Khóa luận Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ Dâu tằm (Morus alba L.), họ Dâu tằm (Moraceae) và Viễn chí (Polygala japonica Houtt), họ Viễn chí (Polygalaceae)

0,03 ± 1,98g/kg. Liều LD50 toàn rễ là 16,95 ± 2,01g/kg mà rễ bỏ lõi gỗ đi dùng đến 75g/kg thì gây tử vong. 1.2.6. Tính vị, công năng Viễn chí có vị hắc, đắng, the, tính hơi ấm, vào 2 kinh tâm và thận, có tác dụng an thần, ích trí, khu đàm, chỉ khái, ích tinh, hoạt huyết, tán ứ, tiêu thũng, giải độc. 1.2.7. Công dụng Viễn chí được dùng chữa ho, nhiều đờm, viêm phế quản, hay quên, giảm trí nhớ, liệt dương, yếu sức, mộng tinh, bổ cho nam giới và người già, thuốc làm sáng mắt, thính tai do tác dụng trên thận. Còn chữa đau tức ngực, lao, ngủ kém, suy nhược thần kinh, ác mộng. Ngày 6-12g dạng thuốc sắc hoặc 2-5g cao lỏng, bột thuốc hoặc cồn thuốc. Dùng ngoài, Viễn chí phơi khô tán bột, tẩm nước, đắp chữa đòn ngã tổn thương, mụn nhọt, lở loét, sưng và đau vú, rắn độc cắn. 1.2.8. Các bài thuốc có Viễn chí  Chữa ho có đờm: Viễn chí 8g, cát cánh 6g, cam thảo 6g, sắc chia 3 lần uống trong ngày. Trường hợp người già ho có đờm lâu năm, đờm kết gây tức ngực, khó thở, dùng Viễn chí 8g, mạch môn 12g, sắc uống dần từng ngụm, ngày 1 thang.  Chữa thần kinh suy nhược, hay quên, đần độn, kinh sợ, hoảng hốt, kém ăn, ít ngủ: Viễn chí, đảng sâm, bạch truật, liên nhục, long nhãn, táo nhân (sao đen), mạch môn, mỗi vị 10g, sắc uống. Hoặc Viễn chí, tâm sen, hạt muồng (sao), mạch môn, nhân hạt táo (sao đen), huyền sâm, dành dành, mỗi vị 12g, sắc uống.  Chữa trẻ sốt cao sinh co giật: Viễn chí, sinh địa, câu đằng, thiên trúc hoàng (bột phấn đọng ở đốt cây nứa), mỗi vị 8-10g, sắc uống.  Trị tâm thống lâu ngày: Viễn chí (bỏ lõi), Xương bồ (thái nhỏ) đều 40g, tán bột. Mỗi lần dùng 12g, nước 1 chén, sắc còn 7 phần, bỏ bã, uống ấm.  Trị ung thư, phát bối, nhọt độc: Viễn chí (bỏ lõi), giã nát. Rượu 1 chén, sắc chung, lấy bã đắp vết thương.  Trị họng sưng đau: Viễn chí nhục, tán nhuyễn, thổi vào, đờm sẽ tiết ra nhiều.  Trị não phong, đầu đau không chịu được: Viễn chí (bỏ lõi), tán nhuyễn. Mỗi lần dùng 2g, lấy nước lạnh ngậm trong miệng rồi thổi thuốc vào mũi.  Trị khí uất hoặc cổ trướng: Viễn chí nhục 160g (sao với trấu). Mỗi lần dùng 20g, thêm gừng 3 lát, sắc uống.  Trị tiểu đục, nước tiểu đỏ: Viễn chí ½ kg (ngâm nước cam thảo, bỏ lõi), phục thần (bỏ lõi), ích trí nhân đều 80g. Tán bột. Lấy rượu chưng với miến làm hồ, trộn thuốc bột làm thành viên, to bằng hạt ngô đồng lớn. Mỗi lần uống 50 viên với nước táo sắc.  Trị vú sưng (suy nhũ): Viễn chí chưng với rượu, uống, bã đắp vào vết thương.  Trị thần kinh suy nhược, hay quên, hồi hộp, mơ nhiều, mất ngủ: Viễn chí (tán). Mỗi lần uống 8g với nước cơm, ngày 2 lần.  Trị tuyến vú viêm, tuyến vú u xơ: Viễn chí 12g, thêm 15ml rượu 600 ngâm 1 lúc, cho nước 1 chén, đun sôi 15-20 phút, lọc cho uống. Trị 62 ca tuyến vú viêm cấp, có kết quả.  Trị âm đạo viêm do trùng roi: Viễn chí tán bột, thêm glycerin làm thành thuốc đạn (đặt vào âm đạo), mỗi viên có hàm lượng thuốc sống là 0,75g. Trước khi đặt thuốc, dùng bài thuốc nước rửa phụ khoa: (ngải diệp, xà sàng tử, khổ sâm, chỉ xác, đều 15g, bạch chỉ 9g), sắc lấy nước để xông và rửa âm hộ. Đặt thuốc vào âm đạo mỗi tối 1 lần. Trị 225 ca, sau 3 – 12 lần, hết triệu chứng và kiểm tra trùng roi âm tính có 193 ca khỏi, tỉ lệ 85,8%.  Trị suy nhược thần kinh do tâm huyết kém có triệu chứng mất ngủ hay quên, hồi hộp, mơ nhiều: Đảng sâm, Viễn chí, mạch môn, phục linh đều 10g, cam thảo 3g, đương quy, bạch thược, sinh khương, đại táo đều 10g, quế tâm 3g, sắc, thêm bột quế tâm vào, hòa uống. 1.2.9. Các chế phẩm từ Viễn chí Chế phẩm Công dụng và cách dùng Eugica Syrup - Thành phần: Bọ mắm, núc nác, Viễn chí, vỏ quýt - Công dụng: Chữa viêm họng, ho lâu ngày, viêm khí- phế quản, ho nhiều đờm, chữa ho mất tiếng, kích thích tiêu hóa. An thần bổ tâm - Thành phần: Sinh địa, đảng sâm, đương qui, mạch môn, táo nhân, bá tử nhân, đan sâm, phục thần, huyền sâm, Viễn chí, cát cánh, ngũ vị tử. Tá dược vừa đủ1 viên nang. - Công dụng: dưỡng âm, an thần, điều hòa nhịp tim. - Liều dùng: uống một lần 2 - 3 viên, ngày 3 lần Bảng 2. Các chế phẩm từ Viễn chí 2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT: [4,8] 2.1. Chiết lỏng - lỏng Phương pháp chiết là phương pháp chuyển một chất ở trạng thái hòa tan hay huyền phù từ pha lỏng (hoặc pha rắn) này sang pha lỏng khác. Chiết những chất tan trong dung dịch hoặc ở dạng huyền phù gọi là chiết chất lỏng, chiết những chất từ hỗn hợp rắn gọi là chiết chất rắn. Chiết lỏng-lỏng , còn được gọi là chiết bằng dung môi, là một phương pháp để tách các hợp chất riêng biệt dựa trên tính tan của hai chất lỏng khác nhau, thường là nước và một dung môi hữu cơ. 2.2. Chiết siêu âm Chiết siêu âm là phương pháp sử dụng sóng với tần số 20.000 Hz Cách tiến hành: Bột nguyên liệu được xay với kích thước khoảng 2mm rồi cho vào becher, làm ẩm bột nguyên liệu rồi thêm một lượng dung môi môi thích hợp. Đặt becher vào trong bể siêu âm sau đó bật máy rồi điều chỉnh thời gian chiết. Sau khi chiết xong, lọc lấy dịch chiết, thêm vào bã nguyên liệu một lượng dung môi cho lần chiết sau. 2.3. Chiết Soxhlet Bột nguyên liệu xay thô hoặc cao được đặt trong một túi vải (hoặc giấy lọc) rồi cho vào ống chữa mẫu. Rót dung môi vào dung môi đã chọn vào bình cầu bằng cách rót trực tiếp vào ống chữa mẫu. Kiểm tra hệ thống kín, mở sinh hàn, cắm vào bếp điện và điều chỉnh sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ. 3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG [2,3,8,9] Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua chất hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất cần phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách dịch chuyển của chất thử và khoảng cách dịch chuyển của dung môi. Rf = Với a: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm) b: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết (cm) 4. ĐỊNH TÍNH BẰNG PHẢN ỨNG HÓA HỌC [1,4,8] Mỗi loại dược liệu đều có các nhóm hợp chất xác định. Có thể dựa vào các nhóm hợp chất này để định tính các dược liệu bằng các phản ứng màu hoặc kết tủa đặc trưng. Ví dụ: • Hợp chất flavonoid: dựa vào phản ứng với NaOH, với FeCl3 • Hợp chất saponin: thử tính tạo bọt, tính phá huyết, phản ứng Liebermann –Burchard, phản ứng Kahlenberg Yêu cầu các phản ứng định tính dược liệu là các phản ứng này càng đặc hiệu càng tốt hay ít nhất là khi kết hợp với các chỉ tiêu khác của tiêu chuẩn đã có sẵn có thể xác định được dược liệu đó và phân biệt với những dược liệu tương tự. Khi có nhiều phản ứng định tính các chất có trong dược liệu, không nhất thiết phải đưa tất cả các phản ứng vào tiêu chuẩn. Có thể chọn một hay hai phản ứng tiêu biểu nhất giúp xác định dược liệu. Các phản ứng sử dụng cho tiêu chuẩn nên dễ thực hiện, sử dụng các dung môi hóa chất thông dụng, cho kết quả rõ ràng và dễ nhận biết. 5. PHỔ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (PHỔ UV - VIS) [1,2,9] 5.1. Khái niệm Phổ tử ngoại - khả kiến là các dạng của bức xạ điện từ, có bản chất là sóng điện từ, chúng chỉ khác nhau về độ dài sóng. Vùng tử ngoại - khả kiến bao gồm các bức xạ điện từ có độ dài sóng trong khoảng 200 - 800 nm (vùng khả kiến 360 - 800 nm). Khi phân tử hấp thụ bức xạ tử ngoại hoặc khả kiến thì những electron hóa trị của nó bị kích thích và chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Sự hấp thụ bức xạ của phân tử được ghi lại, phổ thu được gọi là phổ tử ngoại - khả kiến và cũng được gọi phổ hấp thụ electron. 5.2. Đặc điểm Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và vùng khả kiến phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử. Chỉ một số dạng cấu trúc trong các hợp chất hữu cơ mới có sự hấp thụ nêu trên, thực tế việc ứng dụng phổ tử ngoại cũng giới hạn trong một số hợp chất, chủ yếu là các chất có cấu trúc dây nối đôi liên hợp. Đặc điểm của phổ tử ngoại là phổ của một chất phức tạp có thể rất giống với phổ của một chất đơn giản nếu 2 chất này cùng chứa một nhóm cấu trúc giống nhau. Hoạt động của phổ tử ngoại - khả kiến Vùng tử ngoại - khả kiến bao gồm các bức xạ điện từ có độ dài sóng trong khoảng 200 - 800 nm (vùng khả kiến 360 - 800 nm). Sự hấp thụ có nhiều ứng dụng trong quang phổ tử ngoại là trong vùng từ 200 - 380 nm, gọi là vùng tử ngoại gần. Trên phổ tử ngoại các vị trí băng hay còn gọi là dải hấp thụ được đo bằng độ dài sóng λ, đơn vị là nanomet (nm) hoặc Angstrom (Ao). Cường độ của tia đơn sắc trước và sau khi đi qua môi trường hấp thụ được liên hệ với nhau bởi định luật Lambert - Beer. Khác với vùng phổ hồng ngoại, ở vùng phổ tử ngoại - khả kiến, định luật Lambert - Beer được tuân theo tốt hơn nhiều, do đó thường được xác định chính xác và có tính lặp lại. Phổ tử ngoại - khả kiến (Phổ UV - Vis) thường cho ta đường cong phụ thuộc độ hấp thụ A (lg (Io/I)) vào bước sóng λ. Theo định luật Lambert - Beer mật độ quang phụ thuộc vào nồng độ của chất hấp phụ. Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 18 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Đối tượng nghiên cứu - Cây Dâu tằm (Morus alba L) Bộ phận dùng: Lá Thu mua tại Nhà thuốc YHCT Kim Anh, số 88 Hải Thượng Lãn Ông, phường 10, quận 5, Tp.HCM. - Cây Viễn chí (Polygala japonica Houtt) Bộ phận dùng: rễ. Thu mua tại Nhà thuốc YHCT Kim Anh, số 88 Hải Thượng Lãn Ông, phường 10, quận 5, Tp.HCM - Cao Dâu tằm, do Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM cung cấp. - Cao Viễn chí, do Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM cung cấp. - Rutin chuẩn, do Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM cung cấp. 1.2. Dung môi, hóa chất, trang thiết bị Dung môi – Hóa chất Trang thiết bị -Cồn , MeOH, CHCl3, H2SO4, HCl - Vanillin - Toluen, EtOAc, HCOOH - n-BuOH, CH3COOH, H2O - Diethyl ether, anhydric acetic, ether dầu hỏa - NaOH, FeCl3, AlCl3. - Máy KTS samsung - Máy cô quay giảm áp Buchi - Bình chiết Sohxlet - Lò nung - Cân phân tích Sartorius - Máy đo quang phổ khả kiến Thermo Spectronic HEλIOSγ Bảng 3.Dung môi- hóa chất- trang thiết bị Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 19 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu 2.1.1. Khảo sát độ tinh khiết 2.1.1.1. Xác định độ ẩm Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 12.16 Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy Nguyên tắc: Bột nguyên liệu được sấy ở 105oC, nước trong mẫu sẽ bốc hơi làm giảm khối lượng mẫu, cân khối lượng mẫu sau khi sấy sẽ tính được độ ẩm của mẫu nguyên liệu. Tiến hành: Cân chính xác 1g nguyên liệu vào chén cân dùng để xác định độ ẩm đã được cân bì trước. Chén cân cần có kích thước thích hợp để lớp nguyên liệu cho vào không dày quá 5 mm. Cho chén chứa nguyên liệu vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100- 1050C trong 4 giờ. Cho chén vào bình hút ẩm đến khi nguội, đậy nắp và cân. Làm lại nhiều lần đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0,5mg. Độ ẩm (x %) của nguyên liệu được tính theo công thức sau: p: Số gam của mẫu thử trước khi sấy (g) a: Số gam của mẫu thử sau khi sấy (g) 2.1.1.2. Độ tro toàn phần Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 9.8 Nguyên tắc: Bột nguyên liệu được nung ở 550oC, cacbon trong mẫu sẽ cháy thành tro làm giảm khối lượng mẫu, cân khối lượng mẫu sau khi nung sẽ tính được độ tro toàn phần của mẫu nguyên liệu. Tiến hành: Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 1g nguyên liệu rải đều vào chén nung, sau đó đốt hết hơi nước của nguyên liệu trên bếp điện rồi đem nung trong lò nung ở 550oC trong 4 giờ. Sau mỗi lần nung, Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 20 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC X: Độ tro toàn phần (%) a: Khối lượng nguyên liệu sau khi nung (g) b: Khối lượng nguyên liệu trước khi nung (g) lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nung đến khối lượng giữa hai lần cân không quá 5mg. Độ tro toàn phần được tính theo công thức: X= 2.1.1.3. Xác định độ tro không tan trong acid Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 9.7 Nguyên tắc: Dùng acid HCl hòa tan tro toàn phần, lượng cắn không tan nung ở 550oC, cân khối lượng cắn sau khi nung sẽ tính được độ tro không tan trong acid của mẫu. Tiến hành: Cho 25ml dung dịch acid HCl 2M vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan vào một 1 miếng giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 550oC đến khối lượng không đổi. Tính tỉ lệ phần trăm tro không tan trong acid so với nguyên liệu đã làm khô trong không khí. Y= Y: Độ tro không tan trong acid (%) a’: Khối lượng cắn sau khi nung (g) b: Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g) 2.1.2. Định tính các hợp chất hóa thực vật trong nguyên liệu 2.1.2.1. Nguyên liệu Dâu tằm a. Dựa vào phản ứng hóa học Lấy 5g nguyên liệu Dâu tằm chiết soxhlet bằng ether dầu hỏa (60o-90oC) để loại tạp chất, loại bỏ lớp ether dầu hỏa, lấy bã bay hơi hết dung môi đến khô, chiết tiếp bằng MeOH 70%, thu và cô cắn dịch lọc, sau đó hòa MeOH để được dung dịch A. Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 21 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC Phản ứng Cách tiến hành Yêu cầu xuất hiện Với TT NaOH 20% 2ml dd A + 3 giọt NaOH 20% Tủa vàng cam Với TT FeCl3 5%. 2ml dd A + 2 giọt FeCl3 5% Màu xanh rêu Bảng 4. Định tính hợp chất flavonoid trong nguyên liệu Dâu tằm b. Dựa vào sắc kí lớp mỏng • Kiểm tra sự hiện diện của chất rutin trong nguyên liệu Dâu tằm Bản mỏng Silicagel GF254 Dung môi khai triển: EtOAc - HCOOH - CH3COOH - H2O (100:11:11:26) Dung dịch thử: Lấy 5g nguyên liệu chiết soxhlet bằng ether dầu hỏa (60o-90oC) để loại tạp chất, loại bỏ lớp ether dầu hỏa, lấy bã bay hơi hết dung môi đến khô, chiết tiếp bằng MeOH 70%, thu và cô cắn dịch lọc, sau đó hòa MeOH được dung dịch thử. Dung dịch chuẩn: Lấy 1mg rutin chuẩn, pha với 1ml MeOH để được dung dịch có nồng độ 1mg/ml dùng để chấm sắc kí. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10µl mỗi dung dịch trên. Cách phát hiện: Phun thuốc thử AlCl3 5% trong MeOH. • Quan sát dưới ánh sáng thường • Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365nm 2.1.2.2. Nguyên liệu Viễn chí a. Dựa vào phản ứng hóa học Phản ứng Cách tiến hành Yêu cầu xuất hiện Tạo bọt Cân 0,1g nguyên liệu+ 5ml nước nóng, lắc mạnh 5 phút. Bọt bền ít nhất 10 phút Liebermann- Burchard Cân 0,5g nguyên liệu + 2ml (CH3CO)2O + 2ml CHCl3 + từ từ 2-3 giọt H2SO4 Vòng ngăn cách xuất hiện màu đỏ hồng Bảng 5.Định tính hợp chất hóa thực vật trong nguyên liệu Viễn chí Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 22 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC b. Dựa vào sắc kí lớp mỏng Bản mỏng Silicagel GF254 Dung môi khai triển: CHCl3 - MeOH (9 : 1). Dung dịch thử: Lấy 5g nguyên liệu Viễn chí, chiết Soxhlet với MeOH, lấy dịch chiết đem cô cắn. Hòa cắn với 50ml nước, lấy dịch nước đem lắc với diethyl ether (20ml 3 lần). Tiếp tục lắc với n-BuOH (20ml 3 lần). Dịch n-BuOH đem cô cắn sau đó hòa với MeOH để chấm sắc kí. Cách tiến hành: Chấm lên bản mỏng 10µl dung dịch thử. Cách phát hiện: • Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365nm • Phun thuốc thử vanilin 2% trong ethanol và acid sulfuric, sấy ở 1050C, quan sát dưới ánh sáng thường và dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365nm 2.1.3. Định lượng các hợp chất hóa thực vật trong nguyên liệu 2.1.3.1. Định lượng hàm lượng flavonoid tính theo rutin trong nguyên liệu Dâu tằm - Thuốc thử AlCl3 5% trong MeOH 70% - Chất chuẩn: 60µg rutin chuẩn - Mẫu thử: Cân chính xác 5g nguyên liệu cho vào bình Soxhlet. Thêm 250ml ether dầu hỏa, chiết đến khi dịch chiết không còn màu. Để nguội và gạn bỏ dịch ether dầu hỏa. Cắn trong bình Soxhlet được chiết tiếp tục với 250ml MeOH 70%, cho đến khi dịch chiết không còn màu. Dịch chiết MeOH 70% được cô cạn, chuyển vào bình định mức 100ml, bổ sung MeOH 70%vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu dung dịch A. Lấy chính xác 50µl dung dịch A bằng micropipet, cho vào ống nghiệm có nắp vặn, cô đến cắn, thêm chính xác 5 ml MeOH 70% và 75µl dung dịch AlCl3 5% trong MeOH 70%, lắc đều (tiến hành 3 mẫu thử tương tự để lấy giá trị trung bình). - Mẫu trắng: MeOH 70% Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 23 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC - Mẫu trắng thử: Lấy chính xác 50µl dung dịch A cho vào ống nghiệm có nút vặn, cô đến cắn, thêm chính xác 5,075ml MeOH 70%, lắc đều. - Mẫu chuẩn: Lấy chính xác 60µg rutin chuẩn cho vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm chính xác 5ml MeOH 70% và 75µl dung dịch AlCl3 5% trong MeOH 70%, lắc đều. Tất cả các mẫu đều để ở nhiệt độ phòng lạnh, đậy kín ống nghiệm, sau 30 phút tiến hành đo, thỉnh thoảng lắc nhẹ cho phản ứng xảy ra hoàn toàn. Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu ở đỉnh hấp thu cực đại λmax = 422nm- 424nm trên máy UV – Visible Spectrophotometre, dùng MeOH 70% làm mẫu trắng để chỉnh máy về 0. Hàm lượng flavonoid tính theo rutin có trong nguyên liệu Dâu tằm được tính theo công thức sau: m dm A AAX c c tt 4102000' −× ××× − = Trong đó: At : Độ hấp thu mẫu thử. A’t: Độ hấp thu mẫu trắng thử Ac : Độ hấp thu mẫu chuẩn mc : Khối lượng chất chuẩn (µg) d : Độ tinh khiết của chất chuẩn m : Khối lượng nguyên liệu cần định lượng đã trừ ẩm (g). Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 24 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC Sơ đồ 1. Sơ đồ xác định hàm lượng flavonoid tính theo rutin trong nguyên liệu Dâu tằm Bột nguyên liệu Thêm 250ml MeOH 70% Bã nguyên liệu Cô cách thủy Dịch chiết MeOH 70% Định mức 100ml bằng MeOH 70% Cắn MeOH 70% Dung dịch A Hút 50 µl dung dịch A. Định mức 5ml bằng MeOH 70% Xác định mật độ quang OD Hàm lượng flavonoid tính theo rutin Chiết Soxhlet với 250ml ether dầu hỏa. Loại dịch ether dầu hỏa Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 25 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2.1.3.2. Định lượng hàm lượng saponin toàn phần trong nguyên liệu Viễn chí: Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần được định lượng theo phương pháp Namba (Sơ đồ 2): Cân 5g nguyên liệu Viễn chí cho vào bình Soxhlet chiết với 250ml MeOH cho đến kiệt saponin. Dịch MeOH được cô giảm áp đến cắn. Hòa cắn với 50ml nước. Dung dịch nước được lắc với diethyl ether (20ml x 5 lần), bỏ lớp diethyl ether. Lớp nước được lắc với n-BuOH bão hòa nước (20ml x 6 lần), chiết lấy lớp n- BuOH. Rửa nước lớp n-BuOH khoảng 3 lần. Dịch n-BuOH được bốc hơi trên bếp cách thủy cho đến cắn, làm khô trong tủ sấy chân không cho đến khối lượng không đổi, ta thu được saponin toàn phần. Cân và tính khối lượng saponin toàn phần trong nguyên liệu. (Thực hiện 3 mẫu để lấy giá trị trung bình). Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần được tính theo công thức: M% = Trong đó: M%: Hàm lượng saponin toàn phần A: Độ ẩm của nguyên liệu a: Khối lượng saponin toàn phần (g) b: khối lượng nguyên liệu ban đầu (g) Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 26 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC Sơ đồ 2. Định lượng saponin toàn phần trong nguyên liệu Viễn chí theo phương pháp cân Namba Dịch n-BuOH Bột nguyên liệu Dịch chiết MeOH Cắn MeOH Chiết theo phương pháp Soxhlet Cô giảm áp Dịch nước Cắn n-BuOH (Saponin toàn phần) Lắc với diethyl ether (20ml x 5 lần) Lắc với n-BuOH bão hòa (20ml x 6 lần) Dịch nước Cô cách thủy Dịch diethyl ether (bỏ) Thêm 50ml nước Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 27 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2.2. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao 2.2.1. Khảo sát độ tinh khiết 2.2.1.1. Xác định độ ẩm Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 12.16 Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy Nguyên tắc: Mẫu thử được sấy ở 105oC, nước trong mẫu sẽ bốc hơi làm giảm khối lượng mẫu, cân khối lượng mẫu sau khi sấy sẽ tính được độ ẩm của mẫu. Tiến hành: Cân chính xác 0,5g cao cho vào chén cân dùng để xác định độ ẩm đã được cân bì trước. Cho chén chứa cao vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100- 1050C trong 4 giờ. Cho chén vào bình hút ẩm đến khi nguội. Cân, làm lại nhiều lần đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0,5 mg. Độ ẩm (x %) của cao chiết được tính theo công thức sau: p: Số gam của cao trước khi sấy (g) a: Số gam của cao sau khi sấy (g) 2.2.1.2. Độ tro toàn phần Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 9.8 Tiến hành: Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 0,5g cao vào chén nung, sau đó đốt hết hơi nước của cao trên bếp điện rồi đem nung trong lò nung ở 550oC trong 4 giờ. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nung đến khối lượng giữa hai lần cân không quá 5mg. Độ tro toàn phần được tính theo công thức: X= X: Độ tro toàn phần (%) a: Khối lượng cao sau khi nung (g) b: Khối lượng cao trước khi nung (g) Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 28 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2.2.2. Định tính các hợp chất hóa thực vật trong cao 2.2.2.1. Cao Dâu tằm a. Dựa vào phản ứng hóa học - Lấy 0,5g cao Dâu tằm chiết soxhlet bằng ether dầu hỏa (60o-90oC) để loại tạp chất, loại bỏ lớp ether dầu hỏa, lấy bã bay hơi hết dung môi đến khô, chiết tiếp bằng MeOH 70%, thu và cô cắn dịch lọc, sau đó hòa MeOH để được dung dịch B. Phản ứng Cách tiến hành Yêu cầu xuất hiện Với dd NaOH 20% 2ml dd B + 3 giọt NaOH 20% Tủa vàng cam Với dd FeCl3 5%. 2ml dd B + 2 giọt FeCl3 5% Màu xanh rêu Bảng 6. Định tính hợp chất flavonoid trong cao Dâu tằm b. Dựa vào sắc kí lớp mỏng Mục đích: Để xác định được các thành phần hóa thực vật trong nguyên liệu Dâu tằm cũng phải hiện diện trong cao Dâu tằm và sự hiện diện của chất chuẩn rutin trong cao Dâu phải được kiểm tra đánh giá qua SKLM. Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu trong cao Dâu tằm Bản mỏng Silicagel GF254 Dung môi khai triển: EtOAc - HCOOH - H2O (50:4:10), lớp trên. CHCl3 - MeOH (9:1) Dung dịch thử: • Lấy 5g nguyên liệu chiết siêu âm với MeOH (30ml x 3 lần), thu và cô dịch lọc còn 2ml để chấm sắc kí • Lấy 0,5g cao Dâu tằm, chiết siêu âm với MeOH (30ml x 3 lần), thu và cô dịch lọc còn 2ml để chấm sắc kí. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10µl mỗi dung dịch trên. Cách phát hiện:  Phun thuốc thử NaOH 10% trong cồn Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 29 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC • Quan sát dưới ánh sáng thường • Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365nm  Phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, sấy ở 1050C, quan sát dưới ánh sáng thường Kiểm tra sự hiện diện của hợp chất chuẩn rutin trong cao Dâu tằm Bản mỏng Silicagel GF254 Dung môi khai triển: EtOAc - HCOOH - CH3COOH - H2O (100:11:11:26). Dung dịch thử: Lấy 0,5g cao Dâu tằm chiết soxhlet bằng ether dầu hỏa (60o-90oC) để loại tạp chất, loại bỏ lớp ether dầu hỏa, lấy bã bay hơi hết dung môi đến khô, chiết tiếp bằng MeOH 70%, thu và cô cắn dịch lọc, sau đó hòa MeOH được dung dịch thử. Dung dịch chuẩn: Lấy 1mg rutin chuẩn, pha với 1ml MeOH để được dung dịch có nồng độ 1mg/ml dùng để chấm sắc kí. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10µl mỗi dung dịch trên. Cách phát hiện: Phun thuốc thử AlCl3 5% trong MeOH. • Quan sát dưới ánh sáng thường • Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365nm 2.2.2.2. Cao Viễn chí a. Dựa vào phản ứng hóa học Phản ứng Cách tiến hành Yêu cầu xuất hiện Liebermann- Burchard 0,5g cao + 2ml (CH3CO)2O + 2ml CHCl3 + từ từ 2-3 giọt H2SO4 Vòng ngăn cách xuất hiện màu nâu đỏ. Bảng 7. Định tính hợp chất hóa thực vật trong cao Viễn chí b. Dựa vào sắc kí lớp mỏng Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu trong cao Viễn chí Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 30 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC Bản mỏng Silicagel GF254 Dung môi khai triển: CHCl3 - MeOH (9 : 1). n-BuOH - CH3COOH - H2O (7:1:2). Dung dịch thử: • Lấy 5g nguyên liệu Viễn chí, chiết Soxhlet với MeOH, lấy dịch chiết đem cô cắn. Hòa cắn với 50ml nước, lấy dịch nước đem lắc với diethyl ether (20ml 3 lần). Tiếp tục lắc với n-BuOH (20ml 3 lần). Dịch n-BuOH đem cô cắn sau đó hòa với MeOH để chấm sắc kí. • Lấy 1g cao Viễn chí, hòa với 50ml nước, lắc với diethyl ether và n-BuOH như tương tự như nguyên liệu. Thu được dung dịch thử. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10µl các dung dịch thử. Cách phát hiện: • Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm • Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365nm • Phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, sấy ở 1050C, quan sát dưới ánh sáng thường 2.2.3. Định lượng các hợp chất hóa thực vật trong cao 2.2.3.1. Định lượng hàm lượng flavonoid tính theo rutin trong cao Dâu tằm o Thuốc thử AlCl3 5% trong MeOH 70 % o Chất chuẩn: 60µg rutin chuẩn o Mẫu thử: Cân chính xác 0,5g cao cho vào bình Soxhlet. Thêm 250ml ether dầu, chiết đến khi dịch chiết không còn màu. Để nguội và gạn bỏ dịch ether dầu. Cắn cao trong bình Soxhlet được chiết tiếp tục với 250ml MeOH 70%, cho đến khi dịch chiết không còn màu. Dịch chiết MeOH 70% được chuyển vào bình định mức 100ml, bổ sung MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu dung dịch A. Lấy chính xác 40µl dung dịch A bằng micropipet, cho vào ống nghiệm có nắp vặn, cô đến cắn, thêm chính xác 5 ml MeOH 70% và 75µl dung dịch AlCl3 5% trong MeOH 70%, lắc đều (tiến hành 3 mẫu thử tương tự để lấy giá trị trung bình). Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 31 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC o Mẫu trắng:MeOH 70% o Mẫu trắng thử: Lấy chính xác 40µl dung dịch A bằng micropipet, cho vào ống nghiệm có nắp vặn, cô đến cắn,, thêm chính xác 5,075ml MeOH 70%, lắc đều. o Mẫu chuẩn: Lấy chính xác 60µg rutin chuẩn cho vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm chính xác 5ml MeOH 70% và 75µl dung dịch AlCl3 5% trong MeOH 70%, lắc đều. Tất cả các mẫu đều để ở nhiệt độ phòng lạnh, đậy kín ống nghiệm, sau 30 phút tiến hành đo, thỉnh thoảng lắc nhẹ cho phản ứng xảy ra hoàn toàn. Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu ở đỉnh hấp thu cực đại λmax = 422nm- 424nm trên máy UV – Visible Spectrophotometre, dùng MeOH 70% làm mẫu trắng để chỉnh máy về 0. Lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin có trong cao Dâu tằm được tính theo công thức sau: m dm A AAX c c tt 4102500' −× ××× − = Trong đó: At: Độ hấp thu mẫu thử. A’t: Độ hấp thu mẫu trắng thử Ac: Độ hấp thu mẫu chuẩn mc: Khối lượng chất chuẩn (µg) d: Độ tinh khiết của chất chuẩn m: Khối lượng cao cần định lượng đã trừ ẩm (g). Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 32 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC Sơ đồ 3. Sơ đồ xác định hàm lượng flavonoid tính theo rutin trong Dâu tằm Cao Dâu tằm Thêm 250ml MeOH 70% Cắn Dâu tằm Cô cách thủy Dịch chiết MeOH 70% Định mức 100ml bằng MeOH 70% Cắn MeOH 70% Dung dịch A Hút 40µl dung dịch A. Định mức 5ml bằng MeOH 70% Xác định mật độ quang OD Chiết Soxhlet với 250ml ether dầu. Loại dịch ether dầu Hàm lượng flavonoid tính theo rutin Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 33 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2.2.3.2. Định lượng hàm lượng saponin toàn phần trong cao Viễn chí: Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần được định lượng theo phương pháp Namba (Sơ đồ 4): Cân 1g cao Viễn chí cho vào bình Soxhlet chiết với MeOH cho đến kiệt saponin. Dịch MeOH được cô giảm áp đến cắn. Hòa cắn với khoảng 50ml nước. Dung dịch nước được lắc với diethyl ether (20ml x 5 lần) cho đến khi lớp diethyl ether không màu hoặc rất nhạt, bỏ lớp diethyl ether. Lớp nước tiếp tục được lắc với n- BuOH bão hòa nước (20ml x 8 lần), chiết lấy lớp n- BuOH. Rửa nước lớp n- BuOH khoảng 3 lần. Dịch n- BuOH được bốc hơi trên bếp cách thủy cho đến cắn, làm khô trong tủ sấy chân không cho đến khối lượng không đổi, ta thu được saponin toàn phần. Cân và tính khối lượng saponin toàn phần trong cao (thực hiện 3 mẫu để lấy giá trị trung bình). Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần được tính theo công thức: M% = Trong đó: M%: Hàm lượng saponin toàn phần A: Độ ẩm của cao Viễn chí a: Khối lượng saponin toàn phần (g) b: khối lượng cao ban đầu (g) Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 34 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC Sơ đồ 4. Định lượng saponin toàn phần trong cao Viễn chí theo phương pháp cân Namba Cao Viễn chí Dịch chiết MeOH Cắn MeOH Chiết theo phương pháp Soxhlet Cô giảm áp Dịch nước Cắn n-BuOH (Saponin toàn phần) Lắc với diethyl ether (20ml x 5 lần) Lắc với n-BuOH bão hòa (20ml x 8 lần) Dịch nước Cô cách thủy Dịch diethyl ether (bỏ) Thêm 50ml nước Dịch n-BuOH Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp nghiên cứu SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 35 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC Phần 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 36 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 1. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU 1.2. Khảo sát độ tinh khiết của nguyên liệu 1.2.1. Độ ẩm Dâu tằm Viễn chí Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng bì (g) 5,2600 4,9170 5,0948 4,6195 4,2956 5,0536 Khối lượng nguyên liệu (g) 1,0406 1,0951 1,0764 1,1993 1,0021 1,0434 Khối lượng bì và nguyên liệu sau khi sấy (g) 6,2204 5,9309 6,0872 5,7339 5,2344 6,0311 Độ ẩm (%) 7,71 7,41 7,80 7,08 6,32 6,32 Trung bình 7,64 6,57 Bảng 8. Độ ẩm của nguyên liệu • Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy nguyên liệu có các giá trị về độ ẩm nằm trong giới hạn an toàn cho phép đúng theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV là độ ẩm của nguyên liệu Dâu tằm <15% và của Viễn chí <14%. 1.2.2. Độ tro toàn phần Dâu tằm Viễn chí Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng bì (g) 31,2718 39,0600 38,7460 34,2415 36,7750 36,3080 Khối lượng nguyên liệu (g) 1,0103 1,0056 1,0087 1,0099 1,0186 1,0123 Khối lượng bì và nguyên liệu sau khi nung (g) 31,4209 39,2072 38,8900 34,2724 36,8057 36,3400 Độ tro (%) 14,76 14,64 14,28 3,06 3,04 3,09 Trung bình 14,56 3,07 Bảng 9. Độ tro toàn phần của nguyên liệu Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 37 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC • Nhận xét: Theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV độ tro toàn phần của nguyên liệu Viễn chí đạt yêu cầu khi <6%. Vậy độ tro toàn phần của Viễn chí nằm trong giới hạn cho phép. Độ tro toàn phần của nguyên liệu Dâu tằm đạt 14,56% 1.2.3. Độ tro không tan trong acid Dâu tằm Viễn chí Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng bì (g) 31,2718 39,0600 38,7460 34,2415 36,7750 36,3080 Khối lượng nguyên liệu (g) 1,0103 1,0056 1,0087 1,0099 1,0186 1,0123 Khối lượng bì và nguyên liệu sau khi nung (g) 31,3038 39,0890 38,7750 34,2517 36,7852 36,3139 Độ tro (%) 3,17 2,88 2,80 1,01 1,01 1,09 Trung bình 2,95 1,04 Bảng 10. Độ tro không tan trong acid của nguyên liệu • Nhận xét Theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV thì độ tro không tan trong acid của nguyên liệu Dâu tằm <4,5% và của Viễn chí <1,5%. Có thể kết luận nguyên liệu đạt tiêu chuẩn nằm trong giới hạn an toàn. 1.3. Định tính các hợp chất hóa thực vật trong nguyên liệu 1.3.1. Dâu tằm Các hợp chất hữu cơ trong nguyên liệu và cao được kiểm tra bằng các phản ứng hóa học dựa vào thuốc thử đặc trưng cho mỗi chất và kết quả được trình bày như sau: Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 38 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 1.3.1.1. Dựa vào phản ứng hóa học . Hình 3. Phản ứng hóa học của nguyên liệu Dâu tằm Chú thích: A. Phản ứng với TT NaOH 20% B. Phản ứng với TT FeCl3 5% 1. Dung dịch đối chứng 2. Dung dịch sau khi phản ứng với TT NaOH 20% 3. Dung dịch sau khi phản ứng với TT FeCl3 5% 1 2 1 3 (A) (B) Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 39 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 1.3.1.2. Dựa vào sắc kí lớp mỏng Kiểm tra sự hiện diện của chất rutin trong nguyên liệu Dâu tằm EtOAc - HCOOH - CH3COOH - H2O (100:11:11:26) 1. Nguyên liệu 2. Trùng 2 vết 3. Chuẩn rutin Phun thuốc thử AlCl3 5% trong MeOH, sấy ở 105oC đến khi xuất hiện vết Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm Quan sát dưới ánh sáng thường Hình 4. SKLM kiểm tra sự hiện diện của chất rutin trong nguyên liệu Dâu tằm Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ nguyên liệu Dâu tằm tương ứng với màu sắc và giá trị Rf của vết chuẩn rutin. Như vậy, có sự hiện diện của chuẩn rutin trong nguyên liệu Dâu tằm. . 1 3 2 1 2 3 Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 40 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 1.3.2. Nguyên liệu Viễn chí 1.3.2.1. Dựa vào phản ứng hóa học Hình 5. Phản ứng của nguyên liệu Viễn chí Chú thích: A. Phản ứng tạo bọt B. Phản ứng Liebermann- Burchard 1. Dung dịch đối chứng 2. Dung dịch sau phản ứng (A) 1 2 (B) Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 41 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 1.3.2.2. Dựa vào sắc kí lớp mỏng CHCl3 - MeOH (9:1) CHCl3 - MeOH (9:1) CHCl3 - MeOH (9:1) Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm Phun thuốc thử vanilin 2% trong cồn và acid sulfuric, sấy ở 105oC đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường Phun thuốc thử vanilin 2% trong cồn và acid sulfuric, sấy ở 105oC đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm • Nhận xét: Trên sắc kí đồ thấy xuất hiện 4 vết phát quang màu xanh khi quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm. Bằng thuốc thử hiện màu xuất hiện 3 vết màu xanh khi quan sát dưới ánh sáng thường và 1 vết màu hồng đậm, 2 vết phát quang màu xanh sáng khi quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 42 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 1.4. Định lượng các hợp chất hóa thực vật trong nguyên liệu 1.4.1. Định lượng hàm lượng flavonoid tính theo rutin trong nguyên liệu Dâu tằm Quy trình định lượng hợp chất flavonoid bằng phương pháp phổ tử ngoại khả kiến dựa trên chất chuẩn rutin. Độ hấp thu cực đại của rutin chuẩn là 424nm. Tiến hành đo các mẫu thử ở bước sóng trên ta thu được bảng sau: Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng nguyên liệu (g) 5,0138 5,0079 5,0491 Độ hấp thu mẫu chuẩn (Ac) 0,308 Độ hấp thu mẫu trắng thử (A’t) 0,163 0,167 0,169 Độ hấp thu mẫu thử (A t) 0,689 0,694 0,698 Hàm lượng flavonoid tính theo rutin (%) 4,1961 4,2090 4,1905 Trung bình 4,1985 Bảng 11. Hàm lượng flavonoid tính theo rutin trong nguyên liệu Dâu tằm Nhận xét: Hàm lượng flavonoid tính theo rutin trong nguyên liệu Dâu tằm đạt 4,1985% 1.4.2. Định lượng hàm lượng saponin toàn phần trong nguyên liệu Viễn chí Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng nguyên liệu (g) 5,1106 5,0901 5,0417 khối lượng cắn saponin toàn phần (g) 0,9976 1,0339 1,0072 Hàm lượng cắn saponin toàn phần (%) 20,893 21,740 21,382 Trung bình 21,338 Bảng 12. Hàm lượng saponin toàn phần trong nguyên liệu Viễn chí Nhận xét: Hàm lượng saponin trong nguyên liệu Viễn chí đạt 21,338% Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 43 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CAO CHIẾT 2.1. Khảo sát độ tinh khiết của cao chiết 2.1.1. Độ ẩm Cao Dâu tằm Cao Viễn chí Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng bì (g) 4,8425 4,9396 4,7337 4,7843 4,8188 4,8587 Khối lượng cao (g) 0,5506 0,5365 0,5585 0,5130 0,5135 0,5002 Khối lượng bì và cao sau khi sấy (g) 5,3587 5,4413 5,2570 5,1906 5,2266 5,2549 Độ ẩm (%) 6,25 6,49 6,30 20,80 20,58 20,79 Trung bình 6,35 20,72 Bảng 13. Độ ẩm của cao chiết • Nhận xét: Độ ẩm của cao Dâu tằm đạt 6,35%. Độ ẩm của cao Viễn chí đạt 20,72%. 2.1.2. . Độ tro toàn phần Cao Dâu tằm Cao Viễn chí Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng bì (g) 39,0537 36,7667 31,2662 28,0682 23,8268 30,9338 Khối lượng cao (g) 0,5650 0,5005 0,5469 0,5319 0,5218 0,5142 Khối lượng bì và cao sau khi nung (g) 39,1095 36,8142 31,3180 28,0728 23,8309 30,9382 Độ tro (%) 9,88 9,49 9,47 0,86 0,79 0,86 Trung bình 9,61 0,84 Bảng 14. Độ tro toàn phần của cao chiết • Nhận xét: Độ tro toàn phần của cao Dâu tằm đạt 9,61%. Độ tro toàn phần ẩm của cao Viễn chí đạt 0,84%. Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 44 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2.2. Định tính các hợp chất hóa thực vật trong cao 2.2.1. Cao Dâu tằm 2.2.1.1. Dựa vào phản ứng hóa học Hình 6.Phản ứng hóa học của cao Dâu tằm Chú thích: A. Phản ứng với TT NaOH 20% B. Phản ứng với TT FeCl3 5% 1. Dung dịch đối chứng 2. Dung dịch sau khi phản ứng với TT NaOH 20% 3. Dung dịch sau khi phản ứng với TT FeCl3 5% (A) (B) 1 2 1 3 Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 45 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2.2.1.2. Dựa vào sắc kí lớp mỏng Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu trong cao Dâu tằm Hình 7. SKLM kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu trong cao Dâu tằm • Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của các vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ nguyên liệu Dâu tằm tương ứng với màu sắc và giá trị Rf của các vết thu được của cao Dâu tằm. Như vậy, chứng tỏ các thành phần hóa thực vật trong nguyên liệu Dâu tằm cũng hiện diện trong cao Dâu tằm. CHCl3 - MeOH (9:1) CHCl3 - MeOH (9:1) CHCl3 - MeOH (9:1) EtOAc - HCOOH - H2O (50:4:10), lớp trên. 1. Nguyên liệu 2. Cao Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm Phun thuốc thử NaOH 10% trong cồn. Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm Phun thuốc thử NaOH 10% trong cồn. Quan sát dưới ánh sáng thường. Phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn. Quan sát dưới ánh sáng thường sau khi sấy ở 105oC 1 2 1 2 1 1 2 2 Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 46 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC Kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn rutin trong cao Dâu tằm EtOAc - HCOOH - CH3COOH - H2O (100:11:11:26) 1. Cao 2. Trùng 2 vết 3. Chuẩn rutin Phun thuốc thử AlCl3 5% trong MeOH, sấy ở 105oC đến khi xuất hiện vết Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm Quan sát dưới ánh sáng thường Hình 8. SKLM kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn rutin trong cao Dâu tằm • Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ cao Dâu tằm tương ứng với màu sắc và giá trị Rf của vết chuẩn rutin. Như vậy, có sự hiện diện của chuẩn rutin trong cao Dâu tằm. 1 1 3 3 2 2 Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 47 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2.2.2. . Cao Viễn chí 2.2.2.1. Dựa vào phản ứng hóa học Phản ứng Liebermann- Burchard Hình 9. Phản ứng hóa học của cao Viễn chí 1. Dung dịch đối chứng 2. Dung dịch sau phản ứng 1 2 Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 48 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2.2.2.2. Dựa vào sắc ký lớp mỏng Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu trong cao Viễn chí CHCl3 - MeOH (9:1) CHCl3 - MeOH (9:1) CHCl3 - MeOH (9:1) 1.Nguyên liệu 2. Cao Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 254nm Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm Phun thuốc thử H2SO410% trong cồn, sấy ở 105oC đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường 1 2 1 2 1 2 Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 49 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC n-BuOH-AcOH-H2O (7:1:2) n-BuOH-AcOH-H2O (7:1:2) n-BuOH-AcOH-H2O (7:1:2) • Nguyên liệu 2. Cao Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 254nm Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm Phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, sấy ở 105oC đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường Hình 10. SKLM kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu trong cao Viễn chí • Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của các vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ nguyên liệu Viễn chí tương ứng với màu sắc và giá trị Rf của các vết thu được của cao Viễn chí. Như vậy, chứng tỏ các thành phần hóa thực vật trong nguyên liệu Viễn chí cũng hiện diện trong cao Viễn chí. 1 2 2 1 2 1 Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 50 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2.3. Định lượng các hợp chất hóa thực vật trong cao. 2.3.1. Cao Dâu tằm Quy trình định lượng hợp chất flavonoid bằng phương pháp phổ tử ngoại khả kiến dựa trên chất chuẩn rutin. Độ hấp thu cực đại của rutin chuẩn đo được là 424nm. Tiến hành đo các mẫu thử ở bước sóng trên ta thu được bảng sau: Cao Dâu tằm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng cao (g) 0,5313 0,5348 0,5258 Độ hấp thu mẫu chuẩn (Ac) 0,307 Độ hấp thu mẫu trắng thử (A’t) 0,294 0,296 0,299 Độ hấp thu mẫu thử (A t) 0,518 0,515 0,519 Hàm lượng flavonoid tính theo rutin (%) 20,8967 20,2965 20,7382 Trung bình 20,6438 Bảng 15. Hàm lượng flavonoid tính theo rutin trong cao Dâu tằm • Nhận xét: Hàm lượng flavonoid tính theo rutin trong cao Dâu tằm là 20,6438% 2.3.2. Cao Viễn chí Hàm lượng saponin toàn phần thu được như sau: Cao Viễn chí Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng cao (g) 1,0576 1,0549 1,0439 Khối lượng cắn saponin toàn phần (g) 0,3426 0,3394 0,3386 Hàm lượng cắn saponin toàn phần (%) 40,860 40,582 40,913 Trung bình 40,785 Bảng 16. Hàm lượng saponin toàn phần trong cao Viễn chí • Nhận xét: Hàm lượng saponin toàn phần thu được trong cao là 40,785% Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Khóa luận tốt nghiệp Kết luận và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 52 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 1. KẾT LUẬN Qua quá trình thực nghiệm và làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, em đã thực hiện được các vấn đề sau: 1. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ bản của nguyên liệu Dâu tằm và Viễn chí theo chuyên luận “Dược Liệu” trong Dược Điển Việt Nam như:  Độ ẩm  Độ tro toàn phần  Độ tro không tan trong acid  Đánh giá được chất lượng của nguyên liệu về mặt định tính bằng cả hai phương pháp: − Phản ứng hóa học − Sắc ký lớp mỏng  Đánh giá được chất lượng của nguyên liệu về mặt định lượng − Hàm lượng flavonoid tổng trong nguyên liệu Dâu tằm bằng phương pháp quang phổ tử ngoại - khả kiến. − Hàm lượng saponin toàn phần trong nguyên liệu Viễn chí theo phương pháp cân Namba. 2. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm của cao Dâu tằm và cao Viễn chí theo chuyên luận trong Dược Điển Việt Nam như :  Độ ẩm  Độ tro toàn phần  Đánh giá được chất lượng của cao Dâu tằm và cao Viễn chí về mặt đinh tính bằng cả hai phương pháp: − Phản ứng hóa học − Sắc ký lớp mỏng  Đánh giá được chất lượng của cao Dâu tằm và cao Viễn chí về mặt định lượng Khóa luận tốt nghiệp Kết luận và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 53 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC − Hàm lượng flavonoid trong cao Dâu tằm bằng phương pháp quang phổ tử ngoại- khả kiến − Hàm lượng saponin toàn phần trong cao Viễn chí theo phương pháp cân Namba. Khóa luận tốt nghiệp Kết luận và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 54 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2. KIẾN NGHỊ Qua quá trình xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao Dâu tằm, Viễn chí em xin đề nghị các bảng tiêu chuẩn cơ sở để kiểm nghiệm như sau: 2.1. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu 2.1.1. Nguyên liệu Dâu tằm STT Các tiêu chí Yêu cầu Phương pháp thử 1 Độ ẩm Không được quá 15% DĐVN IV 2 Độ tro toàn phần Không được quá 20% DĐVN IV 3 Độ tro không tan trong acid Không được quá 4,5% DĐVN IV 4 Định tính • Phản ứng hóa học • Sắc ký lớp mỏng Mẫu thử phải cho phản ứng với TT NaOH 20% và TT FeCl3 5%. Các vết thu được trên sắc kí đồ của mẫu thử phải có giá trị Rf và màu sắc tương đồng với các vết thu được của chất chuẩn rutin TCCS 5 Định lượng Hàm lượng flavonoid tính theo rutin trong khoảng 3,57% - 4,83% TCCS Khóa luận tốt nghiệp Kết luận và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 55 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2.1.2. Nguyên liệu Viễn chí STT Các tiêu chí Yêu cầu Phương pháp thử 1 Độ ẩm Không được quá 14% DĐVN IV 2 Độ tro toàn phần Không được quá 6% DĐVN IV 3 Độ tro không tan trong acid Không được quá 1,5% DĐVN IV 4 Định tính • Phản ứng hóa học • Sắc ký lớp mỏng Mẫu thử phải có phản ứng tạo bọt và phản ứng Liebermann- Burchard Mẫu thử phải cho sắc ký đồ có vết phát quang dưới đèn tử ngoại bước sóng 366 nm và các vết khi phun thuốc thử vanillin 2% trong ethanol và acid sulfuric. DĐVN IV TCCS 5 Định lượng Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần trong khoảng 19,2% - 23,4% TCCS Khóa luận tốt nghiệp Kết luận và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 56 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2.2. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao 2.2.1. Cao Dâu tằm STT Các tiêu chí Yêu cầu Phương pháp thử 1 Độ ẩm Không được quá 10% DĐVN IV 2 Độ tro toàn phần Không được quá 15% DĐVN IV 3 Định tính • Phản ứng hóa học • Sắc ký lớp mỏng Mẫu thử phải cho phản ứng với TT NaOH 20% và TT FeCl3 5%. Các vết thu được trên sắc kí đồ của mẫu thử phải có giá trị Rf và màu sắc tương đồng với các vết thu được của Nguyên liệu dâu tằm Chất chuẩn rutin TCCS 4 Định lượng Hàm lượng flavonoid tính theo rutin trong khoảng 17,5% - 23,7% TCCS Khóa luận tốt nghiệp Kết luận và kiến nghị SVTH: PHẠM THỊ KIM KHUYÊN 57 ThS. DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC 2.2.2. Cao Viễn chí STT Các tiêu chí Yêu cầu Phương pháp thử 1 Độ ẩm Không được quá 25 % DĐVN IV 2 Độ tro toàn phần Không được quá 2% DĐVN IV 3 Định tính • Phản ứng hóa học • Sắc ký lớp mỏng Mẫu thử phải có phản ứng Liebermann- Burchard Các vết thu được trên sắc kí đồ của mẫu thử phải có giá trị Rf và màu sắc tương đồng với các vết thu được của nguyên liệu Viễn chí TCCS 4 Định lượng Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần nằm trong khoảng 36,7% - 44,9% TCCS v TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, 2009. 2. Bộ môn Dược Liệu, Giáo trình phương pháp nghiên cứu Dược liệu, Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, 2004. 3. Bộ Y tế, Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, 2005. 4. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam - tập I, NXB KH & KT, Hà Nội, 182-184, 2003. 5. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y Học, TP.HCM, 90- 92, 2004. 6. Hoàng Trị, Tối ưu hóa quy trình chiết xuất 10-deacetyl baccatin III (10-DAB) và taxol từ cành lá thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.), Khóa luận tốt nghiệp cử nhân hóa học, 2009. 7. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Bài giảng chiết xuất dược liệu, Tài liệu giảng dạy sinh viên dược 5, Trường ĐH Y Dược TP.HCM, Bộ môn dược liệu. 8. Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 2007. 9. Ngô Văn Thu, “Bài giảng dược liệu”, tập I. Trường đại học Dược Hà Nội, 2011. 10. Phạm Thanh Kì, “Bài giảng dược liệu”, tập II. Trường đại học Dược Hà Nội, 1998. 11. Viện Dược Liệu, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II, NXB Khoa học kỹ thuật, 2004. Tiếng nước ngoài 12. Camila B. Pereira, Aline Marin, Tiago D. T. Maki, Raquel M. M.Necchi, Melania Palermo Manfron, Physico-chemical quality control and dosage of total polyphenols, flavonoids of Morus alba Leaves (MORACEAE), Saúde (Santa Maria), Ahead of Print, v.37, n.2, pp.57-68, 2011. 13. Dušan Malešev and Vesna Kunti, Investigation Of Metal–Flavonoid Chelates And The Determination Of Flavonoids Via Metal–Flavonoid Complexing vi Reactions, Institute of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, University of Belgrade, Serbia, pp. 921-928, 2007. 14. Honglan Wang. Jie Gao, Danni Zhu and Boyang Yu, Two new Triterpenoid Saponins isolated from Polygala japonica, China Pharmaceutical University, 2006. 15. Jun Wang, Fu An Wu, Hui Zhao, Li Liu and Qiu Sheng Wu, Isolation of flavonoids from mulberry (Morus alba L.) leaves with macroporous resins, African Journal of Biotechnology Vol. 7 (13), pp. 2147-2155, 4 July, 2008. 16. Kai Nie, Zhonghai Tang, Xu Wu, Xiaona Xu, Yizeng Liang, Huang Li and Liqun Rao, Optimization of total flavonoids extraction from mulberry leaf using an ethanol-based solvent system, Journal of Medicinal Plants Research Vol. 6(12), pp. 2373-2380, 30 March, 2012. 17. Mărghita , L. Al, D. Dezmirean, Laura Laslo, Adela Moise, Olimpia Popescu, O. Maghear, Validated Method For Estimation Of Total Flavonoids, in Romanian Propolis, Romania, Bulletin USAMV-CN, pp. 63 -64,2007. 18. Qing-Chun Xue, Chuang-Jun Li, Li Zuo, Jing-Zhi Yang and Dong-Ming Zhang, Three new xanthones from the roots of Polygala japonica Houtt, Journal of Asian Natural Products Research, Vol.11, No.5, 465–469,May 2009. 19. Shreeda S. Adhyapak, Comparison of extraction techniques for quantitative determination of Rutin from morus Alba Linn by reverse phase high performance liquid chromatography, International Journal of Pharma and Bio Sciences, vol 2, issue 1, pp. 751-752, 2011. 20. Walter A. Jacobs and Otto Isler, The Sapogenins Of Polygala Senega, Laboratories of The Rockefeller Institute for Medical Research, New York, pp. 155-157, 1937.