Khóa luận Tìm hiểu quy trình phát hiện Clostritridium botulinum trong thít

hân loại yếu tố độc lực KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 20 Hình 2.4 Cơ chế gây độc của độc tố botulin [12] Khi phát triển trên thực phẩm, c.botulinum tiết độc tố acethylcholine là một chất dẫn truyền thần kinh gây đáp ứng bằng tình hạng co thắt cơ. Botulin tác động như một độc tố thần kinh mạnh làm ức chế phóng thích acetylcholine, do đó gây kết quả như cắt dây thần kinh bằng chất hóa học, gây liệt phản hồi. Mặc dù có đến 7 loại BTX ( A, B, Cl, D, E, F, G) gây liệt phản hồi do ức chế phóng thích acetylcholine tại đường nối thần kinh Nhóm I Nhóm II Nhóm III Nhóm IY Độc tố A, B,F B, E,F c, D G Proteolysis + - Yếu - Saccharolysis - + - - Species Con người, động vật Con người, động vật Động vật Độc tố gen Nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể Bacteriophage Plasmid Close relative c.spororgenes C.putriíícum C.butyricum C.beijemickii c .haemolyticum c.novyi type A c.subterminale C.haemolyticum 2.2.7.2. Cơ chế gây độc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 21 - cơ của các sợi cơ vân, chúng lại không giống nhau tại vị trí gắn kết trên tế bào niêm mạc và vị trí tác động. Có 7 loại nhưng 3 loại A, B và E thuộc loại hay gây ngộ độc và nguy hiểm, gây chết người do tác động lên hệ thống thần kinh. Thời kỳ ủ bệnh thường là 12-36 giờ nhưng cũng có thể từ 2 giờ đến 8 ngày với các hiệu chứng lâm sang như đau bụng, buồn nôn, đau đầu, chóng mặt, hoa mắt có khi nhìn đôi, khó nuốt, khó thở... Ngộ độc c. botuỉinum còn phụ thuộc vào rất nhiều điều kiện như yếu tố môi trường, đặc tính thực phẩm, biện pháp bảo quản, tập quán sinh hoạt và ăn uống của nhân dân mà nguồn thực phẩm gây ngộ độc cũng khác nhau. 2.2.7.3. Cơ chế gây bệnh Khi hoạt động của dây thần kinh vận động tạo nên sự khử cực ở đầu cuối của sợi trục (axon), acetylcholine sẽ được phóng thích từ tế bào chất vào khe synapse. Sự phóng thích acetylcholine được thực hiện bởi một chuỗi protein vận chuyển, phức họp solule N-ethylmalemide-senitive factor attachment protein receptor (SNARE) ( yếu tố có thể hòa tan nhạy với N-ethylmalemide gắn lên thể nhận protein). Khi độc tố botulin thâm nhập vào mô dịch, chuỗi nặng của độc tố thần kinh botulin này sẽ gắn chuyên biệt lên phân tử glycoprotein được tìm thấy ở điểm cuối của dây thần kinh tác động kiểu cholin. Sự gắn chuyên biệt này nguyên nhân cho tính chọn lọc cao của độc tố botulin đối với synapse tác động kiểu synapse. Sau khi xâm nhập, chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh botulin gắn chuyên biệt lên phức họp SNARE. Tùy các loại botulinum toxin khác nhau sẽ có các protein đích khác nhau. Botulinum toxin-A được tách thành SNAP-25, botulinum toxin-B được tách thành vách VAMP. Sự phân cắt chuỗi nhẹ của phức họp protein trong màng tế bào là kết quả là dẫn tới sự khóa chặt các lỗ hổng. Khi mô đích là một phần cơ, xảy ra sự liệt nhẹ do xảy ra sự cắt bó dây thần kinh hóa học. Khi mồ đích là tuyến ngoại tiết thì sự liên kết các chất ở các tuyến ngoại tiết thì sự tiết các chất ở các tuyến này bị khóa chặt. Sự ức chế quá trình xuất bào của KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 22 acetylcholine bị loại bỏ bằng cách khôi phục lại sự thay thế của phức họp protein SNARE. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 23 SNAR E Proto.n s A Normal Neurotransmitter Release (teuronuscưaí vkinctio o Motor Norvo >mínu$ Syn3ptfc Vosicĩo ÌO®Q(ị 3 SNARE Proteins Form Complex Vesicle and Terminal Mombranes Fu$o Nourotrans mi Reieasod ìĩỉ. -V.: ằ Muscle Fiber Contracts Hình 2.5 Cơ chế gây bệnh của Clostrìdium botulinum 2.2.8. Hội chứng ngộ độc thịt [7] Botulism là một căn bệnh bại liệt hiếm nhưng nghiêm trọng do botulin là độc thần kinh và là sản phẩm của vi khuẩn c.botulinum. 2.2.8.1. Bệnh và các triệu chứng Các triệu chứng cơ bản của botulism gồm : làm tổn thương hệ thần kinh trung ương (đặc biệt là đến các tín hiệu từ não đến cơ bắp), gây liệt cơ rõ nhất là liệt cơ mắt (không có phản ứng với ánh sáng, song thị), liệt cơ vòm miệng, lưỡi hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm nhất là gây liệt trung tâm hô hấp, tim dẫn đến tử vong. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 24 Hình 2.6 Vịt bị tê liệt do độc tố botulin Trẻ sơ sinh với botulism sẽ xuất hiện nôn nửa, kém ăn, táo bón, khóc yếu và cơ không phát triển. Nếu không chữa trị, những hiệu chứng này có thể phát hiển gây tê liệt cánh tay, chân, thân và các cơ bắp hô hấp. Các triệu chứng thường bắt đầu từ 18 - 36h sau khi tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm, nhưng cũng có thể xảy ra sớm nhất là 6g hoặc trễ là 10 ngày sau khi tiêu thụ. Botulism có nhiều loại A, B, c, D, E nhưng loại A, B, E cho độc tố mạnh nhất. 2.2.8.2. Phát hiện và điều trị Cách trực tiếp và hiệu quả nhất để xác định chẩn đoán lâm sàng của botulism trong phòng thí nghiệm là chứng minh sự hiện diện của chất độc trong huyết thanh hoặc phân của Hình 2.7 Trẻ em bị nhiễm botulỉsm KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 25 bệnh nhân hoặc ứong thực phẩm bệnh nhân tiêu thụ. Hiện nay, phương pháp sử dụng rộng rải nhất để phát hiện chất độc là thử nghiệm trung hòa ở chuột, trong đó bao gồm việc tiêm huyết thanh hoặc phân người bệnh vào chuột và tỉm kiếm các dấu hiệu của botulism, thử nghiệm này thường mất 48 giờ. Nuôi mẫu vật mất từ 5 - 7 ngày. Những suy hồ hấp và tê liệt nghiêm trọng xảy ra với botulism có thể để bệnh nhân sử dụng máy thở (thông gió) cho 1 tuần, cộng với chuyên sâu về y tế và chăm sóc điều dưỡng. Sau vài tuần, tê liệt từ từ được cải thiện. Nếu chẩn đoán sớm, botulism thực phẩm và botulism vết thương có thể được điều trị bằng một khối chất kháng độc, hoạt động của các độc tố lưu hành ứong máu này có thể ngăn ngừa bệnh xấu đi, nhưng phục hồi vẫn phải mất nhiều tuần lễ. Bác sĩ có thể thử loại bỏ thực phẩm bị ô nhiễm còn trong ruột bằng cách cho nôn ra hoặc rửa ruột. Đối với vết thương cần được điều trị, thường là phẫu thuật, để loại bỏ các nguồn sản xuất vi khuẩn chất độc hại này bằng cách cung cấp thuốc kháng sinh thích họp. Hỗ trợ chăm sóc tốt tại bệnh viện là yếu tố chính của liệu pháp cho tất cả các hình thức bị nhiễm botulism. 2.2.8.3. Biện pháp phòng và kiểm soát bệnh ❖ Các biện pháp phòng - Sử dụng thực phẩm tươi, sạch. - Bảo quản thực phẩm : ưóp muối, ướp lạnh thực phẩm ngay sau khi sơ chế thực phẩm. - Không sử dụng thực phẩm sống : gỏi cá, mắm tôm hoặc các loại mắm ăn sống... - Đun nấu lại thức ăn, thực phẩm đóng hộp. - Không ăn tiết canh, lòng nấu chua chín. - Vệ sinh nấu nuớng, thực phẩm, rửa tay sạch trước khi pha chế nấu nướng thức ăn và trước khi ăn. - Sử dụng sữa tiệt trùng ở nhiệt độ cao, sữa và các chế phẩm sữa theo tiêu chuẩn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 26 HACCP đảm bảo vệ sinh và chất lượng an toàn thực phẩm, sữa có chứa sữa non colostrum giàu kháng thể ngừa bệnh tật. - Thực phẩm nghi ngờ có vi khuẩn độc thịt nên đun sôi liên tục trong 2 giờ. - Các đồ hộp thịt, cá thấy bị phòng thì loại ngay. ♦♦♦ Các biện pháp kiểm soát - Các biện pháp để ngăn chặn botulism bao gồm giảm mức độ ô nhiễm vi sinh vật, quá trình acid hóa, giảm mức độ ẩm, và bất cứ khi nào có thể, tiêu hủy tất cả các bào tử botulism ứong thực phẩm. Chế biến thực phẩm đóng hộp đúng cách sẽ không có sự hiện diện của c. botulinum. - Một thực phẩm có thể chứa c. botulỉnum vẫn không có khả năng gây ra botulism nếu các sinh vật không phát ứiển, không có độc tố được sản xuất. Mặc dù, nhiều loại thực phẩm đáp ứng các yêu cầu về dinh dưỡng cho sự phát triển của c. botulỉnum, không phải tất cả đều cung cấp các điều kiện kỵ khí cần thiết. 2.2.9. Những ứng dụng tuyệt vời của c.botulinum 2.2.9.1. Trong y học - Chữa chứng giật mỉ mắt Vài chục năm trước, các thầy thuốc đã có suy nghĩ độc đáo: tiêm botulotoxin (BoNT-A) vào cơ mắt, làm liệt có mức độ các cơ này sẽ chữa được bệnh mắt hay giật. Thử nghiệm này thành công, trở thành liệu pháp chữa giật mi mắt hiệu quả. - Chữa chúng co cứng cơ Tiêm vào cơ ở chỗ tận cùng thần kinh BoTX-A ức chế sự phóng thích chất dẫn truyền acetylcholin, làm giảm sự co cứng cơ. Sau tai biến mạch máu não có 60% người bị co cứng cơ chi ừên và chỉ 5% ứong số này có thể hồi phục. Co cứng chi trên cùng với việc mất đi các phản ứng kết hợp khéo léo làm cho người bệnh khó khăn trong vận động, không thể chủ động ứong cuộc sống (khó mặc quần áo, cầm thìa nĩa, khó rửa lòng bàn tay). Tiêm tại chỗ, BoTX-A chỉ cho KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 27 tác dụng khu trú, không tác động trên các cơ lành, cũng không gây ra các tác dụng độc chung. Tương tự như cơ chế trên, tiêm BoTX-A vào ở chỗ nối thần kinh - cơ sẽ gây liệt cơ vân nên chống được tắc nghẽn niệu do phì đại tiền liệt tuyến. - Chữa chứng tiết nhiều nước bọt Trong các bệnh thần kinh như Parkinson, bại não, thoái hoá thần kinh, đột quỵ, xơ cứng bên (amyotrophic lateral sclerosis) thường có chứng tiết nhiều nước bọt, ảnh hưởng không tốt đến hình ảnh, hoạt động giao tiếp của người bệnh. Lần lượt có nhiều tác giả Friedman, Potuska, Jongerius (2001); Suskin, Tuilon, Bothvvell (2002), Ellies (2002-2003); Cheng, Mancini (2003) đã nghiên cứu dùng BoTX-A và BoTX-B chữa chứng này. Các nghiên cứu này tuy chưa lớn, nhưng đều nhận thấy có hiệu quả, chưa ghi nhận tai biến, trừ trường hợp trong bệnh xơ cứng bên. Tuy nhiên, ứong bệnh xơ cứng bên, nếu tiêm vào tuyến mang tai hay các tuyến dưới hàm cũng giảm thiểu được tai biến này. - Điều trị bướu lành tuyến tiền liệt Tiêm độc tố botulinum không phải là phương pháp điều ứị dứt điểm triệu chứng bí tiểu do bướu lành tiền liệt tuyến mà chỉ là điều ứị ứiệu chứng nhằm cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân thông qua việc làm giảm co thắt của các cơ vùng cổ bọng đái và theo nghiên cứu có thể một phần làm giảm kích thước bướu thông qua quá trình chết có lập trình nên chỉ định của chúng tôi là bệnh nhân già yếu không thể thực hiện phẫu thuật được và không hy vọng có thể điều trị dứt điểm bệnh lý bướu của bệnh nhân. Vì thế vấn đề truy tầm ung thư tiền liệt tuyến đối với các bệnh nhân này là không đặt ra. Tuy nhiên theo nghiên cứu của một số tác giả sau khi tiêm thuốc một thời gian thì PSA có giảm nhưng chúng tồi hoàn toàn không có kinh nghiệm về vấn đề này. Để hiểu biết hơn lý do tại sao PSA có giảm và thời gian tác dụng lâu hơn 6 tháng chúng tôi có tiến hành sinh thiết tiền liệt tuyến trước và sau tiêm độc tố botulinum thì nhận thấy các tế bào tuyến dẹt đi nhiều nên có thể phỏng đoán độc tố botulinum có khả năng làm giảm các tế bào tuyến chứ không chỉ đơn thuần tác động trên thần kinh, và do ảnh hưởng trên tế bào tuyến KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 28 tiền liệt nên làm giảm PSA. Trong nhóm nghiên cứu này chúng tôi có một bệnh nhân có tổng trạng tương đối nhưng mắc đồng thời bướu tiền liệt tuyến và bướu bàng quang nên không giải quyết bướu tiền liệt tuyến đồng thời với bướu bàng quang vì sợ gieo rắc tế bào bướu nên bệnh nhân chấp nhận cắt đốt bướu bàng quang trước và bơm độc tố botulinum để có thể tạm tiểu được và sẽ giải quyết triệt để bướu tiền liệt tuyến sau. Ngoài ra chúng tôi cũng có một bệnh nhân có ca gan phối hợp,đơn vị bạn ngại giải quyết phẫu thuật nên chuyển thực hiện tiêm độc tố botulinum. Từ đó chúng tôi nhận thấy tiêm độc tố botulinum là phương pháp điều ứị thích hợp cho các bệnh nhân bị ung thư giai đoạn tiến xa và đồng thời bị bí tiểu do bướu tiền liệt tuyến + Đường tiêm độc tổ botulinum Có 2 đường dùng để tiêm thuốc là đường qua tầng sinh môn: có thể thực hiện mù dưới sự hướng dẫn của ngón tay hay dưới hướng dẫn của siêu âm qua ngã trực tràng. Còn đường thứ hai là qua niệu đạo với máy soi niệu đạo bàng quang. Đường tiêm thuốc qua tầng sinh môn được thực hiện đầu tiên và tỏ ra có hiệu quả. Tuy nhiên theo một số tác giả đường nào cũng hiệu quả như nhau, lựa chọn đường tiêm thuốc chủ yếu là theo kinh nghiệm của thầy thuốc cũng như dựa vào trang thiết bị của cơ sở. vấn đề chủ yếu là tiêm được vào tiền liệt tuyến ở gần cổ bàng quang và ở gần vùng cơ trơn niệu đạo. Thường các nhà Niệu khoa thích tiêm thuốc ngã xuyên niệu đạo còn nếu được thực hiện bởi một bác sĩ chẩn đoán hình ảnh thì chọn ngã qua tầng sinh môn. + Thời gian để có hiệu quả Theo các nghiên cứu trước để có hiệu quả nên chờ đợi từ 5-7 ngày để có tác dụng . Ở các bệnh nhân của chúng tôi sau thời gian 7 ngày bệnh nhân được rút thông và tự tiểu được nhưng vì còn tiểu gấp với lượng nước tiểu ít nên chưa kịp khảo sát niệu dòng đồ, chúng tôi có hẹn bệnh nhân quay trở lại sau một tuần để khảo sát niệu dòng đồ thấy tiểu thông Qmax < lOml/giây tuy dòng tiểu vẫn còn yếu hơn ở người trẻ nhưng các bệnh nhân đều rất hài lòng. Có một số trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 29 họp sau đặt thông tiểu một thời gian bệnh nhân có thể tiểu được sau khi rút thông nên có thể lầm với hiệu quả của thuốc nhưng ở các bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu bị bí tiểu từ nhiều tuần đã được đặt thông tiểu lưu và dùng nhiều thuốc vẫn không hiệu quả, chỉ sau khi tiêm thuốc bệnh nhân mới tự tiểu được nên chúng tôi cho là do hiệu quả của thuốc. + Lý do thất bại Như đã đề cập trong phần kết quả trong loạt nghiên cứu này chúng tôi có một trường họp thất bại do bọng đái không co bóp nên có thể phải thực hiện đo áp lực đồ bọng đái như là xét nghiệm tiền phẫu trước khi tiêm độc tố botulinum nhưng việc này ít khả thi vỉ đa số bệnh nhân đều quá già, nhiều bệnh phối hợp nên ít nhiều đều có ảnh hưởng lên trương lực cơ chóp bọng đái nên nếu thấy giảm trương lực bọng đái cũng không thể cho là chống chỉ định của thủ thuật tiêm độc tố botulinum. • KẾT LUÂN Cho tới thời điểm hiện nay cắt đốt nội soi tiền liệt tuyến là phương pháp điều trị chủ yếu cho các bế tắc đường tiểu do bướu tiền liệt tuyến nhưng vẫn không thể giải quyết được tất cả những tình huống phức tạp như ở các bệnh nhân quá già, có nhiều bệnh lý phối họp, tiêm độc tố botulinum có thể là một trong các biện pháp hữu hiệu để giải quyết các tình huống này. Tuy nhiên, do chưa có nhiều kinh nghiệm nên để xác định được hiệu quả của phương pháp này chúng ta cần phải có những nghiên cứu lâu dài với số lượng bệnh nhân lớn hơn. - Chữa chứng tiết mồ hôi khu trú nguyên phát Nghiên cứu của Naumann (2001 và 2002) cho biết: ứong trường họp đổ mồ hôi vừa và nặng, dùng BoTX-A tiêm dưới da cho hiệu quả tới 94% ừong khi ở nhóm chứng chỉ đạt 36%. Trong thử nghiệm này, nhóm chứng cho tác dụng phụ nhiễm khuẩn cao hơn nhóm tiêm BoTX-A. Các tác giả sau đó Dressler, Benecke, Baumann, Halem (2003) cũng lặp lại thử nghiệm này với BoTX-B cho kết quả tương đương, tuy nhiên có gặp tác dụng phụ là làm khô miệng, gây khó khăn ứong điều tiết mắt. Hiện BoTX-A được chỉ định chính thức dùng cho KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 30 chứng tiết mồ hôi khu trú vừa và nặng tại nhiều nước như Canada, Australia, Vương quốc Anh. Hình2.8 Botox giúp ngăn đổ mồ hôi và chữa chứng đau cơ xương -Chữa chứng đau cơ xương Foster (2001) đã thử nghiệm dừng BoTX-A điều trị đau cơ xương thắt lưng mãn tính. Các kết quả cho thấy: trên nhóm dùng BoTX-A có 73% người dừng giảm được 50% các hiệu chứng (tính theo thang điểm nhìn) và có 67% giảm được sự tàn tật (đánh giá bằng bộ thang điểm câu hỏi đau thắt lưng OLBPD), trong khi trên nhóm chứng các tỷ lệ tương ứng này chỉ là 25-19%. Lang (2003) cũng đề nghị dùng BoTX-A để cải thiện đau do làm giảm trương lực, giảm hoạt động quá mức của cơ, coi như một liệu pháp giảm đau đa phương thức, có lợi hơn cách trước đó là làm hồi phục chiều dài bình thường và sự cân bằng sinh học của cơ. -Chữa các chứng đau nhức đầu Có thể tiêm BoTX-A vào các cơ vùng mặt hay vào các điểm đau cho các trường hợp nhức đầu mà nguyên nhân chưa xác định rõ. Nghiên cứu hồi cứu (Blumenfeld-2003): trong 271 người (bao gồm 29 nhức đầu Migraine, 19 nhức đầu do căng thẳng, 74 bị nhức đầu hỗn hợp, 154 nhức đầu mãn tính xảy ra hàng ngày) dùng BoTX-A thấy làm giảm được số ngày nhức đầu tính theo tháng từ 19 xuống 8 ngày, giảm được cường độ đau từ 2,4 điểm xuống 1,8 điểm. Cũng như thế với 263 người khác cũng thấy có 85% số người dùng BoTX-A giảm được về số ngày nhức đầu trong tháng, giảm được cường độ đau. Trước đó Silberstein (2000) và Foster (2001) thực hiện các thử nghiệm có đối chứng với giả được cho KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 31 biết BoTX-A thực sự có lợi ích trên chứng nhức đầu. Tsui (1986) và Brashear (1999) cũng thấy BoTX-A, BoTX-B có làm giảm đau ứên các rối loạn trương lực cổ. ♦> Tồ chức thực phẩm và dược phẩm (Mỹ FDA) cho phép Fỉdaxomỉcỉn điều trị nhiễm Clostridium difficile (CD) cho trẻ từ 16 tuổi trở xuống Mỗi năm nhiễm C.difficile ảnh hưởng đến 700.000 người dân Mỹ và thường được chỉ định các kháng sinh phổ rộng (Cephalosporin hay Flouroquinolone) tuy nhiên việc sử dụng này ảnh hưởng đến hệ vi khuẩn đường ruột và cho phép C.dịffĩcỉle phát triển, vấn đề được đặt ra ở bệnh viện và cả cộng đồng là khi sử dụng các kháng sinh trên thì thất bại điều trị và tỷ lệ tái phát ngày càng tăng. Fidaxomicin là thuốc đầu tiên trong nhóm kháng sinh Macrolide mới phổ hẹp hoạt động bằng cách ức chế men Polymerase RNA. Qua quan sát các nghiên cứu lâm sàng, Fidaxomicin tiêu diệt C.dỉffĩcile một cách chọn lọc, ít ảnh hưởng đến hệ vi khuẩn đường ruột. Điều này giúp ruột ứở lại điều kiện sinh lý bình thường và từ đó giảm tỷ lệ tái phát C.dỉffĩcile . Theo các báo cáo trước đây đăng trên Medscape Medical News, dữ liệu từ 2 thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 3 đã chứng minh Fidaxomicin hiệu quả điều trị không kém hơn so với Vancomycin. Tỷ lệ tái phát thấp hơn khi điều trị C.difficile cho người lớn. Fidaxomicin hiện đang được FDA và Hội đồng Châu Âu xem xét tiêu chuẩn trong điều trị nhiễm C.dịffìcile ở người lớn và dự phòng tái phát. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 32 Hình 2.9 Hình ảnh về thuốc diều trị nhiễm Clostridium difflcile 2.2.9.2. Trong thẩm mỹ Sự co các cơ đã gây nên các vết nhăn gợn sóng ở trán, vết nhăn chân chim ở khoé mắt. Trước cả khi ứng dụng vào y học, các thầy thuốc thẩm mỹ đã táo bạo tiêm vào cơ bắp trên mặt, làm liệt có mức độ các cơ này, xoá vết nhăn. Mãi đến tháng 4/2002, FDA (Mỹ) mới chính thức cho lưu hành, nhưng ngay từ năm 2001 đã có 1,6 triệu người Mỹ tự nguyện dùng thử, doanh số bán ra hàng năm lúc ấy 301 ứiệu USD và đến năm 2006 thì vượt qua ngưỡng 1 tỷ USD. Đối với việc dùng BoTX-A, nếu trong y học đi từng bước thăm dò, dè dặt thì trong thẩm mỹ lại sớm được ưa chuộng và dùng phổ biến. 2.2.9.3. Hạn chế của c.botulinum Hình 2.110 Tiêm BoTX-A điều trị vết nhăn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 33 BoTX-A chỉ xoá được các nếp nhăn do co cơ (ví dụ co cơ khi vui, khi buồn) nhưng không thể xoá vết nhăn do lão hoá (do giãn và trùng cơ). Vì thế, không thể làm cho người già tươi tắn lại như nhiều người vẫn nhầm tưởng. Khi vui, khi buồn thì có sự co cơ tương thích tạo nên nét rạng rỡ hay ủ dột. Làm liệt các cơ này thì xoá được nếp nhăn, song cũng lại mất đi sự co cơ để biểu lộ tình cảm Nói một cách khác, xoá vết nhăn sẽ tạo nên người đẹp nhưng nhìn bên ngoài dường như là "người đẹp vổ hồn". Mỗi lần xoá nếp nhăn chỉ kéo dài được 5-6 tháng, sau đó sẽ nhăn trở lại, và nếu muốn tiếp tục thì lại phải đến điều trị trở lại nhưng dường như sự vô cảm bên ngoài càng rõ hơn. Dùng BoTX-A cần có hai thủ thuật cực kỳ quan ứọng là phải tiêm đúng cơ bị bệnh, tiêm đúng vào đầu thần kinh cơ. Trong thẩm mỹ, nếu tiêm không đứng sẽ làm liệt cơ chỗ khác, sinh ra nếp nhăn khác, kéo lệch hay biến dạng mặt. Trong y khoa, nếu tiêm không đúng sẽ không chữa được bệnh tại nơi cần trong khi đó lại gây giảm trương lực cơ tại nơi khác. Dùng BoTX-A còn có một điều quan trọng thứ hai là phải thăm dò, chọn được liều thích hợp. Cả trong thẩm mỹ cũng như trong y học, việc dùng quá liều sẽ gây phản tác dụng, tức là gây ra tác dụng ngoài ý muốn, làm liệt hay ức chế đau quá mức. Ke từ khi BoTX-A được dùng tới nay cũng đã có nhiều vụ kiện do các tai biến này gây ra. Hiện nay, hầu hết các nghiên cứu phần lớn là trên BoTX-A, thấy có hiệu quả, ít độc, nhưng chưa nhiều trên BoTX-B, thấy có hiệu quả tương đương nhưng có độc hơn. 2.2.10. Các loại thực phẩm nhiễm C.hotulìnum Botulin là độc tố đã được chứng minh có nhiều trong các loại thực phẩm đồ hộp như ngô đóng hộp, ớt, đậu xanh, súp, củ cải, măng tây, nấm, chín ô liu, rau bina, cá ngừ, thịt gà và gan gà và pate gan, và các loại thịt, xúc xích, tôm hùm, thịt hun khói và cá muối... KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 34 Hình2.11 Đồ hộp và trái cấy nhiễm C.botulinum 2.2.11 Tình hình nhiêm C.botulinum trên thế giới và tại Việt Nam - Ở Hoa Kỳ nhiễm c.botulinum chủ yếu trong đồ hộp rau quả như: ớt, đậu xanh, súp, củ cải, măng tây, nấm, chín ô liu, rau bina, cá ngừ, thịt gà. Gần đây, tại Hoa Kỳ sản phẩm tương ớt đóng hộp thuộc nhiều nhãn hiệu đang được thu hồi sau khi có 4 người nhập viện vì bệnh botulism phát sinh từ độc tố có trong sản phẩm của công ty Castleberry"s. - Ở Nga, ngộ độc cá. - Ở Đức do ăn các thức ăn làm bằng thịt chế biến sẵn, ăn nguội, dăm bông, xúc xích... Nhật Bản - 36 người bị bệnh và 11 người đã thiệt mạng sau khi ăn chiên nhồi rễ sen. Rễ sen được chân không đóng gói và bán unreữigerated. Các điều kiện này được cho phép cho sự phát ứiển và sản xuất độc tố của c. botulinum. Canada - ít nhất 37 người đã bị ảnh hưởng sau khi ăn tại một nhà hàng mà được sử dụng một nhiệt độ lạm dụng unacidiííed tỏi ừong dầu vốn đã được bảo quản ở nhiệt độ phòng. - USA - Các trường hợp ngộ độc đã xảy ra do việc tiêu thụ khoai tây salad. Ba ổ dịch đã xảy ra, kết quả là 50 người bị bệnh và tử vong một. Người ta cho rằng các c.botulỉnum được hiện diện ứong khoai tây nướng được sử dụng cho salad này. Những đã được lưu trữ ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong nhiều ngày trước khi sử dụng. - Mỹ - Xào hành tây đã được liên quan đến một ổ dịch tại một nhà hàng ở Mỹ. 28 người đã KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 35 bị ảnh hưởng, với một tử vong. - Anh - bị ồ nhiễm sữa chua hazelnut chịu ứách nhiệm về một ổ dịch dẫn đến 27 người bệnh và tử vong một. c.botulỉnum là nghiền hazelnut được sử dụng trong da ua. - Vào ngày 23/3, 17 bệnh nhân nặng nhất ứong vụ ngộ độc do ăn măng ứe ở tỉnh Nan (Thái Lan) đã được đưa lên Bangkok điều trị. Năm 1991, 90 người ở Ai Cập đã phát bệnh sau khi ăn thức ăn chứa vi khuẩn c. botulinum.Theo Christopher Braden, chuyên gia Trung tâm Atlanta của Trung tâm Kiểm soát và Phòng bệnh của Mỹ (CDC). Chủ yếu do cá. - Việt Nam - Trẻ sơ sinh bị nhiễm độc tố botulin do cha mẹ ứơ lưởi bằng mật ong. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 36 Chương 3: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 3.1. Phương pháp truyền thống để xác định c.botulinum [6] 3.1.1. Thiết bi và vât liêu • • ■ - Tủ lạnh - Giấy thấm khô - Đèn cồn - Dụng cụ vô trùng - Cối và chày vô trùng - Kẹp ghép vô trùng - Pipet có nút và bông gòn vô khuẩu - Dụng cụ phân phối chất lỏng - Ổng nghiệm vồ trùng ( một số cần có nút bần) - Bình ủ yếm khí - Que cấy chuyền - Tủ ấm, 35± l°c và 26 ±l°c - Bình vô khuẩn bảo quản mẫu dự trữ - Giá đựng ống nghiệm - Kính hiển vi nền sáng hay đối đa - Đĩa petri vồ trùng 15 X 100 mm - Ống ly tâm - Máy ly tâm lạnh tốc độ cao - Ổng tiêm vồ trùng, 1 hoặc 3ml, với kích cỡ 25cm, lcm, 6cm để tim vào chuột. - Chuột (khoảng 15-20g) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 37 - Chuồng nhốt chuột, thức ăn cho chuột 3.1.2 Môi trường, dụng cụ, hóa chất - Pepton đệm bufer pepton water (BPW) - Iron suphide Agar (ISA) - Períringns selective Agar ( shahidi ferguson ferữingens, SFP) - Môi trường dịch thể gan băm hay môi trường thịt chín - Môi trường dịch thể TPGY hay với trypsin ( TPGYT) - Môi trường thạch - lòng đỏ trứng - gan - thịt bê hay thạch - lòng đỏ trứng yếm khí. - Dung dịch cồn - odine (iodine 4% trong cồn 70%) - Đệm gen - phosphate vô trùng, pH = 6.2 - Dung dịch nước muối vô trùng - Dung dịch NaOH IN - Dung dịch HC1 IN - Cồn tuyệt đối - Dung dịch trypsin (Difco, 1:250) - Thuốc nhuộm gam, tím kết tinh, hay xanh methylene 3.1.3. Quy trình phân tích 3.1.3.1. Chuẩn bị mẫu trước khỉ phân tích Mau được giải đồng ở nhiệt độ không quá 45°c và được phân tích ngay sau khi giải đồng. Cân lOg (hoặc 25g) mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml (hoặc 225ml) nước pepton đệm và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Mau được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân tùy mật độ hiện diện của c.botulỉnum trong máu. Trước khi cấy, mẫu được xử lý nhiệt ở 70 - 80°c ứong 20 phút để diệt bớt tế bào sinh dưỡng của các vi sinh vật khác. Cấy vào đĩa lml dịch mẫu đã được pha loãng thích hợp vào một đĩa petri vô trùng. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 38 Đỗ 15ml môi trường ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 45°c vào đĩa, lắc đều. sau khi môi trường đã đông, đỗ lên ứên thêm bề mặt khoảng lOml ISA hoặc SFP Agar. Một phương pháp khác là cho thêm một ống nghiệm vô trùng lml dịch mẫu ở nồng độ thích họp, thêm 12ml ISA hoặc SFP Agar đã ủ ấm ở 45°c vào ống trộn đều mẫu. sau khi môi trường đã đông, đỗ thêm lên thêm bề mặt 2-3 ISA hoặc SFP Agar. Đĩa hoăc ống nghiệm đã được cấy mẫu ủ ở 37°c trong 24 - 48h trong các bỉnh kỵ khí. Nếu nghi ngờ Cỉostrỉảỉum chịu nhiệt thực hiện ủ song song ở 37°c và 50°c thông thường đọc kết quả ứên đĩa là dễ hơn trong ống nghiệm. ISA mồi trường không chọn lọc nên các loài sinh H2S khác không phải c.botulinum cũng tăng trưởng được và tạo khuẩn lạc màu đen ứên môi trường này. Để khẳng định khuẩn lạc là c.botuỉỉnum cần thực hiện những quy trình tiêu chuẩn để giúp khẳng định kết quả. Phương pháp này chỉ phân lập Clostridium với các vi sinh vật khác, không phân biệt được các loài Clostridium với nhau như: C.acetobutyỉicum, c.aerotoỉerans, C.beijerinckii, c. bifermentans, c. butyricum,... KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 39 Đồng nhất và pha loãng mẫu theo dãy thập phân xử lý mẫu ở 80°c trong 15-20 phút Tính kết quả Tính kết quả Công thức tính: CFƯ(ml) = (N*R) / (ni.v.fi +...+ ni.v.fi) N: Tổng số khuẩn lạc đếm được R: Tỷ lệ xác xuất V:Thể tích cấy vào mỗi đĩa ni: Số đĩa có khuẩn lạc được chọn U Độ pha loãng tương ứng Hình 3.1 Quỵ trình phân tích C.botulinum Cấy lml dung dịch mẫu vào đĩa petri, đổ 10 - 15 ml môi trường ISA ở 45°c lắc đều Cấy lml dung dịch mẫu vào ống nghiệm vô trùng đổ 10 - 15 ml môi trường ISA ở 45°c lắc đều Đổ lớp ISA thứ 2 khi lớp thứ nhất đã đông đặc Đổ lớp ISA thứ 2 cao hơn l-2cm sau khi lớp thứ nhất đã đông đặc ủ trong bình kín, ở 37°c 24 - 48h ủ trong bình kín, ở 37°c 24 - 48h Đếm tấc cả các khuẩn lạc màu đen đường kính > 0,5 mm Đếm tấc cả các khuẩn lạc màu đen xuất hiện trong ống nghiệm KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 40 Cần phải thực hiên các kiểm tra hóa sinh khác mới khẳng định được. Tính chất của các chủng: Bảng 3.1: Tính chất của các chủng Dựa vào đặc sinh hoá của c.botulinum mà ta kiểm ứa các phản ứng sinh hoá nhằm khẳng định c.botulỉnum. 3.1.4. Phương pháp sử dụng môi trườngTrypticase Peptone Glucose Yeast Extract với Trypsin (TPGYT) Nhóm I II II IV Dạng độc tố A,B,F B,E,F C,D G Làm tan Gelatin + + + + Lên men Glucose + + + - Lên men Fructose ± + ± - Lên men Mannose - + + — Lên men Maltose ± + ± - Lên men Sucroe “ + - - Lên men Trehalose “ + - - Lên men Lactose “ - - - Lipase + + + - Lecithinase - - - - Sinh H2S + + + + KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 41 3.1.4.1. Chuẩn bị mẫu Mẩu được giữ lạnh cho đến khi kiểm tra, trừ các loại thực phẩm đóng hộp còn nguyên. Đánh số thứ tự mẫu. Đối với thực phẩm rắn và lỏng, cho vào cối vô trùng, thêm một lượng dung dịch đệm gen - phosphate rồi nghiền bằng chày vô trùng. Hay có thể gắp từng mẫu nhỏ thực phẩm cho vào môi trường ứăng sinh nhờ cặp ghép vô trùng. Cấy trực tiếp thực phẩm lỏng vào mồi trường nuôi cấy bằng pipet. Chuẩn bị các mẫu dự trữ: sau khi nuôi cấy, chuyển từng phần mẫu dự trữ vào bình dựng mẫu dự trữ và bình dựng mẫu vô trùng để sử dụng các test khi cần thiết. 3.1.4.2. Phát hiện tế bào vỉ khuẩn ❖ Tăng sinh: - Loại bỏ oxy hoàn toàn trong môi trường tăng sinh bằng hơi nước trong 10-1 5 phút và làm lạnh nhanh nhưng không cấy trước khi cấy vào mẫu. - Cấy vào hai ống nghiệm chứa môi trường thịt chín l-2g thực phẩm rắn hay l-2ml thực phẩm lỏng ( cho 15ml môi trường tăng sinh), ủ ở 35°c. - Cấy vào hai ồng nghiệm chứa môi trường TPGY theo như ứên. ủ ở 26°c . Chỉ sử dụng TPGYT thay thế vi khuẩn được nghi ngờ là chuẩn không phân hủy protein chứa các kháng nguyên B, E hay F. - Lưu ý: phải cho mẫu thực phẩm chìm vào bên dưới bề mặt môi trường một cách nhẹ nhàng. Sau 5 ngày ủ, kiểm ứa canh trường vi khuẩn, kiểm tra độ đục của môi trường, sự tạo khí, hay sự phân hủy cơ chất của thịt. Lưu ý mùi tạo thành, kiểm ứa canh trường vi khuẩn dưới kinh hiển vi bằng cách chuẩn bị và quan sát giọt ép dưới kính hiển vi đối pha có độ phân giải cao, hay chuẩn bị vết bôi dịch chứa vi khuẩn nhuộm Gram hay nhuộm đơn với tím kết tinh hay xanh methylene dưới kính hiển vi nền sáng. Kiểm tra hình thái KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 42 vi khuẩn và lưu ý tế bào diễn hỉnh của c.botuỉinum số lượng tìm thấy, mức độ bào tử hóa và vị trí của bào tử trong tế bào. Cũng thời điểm này, kiểm tra vi khuẩn về khả năng tạo toxin theo như cách đã mô tả. Thông thường, toxin được tạo ra với nồng độ lớn nhất sau 7 ngày ủ, ủ thêm 10 ngày nữa để phát hiện ra các bào tử tổn thương do chậm phát triển thành tế bào dinh dưỡng trước khi hấp hơi nước ở áp suất cao để loại bỏ môi trường này. Để phân lập giống thuần, bảo quan canh trường vi khuẩn tại thời điểm tạo nhiều bào tử nhất ở điều kiện 4°c. ♦♦♦ Phân lập giông thuần - Có thể phân lập nhanh các vi khuẩn c.botulỉnum từ hệ vi sinh vật hỗn họp trong môi trường tăng sinh hay từ mẫu thực phẩm ban đầu nếu quá trình tạo bào tử xảy ra tốt. - Tiền xử ỉỷ mẫu để cấy ria: thêm vào ống nghiệm vô trùng có nút bần chứa l-2ml canh trường vi khuẩn một thể tích tương ứng cồn tuyệt đối đã được lọc vô trùng, lắc đều và ủ nhiệt ứong phòng trong 1 giờ. Để phân lập vi khuẩn, lấy 1 -2ml mẫu đã dự trữ cho vào ống nghiệm có nút bần, thêm một thể tích tương ứng cồn tuyệt đối đã lọc vồ trùng, lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong lgiờ. Hay cách khác, có thể đun 1 hay 2ml môi trường tăng sinh có chứa vi khuẩn ở 80°c trong 10-15 phút để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng. Không xử lý nhiệt với các vi khuẩn c.botulinum không phân hủy protein. - Cấy mẫu đã xử lỷ: sử dụng que cấy vòng cấy 1 hay 2 vòng dây cấy chứa đầy dịch mẫu đã xử lý theo một trong 2 phong cách trên lên môi trường thạch - lòng đỏ trứng - gan thịt bê hay thạch - lòng đỏ trứng yếm khí để tách khuẩn lạc phát ứiển riêng lẻ. Nếu cần thiết, pha loãng mẫu đến mức có thể cho các KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 43 khuẩn phát triển dính nhau sau khi ủ. ủ các đĩa khô trước khi đem ủ nhằm tránh vi khuẩn phát triển dính nhau sau khi ủ. ủ các đĩa ở 35°c ứong 48 giờ trong điều kiện yếm khí. ♦> Chọn khuẩn lạc vỉ khuẩn c.botulinum điển hình - Chọn: chọn lấy mẫu 10 khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn c.botulỉnum phát triển độc lập. Những khuẩn lạc này có đặc điểm gồ cao hay dẹt, nhẵn hay xù xì. Chúng thường phát triển và phân bố dàn trải và có mép không đều. Trên môi trường lòng đỏ trứng, chúng có bề mặt óng ánh khi kiểm ứa dưới ánh sáng chiếu lệch góc. Những vùng óng ánh này trông giống như lớp ngọc ứai, theo trước và sau đường viền không điều của khuẩn lạc. Bên cạnh vùng ngọc trai khuẩn lạc c.botulinum loại c, D và E thường được bao quanh bởi một vùng kết tủa rộng (2-4mm), màu vàng. Các khuẩn lạc loại A và B thường có vùng kết tủa nhỏ hơn. Việc phân lập các khuẩn lạc có tính tương đối khó khăn bởi vì một số thành viên nhất định của giống Clostridium cũng do khuẩn lạc có hình thái tương tự nhưng không sinh độc tố. - Cấy khuẩn lạc vào môi trường dịch thể: sử dụng que cấy vòng để cấy khuẩn lạc c.botulinum loại E vào môi trường TPGY , các khuẩn lạc sinh ra các toxin khác vào môi trường gan băm hay môi trường thịt chín. Sau đó đem ủ trong 5 ngày, kiểm ứa sự tạo thành toxin. - Phân lập giống thuần: cấy ria lại các chủng loại toxin lên môi trường thạch lòng đỏ trứng, ủ một đĩa ở 35°c ứong điều kiện yếm khí, còn đĩa kia ủ ở 35°c trong điều kiện hiếu khí. Nếu khuẩn lạc điển hỉnh của c.botuỉinum phát ừiển ừên đĩa thạch đã ủ yếm khí và không phát triển trên đĩa ủ hiếu khí thì giống có thể đã thuần. Nếu không phân lập được c.botulỉnum từ ít nhất KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 44 một ứong các khuẩn lạc đã chọn có nghĩa là mật độ phân bố của chúng ứong hệ vi sinh vật hỗn họp có thể thấp. Tiếp tục cấy chuyền liên tiếp vào môi trường tăng sinh có thể làm tăng số lượng của chúng lên đủ để cho phép phân loại được. Bảo vệ giống thuần ở trạng thái bào tử trong tủ lạnh, trên các hạt thủy tinh, đông lạnh hay đông khô. 3.1.4.3 . Phát hiện độc tổ botulỉn Chuẩn bị mẫu : lấy 1 phần mẫu để phát hiện tế bào vi khuẩn c.botulỉnum sống, 1 phần khác để kiểm tra độc tính. Bảo quản phần mẫu còn lại trong tủ lạnh. Ly tâm các mẫu chứa chất rắn lơ lửng trong điều kiện lạnh và sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính. Chiết mẫu thực phẩm rắn với 1 thể tích tương ứng của dung dịch đệm gel-phosphate, pH= 6,2. Tẩm ướt chất đệm vào mẫu thực phẩm bằng cối và chày đã làm sạch. Ly tâm mẩu đã giã ừong điều kiện lạnh và sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính. Rửa sạch các dụng cụ chứa mẫu nghi có dính thực phẩm với vài ml dung dịch đệm càng tốt để tránh pha loãng toxin đến mức không thể phát hiện được. ❖ Xác định độc tính của mẫu thực phẩm hay canh trường vi khuẩn - Xử lỷ với ừypỉn : nếu có mặt các độc tố của các vi khuẩn không phân hủy protein trong mẫu thì cần phải kích hoạt bằng trypin để xác định. Vỉ vậy, cần xử lý phần lỏng của mẫu rắn sau khi ly tâm, hay mẫu lỏng, hay dịch môi trường thịt chín chúng vi khuẩn với trypin trước khi phát hiện độc tính. Không xử lý trypin với môi trường TPGY, bởi vỉ môi trường này đã chứa sẵn trypin và nếu xử lý tiếp với trypin có thể làm giảm hoạt tính của các toxin đã được kích hoạt ở mức cao nhờ trypin có sẵn trong môi trường. Điều chỉnh pH của phần mẫu lỏng về 6,2 với dung dịch NAOH IN hay HC1 IN. Thêm 0,2ml dung dịch trypin bão hòa ứong nước vào l,8ml mỗi phần mẫu lỏng, ủ dịch hỗn họp này ở 35-37°C ứong 1 giờ, thỉnh thoảng trộn đều, KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 45 để kiểm tra độc tính. Để chuẩn bị dung dịch trypin, cho lgam trypin (Difco, 1:250) vào một ống nghiệm sạch và thêm lOml nước cất, lắc và hơ nóng nhẹ để hòa tan. - Kiểm tra độc tỉnh: tiến hành các test song song trên các mẫu đã xử lý và không xử lý với trypin (lặp đôi). Pha loãng 1 phần của mẫu lỏng hay canh trường vi khuẩn chưa xử lý đến 1:2 , 1:10 và 1:100 , trong dung dich đệm gel-phosphate. Tiến hành pha loãng tương tự với từng mẫu loãng hay canh trường vi khuẩn đã được xử lý với trypin. Tiêm vào bụng mỗi con chuột, theo từng cặp chuột, 0,5ml mẫu lỏng chưa pha loãng vào 0,5ml mẫu kiểm tra chưa xử lý ở mỗi độ pha loãng bằng cách sử dụng ống tiêm 1 hay 3ml với kim cỡ 25cm, l,6cm. Lặp lại các bước này với các mẫu đã xử lý với trypin (lặp đồi). Đun l,5ml mẫu lỏng hay canh trường vi khuẩn trong lOphút ở 100°c. Làm lạnh rồi tiêm 0,5 (chưa pha loãng) vào từng con chuột theo từng cặp. Chuột sẽ không chết, bởi vì độc tố botulin nếu có sẽ bị bất hoạt bởi nhiệt. - Quan sát tất cả các con chuột theo từng khoảng thời gian nhất định trong 48giờ. Ghi nhận triệu chứng và thời gian chuột chết. Triệu chứng ngộ độc ở chuột bắt đầu thường ứong 24 giờ đầu tiên, lông xù lên, thở mạnh từng hồi, cơ thể yếu dần, cuối cùng là liệt và hơi thở yếu hẳn rồi chết. Nếu chuột chết mà không có các ừiệu chứng ở trên thì không có đủ bằng chứng để kết luận rằng độc tố botulin có trong chất lỏng tiêm vào chuột. Đôi khi chuột chết là do các họp chất độc có trong mẫu tiêm hay nhiễm trùng do vết thương. 3.2. Phương pháp hiện đại xác định c.botulỉnum 3.2.1. Phương pháp Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) 3.2.1.1. Khái niệm KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 46 Được sử dụng để phát hiện độc tố hoạt tính sinh học và sự dò tìm độc tố không tích cực. Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng kết họp giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên - kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh đấu (bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzym). Phương pháp này có thể sử dụng cho hầu hết tất cả kháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Nguyên tắc của kỹ thật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng, nếu có sự hiện điện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ giữ lại ứên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzym như horseradish peroxydase hay alkaline phosphatese. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyem vào giếng, enzyme xúc tác thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên. 3.2.1.2. Quy trình thực hiện ❖ Nguyên vật liệu cơ bản - Máy đọc ELISA có bước sóng 405nm - Bản nhựa 96 giếng đáy phẳng (của hãng NƯNC, Denmark) - Pipetman loại 20, 200, 1000 microlit và đầu typ tương ứng - Dung dịch TYG: Môi trường dịch thể Trypticase (Tryptic) - Pepton-Glucose-Yeast Extrace với Trypsin ( TPGYT). - Hòa tan các thành phần rắn của môi trường cơ bản và cho vào ống nghiệm 20x150mm từng thể tích 15ml hay cho lOOml vào các lọ dung tích 170ml có vạch chia. Hấp tiệc trùng các ống nghiệm ở 121°c trong 10 phút và các lọ ứong 15 phút ở 121°c pH=7. Bảo quản ở 5°c. Thêm Tripsin nagy khi sử KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 47 dụng - Mầu c. botulinum. - Mau chứa huyết thanh thỏ có kháng thể TgG - Dung dịch đệm Bicabonate 0.05 M, 0.8g Na2CƠ3 + 1.47g NaHCƠ3 trong 500ml nước cất ở pH =9.6 - 1% dung dịch đệm casein - Đệm NaCl 0.005%, tween 20 6.04g Trisbazo; 8,76g NaCl, thêm 900ml nước cất phân hủy Tris và NaCl, điều chỉnh pH = 25°c với HC12M và 50ml dung dịch tween 20 và định mức tới vạch 1 lít. - Dung dịch đừng phản ứng H2SO4 0,3M pha loãng. ❖ Các bước tiến hành ELISA > Chuẩn bị hỗn hợp dịch vi khuẩn - Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm trên môi trường TPGY Hoặc CMM ở 37°c. Sau 24h sinh trưởng ở 37°c, 5ml môi trường được cho vào môi trường thẩm tích bao gồm: 2.5 lít Peptone Protease 4%, 1% chiết nấm men, 1% dextrone. - Điều chỉnh pH trung bỉnh đến 7.3 trước khi khử trùng. - Môi trường được ủ ở nhiệt độ phòng 10 ngày. - Môi trường nổi trên mặt được ly tâm 18000 vòng ứong 20 phút. - Chất lỏng nổi lên trên bề mặt được tách riêng và đem đi đông lạnh với thể tích như nhau của glycerol. > Kỹ thuật ELISA xác định kháng thể đặc hiệu kháng Clostridium chất dịch của mẫu » $ Chuẩn bị mẫu đổi chứng - Mau âm tính: bản sao giống với tấc cả các thuốc trừ độc ( không pha loãng vồ trùng CMM & TPGY) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 48 - Mau dương tính kiểm tra độc tố chuẩn loại A, B, E, F pha loãng vô trùng CMM & TPGY (pH=7.6 ở nồng độ 2pg/ml). $ Chuẩn bị mẫu toxin ở dạng thô hoặc lọc sạch - Bước l(gẳn bảng nhựa): cho mẫu chứa kháng thể IgG để kết họp với kháng nguyên ở mẫu pha loãng 1:500 ứong dung dịch đệm carbonate, pH=9.6. Cho lOOpl/giếng, ủ qua đêm ở 4°c. Rửa 3 lần bằng dung dịch PBS-Tween 20 0.05%. - Bước 2 (gắn kháng nguyên): Cho 300|il mẫu chứa kháng nguyên 9 với nồng độ 109 tế bào/ml) hoặc ở dạng siêu nghiền đã pha loãng ở nồng độ lOpg/lml trong dung dịch đệm PBST vào mỗi giếng của bảng, ủ 60-90 phút ở 35°c. Sau đó rửa bảng với dung dịch rửa PBS- Tween 0.05% (3-5) lần. - Bước 3: Phủ bảng nhựa bằng dung dịch PBS-sữa không béo 5% PBS-Tween 20 0.05%. cho 300pl/giếng. - Bước 4: Đem ủ mẫu chứa độc tố 2h, 35°c. Rửa mẫu trên 5 lần trong PBST. - Bước 5: Thêm lOOpl/giếng biotin để pha loãng chứa kháng thể có gắn nhãn peroxidase, ủ 60 phút, ứong 35°c. - Bước 6: Rửa mẫu trên với PBST loại bỏ các phần không liên kết. - Bước 7: Cho lOOpl cơ chất TMB vào mỗi giếng, ủ ứong tủ ấm 37°c trong 15-30 phút, không rửa. - Bước 8: Phản ứng có thể dừng lại nếu cho vào H2SO4 0.3M. $ Đọc kết quả: - Đọc bằng mắt thường nhờ bảng so màu - Đọc bằng máy ELISA: Đọc kết quả ở bước sóng 405nm và ghi nhận kết quả: KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 49 ■ Kết quả thử nghiệm xem như dương tính nếu tỷ lệ mật độ quang (OD) của thử nghiệm và chứng âm là >2.3 ■ Ngưỡng phản ứng = 2.3 X OD chứng âm ■ OD mẫu > OD ngưỡng: Dương tính ■ OD mẫu < OD ngưỡng: Âm tính KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 50 SANDVMCH ELISA ASSAY METHOD Copyrighi Elisa acsay com 1 ) 2 ) •% 3 > 4 ) „ Y , IÝJ . Y . . Y J 5 ) l±J Coat ptate a capture antibody Add Sampie to vveỉl. antigen bmdỉ to capture antibocty Dttechng anbbody 3dded. and bmds to anbgen EnzyĩT>e-hnked socondary (2o) antibody «s ađded. b»nds to detocting antibody Subs-trate added. Substrate IS convetteđ by eniymo to déto ctáble form <hght or colour) Mơnơcỉơnaỉ antitoơcty-cơatecỉ we/ỉ Anttgơn bỉrtds tơ antibơdy “V V V *r V" \ 1A/ash / . ---------------- — ' ■ [A/tìStr ^ ---------------------------------------- Suí>str&t& ỉs *3Ơơoct anơ cơnvơrteơ t>y ơnz:ymơ in tơ ơơỉơr prơduơt Enzym&-iink.&ơ monocionsi sntibocỉy ỈDĨrtds to immotìiii^eoỉ antỉgen f/gure 2 Sandwich ELỈSA Hình 3.2 Phương pháp ELISA * Antigen m substrate À antíbody X enzyme-linked antibody Chú ỷ: Giá trị OD của hai giếng trên cùng một mẫu lệch nhau gấp đôi thì cần xét nghiệm lại mẫu đó. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 51 3.3 Phương pháp PCR Tất cả các chủng c.botulinum được nuôi cấy ứong 10 ml Tryptose- Peptone-glucose- Yeast extract (TPGY) và ủ ứong điều kiện kỵ khí ở 37°c trong 24-48h, tiếp theo nuôi qua đêm (20 giờ ở nhiệt độ tương ứng). Bướcl. Chuẩn bị khuôn mẫu: Lấy 1 ml dung dịch chứa tế bào từ môi trường, rửa sạch với 1 ml đệm TE (0,01 M Tris-HCl, EDTA 0,001 M ,PH 8.0) trong 1 giờ ở 37°c và ngâm trong 1 ml nước cất. Ngoài các tế bào riêng rẻ được phân lập của từng chủng vi khuẩn, ba hỗn hợp được phân lập chứa các c.botulinum thủy phân protein loại A, B và F, các c.botulinum không thủy phân protein loại B, E , và F hoặc tất cả bốn huyết thanh đã được chuẩn bị bằng cách trộn riêng rẻ các tế bào được phân lập. Mọi các tế bào phân lập được đun nóng ở 99° c trong 10 phút để chia tế bào và phát hành các DNA của vi khuẩn và đã ly tâm trong 5 phút ở 10.000 X g. Một khối lượng của lịil của nổi trên mặt từng được sử dụng như bản mẫu trong hỗn hợp PCR. Tất cả được đun nóng ở 99°c trong 10 phút nhằm phá vỡ tế bào và tách chiết DNA của c.botulỉnum. Ly tâm trong 5 phút ở 10.000 vòng/phút. Khoảng 1 Ịil dịch nổi trên mặt được sử dụng như bản mẫu trong hỗn họp PCR. Bước2. Mồi: Dựa trên công bố trình tự DNA của gen BoNT, bốn cặp mồi mới với nhau được cụ thể cho cả hai loại c. botulỉnum A, B, E, hoặc F được thiết kế (Bảng 2) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 52 Bảng 3.2: Mồi bắt cặp của c.boíulinum Bảng 2: Môi cho multiplex PCR của c.otulinum loại A, B, E và F Loại Mồi Nhiệt Chuỗi (5 -3’ ) Produrct Vị ừí ĐỘGC Size (bp) (mã vùng) ( °C) ừên gen (%) Af CBMLA1 63.9 AGC TAC GGA GGC 52 AGC TAT GTT 782 1788-1808 Ar BMLA2 CGT ATT TGG AAA GCT GAA AAG G 2569-2548 63.4 41 Bf CBMLB1 64.3 CAG GAG AAG TGG 50 AGC GAA AA 205 434-453 Br CBMLB2 CTT GCG CCT TTG TTT TCT TG 638-619 64.5 45 Ef CBMLE1 CCA AGA TTT TCA 389 TCC GCC TA 156-175 63.7 45 Er CBMLE2 GCT ATT GAT CCA AAA CGG TGA 544-525 63.6 43 Ff CBMLF1 CGG CTT CAT TAG 543 AGA ACG GA 185-194 64.1 50 Fr CBMLF2 TAA CTC ccc TAG ccc GGT AT 727-708 63.3 55 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 53 1 2 3 4 5 0 7 * 0 Bước 3. PCR: PCR được thực hiện với 50 Ịil của hỗn hợp phản ứng có chứa 1 (0.1 của mẫu, 0,3 pM của mỗi mồi, 220 nM của mỗi ứiphosphate deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, và dTTP), 32 mM Tris-HCl (pH 8,4), 80 mM KC1, 4,8 mM MgCl, và DNA polymerase. Các sản phẩm PCR khuyếch đại được xác định ở agarose gel 2% nhuộm màu với ethydium bromide. Bước 4. Đọc kết quả: Multiplex PCR của tế bào c.botulỉnum loại A, B, E, và F mang lại những sản phẩm khuếch đại dự kiến (Bảng 3.2): loại A: 782 bp; loại B: 205 bp; loại E: 389 bp; và loại F 543 bp (Hình 3.3). Hỗn hợp bị đình các tế bào mang các đoạn DNA tưomg ứng. Các sản phẩm PCR được hình dung rõ ràng trong gel agarose, từ 150bp đến 200bp khác biệt trong kích thước của mỗi sản phẩm khuếch đại kích hoạt một sự phân biệt giữa các mảnh vỡ dễ dàng mà không cần sử dụng độ phân giải cao agarose. ( í ]Ợ)Ộ -♦ $1$ -• MKI -♦ 1 5 0 > Hình 3.3 Phương pháp điện đi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 54 Multiplex PCR phát hiện của c. botulỉnum. Đường 1: trọng lượng phân tử đánh dấu; 2: c. botuỉỉnum loại A; 3: c. botulỉnum loại B; 4: c. botuỉinum loại E; 5: c. botulinum loại F; 6: c. botuỉỉnum thủy phân protein loại A, B và F; 7: c. botuỉỉnum không thủy phân protein loại B, E và F; 8: c. botulỉnum loại A, B, E, và F; và 9: tiêu cực kiểm soát. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 55 Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 4.1 Kết luận Botulism là một bệnh rất nguy hiểm nhưng hiếm xảy ra. Mấy năm gần đây, cơ quan FDA Hoa Kỳ và CFIA Canada cũng thỉnh thoảng ra cảnh báo về bệnh botulism và cho lệnh thu hồi một vài loại sản phẩm nhiễm khuẩn bày bán trên thị trường chẳng hạn như Hot Dog Chili Sauce Castleberry’s Ford Cpy USA, Austex Hot Dog Chili Sauce, Kroger Hot Dog Chili Sauce, Chili French Style Green Beans Lakeside Foods, Bolthouse Farm 100% Carrot Juice (Canada), Hot Great Value Original Chili with Beans. Tuy nhiên độc tố botulism cũng có được vài ứng dụng ích lợi trong y khoa trị liệu. Độc tố A (BTXA) được sử dụng để trị những xáo trộn thần kinh gây sự co thắt cơ, bệnh chứng gây ngứa ngoài da (prurit cutané), đau cơ vùng mặt (douỉeur myo/acỉale), tiết quá nhiều mồ hôi (hyperhỉdrose), nhức đầu (migraine)... Gần đây, do một sự tình cờ lý thú trong lúc dùng Toxine để trị chứng mí mắt co thắt bất thường (bỉépharospasme) ở một bệnh nhân, các bác sĩ đã khám phá thêm một tác dụng khác của độc tố là nó có thể làm tan biến và xóa bớt nếp nhăn trên mặt một cách tạm thời. Thế là độc tố botulism nhảy vào lĩnh vực thẩm mỹ với sự xuất hiện của thuốc Botox® Cosmetic (toxinA), Myobloc (toxinB), Dysport và Vistabel. Tất cả đều được bào chế từ độc tố botulism. Botox có thể giúp xoá bỏ đi các nếp nhăn trên trán, hai bên khóe mắt còn gọi là vết chân chim (patte d’oie, crows feet), khóe miệng, giữa hai chân mày.. .Nhưng đây là lĩnh vực làm giàu cho thẩm mỹ và cũng làm giàu cho luật sư. 4.2 Kiến nghị Sau khi hoàn thành bài khóa luận này, tôi nhận thấy c.botuỉỉnum là một vi sinh vật rất nguy hiểm với tấc cả khi nhiễm độc tố botulism này. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 56 Vì thế, c.botulinum và độc tố botulism của nó được sử dụng làm vũ khí sinh học với sức lan tỏa và hủy diệt mạnh nhất hành tinh. Thực phẩm nhiễm c.botuỉỉnum rất khó nhận biết bằng cảm quan chỉ nhận biết qua những biểu hiện lâm sàn. Chúng ta phải thực hiện tốt các biện pháp kiểm soát chúng vì độc tố của vi khuẩn này rất mạnh khi nhiễm tỷ lệ tử vong rất cao. Cần tuyên truyền cho người dân hiểu biết về nguy hại của các loại thực phẩm có khả năng nhiễm khuẩn c.botulỉnum. Quản lý và thực hiện đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm ở tấc cả các khâu chế biến và bảo quản thực phẩm, cần có những biện pháp xử lý những vi phạm vệ sinh an toàn thực phẩm thích hợp nhằm đảm bảo quyền lợi của người tiêu dùng và sức khỏe cộng đồng. Tìm hiểu về nguyên nhân và các biểu hiện bệnh để xử lý kịp thời tránh những hậu quả đáng tiếc xảy ra. TÀI LIỆU THAM KHẢO ❖ PHẨN TIẾNG VIỆT [1] . Bộ môn vi sinh - khoa Y - Đại học Y Dl2lợc TP. HCM, 1996. Vi khuẩn học. [2] . TH.S PHẠM MINH NHựT, 2010. Bài giảng“ Phân tích đánh giả chất lượng thực phẩm [3] . TH.S PHẠM MINH NHựT, 2010. Bài giảng“ Thực hành phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm ”. [4] . Lê Đình Hùng, 1998. Đại cương về phương pháp kiểm tra vỉ sinh vật thực phẩm. Trung tâm Tiêu Chuẩn Đo LDHỜng Chất LDHợng khu vực III, TP. HCM. [5] . LDHơng Đức Phẩm, 2002. Vỉ sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm.Nhà xuất KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Trang 57 bản Nông Nghiệp - Hà Nội. [6] . Trần Linh ThlMc, 2006. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản Giáo Dục. [7] . Nguyễn Ngọc Tuân, 2002. Vệ sinh thịt. Nhà xuất bản Nông Nghiệp - TP. HCM. ❖ PHÀN TIẾNG NƯỚC NGOÀI [8] . Clinical Verterỉnary Microbiologin. [9] .FAO,1992. Microbiological analysỉs ỉn the food centrol laboratory 10.P. J. Quinn và cs, 1994. Clirical Verterỉaary Microbiology ❖ PHẦN TRANG WEB [11] . http:// vm.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4a.html [12] .Clostridium botulinum: ecology and control in foods by Andreas H. w. Hauschild,Karen L. Dodds.