Khóa luận Xác định đồng thời hàm lượng paracetamol và caffein trong một số dược phẩm bằng phương pháp HPLC

ng thức của phép sắc kí.Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: sắc kí lớp mỏng áp suất cao (HPTLC) và sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Trong nhóm HPLC, tùy theo bản chất của quá trình sắc kí của pha tĩnh trong cột tách mà người ta chia thành: − Sắc kí phân bố (PC) của chất tan giữa hai pha không tan (trộn) vào nhau. − Sắc kí hấp phụ pha thường (NP-HPLC). − Sắc kíhấp phụ pha ngược hay pha đảo (RP- HPLC). − Sắc kí trao đổi ion (IEX-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC). − Sắc kí rây phân tử (FG-HPLC). 1.1.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC Hệ thống trang bị của kỹ thuật HPLC, về cơ bản (đơn giản và đủ để làm việc được theo kỹ thuật HPLC) bao gồm 5 bộ phận chính sau đây: a) Bơm cao áp: Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc kí, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc kí. Bơm phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar) để tạo ra được những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc kí, phải có tốc độ nằm trong vùng 0,5 – 3 ml/phút. b) Van bơm mẫu: Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc kí. Đó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích xác Trang 4 định (20, 50 hay 100µl).Van 6 chiều chỉ có một vòng mẫu, nhưng van 10 chiều thì có 3 vòng mẫu. c) Cột tách: Cột tách là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình tách sắc kí. Nó là một trong những yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc kí của một hỗn hợp chất mẫu. Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ sắc kí. Nói chung, các cột tách phân tích thường có kích thước chiều dài từ 10 – 25 cm; đường kính trong thường từ 2 – 5 mm. d) Bộ phận phát hiện chất phân tích: Đây thường là các loại detector dựa theo các tính chất của chất phân tích. Một số detector thông dụng như: − Detector hấp thụ quang phân tử,vùng phổ UV-VIS. − Detector nguyên tử phát xạ (AES) hay hấp thụ nguyên tứ (AAS). − Detector huỳnh quang phân tử. − Detector điện hoá (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng). − Detector chiết suất. − Detector đo độ dẫn nhiệt. − Detector diode phát quang và diode mảng. − Detector phổ khối lượng. Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp để đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như khi định lượng chúng. Trong các loại trên, thì detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS hiện nay đang được dùng phổ biến nhất vì nó thích hợp cho nhiều loại chất và lại không quá đắt. e) Bộ phận hiển thị kết quả: Bộ phận hiển thị kết quả có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là các máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng các pic của các chất, rồi đến bộ tích phân kế (intergrator), sau đó máy tính và máy in kèm theo để xử lý kết quả và in kết quả. Trang 5 Đó là 5 bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống máy HPLC. Những hệ thống máy HPLC hoàn chỉnh, hiện đại, ngày nay còn có thêm: − Bộ chương trình gradient dung môi (pha động). − Bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu. − Bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột tách sắc kí. − Máy tính và các chương trình (phần mềm) điều khiển toàn bộ hệ thống HPLC và xử lý kết quả tách, in kết quả tách. Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống HPLC. 1.1.3. Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột Trong quá trình sắc kí các phân tử chất tan luôn phân bố qua lại giữa hai pha trong khi pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định. Mặt khác, do cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau trong quá trình di chuyển từ đầu cột đến cuối cột sắc kí. Khi ở trong pha động, phân tử chất tan dịch chuyển theo tốc độ của pha động; khi ở trong pha tĩnh, phân tử chất tan bị giữ lại. Như vậy sẽ có một thời gian nhất định chất tan bị lưu giữ lại trong cột sắc kí. Vì vậy, trong quá trình sắc kí, có chất bị lưu giữ lâu trên cột, có chất tan ít bị lưu giữ. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kí ở đây là tổng của các mối tương tác: injector Trang 6  Giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1).  Giữa chất phân tích và pha động (F2).  Giữa pha tĩnh và pha động (F3). Hình 1.2.Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải. Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước. Đối với mỗi chất,sự lưu giữ được qui định bởi ba lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột (như hình dưới đây). Hình 1.3.Quá trình tách sắc kí của các chất. Trang 7 1.1.4. Các đại lượng đặc trưng 1.1.4.1. Thời gian lưu Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc kí sẽ bị lưu giữ ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định. Thời gian lưu là thời gian tính từ lúc bắt đầubơm mẫu vào cột cho tới khi pic đạt giá trị cực đại. Như vậy nếu gọi tRi là thời gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có: tRi = ( to + t′Ri ) Trong đó: + to là thời gian không lưu giữ ( thời gian chất tan nằm trong pha động ) + t′Ri là thời gian lưu giữ thực của chất i ở trong cột sắc kí (thời gian lưu hiệu chỉnh) Nếu to = 0 thì ta sẽ có tRi = t′Ri. Trường hợp này chỉ có khi tRi là rất nhỏ (thường là khi tRi nhỏ hơn 4 phút). Hình 1.4. Thời gian lưu trong HPLC. Giá trị t′Ri của một chất tan trong quá trình sắc kí là phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Ví dụ như:  Bản chất sắc kí của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp.  Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động. Trang 8  Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế.  Trong một số trường hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha động, nồng độ chất tạo phức nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc kí. Giá trị thời gian lưu t′Ri có ý nghĩa rất lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc kí. Vì nó cho ta biết các chất tan (chất phân tích) trong hỗn hợp mẫu được rửa giải ra như thế nào trong các điều kiện thí nghiệm và một hệ pha đã chọn. Đồng thời đó cũng là đại lượng để chúng ta phát hiện định tính một chất. Mặt khác, trong một hệ sắc kí chúng ta còn có: tRi = L / ui (1.1) to = L / uo (1.2) tRi = to ( 1 + k′i ) (1.3) Trong đó ui và uo là tốc độ tuyến tính của pha động; ki′ là hệ số dung lượng của chất tan i; L là chiều dài của cột sắc kí. 1.1.4.2. Hệ số phân bố Quá trình tách sắc kí của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong quá trình sắc kí. Sự phân bố này được đặc trưng bởi mộtđại lượng gọi là hệ số phân bố K i của chất i. Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nồng độ của chất tan i ở trong pha tĩnh và pha động và nó được tính theo công thức: 𝐾 = 𝐶𝑖𝑆𝑃 𝐶𝑖𝑀𝑃 (1.4) Trong đó CiSP và CiMPlà nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và pha động. Hệ số Ki cho ta biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh). 1.1.4.3. Hệ số dung lượng Hệ số dung lượng k’cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan i phân bố vào trong mỗi pha là bao nhiêu. 𝑘′𝑖 = 𝑚𝑆𝑃𝑚𝑀𝑃 (1.5) Trang 9 Mối quan hệ giữa hệ số dung tích ki′ và hệ số phân bố Kithể hiện qua phương trình sau: 𝑘′𝑖 = 𝐾𝑖 . 𝑉𝑆𝑉𝑀 (1.6) 1.1.4.4. Hệ số tách α Hệ số tách α (hay còn gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B) là đại lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc kí. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố và là tỉ số của hệ số phân bố của hai chất. 𝛼 = 𝐾𝐴 𝐾𝐵 = 𝑘′𝐴 𝑘′𝐵 = 𝑡′𝑅𝐴 𝑡′𝑅𝐵 (1.7) Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α ≠ 1 1.1.4.5. Số đĩa lý thuyết N Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc kí, người ta dùng khái niệm số đĩa N. Đây là một đại lượng, về hình thức, có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc kí như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) là H. Tất nhiên đây là lớp có tính chất động, và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như: - Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay mảnh. - Độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh. - Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (chất phân tích). - Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc kí. - Độ nhớt của pha động. Vì thế với một hệ nhất định và trong những điều kiện sắc kí đã chọn, thì chiều cao H cũng có những giá trị xác định ứng với các chất tan. Chiều cao lí thuyết H và số đĩa lí thuyết N được xác định theo công thức: 𝐻 = 𝐿 16 ( 𝑊𝑖 𝑡𝑅𝑖 )2 (1.8) 𝑁 = 𝐿 𝐻 = 16. ( 𝑡𝑅𝑖 𝑊𝑖 )2 (1.9) Trong đó Wi là chiều rộng đáy pic sắc kí và tRi là thời gian lưu của chất i. Trong thực tế của quá trình sắc kí, thì số đĩa hiệu dụng Nef và chiều cao hiệu dụng Hef của một cột sắc kí mới là đại lượng giúp ta đánh giá đúng được khả năng của Trang 10 một cột tách và hiệu quả của nó là như thế nào, tốt hay không tốt trong mỗi trường hợp cụ thể. 𝐻𝑒𝑓 = 𝐿16 ( 𝑊𝑖𝑡𝑅𝑖−t0 )2 (1.10) 𝑁𝑒𝑓 = 16. ( 𝑡𝑅𝑖−t0𝑊𝑖 )2 (1.11) Nếu giá trị Nef là quá nhỏ thì không có sự tách tốt của các chất, hoặc sự tách không hoàn toàn.Nhưng nếuNef là quá lớn thì cũng không cần thiết. Vì khi đó pic sắc kí của các chất tách xa nhau quá và việc rửa giải là tốn nhiều pha động. 1.1.4.6. Độ phân giải R Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép sắc kí. Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao. Độ phân giải được tính theo công thức sau: RAB = 2.(tRB−tRA)WA + WB (1.12) Nếu R càng lớn thì hai chất A và B càng tách ra xa nhau, khi này giữa hai pic sẽ có một đoạn đường nền nằm ngang theo trục hoành của biểu đồ sắc kí. Song nếu đoạn đường nền này dài quá thì cũng không cần thiết. Vì như thế ta tốn nhiều dung môi (pha động) để rửa giải các chất hơn. Do đó giá trị R chỉ vừa đủ để tách hoàn toàn hai chất ra khỏi nhau là tốt. Nghĩa là chỉ cần hai pic vừa tách ra khỏi hẳn nhau dứt khoát là được. Trang 11 a) b ) c) Hình 1.5. Giản đồ về sự tách hai pic sắc kí A và B a) Tối thiểu để có sự tách. b) Đủ để hai chất tách khỏi nhau. c) Hai chất tách xa hẳn nhau. 1.1.4.7. Phương trình Van Deemter Phương trình Van Deemter thể hiện mối quan hệ giữa chiều cao H của một đĩa và tốc độ tuyến tính của pha động u. Phương trình Van Deemter được viết như sau: 𝐻 = 𝐴 + 𝐵 𝑢 + [𝐶𝑆 + 𝐶𝑀]𝑢 Trong đó: + A: hệ số mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán xoáy đến H. + B: hệ số khuếch tán dài. + CS và CM: hệ số chuyển khối của pha tĩnh và pha động. Nếu biểu thị các đường biểu diễn tổng cộng trong quan hệ của H với u thì chúng ta có được đường cong Van Deemter. Trang 12 Hình 1.6. Phương trình đường cong Van Deemter. Hệ số A phụ thuộc vào đường kính hạt nhồi dp trong pha tĩnh; cách chúng được nhồi trong cột hoặc được phủ trên bản mỏng được biểu diễn qua λ (hệ số nạp cột) phụ thuộc vào độ đồng thể của chất nhồi, dạng hình học và kích thước của cột: A = 2.λ.dp (1.13) Hệ số B chỉ ra cho ta ảnh hưởng của hệ số khuếch tán DM của chất tan ở trong pha động theo hướng chiều dài của cột. B = 2γ. DM (1.14) Trong đó: + DM: hệ số khuyếch tán của chất tan ở trong pha động theo hướng chiều dài của cột. + γ: hằng số đặc trưng cho sự khuếch tán trong một đơn vị thời gian và trong điều kiện cột nạp tốt thì giá trị γ hầu như bằng 1. Hệ số C tỉ lệ thuận với tốc độ pha động và ảnh hưởng đáng kể đến đường cong H – u. Hệ số CM và CS được tính theo công thức sau: CM = ϕ.(dp)2 / DM (1.15) CS = k . ρ2 / DS (1.16) Trang 13 Trong đó: + ϕ: một hệ số thực nghiệm, nó được quyết định bởi hệ số dung tích k i’ của chất tan. + k: một hằng số phụ thuộc vào điều kiện nạp cột, và thường nhỏ hơn 2. + ρ:tỷ khối của pha tĩnh. + Ds: hệ số khuyếch tán của chất tan trong pha tĩnh. Đường cong Van Deemter được dùng để xác định tốc độ pha động tối ưu uopt mà tại tốc độ đó chiều cao đĩa H là nhỏ nhất nên hiệu quả tách là tốt nhất. 1.1.5. Định lượng bằng HPLC 1.1.5.1. Phương trình cơ bản để định lượng Trong kỹ thuật HPLC, để định lượng một chất, người ta dựa theo hai phương trình cơ bản sau đây về mối quan hệ giữa pic sắc kí (diện tích, hay chiều cao) của chất với nồng độ C của chúng được bơm vào cột tách. H = a.C + b (1.17) S = a.C+ b (1.18) Trong đó: + H : Chiều cao pic sắc kí của chất. + S : Diện tích pic sắc kí của chất. Hình 1.7.Mối quan hệ H = f(C) và S = f(C) Trang 14 Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật HPLC, chúng ta có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn.Việc chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích. 1.1.5.2. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả Dựa trên (1.17) và (1.18) ta có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn. Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê toán học với các đặc trưng sau: Giá trị trung bình: ∑ = = n i ixn x 1 1 (1.19) Độ lệch chuẩn: ( ) 1 1 2 − − = ∑ = n xx s n i i (1.20) Độ lệch chuẩn tương đối: 100.(%) x sSRD = (1.21) Trang 15 1.2. Paracetamol [3, 4] Tên chung quốc tế: Paracetamol. Công thức phân tử:C8H9NO2. Loại thuốc: giảm đau, hạ sốt. Dược lý và cơ chế tác dụng: Paracetamol (N-acetyl-p-aminophenol hoặc Acetaminophen) là chất chuyển hóa có hoạt tính cuả phenacetin, là thuốc giảm đau, hạ sốt hữu hiệu có thể thay thế aspirin. Paracetamol không có hiệu quả điều trị viêm. Với liều ngang nhau tính theo gam, paracetamol có tác dụng giảm đau và hạ sốt tương tự aspirin. Paracetamol làm giảm thân nhiệt của người bệnh sốt, nhưng hiếm khi làm giảm thân nhiệt ở người bình thường. Thuốc tác dụng lên vùng dưới đồi gây hạ nhiệt, tỏa nhiệt tăng do giãn tĩnh mạch và tăng lưu lượng máu ngoại biên. Với liều điều tri, paracetamol ít tác động đến hệ tim mạch và hô hấp, không làm thay đổi cân bằng axit-bazơ, không gây kích ứng, xước hoặc chảy máu dạ dày như dùng salicylat. Nguyên nhân do paracetamol không tác dụng trên cyclooxygenase toàn thân, chỉ tác động đến cyclooxygenase / prostaglandin của hệ thần kinh trung ương. Paracetamol không tác dụng trên tiểu cầu hoặc thời gian chảy máu. Khi dùng quá liều paracetamol, một chất chuyển hóa là N-bezoquinonimin gây độc nặng cho gan.Liều bình thường, paracetamol dung nạp tốt, không có nhiều tác dụng phụ của aspirin.Tuy vậy, quá liều cấp tính (trên 10g) làm thương tổn gan gây chết người. Những vụ ngộ độc và tự vẫn bằng paracetamol đã tăng lên một cách đáng lo ngại trong những năm gần đây. Hấp thu: Paracetamol được hấp thu nhanh chóng và hầu như hoàn toàn qua đường tiêu hóa. Thức ăn có thể làm viên nén giải phóng kéo dài paracetamol chậm được hấp thu Trang 16 một phần và thức ăn giàu cacbonhydrat làm giảm tỷ lệ hấp thu của paracetamol. Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt trong vòng 30 đến 60 phút sau khi uống với liều điều trị. Phân bố: Paracetamol phân bố nhanh và đồng đều trong phần lớn các mô của cơ thể.Khoảng 25% paracetamol trong máu kết hợp với protein huyết tương. Chuyển hóa: Paracetamol chuyển hóa tại cytocrom P450 ở gan tạo nên chất trung gian là N- acetylbenzoquinonimin, chất này tiếp tục liên hợp với nhóm sulfuryl của glutathion để tạo ra chất không có hoạt tính. Thải trừ: Thuốc thải trừ qua nước tiểu chủ yếu ở dạng đã chuyển hóa, độ thanh thải là 19,3 lít/giờ. Thời gian bán thải khoảng 2,5 giờ. Khi dùng paracetamol ở liều cao (trên 10 g/ngày), sẽ tạo ra nhiều N-acetylbenzoquinonimin làm cạn kiệt glutathion gan.Khi đó N-acetylbenzoquinonimin sẽ phản ứng với nhóm sulfydrid của protein gan gây tổn thương gan, hoại tử gan, có thể gây tử vong nếu không cấp cứu kịp thời. Chỉ định: Paracetamol được dùng rộng rãi trong điều trị các chứng đau và sốt từ nhẹ đến vừa. Đau: Paracetamol được dùng giảm đau tạm thời trong điều trị chứng đau nhẹ và vừa. Thuốc có hiệu quả nhất trong làm giảm đau cường độ thấp có nguồn gốc không phải nội tạng. Paracetamol không có tác dụng trị thấp khớp, là thuốc thay thế cho salicylat (đối với người bệnh chống chỉ định hoặc không dung nạp salicylat) để giảm đau nhẹ hoặc hạ sốt. Sốt: Paracetamol thường dùng để giảm thân nhiệt ở người bị sốt, khi sốt có thể có hại hoặc khi hạ sốt người bệnh sẽ dễ chịu hơn. Tuy vậy, liệu pháp hạ sốt nói chung Trang 17 không đặc hiệu, không ảnh hưởng đến tiến trình của bệnh cơ bản và có thể che lấp tình trạng của người bệnh. Chống chỉ định: Người bệnh quá mẫn cảm paracetamol. Người bệnh thiếu hụt glucose-6-photphat dehydrogenase. Liều lượng và cách dùng: Paracetamol thường dùng uống.Đối với người bệnh không uống được có thể dùng thuốc đạn đặt trực tràng. Không được dùng paracetamol để tự điều trị giảm đau quá 10 ngày ở người lớn hoặc quá 5 ngày với trẻ em.Không dùng cho người lớn và trẻ em để tự điều trị sốt cao trên 39,50C; sốt kéo dài trên 3 ngày hoặc sốt tái phát. Để giảm thiểu nguy cơ quá liều, không nên cho trẻ uống quá 5 liều paracetamol để giảm đau và hạ sốt trong vòng 24 giờ. Để giảm đau hoặc hạ sốt cho người lớn và trẻ em trên 11 tuổi, liều paracetamol thường dùng hoặc đưa vào trực tràng là 320 – 650 mg, cứ 4 – 6 giờ khi cần thiết và không dùng quá 4 g một ngày. Liều một lần lớn hơn (ví dụ 1g) có thể hữu ích để giảm đau ở một số người bệnh. Quá liều: Nhiễm độc paracetamol có thể do dùng một liều duy nhất, do uống lặp lại liều lớn hơn hay do uống thuốc dài hạn. Hoại tử gan là tác dụng độc cấp tính nghiêm trọng nhất do quá liều và có thể gây tử vong. Những biểu hiện thường gặp: buồn nôn, nôn và đau bụng thường xảy ra trong vòng 2 – 3 giờ sau khi uống liều đầu của thuốc. Methemoglobin máu dẫn đến chứng xanh tím da, niêm mạc và móng tay là một trong những dấu hiệu đặc trưng nhiễm độc cấp tính p-amionphenol, một lượng nhỏ sulhemoglobin cũng có thể được sản sinh. Trẻ em có khuynh hướng tạo methemoglobin dễ hơn người lớn sau khi uống paracetamol. Khi bị ngộ độc nặng, ban đầu có thể kích thích hệ thần kinh trung ương, kích động và mê sảng. Tiếp theo có thể là ức chế hệ thần kinh trung ương, hạ thân nhiệt, mệt lả, thở nhanh, nôn, mạch nhanh, yếu, không đều, huyết áp thấp và suy tuần hoàn. Trụy mạch do giảm oxy huyết tương và do tác dụng ức chế trung tâm chỉ xảy ra với Trang 18 liều rất lớn. Sốc thuốc có thể xảy ra nếu giảm mạch nhiều. Cơn co giật nghẹt thở gây tử vong có thể xảy ra. Chuẩn đoán sớm rất quan trọng trong điều trị quá liều paracetamol.Khi nhiễm độc nặng, điều quan trọng là phải điều trị hỗ trợ tích cực.Cần rửa dạ dày trong mọi trường hợp, tốt nhất trong vòng 4 giờ sau khi uống.Liệu pháp giải độc chính là dùng những hợp chất sulfhydryl. Ngoài ra có thể dùng than hoạt tính, thuốc tẩy muối hoặc nước chè đặc để làm giảm hấp phụ paracetamol. Các dạng thuốc thường gặp trên thị trường Hiện tại có 4 dạng thuốc hạ sốt chứa paracetamol phổ biến có thể sử dụng rộng rãi trong cộng đồng: Thuốc viên nén hoặc viên nhộng với nhiều loại, nhiều liều lượng khác nhau.Có 3 liều lượng phổ biến cho dạng viên là 100 mg, 325 mg và 500 mg. Một số nhà sản xuất còn có loại thuốc dạng viên nén sủi bọtvới liều lượng thường gặp là 330 mg và 500 mg. Thuốc dạng bột chứa trong gói thường có vị ngọt thích hợp với trẻ em. Có 3 liều lượng phổ biến cho dạng thuốc gói này là 80 mg, 150 mg và 250 mg. Dạng sirô với liều lượng thông thường là 120 mg cho 5 ml dung dịch. Dạng viên thuốc nhét hậu môn. Trang 19 1.3. Caffein [3, 4] Tên chung quốc tế: Caffein. Công thức phân tử: C8H10N4O2. Nhóm dược lí: thuốc hướng tâm thần. Dược lực: Caffein là thuốc thuộc dẫn xuất xanthin được chiết từ cà phê, ca cao hoặc được tổng hợp từ axit uric. Caffein có tác dụng rõ trên thần kinh trung ương. Dược động học: Thuốc hấp thu nhanh qua đường uống và đường tiêm. Thuốc đạt nồng độ tối đa trong huyết tương sau khi uống khoảng một giờ. Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể, qua nhau thai và sữa mẹ, thể tích phân bố 0,4 – 0,6 l/kg. Chuyển hóa: Thuốc chuyển hóa ở gan bằng phản ứng dimethyl và oxy hóa. Thải trừ: Thuốc thải trừ qua nước tiểu chủ yếu ở dạng đã chuyển hóa. Thời gian bán thải khoảng 3 – 7 giờ, kéo dài ở trẻ sơ sinh và trẻ đẻ non. Tác dụng: Trên thần kinh trung ương:caffein kích thích ưu tiên trên vỏ não làm giảm các cảm giác mệt mỏi, buồn ngủ; làm tăng hưng phấn vỏ não, tăng cảm nhận giác quan, do đó tăng khả năng làm việc và làm việc minh mẫn hơn. Tuy nhiên, nếu sử dụng caffein liên tục và kéo dài thì sau giai đoạn hưng phấn là ức chế. Với liều sử dụng cao, caffein tác dụng trên toàn bộ hệ thần kinh trung ương gây co giật. Trên hệ tuần hoàn: caffein kích thích làm tim đập nhanh, mạnh tăng lưu lượng tim và lưu lượng mạch vành. Ở liều điều trị thuốc ít ảnh hưởng đến huyết áp. Trên hệ hô hấp: kích thích trung tâm hô hấp, làm giãn phế quản và giãn mạch phổi. Tác dụng này càng rõ khi trung tâm hô hấp bị ức chế. Trang 20 Trên hệ tiêu hóa: gây táo bón, tăng tiết dịch vị, có thể gây loét dạ dày, tá tràng. Trên cơ trơn: thuốc có tác dụng làm giãn cơ trơn mạch máu, mạch vành, cơ trơn phế quản và cơ trơn tiêu hóa. Trên thận: thuốc làm giãn mạch thận, tăng sức lọc cầu thận, giảm tái hấp thu Na+ nên có tác dụng lợi tiểu, tuy nhiên tác dung lợi tiểu kém. Nguyên nhân là do caffein ngăn cản phân hủy AMPv do ức chế cạnh tranh với phosphodiesterase. Nồng độ AMPv tăng thúc đẩy các phản ứng làm tăng canxi nội bào, tăng hoạt động của cơ tim, tăng chuyển hóa, tăng phân hủy lipid, tăng glucose trong máu. Chỉ định: Caffein được dùng trong các trường hợp kích thích thần kinh trung ương khi mệt mỏi, suy nhược; suy hô hấp, tuần hoàn; hen phế quản. Chống chỉ định: Không dùng caffein với các trường hợp mẫn cảm với thuốc, suy mạch vành, nhồi máu cơ tim, nhịp tim nhanh, ngoại tâm thu. Liều lượng: Ống tiêm: 1ml dung dịch 0,7%. Uống: 0,1 – 0,2 g/lần và 2 lần/ngày. Quá liều: Triệu chứng là mất ngủ, bồn chồn, kích thích nhẹ. 1.4. Các phương pháp phân tích paracetamol Sinan Suzen, Cemal Akay, và các cộng sự sử dụng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng paraccetamol trong dược phẩm vào năm 1998. chương trình sử dụng cột sắc kí C18; hỗn hợp methanol và nước theo tỉ lệ thể tích 1:2 làm dung môi pha động, tốc độ pha động là 1,78 ml/phút tại bước sóng 193,3 nm. Kết quả thu được thời gian lưu của paractamol là 2,560 phút và hệ số thu hồi của paracetamol đạt 98,8% ± 0,83 [5]. Năm 2006, Shulin Zhaovà cộng sựđã sử dụng phương pháp điện di mao quản xác định paracetamol trong dược phẩm. Khoảng tuyến tính nồng độ paracetamol thu Trang 21 được từ 6,6.10-10 M đến 6,6.10-8 M (hệ số tương quan r = 0,9999) và giới hạn phát hiện paracetamol là 5,6.10-10 M [6]. 1.5. Các phương pháp phân tích caffein Hàm lượng caffein có trong huyết thanh người và thức uống có cola đã được Wenrui Jin và các cộng sự xác định bằng phương pháp điện di mao quảnvào năm 2000. Giới hạn phát hiện của caffein thu được là 2,9.10-4 mM và độ lệch chuẩn của thời gian điện di và diện tích pic thu được của caffein lần lượt là 0,68% và 2,3% [7]. Năm 2000, Guzin Alpdogan, Kadir Karabina, Sidika Sungurg dùng phương pháp phổ đạo hàm để xác định caffein trong các loại nước uống như cola, cà phê và trà, lấy phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao được sử dụng làm phương pháp đối chiếu với chương trình sắc kí sử dụng cột C18, hỗn hợp methanol: nước theo tỉ lệ thể tích 30:70 thu được pic sắc kí tại thời gian lưu là 5,14 phút. Kết quả thu được giới hạn phát hiện của caffein với phương pháp trên là 2 μg/g; 1,5 μg/ml và 2 μg/g đối với trà, cola và cà phê [8]. 1.6. Các phương pháp xác định đồng thời paracetamol và caffein H. Tavallali và M. Sheikhaei đã tiến hành xác định đồng thời paracetamol và caffein bằng phương pháp thêm chuẩn điểm H vào năm 2009. Phương pháp dựa trên sự khác nhau về tỉ lệ oxi hóa của hai chất cần xác định với Cu(II) neocuproine và sự tạo thành phức Cu(I) neocuproine tại bước sóng quang phổ là 453 nm và điều kiện pH là 5,0 với sự có mặt của chất hoạt động bề mặt natri dodecyl sunfat. Paracetamol được xác định trong khoảng nồng độ 1,5 – 7,0 µg/ml và caffein được xác định trong khoảng nồng độ 0,1 – 3,0 µg/ml [9]. Năm 2010, Vijaya Vichare, Preeti Mujgond và cộng sự sử dụng phương pháp trắc quang để xác định đồng thời paracetamol và caffein trong các sản phẩm dược. Khoảng tuyến tính thu được nằm trong khoảng 2 – 16 µg/ml đối với paracetamol và 2 – 32 µg/ml đối với caffein [10]. Paracetamol và caffein trong thuốc đã được M. Prodan và cộng sự xác định bằng phương pháp HPLC sử dụng cột C18, dung môi pha động là methanol : nước Trang 22 theo tỉ lệ thể tích 40:60, tốc độ pha động là 0,5 ml/phút. Bước sóng của đầu dò với mỗi chất là 249 nm và 279 nm [11]. M. Levent Altun dùng phương pháp HPLC phân tích đồng thời paracetamol, caffein và dipyrone, sử dụng cột C8 với tốc độ pha động là 1 ml/phút. Hệ dung môi pha động được sử dụng gồm 0,01 M KH2PO4,methanol, acetonitrile, isopropyl alcohol với tỉ lệ thể tích 420:20:30:30 và bước sóng của đầu dò tại 215 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính của paracetamol, caffein và dipyrone lần lượt là 0,409 – 400 µg/ml, 0,151 – 200 µg/ml and 0,233 – 600 µg/ml [12]. Viswanath Reddy Pyreddy cùng cộng sự xác định đồng thời paracetamol, caffein, pseudoephedrine và chlorpheniramine maleate trong dược phẩm bằng phương pháp HPLC vào năm 2011.Chương trình sắc kí sử dụng cột C18 (150mm, 4.6mm và 3µm) với chương trình gradient nồng độ. Hệ dung môi pha động gồm dung dịch A là đệm phosphate (1,0g KH2PO4 trong 1000 ml nước) và dung dịch B là acetonitrile với tốc độ pha động là 1 ml/phút ở 400C tại bước sóng 210 nm và chương trình chạy sắc kí sau: Thời gian (phút) 0 - 5 5 - 10 10 - 15 15 - 17 17 - 20 20 - 25 %VddA 94-94 94-86 86-54 54-52 52 – 94 94 – 94 Kết quả thu được pic sắc kí của paracetamol, pseudoephedrine HCl, caffein và chlorpheniramine maleate theo thứ tự tại phút thứ 6,5; 9,7; 12,0 và 16,2. Khoảng nồng độ tuyến tính thu được của mỗi chất trong khoảng từ 10-60 µg/ml với hệ số tương quan r = 0,999 và hệ số thu hồi đạt 98 – 102% [13]. SM Ashraful Islam , Shamima Shultana, Muhammad Shahdaat Bin Sayeed và Irin Dewan xác định đồng thời paracetamol và caffein bằng phương pháp trắc quang và HPLC sử dụng cột C18 với dung môi pha động là đệm photphat (pH= 5,5) và methanol theo tỉ lệ thể tích là 60:40, tốc độ pha động là 1ml/phút tại bước sóng 273 nm. Khả năng thu hồi đạt 99,29 – 100,19% khi phân tích bằng phương pháp trắc quang và đạt 99,14 – 100,25% khi phân tích bằng phương pháp HPLC. [14]. Trang 23 Thái Duy Thìn đã sử dụng phương pháp HPLC với chương trinh sắc kí sử dụng cột C18 (250 x 4 mm, 10 µm), pha động là dung dịch axit photphoric 0,75% trong hỗn hợp dung môi methanol : nước (35 : 65), tốc độ dòng 1ml/phút. Kết quả thu được thời gian lưu của paracetamol và caffein lần lượt là 2,219 và 6,041. Độ lặp lại của phương pháp tốt với sai số tương đối nằm trong khoảng 0,54 – 1,07% [15] Trang 24 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất, dụng cụ 2.1.1. Hoá chất 2.1.1.1. Chất chuẩn STT Tên chất chuẩn Số lộ hiện hành Số lô thay thế Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Paracetamol QT009 121911 QT009 130312 99,87% 2 Caffein QT028080411 QT028100313 99,70% Dung dịch gốc 1200 ppm được chuẩn bị từ việc cân chính xác lượng chất chuẩn và hòa tan trong metanol tinh khiết loại dùng cho HPLC, được bảo quản trong tủ lạnh. Các dung dịch làm việc được pha từ dung dịch gốc bằng methanol. Các dung dịch loãng chỉ sử dụng trong ngày. 2.1.1.2. Dung môi STT Tên dung môi Nhà sản xuất Tiêu chuẩn Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Acetonitril Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC ≥ 99,80 % 2 Methanol Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC ≥ 99,80 % 3 Water Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC ≥ 99,80 % 2.1.1.3. Chất chuẩn khác STT Tên hóa chất Nhà sản xuất Tiêu chuẩn Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Chlorofom Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC ≥ 99,80 % 2 Acid Phosphoric Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC 85,00 % 3 NaOH Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC ≥ 99,80 % 4 Aceton Trung Quốc Thông thường ≥ 99,50 % Trang 25 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 2.1.2.1. Thiết bị STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã số 1 Bình dựng dung môi 4 kênh Pyrex 1000 ml Germany 00330341 2 Bơm cao áp Pump Perkin Elmer Series 200 3 Bộ loại khí cho dung môi Vacuum Degasser Perkin Elmer Series 200 4 Thiết bị tiêm mẫu Syringe 100 𝜇𝑙 Hamilton 80665 5 Thiết bị nạp mẫu Injector 20 𝜇𝑙 USA 6 Cột sắc kí Brownlee Columns RP - 18 Perkin Elmer Brownlee Columns 07110017 7 Thiết bị ghi tín hiệu UV/Vis Detector Perkin Elmer Series 200 8 Thiết bị nhận tín hiệu và phần mềm điều khiển hệ thống Bộ PC cài đặt phần mềm Total Chrom Workstation ver6.1.3 Intel Phần mềm do Perkin Elmer cung cấp 9 Bộ lọc dung môi cho giấy lọc 0,45𝜇𝑚 Glassico India 10 Máy rút chân không Neuburger KNF-Germany N035AN.18 11 Giấy lọc 0,45𝜇𝑚 Membrane Filter Sterile Whatman, Japan 7141104 12 Máy lắc KS130 Basic IKA - Germany KS130B 13 Máy đánh siêu âm S100H Elmasonic Elma - Germany 101141013 Trang 26 14 Cân phân tích Balances and Precious Metal scales Sartorius 98648-012-13 15 Máy đo quang Lambda 25 UV/Vis Spectrometor Perkin Elmer 101N7062504 16 Máy lọc nước siêu sạch Water Pro PS LABCONCO 091118524 2.1.2.2. Dụng cụ - Bình định mức các loại. - Pipet các loại. - Bình tam giác, cốc thủy tinh. - Ống nhỏ giọt, bình tia, phễu busne, cối sứ, chày sứ, giấy lọc thường, giấy parafin. 2.2. Thực nghiệm 2.2.1. Khảo sát điều kiện tối ưu 2.2.1.1. Chọn thể tích vòng mẫu Độ chính xác, độ đúng và lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột. Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi được thể tích bơm mẫu vào cột.Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần làm chân pic sắc kí bị doãng ra. Nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tượng doãng pic xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách. Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta lựa chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của pic sẽ tăng tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu = V0 mà tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc kí cũng không tăng nữa và lúc đó pic sắc kí sẽ tù, doãng chân và không sắc nét. Vì vậy việc lựa chọn thể tích vòng mẫu cũng rất quan trọng. Trang 27 Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu có thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo nên pic có độ sắc nét cao, tránh doãng pic. Trong phân tích HPLC người ta thường sử dụng các vòng mẫu 10, 20, 30, 50 và 100 µl trong đó vòng mẫu 20 µl thường hay được sử dụng nhất. Trong đề tài nghiên cứu này để phân tích đồng thời paracetamol và caffein chúng tôi lựa chọn van bơm mẫu 6 chiều và thể tích vòng mẫu là 20 µl. 2.2.1.2. Chọn cột Trong đề tài nghiên cứu này, paracetamol và caffein là những chất rất ít phân cực và dựa vào dược điển Mỹ USP 23, 24 quy định về chỉ tiêu phân tích định lượng các thành phần trong dược phẩm, nên ta phải chọn các loại cột RP – HPLC. Trên thị trường có rất nhiều hãng sản xuất cột sắc kípha đảo C8 và C18. Tuy nhiên cột Brownlee RP – 18 của hãng Perkin Elmer được sử dụng rộng rãi trong ngành kiểm nghiệm dược phẩm và được trang bị cho hệ thống HPLC của phòng thí nghiệm của trường, cho thấy khả năng tách tốt, thời gian lưu ngắn và được nhà sản xuất hỗ trợ về kỹ thuật nên chúng tôi chọn cột Brownlee RP – 18,5µm, 220 x 4,6mm cho phép định lượng này. 2.2.1.3. Khảo sát thành phần pha động Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột. Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc trưng cho quá trình sắc kí. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môi pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích qua đó làm thay đổi hệ số lưu của chất phân tích đó. Vì vậy để có được tỷ lệ thành phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát hệ sắc kí với tỷ lệ thành phần pha động khác nhau với các điều kiện sắc kí như nhau: - Cột tách: RP – 18,5µm, 220x4,6 mm. -Thể tích vòng mẫu: 20 μl. -Nồng độ chất phân tích: 2,4 ppm. -Tốc độ dòng: 1 ml/phút. -Detector: 270nm Trang 28 Trang 29 2.2.1.4. Khảo sát tốc độ pha động Để khảo sát ảnh hưởng của tốc độ pha động, tiến hành khảo sát sự thay đổi chiều cao pic sắc kí theo bước sóng của detector với điều kiện chạy sắc kí: -Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm. -Thể tích vòng mẫu: 20µl. -Nồng độ chất phân tích: 2,4 ppm. -Tốc độ dòng: 1 ml/phút. -Detector: UV-VIS. -Pha động: pha động đã khảo sát ở 2.2.1.4. Tổng kết các điều kiện đã khảo sát suy ra điều kiện tối ưu để phân tách đồng thời paracetamol và caffein. 2.2.2. Phân tích mẫu dược phẩm 2.2.2.1. Xác định khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích. Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ của chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính. Để khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ của paracetamol, caffein và diện tích pic sắc kí, ta lần lượt pha các dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần trong dung môi pha động. Sau đó tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 2.2.1, ghi giá trị diện tích pic và dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 xây dựng phương trình hồi quy mối quan hệ giữa nồng độ C và diện tích pic Spic. 2.2.2.2. Ứng dụng quy trình phân tích vào một số mẫu dược phẩm a) Xử lý mẫu Do mẫu thuốc khảo sát ở dạng viên nén nên chúng tôi đã tiến hành khảo sát quy trình chiết mẫu như sau: - Cân 10 viên mẫu thuốc, ghi lại kết quả cân. - Nghiền mịn mẫu bằng chén sứ sau đó cân một lượng mẫu và ghi lại kết quả (m g). Trang 30 - Cho m (g) mẫu vào bình bình tam giác có chứa 30 ml dung dịch pha động. Lắc trong 15 phút. Sau đó lọc tách phần cặn không tan và phần dung dịch. - Chạy sắc kí phần dung dịch thu được sau lần lọc thứ hai. • Nếu không có pic xuất hiện trên sắc kí đồ có nghĩa là lượng chất cần phân tích đã được chiết hoàn toàn trong lần lọc đầu tiên. • Ngược lại có nghĩa là lượng chất cần phân tích vẫn chưa được chiết hoàn toàn. Khi đó, tiến hành lặp lại quá trình lắc và lọc mẫu n lần cho đến khi không có pic xuất hiện trên sắc kí đồ. Như vậy, lượng chất trong mẫu đã được chiết hoàn toàn trong (n – 1) lần lọc. Có thể khái quát quy trình theo sơ đồ sau: Thu lấy các dịch lọc có chứa chất và dịch lọc không chứa chất (làm mẫu trắng). Dựa vào kết quả khảo sát suy ra quy trình chiết mẫu. Trang 31 b) Phân tích định lượng mẫu dược phẩm Mẫu thuốc khảo sát được sử dụng là thuốc giảm đau và hạ sốt Panadol Extra do Công ty liên doanh Dược phẩm Sanobe Synthelabo Việt Nam sản xuất với số đăng kí VNB – 0891 – 03. Mỗi viên Panadol Extra chứa 500 mg paracetamol và 65 mg caffein. Áp dụng quy trình chiết mẫu ở mục 2.2.3.1, tiến hành chiết mẫu lấy phần dung dịch có chứa chất cần phân tích đối với mẫu thuốc, pha loãng dung dịch bằng dung môi pha động sao cho nồng độ chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tiến hành chạy sắc kí với điều kiện tối ưu đã khảo sát ở mục 2.2.1. Lặp lại ít nhất ba lần. Trang 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ- THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu 3.1.1. Khảo sát thành phần pha động Để khảo sát thành phần pha động, tiến hành chạy chương trình sắc kí như mục 2.2.1.2 đã trình bày với sự thay đổi thành phần pha động. Dung dịch chất chuẩn của paracetamol được pha loãng từ dung dịch gốc 1200 ppm. Thành phần dung môi pha động được chọn để khảo sát là methanol và nước với các tỉ lệ thể tích khác nhau. Kết quả sự phụ thuộc của thời gian lưu, chiều cao pic sắc kí vào thành phần pha động được chỉ ra trong bảng 3.1 và hình 3.1. Hình 3.1. Sắc kí đồ của paracetamol và caffein khi khảo sát pha động. a) Paracetamol – 100% CH3OH. b) Paracetamol – 90% CH3OH. c) Caffein – 100% CH3OH d) Caffein – 90% CH3OH Trang 33 tR (phút) H H Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của thơi gian lưu, chiều cao pic sắc kí vào tỉ lệ của methanol trong pha động. %Methanol Paracetamol Caffein Thơi gian lưu(tR - phút) Diện tíchpic (S) Thời gian lưu(tR – phút) Diện tíchpic (S) 100 2,14 16561,13 2,52 61705,82 90 2,08 21742,12 2,45 46255,60 Nhìn vảo bảng 3.1 và pic sắc kí trong hình 3.1 nhận thấy với tỷ lệ CH3OH 100% hai chất đầu tách rõ ràng, pic sắc nét và thời gian rửa giải ra nhanh hơn. Tiến hành chạy sắc kí kiểm tra với hỗn hợp hai chất cần phân tích theo chương trình sau : - Cột tách: RP – 18, 5µm, 220 x 4,6 mm. - Thể tích vòng mẫu: 20 μl. - Nồng độ chất phân tích: 2,4 ppm cho mỗi chất. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. -Detector: 270 nm Kết quả thu được sắc kí đồ sau : Hình 3.2. Sắc kí đồ hỗn hợp paracetamol và caffein với pha động là methanol paracetamol caffein Trang 34 Do đó lựa chọn tỉ lệ pha động 100% CH3OH để tiến hành phân tích đồng thời hai chất. 3.1.2. Khảo sát tốc độ pha động Sự ảnh hưởng của tốc độ pha động đến thời gian lưu và chiều cao pic sắc kí được khảo sát bằng cách tiến hành chạy sắc kí hỗn hợp paracetamol và caffein với các tốc độ khác nhau: • 0,8 ml/phút. • 1ml/phút. • 1,2ml /phút. • 1,4 ml/phút. Các điều kiện còn lại của quá trình sắc kí không đổi, cụ thể như sau: - Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm. - Thể tích vòng mẫu: 20µl. - Nồng độ chất phân tích: • Paracetamol: 2,4 ppm • Caffein: 2,4 ppm - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Detector UV-VIS: 270 nm. - Pha động: pha động đã khảo sát ở 2.2.1.4. Kết quả khảo sát tốc độ pha động được chỉ ra ở bảng 3.2 và hình 3.3. Trang 35 Bảng 3.2.Mối quan hệ giữa tốc độ pha động và chiều cao đĩa lý thuyết. Tốc độ pha động u (ml / phút) Paracetamol Caffein Thời gian lưu (tR – phút) Chiều cao đĩa lý thuyết (H) Thời gian lưu (tR - phút) Chiều cao đĩa lý thuyết (H) 0,8 2,654 12416,71 3,118 25426,13 1,0 2,080 10550,11 2,451 17402,01 1,2 1,729 7461,28 2,036 12702,78 1,4 1,505 8030,38 1,770 15594,63 a) b) Hình 3.3. Sự phụ thuộc của chiều cao đĩa lý thuyết vào tốc độ pha động a) Paracetamol b) Caffein 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0 0.5 1 1.5 Trang 36 Theo đường cong Van Deemter, giá trị tốc độ tối ưu để hiệu quả tách là lớn nhất là 1,2 ml/phút. Như vậy từ các khảo sát ở trên ta rút ra được điều kiện chạy tối ưu để phân tích đồng thời paracetamol và caffein như sau: - Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm - Pha động : 100% CH3OH - Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút. - Detectơ UV-VIS: λ = 270 nm. - Nhiệt độ cột: 250C. - Thể tích vòng mẫu : 20µl. 3.2. Phân tích mẫu dược phẩm 3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính của paracetamol được khảo sát bằng cách pha một dãy dung dịch chuẩn paracetamol có nồng độ tăng dần sau: 6 ppm, 12 ppm, 24 ppm, 48 ppm, 96 ppm, 192 ppm, 240 ppm. Tiến hành pha dãy chuẩn như sau: - Pha loãng dung dịch paracetamol gốc có nồng độ 1200 ppm thành 100 ml dung dịch paracetamol có nồng độ 240 ppm: hút chính xác 20 ml dung dịch gốc cho vào bình định mức 100 ml, định mức bằng methanol cho đến vạch. - Pha dãy chuẩn từ dung dịch 240 ppm vừa thu được ở trên: hút chính xác Vx ml cho vào bình định mức 10 ml và định mức bằng methanol. Cụ thể như sau: C (ppm) 6 12 24 48 96 192 240 Vx (ml) 0,25 0,5 1 2 4 8 10 Vmethanol Định mức đến vạch Để khảo sát khoảng tuyến tính của caffein, ta cũng tiến hành khảo sát dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần: 2,4 ppm; 6 ppm; 12 ppm; 24 ppm; 48ppm; 96 ppm và 192 ppm. Dãy dung dịch này cũng được pha bằng cách hút chính xác Vx’ ml dung dịch Trang 37 caffein có nồng độ 240 ppm (dung dịch này cũng được pha loãng từ dung dịch caffein gốc có nồng độ 1200 ppm) cho vào bình định mức 10 ml và định mức bằng dung dịch methanol. C (ppm) 2,4 6 12 24 48 96 192 Vx (ml) 0,1 0,25 0,5 1 2 4 8 Vmethanol Định mức đến vạch Sau đó, tiến hành chạy sắc kí với từng dung dịch của mỗi dãy chuẩn theo chương trình sắc kí sau: - Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm - Pha động : 100% CH3OH - Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút. - Detectơ UV-VIS: λ = 270 nm. - Nhiệt độ cột: 250C. - Thể tích vòng mẫu : 20µl. Từ các giá trị diện tích pic Sp thu được, xây dựng phương trình hồi quy giữa diện tích pic Sp và nồng độ C của mỗi dãy chuẩn. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được chỉ ra trong bàng 3.3, bảng 3.4, hình 3.4 và hình 3.5. Trang 38 Bảng 3.3.Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc kí vào nồng độ của paracetamol. Nồng độ C (ppm) Diện tích pic Sp 6 43910,90 12 108529,73 24 263325,01 48 327274,36 96 633312,42 192 2271446,69 240 2906672,58 Hình 3.4. Đường chuẩn của paracetamol. Từ các số liệu thực nghiệm, ta thu được kết quả sau: Khoảng tuyến tính của paracetamol là 6 – 240 ppm. Mối quan hệ giữa diện tích pic (y) với nồng độ của paracetamol (x) được thể hiện qua phương trình: y = 12323. x – 85277 (3.1) Hệ số tương quan r = 0,997. y = 12323x - 85277 R² = 0.9948 -500000 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 0 50 100 150 200 250 300 Trang 39 Bảng 3.4 Sự phụ thuộc của chiều cao pic sắc kí vào nồng độ của caffein. Nồng độ C Diện tích pic Sp 2,4 29134,10 6 73917,45 12 253571,96 24 459172,79 48 890985,14 96 1697188,25 192 2932110,53 Hình 3.5. Đường chuẩn của caffein. Từ các số liệu thực nghiệm, ta thu được kết quả sau: Khoảng tuyến tính của caffein là 2,4 – 192 ppm. Mối quan hệ giữa diện tích pic (y) với nồng độ của paracetamol (x) được thể hiện qua phương trình: y = 15415. x + 67467 (3.2) Hệ số tương quan r = 0,996. y = 15415x + 67467 R² = 0.9924 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 0 50 100 150 200 250 Trang 40 3.2.2. Ứng dụng quy trình phân tích vào một số mẫu dược phẩm 3.2.2.1. Xử lý mẫu Tiến hành khảo sát quy trình chiết mẫu đã trình bày ở mục 2.2.2.2, cụ thể như sau: - Nghiền mịn 10 viên thuốc Panadol Extra (m = 6,875 g) bằng chén sứ, chày sứ. - Cân một lượng tương đương với khối lượng 2 viên thuốc (1,375 g), lắc với pha động bằng máy lắc KS130 Basic trong 15 phút, tốc độ lắc 240 vòng/phút. Sau đó lọc lấy phần dung dịch. - Chạy sắc kí phần dung dịch thu được ở lần lọc thứ hai. Kết quả thu được pic trên sắc kí đồ. Như vậy, chất cần phân tích vẫn chưa được chiết hoàn toàn. - Tiến hành lặp lạiquá trình lắc, lọc mẫu và chạy sắc kí. Kết quả thu được cho thấy diện tích pic giảm dần sau mỗi lần lọc mẫu. Đến lần thứ 6 thì không thu được pic trên sắc kí đồ nữa. Vì thế, có thể kết luận chất cần phân tích đã được chiết hoàn toàn sau 5 lần lọc. - Thu phần dung dịch trong 5 lần lọc đầu cho vào bình định mức 250 ml, định mức đến vạch bằng methanol. Dung dịch này được giữ lại dùng cho việc phân tích hàm lượng chất có trong mẫu thuốc Panadol Extra ở mục 3.2.2.2, kí hiệu là PE1. Kết quả xử lí mẫu (viên nén Panadol Extra) được chỉ ra trong bảng 3.5. Bảng 3.5. Diện tích pic thu được sau mỗi lần lọc. Lần lọc Diện tích pic paracetamol caffein 2 2880962,83 677185,42 3 759619,68 171843,16 4 341910,87 74303,69 5 273094,01 64054,84 Trang 41 3.2.2.2. Phân tích định lượng mẫu dược phẩm Hàm lượng paracetamol và caffein có trong mẫu thuốc Panadol Extra được xác định như sau: - Dùng pipet hút chính xác 0,5 ml dung dịch mẫu PE1 cho vào bình định mức 10 ml, định mức bằng methanol đến vạch. - Tiến hành chạy sắc kí với dung dịch mẫu đã pha loãng ở trên, ghi lại kết quả thu được. - Nồng độ paracetamol và caffein được tính từ phương trình (3.1) và (3.2). - Tiến hành lặp lại tương tự như trên đối với các mẫu PE2 và PE3. Kết quả phân tích mẫu dược phẩm được trình bày trong bảng 3.6 và hình 3.6, Bảng 3.6. Kết quả phân tích các mẫu dược phẩm. Mẫu Sparacetamol Scaffein Cparacetamol (ppm) Ccaffein (ppm) PE1 1907923,63 428688,63 162,56 23,43 PE2 1981550,56 419057,54 167,72 22,81 PE3 2114343,02 446152,09 178,50 24,57 C� (ppm) 170 ± 25 23,60 ± 2,7 Trang 42 H H tR tR H tR a) b ) c) Hình 3.6. Sắc kí đồ của các mẫu thuốc a) Mẫu PE1 b) Mẫu PE2 c) Mẫu PE3 Trang 43 Từ nồng độ paracetamol và caffein có trong mẫu, ta quy đổi sang hàm lượng của chúng trong 2 viên thuốc Panadol Extra như sau: 𝑚 = 𝐶 .𝑉 .𝐹 . 10−3 Trong đó: - m: khối lượng chất phân tích có trong 2 viên thuốc (mg) - C: nồng độ chất phân tích tính theo phương trình hồi quy (ppm). - V: thể tích của dung dịch mẫu (ml) - F: hệ số pha loãng. Từ kết quả thu được tính khả năng thu hồi theo công thức: 𝐻 = 𝑚𝐻𝑄 𝑚𝑇𝑇 Trong đó: mHQ và mTT lần lượt là khối lượng chất tính theo phương trình hồi quy và khối lượng chất trên thực tế. Kết quả phân tích hàm lượng của paracetamol và caffein trong 2 viên thuốc Panadol Extra được trình bày trong bảng 3.7 Bảng 3.7. Kết quả phân tích hàm lượng paracetamol và caffein trong 2 viên thuốc Panadol Extra. Paracetamol Caffein m (mg) 850 ± 125 118 ± 13,5 H (%) 0,85 ± 0,125 0,908 ± 0,135 Trang 44 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Kết quả đề tài “Xác định đồng thời hàm lượng paracetamol và caffein trong một số dược phẩm bằng phương pháp HPLC” cho những kết luận sau: 1. Chọn được điều kiện phù hợp để tách và xác định đồng thời paracetamol và caffein trong một số dược phẩm bằng hệ thống sắc kí HPLC sử dụng detector UV-VIS. - Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm - Pha động : 100% CH3OH - Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút. - Detectơ UV-VIS: λ = 270 nm. - Nhiệt độ cột: 250C. - Thể tích vòng mẫu : 20µl. 2. Xác định được khoảng tuyến tính cho hai chất paracetamol và caffein Paracetamol Caffein Phương trình hồi quy y = 12323. x – 85277 y = 15415. x + 67467 Hệ số tương quan r = 0,997 r = 0,996 Khoảng tuyến tính 6 – 240 ppm 2,4 – 192 ppm 3. Phân tích hàm lượng paracetamol và caffein trong mẫu dược phẩm Panadol Extra thu được hệ số thu hồi đối với paracetamol là 0,85 ± 0,125 và đối với caffein là 0,908 ± 0,135. 4.2. Đề nghị Dựa trên kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy phương pháp xác định đồng thời paracetamol và caffein tương đối tốt và có thể sử dụng để xác định hàm lượng paracetamol và caffein trong dược phẩm. Trang 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Phạm Luận, Cơ sở lý thuyết sắc kí lỏng iệu năng cao HPLC, trường Đại học Tổng hợp Hà Nội. [2]. Hồ Viết Quý, Phân tích lí – hóa, NXB. Giáo dục. [3]. Bộ Y tế, Dược thư quốc gia, NXB. Y học, 2009. [4]. Bộ Y tế, Dược điển quốc gia, NXB. Y học, 2010. [5]. Sinan Suzen, Cemal Akay, Senol Tartilmis, R. Serdar Erdol, Atilla Onal and Semsettin Cevheroglu (1998), Quantitative of acetaminophen in pharmaceutical formulations using high-performance liquid chromatography, J. Fac. Pharm. Ankara, pp. 93-100. [6]. Shulin Zhao, Wenling Bai, Hongyan Yuan and Dan Xiao (2006), Detection of paracetamol by capillary electrophoresiswith chemiluminescence detection, Analytica Chimica Acta,pp. 195-199. [7]. Wenrui Jin, Daiqing Yu, Qian Dong, and Xiaoying Ye (2000), Quantitation of Caffeine by Capillary ZoneElectrophoresis with End-Column AmperometricDetection at a Carbon Microdisk Array Electrode, Journal of Chromatographic Science, Vol. 38, pp. 11-15. [8]. Guzin Alpdogan, Kadir Karabina and Sidika Sungurg (2000), DerivativeSpectrophotometric Determination ofCaffeine in Some Beverages, Turk J Chem, 2002, pp. 295-302. [9]. H. Tavallali and M. Sheikhaei (2009), Simultaneous kinetic determination of paracetamol and caffeine by H-point standard addition method, African Journal of Pure and Applied Chemistry Vol. 3, pp. 11-19. [10]. Vijaya Vichare, Preeti Mujgond, Vrushali Tambe and Dhole S.N (2010),Simultaneous Spectrophotometric determination of Paracetamol and Caffeine in tablet formulation, International Journal of PharmTech Research, Vol.2, No.4, pp. 2512-2516. Trang 46 [11]. M. Prodan, E. Gere-Paszti, O. Farkas, E. Forgacs, Validation and Simultaneous Determination of Paracetamol and Caffeine in Pharmaceutical Formulations by RP-HPLC, Chem. Anal (Warsaw), 2003. [12]. M. Levent Altun (2001), HPLC Method for the Analysis of Paracetamol,Caeine and Dipyrone, Turk J Chem, pp. 521 – 528. [13]. Viswanath Reddy Pyreddy, Useni Reddy Mallu, Varaprasad Bobbarala and Somasekhar Penumajji (2011), A novel RP-HPLC method for analysis of paracetamol, pseudoephedrine, caffeine and chlorpheniramine maleate in pharmaceutical dosage forms,Journal of Pharmacy Research 2011, Vol. 4, Issue. 4, pp. 1225-1227. [14]. SM Ashraful Islam , Shamima Shultana, Muhammad Shahdaat Bin Sayeed and Irin Dewan (2012),UV- spectrophotometric and RP-HPLC methods for the simultanios estimation of acetaminophen an caffeine: valiation, comparison and application for marketed tablet analysic, International journal of pharmacy, 2012. [15]. Thái Duy Thìn (2005), Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) và đo quang phổ UV-VIS để định tính và định lượng các hoạt chất có trong một số thuốc có từ 2 đến 5 thành phần, Bộ Y Tế. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Tiêu chuẩn của các chất chuẩn paracetamol và caffeine Phụ lục 2: Sắc kí đồ của các dung dịch chuẩn trong khoảng tuyến tính của paracetamol. Phụ lục 3: Sắc kí đồ của các dung dịch chuẩn trong khoảng tuyến tính của caffein.