc. Ñaåy protein baèng dung dòch ñeäm Amonium acetate 0,05M pH7,2. Höùng ñoaïn 10ml/ñoaïn/40 phuùt. Ño A280 baèng maùy quang phoå ñeå xaùc ñònh noàng ñoä protein trong caùc phaân ñoaïn thu ñöôïc. 2. Kieåm tra möùc ñoä tinh cheá baèng phöông phaùp ñieän di gel polyacrylamide gradient 8-18%T coù SDS 2.1. Nguyeân taéc Kyõ thuaät ñieän di döïa treân neàn taûng caùc phaân töû mang ñieän tích (DNA, RNA, protein…) coù khaû naêng di chuyeån khi ñaët chuùng trong moät ñieän tröôøng [7]. Ngöôøi ta söû duïng gel agarose hoaëc polyacrylamide laøm moâi tröôøng ñieän di. Ñoái vôùi caùc phaân töû protein, gel polyacrylamide ñöôïc öa chuoäng hôn. Caùc thaønh phaàn tham gia taïo thaønh maïng löôùi gel polyacrylamide naøy bao goàm Acrylamide, N,N’-Methylene-bis-(acrylamide), Tetramethylenediamine (TEMED) vaø Amonium persulfate (APS). Khi tan trong nöôùc, APS taïo caùc goác töï do theo cô cheá: S2O82- 2SO4- Caùc goác töï do naøy hoaït hoùa caùc phaân töû Acrylamide vaø N, N’-Methylene- bis-(acrylamide) taïo thaønh maïng löôùi polymer lieân keát cheùo giöõa caùc phaân töû naøy. Khi ñoù, trong maïng löôùi seõ taïo neân caùc vi loã phuï thuoäc vaøo hai thoâng soá: moät laø Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 25 löôïng acrylamide toång soá söû duïng, hai laø möùc ñoä lieân keát cheùo. Nhìn chung, löôïng acrylamide toång soá caøng cao thì loã taïo neân caøng nhoû vaø neáu 5% toång acrylamide laø do bis-(acrylamide) thì loã seõ coù kích thöôùc nhoû nhaát. TEMED thöôøng ñöôïc theâm vaøo ôû noàng ñoä 0,4% ñeå xuùc taùc cho vieäc taïo gel vì vai troø laøm toàn taïi caùc goác töï do cuûa noù. Heä thoáng ñeäm giuùp duy trì pH khoâng ñoåi trong thuøng chöùa ñeäm, trong gel vaø coù vai troø nhö moät chaát ñieän phaân cho pheùp daãn doøng ñieän ngang qua ñieän tröôøng. Do vaäy, heä ñeäm phaûi hoäi ñuû 3 ñieàu kieän sau: • Khoâng töông taùc vôùi caùc ñaïi phaân töû caàn phaân tích. • pH cuûa moâi tröôøng ñieän di khoâng laøm bieán tính caùc ñaïi phaân töû. • Löïc ion vaø noàng ñoä ñeäm phaûi thích hôïp. Coù hai phöông phaùp dieän di duøng gel polyacrylamide: coù SDS vaø khoâng SDS (SDS: Sodium dodecylsulfate). SDS coù vai troø laøm bieán tính protein do SDS keát hôïp vôùi caùc vuøng kò nöôùc cuûa protein vaø taùch chuùng thaønh caùc tieåu phaàn, ñoàng thôøi laøm aâm tính hoùa caùc tieåu phaàn naøy. Ngoaøi ra, neáu caùc tieåu phaàn cuûa protein gaén vôùi nhau baèng caùc lieân keát disulfite, nhöõng lieân keát naøy bò beõ gaõy khi coù maët SDS vaø β-Mercaptoethanol hay Dithiothreitol (DTT) taïo thaønh nhoùm –SH. Nhöõng nhoùm naøy sau ñoù seõ bò khoùa bôûi taùc nhaân alkyl hoùa ñeå choáng laïi söï taùi taïo lieân keát disulfite. Haàu heát protein ñeàu tích ñieän aâm, do ñoù, khi di chuyeån trong ñieän tröôøng, protein seõ höôùng veà ñieän cöïc döông (anode). Taïi cöïc aâm (cathode) vaø cöïc döông (anode) xaûy ra quaù trình ñieän phaân nöôùc nhö sau: • Cöïc aâm: 2H2O + 2e- -> 2OH- + H2 HA + OH- A- + H2O • Cöïc döông: H2O - 2e- -> 2H+ + ½ O2 H+ + A- HA Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 26 Ñeå taêng hieäu quaû phaân taùch, ngöôøi ta ñaõ söû duïng phöông phaùp ñieän di khoâng lieân tuïc baèng caùch duøng hai heä gel goàm: • Lôùp gel taäp trung: coù vai troø laøm cho caùc ñaïi phaân töû taäp trung laïi taïi moät vaïch xuaát phaùt (beà maët tieáp xuùc giöõa hai lôùp gel laø lôùp gel taäp trung vaø lôùp gel phaân tích), noàng ñoä acrylamide thaáp, pH6,8. • Lôùp gel phaân tích: laø lôùp chính duøng ñeå phaân taùch caùc ñaïi phaân töû trong maãu, noàng ñoä acrylamide cao, pH8,8. 2.2. Tieán haønh Thí nghieäm söû duïng phöông phaùp ñieän di gel polyacrylamide vôùi gradient doác cong töø 8%T tôùi 18%T ñoái vôùi lôùp gel phaân tích vaø 4,25%T ñoái vôùi lôùp gel taäp trung. Maãu ñieän di laø noïc toaøn phaàn vaø caùc thaønh phaàn tinh cheá ñöôïc sau quaù trình Saéc kyù loïc (xem phaàn III) vôùi phaân boá theo baûng 2 nhö sau: Baûng 2: Phaân boá maãu trong xeùt nghieäm ñieän di gel polyacrylamide gradient 8-18%T coù SDS. Gieáng Maãu Khoái löôïng (µg) 1 2 3 4 5 Noïc Ñænh 1 Ñænh 2 Ñænh 3 Ñænh 4 4 4 4 4 4 6 7 8 9 10 Ñænh 4 Ñænh 3 Ñænh 2 Ñænh 1 Noïc 2 2 2 2 2 Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 27 Thöïc hieän quaù trình ñieän di vôùi cöôøng ñoä doøng ñieän I = 40mA, hieäu ñieän theá U = 80V, coâng suaát P = 30W, thôøi gian t = 3h. 3. Xaùc ñònh ñoäc löïc Nhaèm xaùc ñònh ñöôïc khaùng nguyeân muïc tieâu, moät xeùt nghieäm xaùc ñònh ñoäc löïc gaây cheát ñöôïc tieán haønh ñoái vôùi töøng thaønh phaàn trong noïc sau Saéc kyù loïc vaø so saùnh vôùi noïc toaøn phaàn. 3.1. Nguyeân taéc Ñoäc löïc ñöôïc bieåu thò baèng giaù trò LD50 (lethal dose 50%). LD50 laø lieàu toái thieåu (cuûa noïc hoaëc ñoäc toá) gaây cheát 50% soá ñoäng vaät thí nghieäm. Do ñoù, noïc hoaëc ñoäc toá caøng ñoäc thì giaù trò LD50 caøng thaáp. Ñoäng vaät duøng thöû nghieäm laø thoû hay chuoät nhaét traéng nhöng chuoät nhaét traéng thöôøng ñöôïc söû duïng nhieàu hôn. Noïc hoaëc ñoäc toá ñöa vaøo cô theå baèng ñöôøng tieâm nhö tieâm da, tieâm baép, tieâm phuùc maïc, tieâm tónh maïch hay tieâm maøng naõo. Ñöôøng tieâm khaùc nhau cho keát quaû LD50 khaùc nhau. Thoâng thöôøng, lieàu gaây cheát khi tieâm tónh maïch < tieâm naõo < tieâm döôùi da [4]. Tuy nhieân, caùch tieâm tónh maïch ñuoâi (i.v) cho keát quaû ñoàng nhaát cao vaø ñöôïc duøng trong caùc qui trình chuaån. Ñeå keát quaû thu ñöôïc coù ñoä laëp laïi cao, caùc ñieàu kieän tieán haønh thí nghieäm phaûi ñöôïc tuaân thuû chaët cheõ. Troïng löôïng vaø tuoåi chuoät phaûi ít dao ñoäng, söùc khoûe chuoät phaûi toát, khoâng mang maàm beänh, cuøng giôùi tính, cuøng moät doøng vaø khoâng mang thai. Ngoaøi ra, ñöôøng tieâm vaø caùch tieâm vaøo moãi chuoät phaûi nhö nhau, nhieät ñoä moâi tröôøng oån ñònh vaø aám trong quaù trình thöû nghieäm. Caùc loaøi ñoäng vaät khaùc nhau nhaïy caûm khaùc nhau, duø cuøng moät loaøi nhöng khaùc doøng thì söï ñaùp öùng vôùi ñoäc toá cuõng khaùc nhau. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 28 3.2. Tieán haønh a. Caùc thoâng soá kyõ thuaät • Ñoäng vaät: chuoät nhaét traéng 18g hoaøn toaøn khoûe maïnh. • Ñöôøng tieâm: tónh maïch ñuoâi (i.v). • Lieàu tieâm: 0,2ml/chuoät. • Ñôn vò tính: lieàu gaây cheát 50% ñoäng vaät thí nghieäm ñöôïc dieãn taû baèng soá µg noïc hay ñoäc toá/chuoät. • Soá chuoät moãi loâ: 3 con. b. Kyõ thuaät tieán haønh • Pha dung dòch noïc Caân 15mg noïc O.hannah (daïng tinh theå ñoâng khoâ) pha trong 3ml ñeäm PBS ñöôïc dung dòch 5mg/ml. Pha dung dòch noïc raén thöû nghieäm 0,25mg/ml baèng ñeäm PBS. Taát caû dung dòch ñeäm ñeàu ñöôïc boå sung dung dòch baûo quaûn NaN3 0,05%. • Chuaån bò dung dòch ñoäc toá Dung dòch ñoäc toá bao goàm caùc dung dòch cuûa caùc thaønh phaàn thu ñöôïc sau Saéc kyù loïc (xem phaàn III). • Gaây nhieãm Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 29 Loâ ñoái chöùng: moãi chuoät nhaän 0,2ml nöôùc muoái sinh lyù NaCl 0,9%. Caùc loâ thí nghieäm: choïn caùc noàng ñoä noïc vaø ñoäc toá khaùc nhau sao cho trong ñoù coù chöùa noàng ñoä gaây cheát 0% vaø 100% soá chuoät thí nghieäm. Ñoïc keát quaû trong 48 giôø keå töø luùc tieâm. Giaù trò LD50 ñöôïc tính theo phöông phaùp cuûa Spearman_Karber nhö sau: n R ddXLD i∑−+= 2 log 05010 Trong ñoù: X0: log10 cuûa ñoä pha loaõng taïi ñoù gaây ra 100% soá chuoät cheát. d: log10 cuûa taùc nhaân ñoä pha loaõng. Ri: soá chuoät cheát trong moãi loâ. n: soá chuoät trong moãi loâ. Thaønh phaàn noïc vaø ñoä ñoäc töông öùng coù theå thay ñoåi ôû töøng caù theå trong cuøng moät loaøi raén, thaäm chí thay ñoåi ôû nhöõng thôøi ñieåm khaùc nhau trong suoát thôøi gian soáng cuûa moät caù theå. Caùc thay ñoåi naøy coù theå do nguoàn goác ñòa lyù, cheá ñoä aên uoáng, tuoåi raén… ñaõ aûnh höôûng leân quaù trình sinh toång hôïp noïc ñoäc. Nhaèm thöïc hieän toát xeùt nghieäm naøy vaø ñeå taïo moät khaùng huyeát thanh coù khaû naêng trung hoøa ñoäc toá thaàn kinh alpha trong noïc raén Hoå mang chuùa, noïc xeùt nghieäm phaûi ñi töø hoãn hôïp noïc cuûa moät soá lôùn raén Hoå mang chuùa khaùc nhau. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 30 B. Giai ñoaïn II: Taïo khaùng theå khaùng ñoäc toá thaàn kinh alpha 1. Gaây mieãn nhieãm thoû ñeå taïo khaùng theå khaùng ñoäc toá thaàn kinh alpha 1.1. Nguyeân taéc Ñeå taïo ñöôïc khaùng theå, buoäc phaûi döïa vaøo cô theå ñoäng vaät. Khaùng nguyeân laø ñoäc toá thaàn kinh alpha tinh cheá sau quaù trình Saéc kyù loïc. Khi tieâm ñoäc toá alpha vaøo cô theå ñoäng vaät (thoû), trong cô theå seõ hình thaønh moät ñaùp öùng mieãn nhieãm (ÑÖMN) ñeå choáng laïi söï xaâm nhaäp cuûa khaùng nguyeân laï, ñoù laø ñoäc toá alpha, baèng vieäc saûn sinh ra khaùng theå ñaëc hieäu vôùi ñoäc toá naøy [2, 8, 12, 17]. Khi tieáp xuùc laàn ñaàu vôùi phaân töû ñoäc toá thaàn kinh alpha, cô theå seõ hình thaønh moät ÑÖMN goïi laø ñaùp öùng sô caáp. Caùc ñaïi thöïc baøo nhaän dieän caùc phaân töû ñoäc toá alpha, xöû lyù roài trình dieän vôùi teá baøo baïch huyeát TH, töø ñoù kích thích söï bieät hoùa cuûa teá baøo baïch huyeát B thaønh töông baøo saûn sinh khaùng theå choáng phaân töû ñoäc toá alpha vaø ñoàng thôøi cuõng taïo ñöôïc caùc teá baøo nhôù (memory cell) ñoái vôùi ñoäc toá naøy. Khaùng theå taïo ra goàm phaàn lôùn laø IgM vôùi noàng ñoä vaø aùi löïc thaáp. Tuy nhieân, ñieàu quan troïng nhaát trong ñaùp öùng sô caáp laø söï taïo thaønh caùc teá baøo nhôù, do ñoù, ÑÖMN seõ xaûy ra nhanh choùng khi cô theå tieáp xuùc laïi vôùi cuøng moät khaùng nguyeân ñoäc toá alpha ban ñaàu. Hình 10 phía döôùi trình baøy moät ÑÖMN töø khi tieáp xuùc vôùi khaùng nguyeân ñeán khi hình thaønh khaùng theå vaø teá baøo nhôù. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 31 Hình 10: Quaù trình trình dieän khaùng nguyeân trong ÑÖMN [27]. Nhö ñaõ neâu ôû treân, khi tieáp xuùc laïi vôùi ñoäc toá alpha, cô theå seõ nhanh choùng ñaùp öùng laïi vì trong cô theå ñaõ coù saün caùc teá baøo nhôù. Ñaùp öùng naøy laø ñaùp öùng thöù caáp ñöôïc ñaëc tröng bôûi söï gia taêng nhanh noàng ñoä khaùng theå, chuû yeáu laø IgG, cuøng vôùi söï taêng cöôøng mieãn nhieãm qua trung gian teá baøo. Neáu tieâm nhaéc laïi lieân tuïc nhieàu laàn thì noàng ñoä khaùng theå IgG saûn sinh caøng cao vaø aùi löïc caøng maïnh. 1.2. Tieán haønh Döïa vaøo nhöõng ñieàu neâu treân, qui trình gaây mieãn nhieãm thoû ñeå taïo khaùng theå choáng ñoäc toá thaàn kinh alpha ñöôïc tieán haønh nhö sau: Thoû gaây mieãn nhieãm phaûi hoaøn toaøn khoûe maïnh, hoaøn toaøn khoâng coù daáu hieäu beänh taät, ñöôïc nuoâi trong ñieàu kieän veä sinh toát vaø an toaøn. Gaây mieãn nhieãm baèng ñoäc toá thaàn kinh alpha cho moät thoû nhaèm thu huyeát thanh khaùng ñoäc toá thaàn kinh alpha naøy. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 32 Thoû (2kg) ñöôïc tieâm ñoäc toá thaàn kinh moãi thaùng moät laàn baèng caùch tieâm döôùi da löng thaønh töøng muõi nhoû ñeå taêng cöôøng ñaùp öùng mieãn nhieãm vaø khoâng laøm toån thöông ñeán moâ. Qui trình mieãn nhieãm tieán haønh nhö baûng 3: Baûng 3: Qui trình mieãn nhieãm thoû vôùi ñoäc toá thaàn kinh alpha. Muõi tieâm Lieàu (µg) Theå tích maùu (ml) Maãn caûm 50 1* Nhaéc laïi laàn 1 50 0 Nhaéc laïi laàn 2 50 1** Nhaéc laïi laàn 3 50 50** Nhaéc laïi laàn 4 50 50** Nhaéc laïi laàn 5 50 93** (laáy heát maùu, thoû cheát) *Tröôùc khi tieâm, **Sau khi tieâm 10 ngaøy. Tröôùc khi tieâm muõi maãn caûm ñaàu tieân, laáy 1ml maùu ñeå laøm ñoái chöùng veà söï xuaát hieän cuûa khaùng theå ñaëc hieäu vôùi ñoäc toá alpha tröôùc vaø sau khi gaây mieãn nhieãm (phöông phaùp Ouchterlony). (Söû duïng Freund’s complete adjuvant vaø vaccine ho gaø cho muõi tieâm maãn caûm ñaàu tieân, Freund’s incomplete adjuvant cho caùc muõi tieâm nhaéc laïi). 2. Tinh cheá khaùng theå baèng dung dòch Amonium sulfate baõo hoøa 2.1. Nguyeân taéc ÔÛ traïng thaùi baõo hoøa, moät soá muoái coù tính haùo nöôùc cao vì trong dung dòch baõo hoøa cuûa caùc muoái naøy, soá phaân töû nöôùc töï do haàu nhö raát haïn cheá. Khi ñoù, caùc Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 33 phaân töû protein khoâng taïo ñöôïc caùc lieân keát vôùi caùc phaân töû nöôùc nöõa neân taïo thaønh tuûa. Tuy nhieân, caùc protein khaùc nhau coù ñoä tan khaùc nhau vaø khaû naêng tuûa cuõng seõ khaùc nhau theo söï thay ñoåi cuûa noàng ñoä muoái, löïc ion, pH cuûa moâi tröôøng… Moät ví duï: khi tuûa phaân töû khaùng theå thì caàn noàng ñoä muoái Amonium sulfate 50% baõo hoøa. ÔÛ noàng ñoä muoái naøy, protein tuûa chuû yeáu laø protein khaùng theå. Neáu noàng ñoä muoái thaáp hôn thì khoâng tuûa heát khaùng theå, hoaëc neáu cao hôn thì trong tuûa thu ñöôïc seõ laãn moät vaøi loaïi protein khaùc khoâng caàn thieát, khoâng mong muoán. Do vaäy, ñaây laø moät phöông phaùp ñeå tinh cheá khaùng theå ñôn giaûn vaø hieäu quaû thöôøng ñöôïc söû duïng. Ñeå hoøa tan trôû laïi protein, caùch toát nhaát vaø ñôn giaûn nhaát laø laøm giaûm noàng ñoä muoái trong tuûa. Ñeå traùnh pha loaõng maãu, coâng vieäc coù theå ñöôïc tieán haønh baèng bao thaåm tích. Ñaây laø loaïi bao laøm baèng vaät lieäu polymer taïo neân caùc vi loã cho pheùp söï khueách taùn xaûy ra ñoái vôùi caùc phaân töû coù kích thöôùc nhoû hôn loã tan trong dung moâi. Caùc phaân töû protein coù kích thöôùc lôùn hôn loã seõ khoâng thaám ñöôïc qua maøng neân ñöôïc giöõ laïi trong bao. Noàng ñoä muoái trong bao thaåm tích giaûm daàn ñeán khi ñaït möùc caân baèng giöõa trong vaø ngoaøi maøng thaåm tích. Ngöôïc vôùi chieàu di chuyeån cuûa muoái, caùc phaân töû nöôùc seõ thaám vaøo trong bao ñeå hoøa tan trôû laïi protein. 2.2. Tieán haønh Maùu thu ñöôïc trong caùc laàn laáy ñöôïc ñeå laéng ôû 4oC nhaèm thu huyeát töông. Taùch huyeát töông baèng li taâm. Söû duïng dung dòch muoái Amonium sulfate 100% baõo hoøa ñeå tuûa protein trong huyeát töông thu ñöôïc sau li taâm. Ñeå thu ñöôïc phaàn lôùn khaùng theå trong huyeát töông, dung dòch muoái Amonium sulfate 100% baõo hoøa phaûi ñöôïc cho vaøo töø töø (khoaûng 6ml/phuùt) vaø ñaït noàng ñoä cuoái cuøng laø 50%. Li taâm thu tuûa, röûa laïi nhieàu laàn baèng dung dòch Amonium sulfate 50%. Laáy moät ít protein tuûa ñem hoøa tan trôû laïi baèng caùch söû duïng bao thaåm tích ñeå duøng trong caùc xeùt nghieäm tieáp theo. Protein tuûa vaø hoøa tan ñöôïc baûo quaûn ôû 4oC. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 34 3. Ñònh tính khaùng theå baèng phöông phaùp Ouchterlony 3.1. Nguyeân taéc Ñaây laø phöông phaùp khuyeách taùn keùp treân gel agarore thöôøng ñöôïc duøng trong caùc xeùt nghieäm mieãn dòch ñeå ñònh tính khaùng theå sau khi gaây mieãn nhieãm ñoäng vaät. Caùc dung dòch khaùng nguyeân vaø khaùng theå ñöôïc ñaët trong caùc gieáng khaùc nhau treân gel agarose vôùi moät khoaûng caùch thích hôïp ñeå chuùng coù khaû naêng gaëp nhau (döïa vaøo khaû naêng khueách taùn). Khi ñoù, caùc phaân töû khaùng nguyeân vaø khaùng theå seõ khueách taùn vaøo gel. Noàng ñoä cuûa moãi phaân töû giaûm daàn töø taâm gieáng ñeán vò trí khueách taùn xa nhaát. Taïi nôi tieáp xuùc giöõa khaùng nguyeân vaø khaùng theå seõ xaûy ra töông taùc khaùng nguyeân-khaùng theå taïo thaønh tuûa. Tuy vaäy, söï keát tuûa chæ coù ñöôïc khi coù moät tæ leä thích hôïp giöõa löôïng khaùng nguyeân vaø khaùng theå ñaëc hieäu [7, 18]. Maëc duø vaäy, tæ leä thích hôïp naøy coøn phuï thuoäc raát nhieàu vaøo tính chaát khaùng nguyeân, loaïi khaùng nguyeân, soá löôïng hoùa trò (epitope) cuûa khaùng nguyeân cuõng nhö tính chaát cuûa khaùng theå coù ñöôïc. 3.2. Tieán haønh Pha loaõng baäc hai lieân tuïc khaùng nguyeân (noïc toaøn phaàn vaø ñoäc toá thaàn kinh alpha). Xaây döïng caùc xeùt nghieäm nhö baûng 4: Baûng 4: Caùc xeùt nghieäm ñònh tính khaùng theå tröôùc vaø sau mieãn nhieãm vôùi ñoäc toá thaàn kinh alpha. Khaùng theå Khaùng nguyeân Xeùt nghieäm Thôøi gian thu Pha loaõng baäc hai Maãu Pha loaõng baäc hai A Tröôùc mieãn 1 Ñoäc toá 1- 1/32, 1/10 - 1/320 B Sau mieãn 1 Ñoäc toá 1- 1/32, 1/10 - 1/320 C Sau mieãn 1 Noïc 1- 1/32, 1/10 - 1/320 Phaûn öùng thöïc hieän vôùi gel agarose 1%, thôøi gian phaûn öùng töø 48 ñeán 60 giôø. Phaùt hieän baèng caùch nhuoäm vôùi dung dòch Ponceau-S 0,2%. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 35 4. Ñònh löôïng khaùng theå baèng phöông phaùp quang haáp thuï A280 vaø phöông phaùp Bradford 4.1. Nguyeân taéc a. Phöông phaùp quang haáp thuï A280 Phaân töû protein haáp thuï aùnh saùng cöïc ñaïi ôû böôùc soùng 280nm, söï haáp thuï naøy coù ñöôïc chuû yeáu laø do caùc amino acid coù nhaân thôm nhö Phenylalanine, Tryptophan… Tuy nhieân, öùng vôùi moãi loaïi protein seõ coù moät heä soá taét E (extinction) töông öùng. Trong tröôøng hôïp protein laø khaùng theå IgG thì heä soá taét laø 14 1%,1 280 =cmnmE . Nhö vaäy, neáu giaù trò A280 = 1,4 thì noàng ñoä IgG = 1mg/ml. b. Phöông phaùp Bradford Ñònh löôïng protein baèng phöông phaùp Bradford trôû neân phoå bieán do ñoä nhaïy cao, reû tieàn, ít toán thôøi gian vaø chuyeân bieät ñoái vôùi protein. Ñoàng thôøi, phöông phaùp naøy ít bò aûnh höôûng bôûi caùc hoùa chaát duøng trong caùc thí nghieäm nghieân cöùu protein nhö Amonium sulfate. Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp naøy laø döïa treân söï thay ñoåi böôùc soùng haáp thuï cöïc ñaïi cuûa thuoác nhuoäm Coomassie Brilliant Blue khi taïo phöùc vôùi protein. Trong dung dòch mang tính acid, khi chöa keát noái vôùi protein thì böôùc soùng haáp thuï cöïc ñaïi laø 465nm, khi taïo phöùc vôùi protein thì böôùc soùng haáp thuï cöïc ñaïi laø 595nm. Ñeå xaùc ñònh ñöôïc protein coù trong maãu quan taâm, vieäc xaây döïng ñöôøng chuaån laø raát quan troïng. Vieäc xaây döïng ñöôøng chuaån naøy döïa treân protein chuaån ñaõ bieát tröôùc noàng ñoä, thöôøng laø Bovine plasma γ-globulin hay Bovine serum albumin. Giaù trò haáp thuï ghi nhaän ñöôïc seõ laø: Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 36 ∆OD = ODx - ODo Trong ñoù: ODx laø ñoä haáp thuï cuûa maãu protein. ODo laø ñoä haáp thuï cuûa maãu ñoái chöùng (nöôùc caát). Nhö vaäy, noàng ñoä protein trong maãu caàn khaûo saùt seõ coù ñöôïc döïa treân ñöôøng chuaån ñaõ xaây döïng. Vôùi maãu protein laø IgG, giaù trò noàng ñoä thöïc teá baèng hai laàn giaù trò coù ñöôïc töø ñöôøng chuaån. Trong tröôøng hôïp ñoä haáp thuï cuûa maãu vöôït ra khoûi giôùi haïn cuûa ñöôøng chuaån thì phaûi tieán haønh pha loaõng (vöôït giôùi haïn treân) hay coâ ñaëc (vöôït giôùi haïn döôùi) maãu. 4.2. Tieán haønh a. Phöông phaùp quang haáp thuï A280 Ño ñoä haáp thuï cuûa dung dòch khaùng theå IgG thu ñöôïc baèng maùy quang phoå ôû böôùc soùng 280nm. b. Phöông phaùp Bradford • Döïng ñöôøng chuaån Albumine huyeát thanh boø (BSA) Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh vôùi dung dòch BSA chuaån ôû caùc noàng ñoä 0, 2, 4, 8, 16, 32µg/µl. • Chuaån bò maãu protein khaùng theå Pha loaõng maãu sao cho söï quan saùt coù ñöôïc naèm trong giôùi haïn cho pheùp cuûa ñöôøng chuaån. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 37 • Xöû lyù döõ lieäu Maãu ñöôïc ñoïc baèng maùy ELISA (PR 2100). Döõ lieäu nghieäm thu ñöôïc xöû lyù baèng phaàn meàm kc4. C. Giai ñoaïn III: Kieåm tra khaû naêng choáng ñoäc cuûa khaùng theå thu ñöôïc ñoái vôùi noïc toaøn phaàn Khaû naêng trung hoøa ñoäc löïc laø laøm maát tính gaây ñoäc cuûa noïc. Caùc phaân töû khaùng theå baét laáy thaønh phaàn gaây ñoäc laø ñoäc toá thaàn kinh alpha trong noïc vaø laøm voâ hieäu hoùa chuùng (nhö ñaõ trình baøy ôû phaàn I). Do ñoù, con moài seõ ñöôïc cöùu soáng. a. Caùc thoâng soá kyõ thuaät • Ñoäng vaät: chuoät nhaét traéng 18g. • Ñöôøng tieâm: tónh maïch ñuoâi. • Lieàu tieâm: 0,2ml/chuoät. • Soá chuoät moãi loâ: 3 con. • Dung dòch noïc raén vaø dung dòch khaùng theå baûo quaûn ôû 4oC. b. Phaûn öùng trung hoøa • Chuaån bò dung dòch noïc raén Dung dòch noïc raén ñaõ pha saün coù noàng ñoä 0,61mg/ml (A280 = 0,61 vôùi 101%,1280 =cmnmE ). Laáy moät theå tích xaùc ñònh dung dòch noïc naøy töông öùng vôùi löôïng 3LD50 (xem phaàn III) ñeå thöïc hieän phaûn öùng trung hoøa. • Ñoä pha loaõng cuûa dung dòch khaùng theå khaùng ñoäc toá alpha Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 38 Choïn caùc ñoä pha loaõng baäc hai lieân tuïc cuûa dung dòch khaùng theå sao cho caùc ñoä pha loaõng chöùa hai noàng ñoä maø khaû naêng trung hoøa vaãn gaây cheát 0% vaø 100% soá chuoät thöû nghieäm. • Phaûn öùng trung hoøa giöõa khaùng theå khaùng ñoäc toá alpha vôùi noïc toaøn phaàn Phaûn öùng thöïc hieän trong beå oån nhieät 37oC trong 30 phuùt. Hoãn hôïp sau phaûn öùng ñöôïc ñem thöû treân chuoät baèng caùch tieâm 0,2ml/chuoät vaøo tónh maïch ñuoâi. Quan saùt keát quaû trong voøng 48 giôø keå töø luùc tieâm. Ñaùnh giaù coâng hieäu baûo veä cuûa khaùng theå thu ñöôïc: Hieäu giaù baûo veä (LD50/ml) = Trong ñoù: T: soá LD50 phaûn öùng. D: ñoä pha loaõng cuûa dung dòch khaùng theå gaây 100% chuoät soáng. V: lieàu tieâm (ml). T-1 DxV Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 39 Phaàn III Keát quaû & Thaûo luaän Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 40 1. Keát quaû thöïc nghieäm Töø 702mg noïc khoâ toaøn phaàn hoøa trong 6ml dung dòch ñeäm Amonium acetate 0,05M pH7,2 vaø cho qua coät Saéc kyù Sephadex G-50 SF (27x5,5cm). Vôùi toác ñoä ñaåy cuûa dung dòch ñeäm Amonium acetate 0,05M pH7,2 laø 10ml/40 phuùt töùc 0,25ml/phuùt, caùc thaønh phaàn trong noïc ñöôïc phaân giaûi thaønh nhieàu phaân ñoaïn nhö trình baøy trong ñoà thò 1: Keát quaû saéc kyù loïc Sephadex G- 50 SF 0 1 2 3 4 5 6 7 1 11 21 31 41 51 61 71 Ñoaïn 10 ml O D 28 0 Ñoà thò 1: Söï phaân giaûi cuûa caùc thaønh phaàn trong noïc sau khi Saéc kyù loïc. Coù 4 thaønh phaàn chính trong noïc toaøn phaàn ñöôïc theå hieän baèng 4 ñænh treân ñoà thò 1, nhöõng phaàn coøn laïi laø caùc peptide, acid amin… Sau ñoù, duøng kyõ thuaät ñieän di treân thaïch vôùi noàng ñoä polyacrylamide taêng daàn theo ñoä doác cong töø 8%T ñeán 18%T ñeå kieåm tra khaû naêng tinh cheá protein cuûa coät Saéc kyù. Sau khi protein ñaõ ñöôïc xöû lyù vôùi Sodium dodecylsulfate (SDS) vaø Dithiothreitol (DTT), caùc thaønh Ñænh 1 Ñænh 2 Ñænh 3 Ñænh 4 Keát quaû Saéc kyù loïc Sephadex G-50 SF Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 41 phaàn trong noïc ban ñaàu ñöôïc ñoái chieáu vôùi caùc phaân ñoaïn sau Saéc kyù loïc. Hình 11 cho thaáy keát quaû sau ñieän di vôùi caùc ñoaïn protein nhuoäm baèng Coomassie-R250. Gieáng Maãu Khoái löôïng (µg) 1 2 3 4 5 Noïc Ñænh 1 Ñænh 2 Ñænh 3 Ñænh 4 4 4 4 4 4 6 7 8 9 10 Ñænh 4 Ñænh 3 Ñænh 2 Ñænh 1 Noïc 2 2 2 2 2 Hình 11 : Keát quaû ñieän di gradient 8%T->18%T coù SDS. Vì keát quaû töông töï ôû hai nhoùm 1-5 vaø 6-10 neân chæ caàn xeùt nhoùm 1-5 do nhoùm naøy cho keát quaû roõ raøng hôn. Keát quaû ñieän di cho thaáy, caùc maãu protein ôû gieáng 2, 3 vaø 5 (theo thöù töï ñænh 1, 2 vaø 4 treân ñoà thò 1) ñaït ñoä tinh khieát töông ñoái ñaùng tin caäy. Coøn ôû gieáng 4 (töông öùng vôùi ñænh 3 treân ñoà thò 1) xuaát hieän hai caëp vaïch neân khoâng cho pheùp khaúng ñònh laø ñaõ ñöôïc tinh cheá. Sau khi ñaõ phaân ñoaïn caùc thaønh phaàn cuûa noïc vaø ñaõ ñaùnh giaù ñoä tinh cheá, hoaït tính ñoäc löïc cuûa caùc ñænh (thaønh phaàn) ñaõ ñöôïc thöû nghieäm treân chuoät song song vôùi noïc toaøn phaàn. Baûng 5 döôùi ñaây trình baøy veà löôïng protein thu hoài sau Saéc kyù loïc (ñoà thò 1) cuøng vôùi hoaït tính gaây ñoäc treân chuoät (18g) khi tieâm noïc vaø töøng thaønh phaàn trong noïc qua ñöôøng tónh maïch (i.v) ôû ñuoâi. 8%T 18%T Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 42 Baûng 5: Phaàn traêm thu hoài vaø ñoäc löïc cuûa moãi phaân ñoaïn sau Saéc kyù loïc so saùnh vôùi noïc toaøn phaàn. Maãu Protein (%) Ñoäc löïc (LD50, µg, i.v/18g) Noïc toaøn phaàn 100 9,46 Ñænh 1 14,1 >100 Ñænh 2 13,6 57,9 Ñænh 3 5,7 36,9 Ñænh 4 28,8 3,01 Ñænh (1+2+3+4) 62,2 Keát quaû naøy noùi leân roõ vai troø cuûa thaønh phaàn 4 trong söï tham gia tính gaây ñoäc cuûa noïc toaøn phaàn: • Veà löôïng: thaønh phaàn naøy chieám haàu nhö 1/3 (28,8%) toång löôïng protein coù trong noïc. • Veà ñoäc löïc: maïnh hôn haún gaáp nhieàu laàn so vôùi caùc thaønh phaàn coù ñoäc löïc khaùc. Baûng 6: So saùnh ñoäc löïc cuûa caùc thaønh phaàn 1, 2, 3 trong noïc vaø noïc toaøn phaàn vôùi thaønh phaàn 4. Thaønh phaàn Ñoä yeáu hôn veà ñoäc löïc so vôùi thaønh phaàn 4 (laàn) 1 12,2 2 19,2 3 33,2 Noïc toaøn phaàn 3,14 Nhöõng nhaän xeùt treân ñaõ gôïi môû yù töôûng taïo huyeát thanh chæ choáng laïi thaønh phaàn tinh cheá mang ñoäc löïc chuû yeáu thay cho vieäc taïo huyeát thanh khaùng nhieàu Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 43 thaønh phaàn cuûa noïc. Huyeát thanh ñaëc hieäu vôùi thaønh phaàn 4 coù moät vai troø then choát trong thöû nghieäm giaûi ñoäc trong nghieân cöùu cuûa Phoøng Mieãn dòch. Do ñoù, qui trình gaây mieãn nhieãm ñaõ ñöôïc thieát keá ñeå taïo khaùng theå coù aùi löïc cao nhaát ñoái vôùi thaønh phaàn 4 (xem Phaàn II). Huyeát thanh thu hoài sau quaù trình gaây mieãn nhieãm ñöôïc tuûa ôû 50% baõo hoøa Amonium sulfate ñeå taùch khaùng theå IgG vaø ñoàng thôøi cuõng ñeå baûo quaûn IgG ôû daïng tuûa giöõ trong 4oC. Nhöõng ñieàu caàn bieát cuûa IgG taïo neân laø: • Khaû naêng baét thaønh phaàn 4 tinh cheá vaø trong noïc toaøn phaàn. • Khaû naêng trung hoøa ñoäc löïc cuûa noïc toaøn phaàn. Nhöõng thöû nghieäm nhaèm coù nhöõng thoâng tin veà hai ñieåm treân cho keát quaû nhö sau: IgG tuûa ñaõ ñöôïc thaåm tích ñeå loaïi Amonium sulfate vaø laøm tan trong ñeäm PBS coù noàng ñoä laø 8,488mg/ml (theo phöông phaùp Bradford) vaø 11,2mg/ml (theo phöông phaùp quang haáp thuï A280, duøng 14 1%,1 280 =cmnmE ). Do ñoù, coù theå laáy giaù trò trung bình cuûa hai phöông phaùp naøy laø 9,844mg/ml laøm giaù trò noàng ñoä cuûa dung dòch khaùng theå IgG. Dung dòch IgG naøy duøng ñeå: • Thöû phaûn öùng vôùi khaùng nguyeân theo phöông phaùp Ouchterlony. • Thöû khaû naêng baûo veä chuoät nhieãm ñoäc vôùi noïc raén Hoå mang chuùa. Phaûn öùng cuûa IgG taïo neân vôùi khaùng nguyeân (thaønh phaàn 4) tinh cheá vaø trong noïc toaøn phaàn ñöôïc thaáy treân hình 12. Vôùi noàng ñoä IgG laø 9,844mg/ml, dung dòch khaùng nguyeân tinh cheá cho ñöôøng tuûa ôû ñoä pha loaõng töø 1 ñeán 1/40 töông öùng noàng ñoä töø 3,68mg/ml ñeán 0,092mg/ml vaø dung dòch noïc toaøn phaàn cho ñöôøng tuûa ôû ñoä pha loaõng töø 1 ñeán 1/4 töông öùng noàng ñoä töø 6,1mg/ml ñeán 1,525mg/ml. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 44 Hình 12: Keát quaû phaûn öùng ñònh tính Ouchterlony. A (ñoái chöùng): Phaûn öùng giöõa huyeát thanh tröôùc mieãn nhieãm vôùi thaønh phaàn 4 tinh cheá. Keát quaû aâm tính. B: Phaûn öùng giöõa khaùng theå IgG sau mieãn nhieãm vôùi thaønh phaàn 4 tinh cheá. Keát quaû döông tính. C: Phaûn öùng giöõa khaùng theå IgG sau mieãn nhieãm vôùi noïc toaøn phaàn. Keát quaû döông tính. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 45 Thöû nghieäm nhieãm ñoäc chuoät vôùi noïc toaøn phaàn vaø duøng dung dòch IgG noàng ñoä 9,488mg/ml ñeå trung hoøa ñoäc löïc cho thaáy: 1ml dung dòch IgG naøy trung hoøa ñöôïc 20LD50 (LD50 noïc = 9,46µg, i.v/18g). Keát quaû treân chöùng minh khaû naêng trung hoøa cuûa IgG taïo neân vôùi thaønh phaàn 4 choáng laïi ñoäc löïc cuûa noïc toaøn phaàn. 2. Thaûo luaän Theo y vaên [13, 14, 15, 17, 19], trong noïc raén coù nhieàu loaïi ñoäc toá, ví duï: caùc raén thuoäc doøng nhôõn kính (Elapidae) coù ñoäc toá haäu khôùp thaàn kinh (ñoäc toá alpha), ñoäc toá tim (ñoäc toá gamma)… Do ñoù, khaùng huyeát thanh taïo neân cho muïc ñích ñieàu trò naïn nhaân nhieãm ñoäc noïc raén cho ñeán nay laø choáng noïc toaøn phaàn (antivenom). Nhöõng keát quaû thöû nghieäm vôùi noïc raén Hoå mang chuùa nhö ñaõ trình baøy cho thaáy vai troø cuûa thaønh phaàn 4 vôùi nhöõng ñaëc ñieåm: veà löôïng thì tæ leä troäi hôn chieám trong noïc (gaàn 1/3 noïc toaøn phaàn) vaø veà ñoäc löïc thì raát maïnh (nhö so saùnh trong baûng 6). Trong khi caùc thaønh phaàn khaùc hoaëc khoâng coù ñoäc löïc (gaàn 37,8%) hoaëc coù ñoäc löïc raát nheï (thaønh phaàn 1 coù LD50 > 100µg/chuoät…). Do coù nhieàu ñoäc toá trong noïc, moät caâu hoûi coù theå ñaët ra laø: caùc ñoäc toá trong noïc coù “keát hôïp” hoaït ñoäng ñeå taïo neân ñoäc löïc khoâng? YÙ töôûng coù söï keát hôïp hoaït ñoäng ñeå taêng ñoäc löïc bieän luaän cho söï caàn thieát taïo huyeát thanh khaùng noïc toaøn phaàn. Do ñaùp öùng mieãn nhieãm khoâng cao, nhö vaäy, trong caùc thaønh phaàn cuûa noïc, coù thaønh phaàn naøo coù theå öùc cheá ñaùp öùng mieãn nhieãm? Hôn nöõa, huyeát thanh khaùng noïc taïo neân duøng trong ñieàu trò thöôøng hay gaây phaûn öùng phaûn veä, nhö vaäy, trong caùc thaønh phaàn cuûa noïc, thaønh phaàn naøo tham gia, hoaëc khaùng theå ñaëc hieäu vôùi thaønh phaàn naøo coù theå tham gia taïo phaûn öùng phaûn veä? Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 46 Trong boái caûnh ñoù, moät caâu hoûi ñôn giaûn hôn raát phuø hôïp ñeå toå chöùc thöïc nghieäm mang laïi lôøi ñaùp laø: duøng khaùng theå taïo neân vôùi thaønh phaàn 4 coù baûo veä choáng noïc ñoäc toaøn phaàn ñöôïc khoâng? Ñeå laøm saùng toû nhöõng vaán ñeà treân, caùc thaønh phaàn cuûa noïc raén O. hannah ñaõ ñöôïc taùch rieâng bieät vaø thaønh phaàn quan troïng nhaát ñaõ ñöôïc duøng ñeå taïo khaùng theå. Taát nhieân, qui trình mieãn nhieãm ñaõ ñöôïc thieát keá nhaèm taïo khaùng theå coù theå trung hoøa ñoäc löïc coù hieäu quaû cao nhaát ñoái vôùi thaønh phaàn 4. Duøng khaùng theå ñaëc hieäu vôùi thaønh phaàn 4 trong thöû nghieäm trung hoøa vôùi ñoäc löïc cuûa noïc toaøn phaàn ñaõ ñem laïi lôøi ñaùp khaù roõ raøng. Keát quaû naøy coù nhöõng yù nghóa sau: • Veà vai troø sinh hoïc cuûa noïc raén: ñoäc löïc chuû yeáu do moät loaïi phaân töû ñaûm nhieäm. Cuï theå ñoái vôùi O. hannah, thaønh phaàn 4 laøm cho ñoäng vaät nhieãm bò teâ lieät vaø theo y vaên [13, 15, 17, 22] ñaây laø ñoäc toá thaàn kinh alpha. • Veà trieån voïng taïo huyeát thanh ñieàu trò nhieãm ñoäc noïc raén: taïo huyeát thanh khaùng ñoäc toá coù theå giaûi quyeát caùc nhöôïc ñieåm cuûa huyeát thanh khaùng noïc toaøn phaàn. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 47 Phaàn IV Keát luaän & Ñeà nghò Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 48 1. Keát luaän Qua thôøi gian töông ñoái ngaén laøm ñeà taøi taïi Phoøng Mieãn dòch, Vieän Pasteur Tp. Hoà Chí Minh, vôùi muïc tieâu ñeà ra laø taïo khaùng theå khaùng ñoäc toá thaàn kinh alpha vaø ñaùnh giaù khaû naêng choáng ñoäc cuûa khaùng theå naøy ñoái vôùi noïc toaøn phaàn, ñeà taøi ñaõ ñaït ñöôïc caùc thaønh coâng chính nhö sau: • Ñoäc toá thaàn kinh alpha ñaõ ñöôïc phaân taùch vaø tinh cheá baèng Saéc kyù loïc Sephadex G-50 SF duøng laøm khaùng nguyeân. • Ñaõ taïo ñöôïc khaùng theå khaùng ñoäc toá thaàn kinh alpha khi gaây mieãn nhieãm thoû. • Khaùng theå thu ñöôïc coù khaû naêng trung hoøa ñöôïc ñoäc löïc cuûa noïc toaøn phaàn: vôùi 1ml dung dòch khaùng theå IgG naøy ôû noàng ñoä 9,488mg/ml trung hoøa ñöôïc 20LD50 noïc toaøn phaàn treân chuoät nhaét traéng 18g theo ñöôøng tieâm tónh maïch ñuoâi. 2. Ñeà nghò Vì thôøi gian thöïc hieän ñeà taøi coù haïn neân chuùng toâi khoâng theå ñaït ñöôïc muïc tieâu xa hôn laø taïo huyeát thanh chöõa trò cho beänh nhaân bò raén Hoå mang chuùa caén döïa treân qui trình taïo khaùng theå khaùng ñoäc toá thaàn kinh alpha maø chuùng toâi ñaõ thieát laäp ñöôïc treân thoû ñeå ñöa vaøo thöïc tieãn cuoäc soáng. Do ñoù, chuùng toâi coù nhöõng ñeà nghò nhö sau: a. Tieáp tuïc coâng trình nghieân cöùu naøy ñeán muïc tieâu cuoái cuøng laø saûn xuaát khaùng huyeát thanh cöùu chöõa naïn nhaân bò raén Hoå mang chuùa caén Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 49 moät caùch hieäu quaû nhaát. Ñaây ñöôïc xem laø coâng vieäc thieát thöïc cho coâng taùc khoa hoïc. b. AÙp duïng töông töï cho moät soá qui trình taïo huyeát thanh choáng noïc ñoäc khaùc (raén, boø caïp, ong, nheän ñoäc, coùc…). Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 50 Phaàn V Taøi lieäu tham khaûo Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 51 1. Taøi lieäu trong nöôùc [1]. Phaïm Ñình Löïu, 1998. Sinh lyù hoïc, Ñaïi hoïc Y-Döôïc thaønh phoá Hoà Chí Minh. [2]. Phaïm Hoaøng Phieät, 1999. Mieãn dòch-Sinh lyù beänh, Ñaïi hoïc Y-Döôïc thaønh phoá Hoà Chí Minh. [3]. Nguyeãn Thò Nguyeät Thu, Nguyeãn Leâ Trang vaø cs, 1998-1999. Raén caén, Vieän Pasteur thaønh phoá Hoà Chí Minh. [4]. Nguyeãn Thò Nguyeät Thu, 2002. Nghieân cöùu öùng duïng kyõ thuaät hai khaùng nguyeân keïp khaùng theå ñeå theo doõi ñaùp öùng mieãn dòch, Vieän Pasteur thaønh phoá Hoà Chí Minh. 2. Taøi lieäu ngoaøi nöôùc [5]. C. Bon & M. Goyffon, 1995. Envenomings and Their Treatment, France. [6]. N. Catsimpoolas, 1978. Methods of Protein Separation, Volume 1, USA. [7]. Terrance G. Cooper, 1997. The Tools of Biochemistry, University of Pittsburgh, Pennsylvania. [8]. Julius M. Cruse & Robert E. Lewis, 1999. Atlas of Immunology, USA. [9]. Charles A. Janeway et al., 1999. Immunobiology, USA. [10]. H. Lodish et al., 1995. Molecular Cell Biology, USA. [11]. Henry R. Mahler & Eugene H. Cordes, 1967. Biological Chemistry, Japan. [12]. John H. Postlethwait & Janet L. Hopson, 1989. The Nature of Life, USA. [13]. Kurt F. Stocker, 1990. Medical Use of Snake Venom Proteins, USA. [14]. N. H. Tan & M. N. Saifuddin Hj, 1989. Enzymatic and Toxin Properties of Ophiophagus hannah (King Cobra) Venom and Venom Fractions, Toxicon, 27, 689-695, Britain. Luaän vaên toát nghieäp. Ngaønh CNSH Nguyeãn Höõu Huøng Khoùa 1999-2003 52 [15]. N. H. Tan, M. N. Saifuddin Hj & M. I. N. Jaafar, 1990. Preparation of Antibodies to King Cobra (Ophiophagus hannah) Venom Hemorrhagin and Investigation of Their Cross-Reactivity, Toxicon, 28, 1355-1359, Britain. [16]. P. Tijssen, 1985. Practice & Theory of Enzyme Immunoassays, Netherlands. [17]. Anthony T. Tu, 1991. Reptile Venoms and Toxins, USA. [18]. D. M. Weir et al., 1986. Immunochemistry, Volume 1, Britain. [19]. S. Weissenberg, M. Ovadia & E. Kochva, 1987. Species Specific Sensitivity towards The Hemorrhagin of Ophiophagus hannah (Elapidae), Toxicon, 25, 475-481, Britain. 3. Taøi lieäu Internet [20]. [21]. [22]. [23]. www.patc.net/resources/florafauna/snakebite.html [24]. www.vetinfo4dogs.com/dsnakebite.html [25]. [26]. [27]. [28]. www.sp.uconn.edu [29]. www.techfak.uni-bielefeld.de [30]. zoltantakacs.com/zt/ pw/sn/s22.shtml