Khóa luận Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ Quế (Cinnamomum cassia Bl.), họ Long não (Lauraceae) và Xạ Can (Belamcanda chinensis (L.) DC) họ Lay ơn (Iridaceae)

ịnh của Dược điển Trung Quốc 1997 ( bản in tiếng Anh), hàm lượng chất chiết nóng bằng cồn không được dưới 18%. 1.2.3. Thành phầnhoá học − Nghiên cứu trong nước[22] Theo Lê Minh Hà, Phan Văn Kiệm và Natalya Khripach năm 2009, các tác giả đã phân lặp ra 5 chất trong cây xạ can irisflorentin, tectorigenin, iristectorigenin A, irigenin, acetovanillon. O O O O O O O O Cấu trúc hóa học của irisflorentin Cấu trúc hóa học của tectorigenin O O H O H O O O H O Cấu trúc hóa học của iristectorigenin A Cấu trúc hóa học của irigenin OH CH3 O CH3 O Cấu trúc hóa học của acetovanillon − Nghiên cứu ngoài nước Thân rễ xạ can chứa tectorigenin, irigenin, tectoridin, iridin, 5,3 – dihydroxy – 4’,5’ – dimethoxy – 6,7 – methylendioxyisoflavon, dimethyltectorigenin, irisflorentin, muningin, các iristectorigenin A và B (CA 115: 209992 a), các chất (6R, 10S, 11S, 14S, 26(R) – 26 – hydroxy – 15 – methylidenespiroirid – 16 – enal, iso – iridogermanal, 28 – acetoxy – 14, 15 – dihydro – 26 – hydroxy – 19 methyldepenespiroirida – 15, 17 – dienal (Abe Fumiko và cs 1991); noririsflorentin (5 – hydroxy; 6, 7 – methylendioxy – 3’,4’,5’ – trimethoxyisoflavon (CA 119: 245 560). Theo Tsuchiya Hiroyoshi và cs, 1986, từ 2,5 kg rễ xạ can có thể tách chiết được 2,22g tectorigenin. Chất này có tác dụng ức chế dị ứng (CA 109: 216001t). Theo Qin Minjian và cs, 1996, hàm lượng irigenin trong xạ can là 1,36%. Rễ có các chất shegansu A (irigenin – 5 – O – (6’ – O – vanilin acid) - β - D. glucosid), isorhopontigenin, resveratrol, acid p.hyroxybenzoic, iridin, tectoridin, tectorigenin, daucosterol, irigenin, irisflorentin, 3- stigmastenol, apocynin, β - sitosterol. Cấu trúc hóa học của tectoridin Cấu trúc hóa học của iridin Hạt có 4 endion và belamcandon A-D (Seki Katsura và cs 1995) (CA 122: 261087 x); belamcandaquinon A (Fukuyama Yoshasu và cs, 1992; CA 120: 101972 v), các chất I và II (Fukuyama Yoshasu và cs, 1990; CA 118: 11723 u), các benlamcandol A và B (Fukuyama Yoshasu và cs, 1991; CA 116: 3555 j). Xạ can còn có chất 1, 4- benzopunon I (Fukuyama Yoshasu và cs 1992) (CA 120:134 035 v), Me irisolidon, irisflorentin, iristectorigenin A (Yamaki Masae và cs, 1990;CA 113:208350 y). 1.2.4. Tác dụng dược lý Tác dụng chống nấm và virus: Chích liều cao dung dịch xạ can , invitro thấy có tác dụng ức chế nhiều loại nấm da. Thuốc cũng có tác dụng chống virus hô hấp. Tác dụng đối với nội tiết: Dịch chiết và cồn chiết xuất xạ can cho uống hoặc chích đều có kết quả làm tăng tiết nước miếng. Thuốc chích có tác dụng nhanh và dài hơn. Tác dụng giải nhiệt: Cho chuột đang sốt cao uống nước sắc xạ can, thấy có tác dụng giải nhiệt. Tác dụng khứ đờm: Cho chuột nhắt uống nước sắc xạ can, thấy hô hấp tăng, tống đờm ra mạnh hơn. Tác dụng kháng vi sinh: Nước sắc xạ can có tác dụng ức chế bồ đào cầu khuẩn, liên cầu khuẩn, khuẩn bạch hầu, khuẩn thương hàn quách Võ Phi. 1.2.5. Tính vị và công năng Xạ can có vị đắng, tính mát, hơi có độc, vào hai kinh: phế và can, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tán huyết, tiêu đờm. 1.2.6. Công dụng Xạ can được coi là một vị thuốc quý chữa các bệnh về họng, viêm amiđan có mủ, ho nhiều đờm, khản tiếng, còn được dùng chữa sốt, đại tiểu tiện không thông, sưng vú tắc tiêu sữa, đau kinh, và làm thuốc lọc máu. Ngày dùng từ 3-6g dưới dạng thuốc sắc hoặc bột làm viên ngậm. Trong y học cổ truyền Trung Quốc, xạ can được coi là có tác dụng trừ nhiệt độc, trừ đờm làm đỡ đau họng, thuốc long đờm, điều trị viêm họng, viêm amiđan, ho và khó thở, khạc ra đờm. Ngày dùng từ 3-9g. 1.2.7. Bài thuốc có xạ can 1. Chữa viêm họng: a) Xạ can 4g, kinh giới 16g, kim ngân, huyền sâm, sinh địa, mỗi vị 12g; bạc hà, cỏ nhọ nồi, tang bạch bì, mỗi vị 8g. Sắc uống ngày một thang. b) Xạ can 6g, sinh địa, huyền sâm, mỗi vị 16g; mạch môn, tang bạch bì, cam thảo nam, kê huyết đằng, thạch hộc, mỗi vị 12g; tằm vôi 8g. Sắc uống ngày một thang. 2. Chữa viêm họng, ho đờm: a) Xạ can 6g, sâm đại hành 15g, mạch môn 15g, cát cánh 6g. Sắc uống ngày một thang. b) Xạ can 8g, cam thảo dây hoặc mạch môn 10g. Sắc uống ngày một thang. c) Xạ can 8g, sài đất 10g, đậu chiều (sao vàng) 8g, cam thảo dây tươi 6g. Sắc uống ngày một thang. 3. Viên nén chữa viêm họng: Mỗi viên có 0,08g bột rễ và lá xạ can, bột cát cánh 0,01g, bột trần bì 0,01g, tá dược vừa đủ cho một viên. Mỗi ngày dùng 10 viên, chia làm 3 lần ngậm. 4. Si rô chữa ho: Cao xạ can tỉ lệ 2/115ml, cao hương nhu 2/120ml, cao cam thảo 2/110ml, sirô đơn vừa đủ cho 100ml. Người lớn: Mỗi lần uống 2 thìa canh, ngày 2 lần. Trẻ em: mỗi lần 2 thìa cà phê, ngày 2 lần. 5. Viên nén và sirô sâm can điều trị viêm họng cấp và mạn tính: Mỗi viên nén chứa lượng cao tương đương 0,2g xạ can và 0,5g huyền sâm. Sirô chứa 8g xạ can và 20g huyền sâm trong 100ml. Người lớn: mỗi ngày uống hay ngậm 8-15 viên, chia 3 lần. Trẻ em: Uống sirô mỗi ngày 2-3 thìa cà phê, chia 3 lần. 6. Chữa amiđan cấp tính: a) Xạ can 6g; kim ngân hoa, cỏ nhọ nồi, bồ công anh, mỗi vị 16g, huyền sâm, sinh địa, sơn đậu căn, mỗi vị 12g; bạc hà, ngưu bàng tử, mỗi vị 8g; cát cánh 6g. Sắc uống ngày một thang. b) Xạ can 8g; kim ngân hoa, thạch cao, mỗi vị 20g; huyền sâm, sinh địa, cam thảo nam, mỗi vị 16g, hoàng liên, hoàng bá, tang bạch bì, mỗi vị 12g. Sắc uống ngày một thang. 7. Chữa viêm amiđan mãn tính: a) Xạ can 8g, huyền sâm 16g; sa sâm, mạch môn, tang bạch bì, ngưu tất, mỗi vị 12g; thăng ma 6g, cát cánh 4g. Sắc uống ngày một thang. b) Xạ can 8g; sa sâm, mạch môn, huyền sâm, tang bạch bì, mỗi vị 12g. Sắcuống ngày một thang. 8. Chữa hen phế quản thể hàn: Xạ can, tô tử, ma hoàng, bán hạ chế, hạnh nhân, bách bộ, thảo quả, mỗi vị 10g; cam thảo, quế chi, bồ kết, mỗi vị 6g. Sắc uống ngày một thang. 9. Chữa hen phế quản thể nhiệt: Xạ can 10g, thạch cao 20g, đại táo 12g, hạnh nhân 10g, ma hoàng, tô tử, đình lịch tử, mỗi vị 8g, bán hạ chế 6g, gừng tươi 4g. Sắc uống ngày một thang. 10. Chữa lao phổi: Xạ can 16g, hạ khô thảo 16g, sinh địa, mạch môn,sa sâm, mỗi vị 12g, huyền sâm, địa cốt bì, bách bộ chế,mỗi vị 8g. Sắc uống ngày một thang. 11. Chữa lao hạch: a) Xạ can 8g, cải trời (hạ khô thảo nam) 40g. Sắc đặc ngày uống một một lần, hoặc nấu thành cao uống trong một ngày như trên. b) Xạ can 8g, huyền sâm, hạ khô thảo, mẫu lệ, mỗi vị 16g, địa cốt bì, mai ba mỗi vị 12g. Sắc uống ngày một thang. 12. Chữa tắc cổ họng: Xạ can 4g, hoàng cầm, sinh cam thảo, cát cánh, mỗi vị 2g. Các vị tán nhỏ uống với nước sôi để nguội. 13. Chữa bệnh bạch hầu: Xạ can 2g, sinh địa, huyền sâm, cổ nhọ nồi, kim ngân, mỗi vị 16g; mạch môn, ngưu tất, mỗi vị 12g. Sắc uống mỗi này một thang. 14. Chữa sưng đau: Xạ can, lá cúc tần,mỗi vị 20g, lá thầu dầu tía 10g. Giã nhỏ với cơm nóng, nặn thành bánh đắp vào chỗ sưng đau, bang lại. Ngày làm 2 lần. 15. Chữa đại tiểu, tiện không thông, bụng báng: Xạ can (để sống) 12g, giã nát, hòa vào một chén nước, lọc bỏ bã, uống mỗi ngày đến khi thấy lợi đại tiểu, tiện thì thôi. 16. Chữa kết hạch và u báng: Xạ can 10g, nghệ đen 8g, xuyên khung 6g. Sắc uống ngày một thang. 17. Chữa sốt rét: Xạ can 6g, tri mẫu 20g, sài hồ, ý dĩ sao,mạch môn, thanh hao, hoàng dằng, trần bì, bán hạ chế, chỉ xác, cam thảo nam, hoàng cầm,tô tử, mỗi vị 10g. Sắc uống ngày một thang. 1.2.8. Các chế phẩm từ Xạ Can Tiêu Khiết Thanh Công dụng: -Giúp phòng nghừa và giảm các triệu chứng viêm đường hô hấp mãn tính như: viêm thanh quản, viêm amiđan, khản tiếng, mất tiếng. -Hỗ trợ các biện pháp điều trị tiêu viêm, giảm sưng, giảm viêm thanh quản, làm trong sáng giọng nói. Viên ngậm Ngọc Hầu Viên ngậm CAGU Chủ trị: Hầu họng viêm, sưng đau, họng khô, đau rát do ho kéo dài, do thay đổi thời tiết, cảm cúm, hút thuốc lá. Công thức: Chanh muối, kim ngân hoa, xạ can, huyền sâm, sinh địa, thiên môn, mạch môn, bạc hà, mật ong, cam thảo và các tá dược khác. Công năng: Kháng khuẩn, tiêu viêm, thanh nhiệt hóa đàm. Thành phần: Xạ can, can khương, cam thảo, quế. Tá dược vừa đủ 1 viên. Công dụng: Dùng trong trường hợp viêm họng, đau họng, ho do cảm lạnh, khản tiếng, rát cổ. Chỉ định: Viêm họng, đau họng, ho do cảm lạnh. Khản tiếng, rát cổ. Bảng 2: Các chế phẩm từ Xạ Can 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT[1,3,5,16] 2.1. Chiết lỏng-lỏng Chiết lỏng-lỏng, còn được gọi là phương pháp chiết bằng dung môi, là một phương pháp để tách các chất riêng biệt dựa trên tính tan của hai chất lỏng khác nhau, thường là nước và dung môi hữu cơ. 2.2. Chiết siêu âm Chiết siêu âm là phương pháp sử dụng sóng với tần số 20.000Hz. Cách tiến hành: Bột nguyên liệu được xay với kích thước khỏang 2 mm rồi cho vào becher, làm ẩm bột nguyên liệu rồi thêm một lượng dung môi thích hợp, đặt becher vào trong bể siêu âm, sau đó bật máy rồi điều chỉnh thời gian chiết. Sau khi chiết xong, lọc lấy dịch chiết, thêm vào bã nguyên liệu một lượng dung môi cho lần chiết sau. 2.3. Chiết soxhlet Bột nguyên liệuxay thô hoặc cao được đặt trong một túi vải (hoặc giấy lọc) rồi cho vào ống chữa mẫu. Rót dung môi vào dung môi đã chọn vào bình cầu bằng cách rót trực tiếp vào ống chữa mẫu. Kiểm tra hệ thống kín, mở sinh hàn, cắm vào bếp điện và điều chỉnh sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ. 3. ĐỊNH TÍNH BẰNG PHẢN ỨNG HOÁ HỌC[1,3,5,10] Mỗi loại dược liệu đều có các nhóm hợp chất xác định. Có thể dựa vào nhóm chất này đế xác định các nguyên liệu bằng các phản ứng màu hoặc kết tủa đặc trưng. Hợp chất alkaloid: dựa vào phản ứng kết tủa với các thuốc thử chung (TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat). Hợp chất saponin: thử tính tạo bọt, tính phá huyết, phản ứng Liebermanm -Burchard, phản ứng Kahlenberg. Hợp chất anthraquinon: Định tính bằng phản ứng Borntrager. Hợp chất flavonoid: Phản ứng tạo phức màu với muối kim loại, phản ứng với dung dịch kiềm, phản ứng với thuốc thử Cyanidin. Yêu cầu các phản ứng định tính nguyên liệu là các phản ứng này càng đặc hiệu càng tốt ít nhất là khi kết hợp với các chi tiết khác của tiêu chuẩn có sẵn có thể xác định được nguyên liệu đó và phân biệt được với những nguyên liệu tương tự. Khi có nhiều phản ứng định tính các chất có trong dược liệu, không nhất thiết phải đưa tất cả các phản ứng vào tiêu chuẩn. Có thể chọn một hay hai phản ứng tiêu biểu nhất giúp xác định dược liệu. Các phản ứng sử dụng cho tiêu chuẩn nên dễ thực hiện, sử dụng các dung môi hóa chất thông dụng, cho kết quả rõ ràng và dễ nhận biết. 4. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG[1,3,12,16] Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng. Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng chất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn vào nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua chất hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển lên trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất cần phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách dịch chuyển của chất thử và khoảng cách dịch chuyển của dung môi. f aR b = Với a: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm) b: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết (cm). 5. PHỔ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (PHỔ UV-VIS)[1,3,4,5,10] 5.1. Khái niệm Phổ tử ngoại- khả kiến là các dạng của bức xạ điện từ, có bản chất là sóng điện từ, chúng chỉ khác nhau về độ dài sóng. Vùng tử ngoại- khả kiến bao gồm các bức xạ điện từ có độ dài sóng trong khoảng 200-800nm (vùng khả kiến 360-800). Khi phân tử hấp thụ bức xạ tử ngoại- khả kiến phụ thuộc vào cấu trúc tử ngoại hoặc khả kiến thì những electron hoá trị của nó bị kích thích và chuyển từ trạng thái cơ bản lên trang thái khích thích. Sự hấp thụ bức xạ, của phân tử được ghi lại, phổ thu được gọi là phổ tử ngoại-khả kiến và cũng được gọi phổ hấp thụ electron. 5.2. Đặc điểm Sự hấp trong vùng tử ngoại và vùng khả kiến phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử. Chỉ một số dạng cấu trúc trong các hợp chất hữu cơ mới có sự hấp thụ nêu trên, thực tế việc ứng dụng phổ tử ngoại cũng giới hạn trong một số hợp chất, chủ yếu là các chất có cấu trúc dây nối đôi liên hợp. • Hoạt động của phổ tử ngoại-khả kiến Vùng tử ngoại-khả kiến bao gồm các bức xạ điện từ có độ dài sóng trong khoảng 200-800 nm (vùng khả kiến 360-800nm). Sự hấp thụ có nhiều ứng dụng trong quang phổ tử ngoại là trong vùng 200-380 nm, gọi là vùng tử ngoại gần. Trên phổ tử ngoại các vị trí băng hay còn gọi là dải hấp thụ được đo bằng độ dài sóng λ , đơn vị là nanomet (nm) hoặc Angstron (A0). Cường độ của tia đơn sắc trước và sau khi đi qua môi trường hấp thụ được liên hệ với nhau bởi định luật Lambert-Beer. Khác với vùng phổ hồng ngoại, ở vùng phổ tử ngoại-khả kiến, định luật Lambert-Beer được tuân theo tốt hơn nhiều, do đó thường được xác định chính xác và có tính lặp lại. Phổ tử ngoại- khả kiến (Phổ UV- Vis) thường cho ta đường cong phụ thuộc độ hấp thụ A (lg (I0/I)) vào bước sóng λ . Theo định luât Lambert- Beer mật độ quang phụ thuộc vào nồng độ của chất hấp thụ. Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Đối tượng nghiên cứu • Quế (Cinnamomum cassia Bl.) Bộ phận dùng: Vỏ cây Thu mua tại Nhà thuốc YHCT Kim Anh, số 88 Hải Thượng Lãn Ông, phường 10, quận 5, Tp.HCM • Xạ Can (Belamcanda chinensis (L.) DC) Bộ phận dùng: Rễ Thu mua tại Nhà thuốc YHCT Kim Anh, số 88 Hải Thượng Lãn Ông, phường 10, quận 5, Tp.HCM • Cao Quế, Cao Xạ Can do Trung tâm Sâm và Dược Liệu TP.HCM cung cấp • Chất chuẩn: aldehyd cinamic (Sigma) • Chất chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat do Trung tâm Sâm và Dược Liệu TP.HCM cung cấp. 1.2. Dung môi- Hoá chất- Trang thiết bị Dung môi- Hoá chất Trang thiết bị − Cồn 960 − MeOH, Chloform, H2SO4 − Vanillin (Merck) − Toluen, nước cất − Ethyl acetat, diethyl ether, cyclohexan. − n-hexan, aceton. − Bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 F254(Merck). − Máy kĩ thuật số canon − Máy cô quay giảm áp Buchi − Bình chiết Sohxlet − Tủ sấy chân không VWR SIP − Cân phân tích Sartorius − Máy đo quang phổ khả kiến Thermo Spectroni HEλ IOS Bảng 3: Dung môi- Hoá chất- Trang thiết bị 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Xây dựng tiêu chuẩn kiếm nghiệm nguyên liệu 2.1.1. Khảo sát độ tinh khiết của nguyên liệu 2.1.1.1. Xác định độ ẩm Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 12.13, PL-240 [1] Xác định độ ẩm bằng phương pháp cất với dung môi  Tiến hành: - Dụng cụ (hình vẽ) Dụng cụ bao gồm bình cầu A, được nối với ống sinh hàn C qua bộ phận xác định lượng nước. Bộ phận này bao gồm bầu ngưng tụ B, bộ phận chia vạch E và ống dẫn hơi D. Bộ phận chia vạch được chia độ đến 0,1ml. Sau quá trình cất, nước sẽ ngưng tụ ở đây vì vậy ta có thể đọc được dễ dàng lượng nước chứa trong nguyên liệuđem thử. Nguồn nhiệt thích hợp là bếp điện có biến trở hoặc đun cách dầu. - Cách tiến hành Cho vào bình cầu đã được làm khô 200ml toluen, 2ml nước cất. Lắp dụng cụ (đã được sấy khô). Cất khoảng 2 giờ. Để nguội trong 30 phút. Đọc thể tích nước cất được ở ống hứng, chính xác đến 0,05ml. Thêm vào bình cầu một lượng nguyên liệu đã cân chính xác tới 0.01g có chứa khoảng 2-3ml nước. Thêm vài mảnh đá bọt. Đun nóng nhẹ, khi toluen đã bắt đầu sôi thì điều chỉnh nhiệt để cất với tốc độ 2 giọt/giây. Khi đã cất được phần lớn nước sang ống hứng thì nâng tốc độ lên 4 giọt/1 giây. Tiếp tục cất cho tới khi mực nước cất được trong ống hứng không tăng lên nữa. Hình 3: Dụng cụ xác định hàm lượng nước bằng phương pháp cất với dung môi Dùng 5-10ml toluen rửa ống sinh hàn. Cất thêm 5 phút nữa. Tách bộ phận cất ra khỏi nguồn nhiệt. Nếu còn có những giọt nước đọng lại trên thành ống sinh hàn thì dùng 5ml toluen để rửa kéo xuống. Khi lớp nước và lớp toluen đã được phân tách hoàn toàn, đọc thể tích nước trong ống hứng. Độ ẩm (X%) của nguyên liệu được tính theo công thức sau: 2 1100 ( )V VX p × − = V1: Số ml nước cất được sau lần cất đầu V2: Số ml mước cất được sau lần cất thứ hai p: Số g mẫu đã cân. 2.1.1.2. Độ tro toàn phần Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ luc 9.8 (phương pháp 2)[1]  Tiến hành Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 1g mẫu thử rải đều vào chén nung, sau đó đốt hết hơi nước của nguyên liệu trên bếp điện rồi đem nung trong lò nung ở 550oC trong 4 giờ. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nung đến khối lượng giữa hai lần cân không quá 5mg. Độ tro toàn phần được tính theo công thức: 100aX b = × X: Độ tro toàn phần (%) a : Khối lượng nguyên liệusau khi nung(g) b: Khối lượng nguyên liệutrước khi nung (g) 2.1.1.3. Độ tro không tan trong acid Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 9.7 (phương pháp 1)[1]  Tiến hành Cho 25ml dung dịch acid hydrochloric 2M vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung vào chất không tan vào một phễu thuỷ tinh xốp đã cân bì, hoặc vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng và đem nung ở 5000C đến khối lượng không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với nguyên liệuđã làm khô trong không khí. 2.1.2. Định tính các hợp chất hoá thực vật của nguyên liệu 2.1.2.1. Quế [1,3,5,10,13,16]  Dựa vào phản ứng hoá học Lấy 4 giọt tinh dầu trộn với 4 giọt acid nitric, ở nhiệt độ dưới 50C, xuất hiện tinh thể trắng hoặc vàng.  Dựa vào sắc ký lớp mỏng Kiểm nghiệm sự hiện diện của chất chuẩn trong nguyên liệu: Bản mỏng Silica gel GF254 Dung môi triển khai: cyclohexan - ethyl acetat (9:1) n-hexan - chloroform (4:3) Dung dịch thử: Lấy 2,0g bột nguyên liệu lắc với 10ml diethyl ether trong 3 phút, lọc. Dùng dịch lọc làm dung dịch thử. Dung dịch chuẩn: Dung dịch aldehyd cinamic 1mg/1ml diethyl ether. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 l mỗi dung dịch trên. Cách phát hiện: Phun dung dịch 2,4- dinitrophenyl hydrazin 2.1.2.2. Xạ Can [1,2,3,5,10,13,16,20]  Dựa vào phản ứng hoá học Lấy 5g bột nguyên liệu, thêm 40ml ethanol, đun hồi lưu cách thuỷ trong 30 phút. Lọc, cô dịch lọc còn khoảng 10ml.  Phản ứng với dung dịch natri hydroxyd Phản ứng 1: Nhỏ dịch chiết lên giấy lọc thành 2 vết riêng biệt, nhỏ tiếp lên một dịch chiết 1 giọt dung dịch natri hydroxyd 10%, để khô soi dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365nm. Vết dịch chiết không có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng cam nhạt, vết dịch chiết có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng sáng. Phản ứng 2: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2ml chloroform và 2ml dung dịch natri hydroxyd 10%, lắc mạnh. Đun trên cách thuỷ 2 phút, lắc đều, lớp nước kiềm có màu đỏ.  Dựa vào sắc ký lớp mỏng Bản mỏng Silica gel GF254 Dung môi khai triển: ether dầu – aceton (8:2) Dung dịch thử: Lấy 10g bột nguyên liệu cho vào becher loại 250ml, chiết siêu âm 3 lần mỗi lần với 50ml methanol, lọc lấy dịch nước đem cô cắn rồi hòa với 20ml nước cất. Sau đó, chiết lỏng lỏng với CHCl3 (3 lần x 20ml). Cô dịch lọc còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký. Dung dịch chuẩn: Dung dịch 31- norcycloartanyl tridecanoat 2mg/1ml trong CHCl3. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10μl mỗi dung dịch trên. Cách phát hiện: Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết.  Quan sát dưới ánh sáng thường  Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm. 2.1.3. Định lượng các hợp chất hóa thực vật trong nguyên liệu 2.1.3.1. Quế[1] Định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất lôi cuốn theo hơi nước trong nguyên liệu Quế.  Dụng cụ thí nghiệm: Cất tinh dầu Cân chính xác 20g nguyên liệu đã được xay nhỏ vào bình cầu dung tích 500 ml của bộ dung cụ định lượng tinh dầu trong dược điển. Thêm 200ml dung dịch acid hydrocloric 0,1N. Tiến hành cất trong 3 giờ (tốc độ cất 2,5-3,5ml/phút). Ngừng cất Sau 15 phút đọc thể tích tinh dầu ở phần chia vạch. Tính hàm lượng tinh dầu theo công thức: 100aX b = × X: hàm lượng phần trăm tinh dầu (ml/g) a: thể tích tinh dầu đọc được sau khi cất (ml) b: khối lượng nguyên liệu đã trừ độ ẩm (g) 2.1.3.2. Xạ Can Định lượng thành phần hóa thực vật trong Xạ Can bằng phương pháp đo phổ tử ngoại khả kiến dựa trên chất chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1,5mg chất chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat hòa tan trong CHCl3, định mức 10ml, được dung dịch A có nồng độ 150μg/ml. Sau đó, hút 100μl dung dịch A, định mức 10ml bằng CHCl3 ta được dung dịch chuẩn có nồng độ 1,5μg/ml. Dung dịch thử: Pha dung dịch mẫu cao theo sơ đồ sau Hình 4:Thiết bị cất tinh dầu Sơ đồ 1: Định lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat trong nguyên liệu Xạ Can Nguyên liệu Xạ Can Cắn MeOH Dịch CHCl3 Dung dịch 1 Cắn CHCl3 Dịch chiết MeOH Chiết Soxhlet bằng MeOH trong vòng 12 giờ. Cô cách thủy Hòa nước, lắc 8 lần với CHCl3 Dung dịch 2 Cô cách thủy Định mức 25ml bằng CHCl3 Hút 100μl Định mức 10ml bằng CHCl3 Xác định mật độ quang OD Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat Hút 1ml Định mức 5ml bằng CHCl3 Dung dịch 3 Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat có trong cao Xạ Can được tính theo công thức sau: Trong đó: At : Độ hấp thu mẫu thử. Ac : Độ hấp thu mẫu chuẩn Cc : Nồng độ chất chuẩn (μg/ml) d : Độ tinh khiết của chất chuẩn (90%) m : Khối lượng nguyên liệu cần định lượng đã trừ ẩm (g). 2.2. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao Quế và cao Xạ Can 2.2.1. Khảo sát độ tinh khiết của cao Quế và cao Xạ Can 2.2.1.1. Xác định độ ẩm Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 12.16 [1] Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy  Nguyên tắc Cao được sấy ở 105oC, nước trong mẫu sẽ bốc hơi làm giảm khối lượng mẫu, cân khối lượng mẫu sau khi sấy sẽ tính được độ ẩm của mẫu cao.  Tiến hành Cho vào chén cân dùng để xác định độ ẩm, đã được cân bì trước. Chén cân cần có kích thước thích hợp để lớp cao cho vào không dày quá 5mm. Cho chén chứa cao vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100 -1050C trong 4 giờ. Cho chén vào bình hút ẩm đến khi nguội. Làm lại nhiều lần đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0,5mg. 412500 10t c c AX C d A m −× = × × × Độ ẩm (X %) của cao được tính theo công thức sau: 100p aX p − = × p: Số gam mẫu thử trước khi sấy (g) a: Số gam mẫu thử sau khi sấy (g) 2.2.1.2. Độ tro toàn phần Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 9.8[1]  Tiến hành Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 0,5g cao rải đều vào chén nung, sau đó đốt hết hơi nước của cao trên bếp điện rồi đem nung trong lò nung ở 550oC trong 4 giờ. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nung đến khối lượng giữa hai lần cân không quá 5mg. Độ tro toàn phần được tính theo công thức: 100aX b = × X: Độ tro toàn phần (%) a: Khối lượng cao sau khi nung(g) b: Khối lượng cao trước khi nung (g) 2.2.2. Định tính các hợp chất trong cao Quế và cao Xạ Can 2.2.2.1. Cao Quế  Dựa vào sắc ký lớp mỏng Mục đích: Để xác định được các thành phần hóa thực vật trong nguyên liệu Quế cũng phải hiện diện trong cao Quế và sự hiện diện của chất chuẩn aldehyd cinnamic trong cao Quế phải được kiểm tra bằng SKLM.  Kiểm nghiệm sự hiện diện của nguyên liệu Quế có trong cao Quế Dung dịch thử: Cân khoảng 20g nguyên liệu, cho vào becher 250ml, chiết siêu âm với cồn 96% cho tới khi dịch chiết hết màu, tiếp tục chiết siêu âm bã nguyên liệu lần lượt với cồn 72% và cồn 48% đến khi kiệt. Tập trung toàn bộ dịch chiết được lọc và cô giảm áp thu hồi dung môi đến cắn. Cắn được hòa với 50ml nước cất, cho vào bể chiết siêu âm trong vòng 15 phút, lọc. Dịch nước được lắc với diethyl ether, đến khi dịch diethyl ether hết màu. Tập trung dịch diethyl ether cô còn 2ml làm dung dịch chấm sắc ký. Cân khoảng 1g cao Quế hòa với 50ml nước cất, cho vào bể chiết siêu âm trong vòng 15 phút, lọc. Dịch nước được lắc với diethyl ether, đến khi dịch diethyl ether hết màu.Tập trung dịch diethyl ether cô còn 2ml làm dung dịch chấm sắc ký. Bản mỏng Silica gel GF254 Dung môi khai triển: cyclohexan - ethyl acetat (9:1) n-hexan - aceton (8:2) Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10μl dd nguyên liệu và 10μl dd cao. Cách phát hiện:  Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm.  Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm.  Phun thuốc thử vanilin 5% trong ethanol. Sấy bản mỏng ở 1050C tới khi thấy vết.  Kiểm nghiệm sự hiện diện của chuẩn aldehyd cinnamic có trong cao Quế Bản mỏng Silica gel GF254 Dung môi khai triển: cyclohexan - ethyl acetat (9:1) ether dầu- aceton (8:2) Dung dịch thử: Cân khoảng 1g cao Quế chiết siêu âm với diethyl ether (3 lần x 20ml), lọc. Cô dịch lọc, còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký. Dung dịch chuẩn: Dung dịch aldehyd cinamic 1mg/1 ml diethyl ether. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10μl dd chuẩn và 10μl dd cao. Cách phát hiện: Phun dung dịch 2,4 - dinitrophenyl hydrazin. Quan sát dưới ánh sáng thường. 2.2.2.2. Cao Xạ Can  Dựa vào phản ứng hóa học Lấy 1 g cao Xạ Can, thêm 40ml ethanol, đun hồi lưu cách thuỷ trong 30 phút. Lọc, cô dịch lọc còn khoảng 10ml.  Phản ứng với dung dịch natrihydroxyd Phản ứng 1: Nhỏ dịch chiết lên giấy lọc thành 2 vết riêng biệt, nhỏ tiếp lên một dịch chiết 1 giọt dung dịch natri hydroxyd 10%, để khô soi dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365nm. Vết dịch chiết không có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng cam nhạt, vết dịch chiết có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng sáng. Phản ứng 2: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2ml chloroform và 2ml dung dịch natri hydroxyd 10%, lắc mạnh. Đun trên cách thuỷ 2 phút, lắc đều lớp nước kiềm có màu đỏ.  Dựa vào sắc ký lớp mỏng  Kiểm nghiệm sự hiện diện của nguyên liệu Xạ Can có trong cao Xạ Can Bản mỏng Silica gel GF254 Dung môi khai triển: chlorofrom - methanol (9:1) ether dầu - aceton (9:1) Dung dịch thử: Lấy 5g bột nguyên liệu cho vào becher loại 100ml, chiết siêu âm 3 lần mỗi lần với 30ml methanol, rồi lọc. Cô dịch lọc còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký. Lấy 1g cao Xạ Can cho vào becher loại 100ml, chiết siêu âm 3 lần mỗi lần với 30ml methanol, rồi lọc. Cô dịch lọc còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10μl mỗi dung dịch trên. Cách phát hiện:  Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm.  Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm.  Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường.  Phun thuốc thử sắt (III) clorid. Quan sát dưới ánh sáng thường  Kiểm nghiệm sự hiện diện của chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat có trong cao Xạ Can. Bản mỏng Silica gel GF254 Dung môi khai triển: ether dầu – aceton (8:2) Dung dịch thử: Lấy 1g cao cho vào becher loại 250ml, hòa nước. Sau đó, chiết lỏng lỏng CHCl3 (3 lần x 20ml). Cô dịch lọc còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10μl mỗi dung dịch trên. Cách phát hiện: .Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết.  Quan sát dưới ánh sáng thường  Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm. 2.2.3. Định lượng các hợp chất trong cao Quế và cao Xạ Can 2.2.3.1. Cao Quế Định lượng hợp chất aldehyd cinamic bằng phương pháp quang phổ tử ngoại dựa trên chất chuẩn aldehyd cinamic. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 5mg andehyd cinamic hòa tan trong methanol, định mức 10ml, được dung dịch A có nồng độ 0,5mg/ml. Sau đó, hút 30μl dung dịch A, định mức 5ml bằng methanol ta được dung dịch chuẩn có nồng độ 3μg/ml. Dung dịch thử: Pha dung dịch mẫu theo sơ đồ sau: Sơ đồ 2: Định lượng hàm lượng aldehyd cinamic trong cao Quế cao Quế Dung dịch 1 Dung dịch 2 Hàm lượng aldehyd cinamic Xác định mật độ quang OD Dịch chiết MeOH Chiết siêu âm với MeOH (6 lần x10ml) Định mức 100ml bằng MeOH Hút 0,8ml Định mức 10ml bằng MeOH Lượng aldehyd cinamic có trong cao Quế được tính theo công thức sau Trong đó: At : Độ hấp thu mẫu thử. Ac : Độ hấp thu mẫu chuẩn Cc : Nồng độ chất chuẩn (µg/ml) d : Độ tinh khiết của chất chuẩn (98%) m : Khối lượng chế phẩm cần định lượng đã trừ ẩm (g). 2.2.3.2. Cao Xạ Can Định lượng thành phần hoá thực vật trong cao Xạ Can bằng phương pháp đo phổ tử ngoại dựa trên chất chuẩn 31- norcycloartanyl tridecanoat Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1,5 mg chất chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat hòa tan trong CHCl3, định mức 10ml, được dung dịch A có nồng độ 150μg/ml. Sau đó, hút 100μl dung dịch A, định mức 10 ml bằng CHCl3 ta được dung dịch chuẩn có nồng độ 1,5μg/ml. Dung dịch thử: Pha dung dịch mẫu cao theo sơ đồ sau m dC A AX c c t 4101250 −× ×××= Sơ đồ 3: Định lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat trong cao Xạ can cao Xạ Can Cắn MeOH Dịch CHCl3 Dung dịch 1 Cắn CHCl3 Dịch chiết MeOH Chiết Soxhlet bằng MeOH trong vòng 12 giờ. Cô cách thủy Hòa nước, lắc 8 lần với CHCl3 Dung dịch 2 Cô cách thủy Định mức 25ml bằng CHCl3 Hút 40μl Định mức 10ml bằng CHCl3 Xác định mật độ quang OD Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat Lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat có trong cao Xạ Can được tính theo công thức sau: Trong đó: At : Độ hấp thu mẫu thử Ac : Độ hấp thu mẫu chuẩn Cc : Nồng độ chất chuẩn (μg/ml) d : Độ tinh khiết của chất chuẩn (90%) m : Khối lượng chế phẩm cần định lượng đã trừ ẩm(g). 46250 10t c c AX C d A m −× = × × × Phần 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU QUẾ VÀ XẠ CAN 1.1. Khảo sát độ tinh khiết của nguyên liệu 1.1.1. Độ ẩm Quế Xạ Can Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng nguyên liệu(g) 10,0027 10,0020 10,0044 10,0067 10,0197 10,0137 Thể tích nước sau 2h (ml) 1,35 1,3 1,3 1,35 1,6 1,55 Thể tích nước sau khi cho dược liệu(ml) 2,4 2,3 2,4 2,35 2,7 2,6 Độ ẩm(%) 10,5 10,0 11,0 9,99 10,9 10,49 Trung bình 10,50 10,46 Bảng 4: Độ ẩm của nguyên liệu • Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy nguyên liệu có các giá trị về độ ẩm nằm trong giới hạn an toàn cho phép đúng theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV là độ ẩm của nguyên liệu Quế < 14% và của Xạ Can < 12%. 1.1.2. Độ tro toàn phần Quế Xạ can Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng bì (g) 34,7599 38,3694 38,0464 32,1983 32,4455 35,3875 Khối lượng nguyên liệu (g) 1,0059 1,0084 1,0093 1,0021 1,0102 1,0078 Khối lượng bì và nguyên liệu sau khi nung (g) 34,7995 38,4122 38,0882 32,2535 32,4995 35,4392 Độ tro(%) 3,9368 4,2443 4,1415 5,5084 5,3455 5,1300 Trung bình 4,1075 5,3280 Bảng 5: Độ tro toàn phần của nguyên liệu • Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy nguyên liệu có các giá trị về độ tro toàn phần nằm trong giới hạn an toàn cho phép đúng theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV là độ tro toàn phần của nguyên liệu Quế < 5% và của Xạ Can < 8,5%. 1.1.3. Độ tro không tan trong acid Quế Xạ Can Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng bì (g) 34,7599 38,3694 38,0464 32,1983 32,4455 35,3872 Khối lượng nguyên liệu (g) 1,0059 1,0084 1,0093 1,0021 1,0102 1,0078 Khối lượng bì và nguyên liệu sau khi nung (g) 34,7995 38,4122 38,0882 32,2535 32,4995 35,4392 Khối lượng còn lại (g) 0,0002 0,0005 0,0002 0,0075 0,0065 0,0050 Độ tro (%) 0,0200 0,0500 0,0200 0,7500 0,6500 0,5000 Trung bình 0,03 0,63 Bảng 6: Độ tro không tan trong acid của nguyên liệu • Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy nguyên liệu có các giá trị về độ tro không tan trong acid nằm trong giới hạn an toàn cho phép đúng theo tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV là độ tro không tan trong acid của nguyên liệu Quế < 2% và của Xạ Can < 2%. 1.2. Định tính các hợp chất hóa nguyên liệu Quế và Xạ Can 1.2.1. Quế  Phản ứng hóa học Lấy 4 giọt tinh dầu trộn với 4 giọt acid nitric, ở nhiệt độ dưới 50C, xuất hiện tinh thể trắng hoặc vàng.  Sắc ký lớp mỏng  Kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn aldehyd cinamic có trong nguyên liệu Quế Cyclohexan - Ethyl acetat (9:1) n-Hexan - Clorofrom (4:3) 1. Chuẩn 2. Nguyên liệu Phun thuốc thử 2,4 dinitropheny hydrazin. Quan sát dưới ánh sáng thường Hình 5: SKLM kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn aldehyd cinamic trong nguyên liệu Quế • Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ nguyên liệu Quế tương ứng với màu sắc và giá trị Rf của vết chuẩn 1 2 1 2 aldehyd cinamic. Như vậy, có sự hiện diện của chuẩn aldehyd cinamic trong nguyên liệu Quế. 1.2.2. Xạ Can  Phản ứng hóa học Phản ứng 1 Phản ứng 2 1.Nguyên liệu không có NaOH 2. Nguyên liệucó NaOH 1. Dd nguyên liệu 2. Sau khi phản ứng xảy ra Hình 6: Phản ứng hóa học của nguyên liệu Xạ Can • Nhận xét: Phản ứng 1: Vết dịch chiết không có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng cam nhạt, vết dịch chiết có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng sáng. Phản ứng 2: Sau phản ứng, lớp nước kiềm có màu đỏ.  Sắc ký lớp mỏng  Kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat trong nguyên liệu Xạ Can 1 2 1 2 Ether dầu - Aceton (8:2) Ether dầu - Aceton (8:2) 1.Chuẩn 2.Nguyên liệu Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm. Hình 7: SKLM kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn 31- norcycloartanyl tridecanoat trong nguyên liệu Xạ Can • Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ nguyên liệu Xạ Can tương ứng với màu sắc và giá trị Rf vết thu được của chuẩn 31- norcycloartanyl tridecanoat. Như vậy, có sự hiện diện của chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat trong nguyên liệu Xạ Can. 1 2 1 2 1.3. Định lượng các hợp chất hóa thực vật 1.3.1. Quế Hàm lượng tinh dầu có trong nguyên liệu Quế: Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng nguyên liệu (g) 20,005 20,0032 20,0027 Số ml tinh dầu thu được (ml) 0,6500 0,7500 0,6500 Trung bình 0,6833 Hàm lượng tinh dầu(%) 3,7975 Bảng 7: Hàm lượng tinh dầu có trong nguyên liệu Quế • Nhận xét: Hàm lượng tinh dầu chiếm 3,7975% trong nguyên liệu phù hợp yêu cầu trong Dược Điển Việt Nam IV về hàm lượng tinh dầu nguyên liệu Quế là không nhỏ hơn 1% . 1.3.2. Xạ Can Lần Khối lượng nguyên liệuđã trừ ẩm (g) At Ac Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat (%) Trung bình (%) 1 4,5091 0,4670 0,4800 0,369 0,3605 0,4870 0,4660 2 4,4999 0,4490 0,4800 0,3458 0,4430 0,4360 3 4,4858 0,4760 0,4800 0,3668 0,4680 0,4600 Bảng 8: Hàm lượng 31-norcycloartanyl tridecanoat trong nguyên liệu Xạ Can • Nhận xét: Hàm lượng 31-norcycloartanyl tridecanoat trong nguyên liệu Xạ Can chiếm khoảng 0,3605 %. 2. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CAO QUẾ VÀ CAO XẠ CAN. 2.1. Khảo sát độ tinh khiết của cao Quế và cao Xạ Can 2.3.1. Độ ẩm. cao Quế cao Xạ can Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng bì (g) 1,8643 4,2956 4,6195 3,9016 4,3982 4,7203 Khối lượng cao (g) 0,5129 0,5082 0,5232 0,5143 0,4561 0,49352 Khối lượng bì và cao sau khi nung (g) 2,3585 4,7849 5,1245 4,3678 4,8089 5,16842 Độ ẩm (%) 3,6459 3,7190 3,4786 9,3525 9,9540 9,1992 Trung bình 3,6145 9,5019 Bảng 9: Độ ẩm của cao Quế và cao Xạ Can • Nhận xét: Độ ẩm của cao Quế là 3,6145% và độ ẩm cao Xạ Can là 9,5019% 2.3.2. Độ tro toàn phần cao Quế cao Xạ can Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng bì (g) 21,0783 26,3289 24,4181 35,4652 38,7715 35,3864 Khối lượng cao (g) 0,5134 0,5025 0,5384 0,5175 0,5211 0,5183 Khối lượng bì và cao sau khi nung (g) 21,0870 26,3382 24,4289 35,4775 38,7825 35,3977 Độ tro (%) 1,6946 1,8507 2,0059 2,3768 2,1109 2,1802 Trung bình 1,8504 2,2226 Bảng 10: Độ tro toàn phần của cao Quế và cao Xạ Can • Nhận xét: Độ tro toàn phần của cao Quế là 1,8504% và của cao Xạ Can là 2,2226%. 2.2. Định tính các hợp chất trong cao Quế và cao Xạ Can 2.2.1. Cao Quế  Sắc ký lớp mỏng  Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu trong cao Quế Cyclohexan- Ethyl acetat (9:1) Cyclohexan- Ethyl acetat (9:1) Cyclohexan- Ethyl acetat (9:1) 1. Nguyên liệu 2. Cao Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 254nm. Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm. Phun thuốc thử vanilin trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. 2 1 2 2 1 1 n-Hexan - Aceton ( 8:2) n-Hexan - Aceton ( 8:2) Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 254nm. Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm. Hình 8:SKLM kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Quế trong cao Quế • Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của các vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ nguyên liệu Quế tương ứng với màu sắc và giá trị Rf của các vết thu được của cao Quế. Như vậy, chứng tỏ các thành phần hóa thực vật trong nguyên liệu Quế cũng hiện diện trong cao Quế. 2 1 1 2  Kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn aldehyd cinamic trong cao Quế Cyclohexan - Etyl acetat (9:1) Ether dầu - Aceton (8:2) 1. Chuẩn 2. Cao Phun thuốc thử 2,4-dintrophenyl hydrazin. Quan sát dưới ánh sáng thường. Hình 9: SKLM kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn aldehyd cinamic trong cao Quế • Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ cao Quế tương ứng với màu sắc và giá trị Rf vết thu được của chuẩn aldehyd cinamic. Như vậy, chứng tỏ trong cao Quế có sự hiện diện của chuẩn aldehyd cinamic. 1 2 1 2 2.2.2. Cao Xạ Can  Phản ứng hóa học Phản ứng 1 Phản ứng 2 1. Cao không có NaOH 2. Cao có NaOH 1. dd cao 2. Sau khi phản ứng xảy ra Hình 10: Phản ứng hóa học của cao Xạ Can • Nhận xét: Phản ứng 1: Vết dịch chiết không có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng cam nhạt, vết dịch chiết có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng sáng. Phản ứng 2: Sau phản ứng, lớp nước kiềm có màu đỏ. 1 2 1 2 1  Sắc ký lớp mỏng  Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Xạ Can trong cao Xạ Can Chlorofrom - Methanol (9:1) Chlorofrom - Methanol (9:1) Chlorofrom - Methanol (9:1) 1. Nguyên liệu 2. Cao Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm. Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 254nm. Phun thuốc thử sắt (III) clorid. Quan sát dưới ánh sáng thường. 2 1 1 2 1 2 Ether dầu- Aceton (9:1) Ether dầu- Aceton (9:1) 1. Nguyên liệu 2.Cao Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm. Hình 11: SKLM kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu trong cao Xạ Can • Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của các vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ nguyên liệu Xạ Can tương ứng với các màu sắc và giá trị Rf cácvết thu được của cao Xạ Can. Như vậy, chứng tỏ các thành phần hóa thực vật trong nguyên liệu Xạ can cũng hiện diện trong cao Xạ can. 1 2 1 2  Kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn 31- norcycloartanyl tridecanoat trong cao Xạ Can. Ether dầu – Aceton (8:2) Ether dầu - Aceton (8:2) 1. Chuẩn 2. Cao Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm. Hình 12: SKLM kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn 31- norcycloartanyl tridecanoat trong cao Xạ Can • Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ cao Xạ can tương ứng với màu sắc và giá trị Rf của vết thu được của chất 1 2 1 2 chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat. Như vậy, chứng tỏ trong cao Xạ can có sự hiện diện của chất chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat. 2.3. Định lượng các hợp chất trong cao Quế và cao Xạ Can 2.3.1. Cao Quế Hàm lượng aldehyd cinamic trong cao Quế Lần Khối lượng cao đã trừ ẩm (g) At Ac Hàm lượng aldehyd cinamic (%) Trung bình (%) 1 0,1079 0,6210 0,3390 6,1387 6,1414 0,6070 0,6090 2 0,1089 0,6050 0,3390 6,0952 0,6180 0,6140 3 0,1056 0,5970 0,3390 6,1902 0,5990 0,6130 Bảng 11: Hàm lượng aldehyd cinamic trong cao Quế • Nhận xét: Hàm lượng aldehyd cinnamic trong cao Quế chiếm khoảng 6,1414 %. 2.3.2. Cao Xạ Can Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat trong cao Xạ Can Lần Khối lượng cao Xạ Can đã trừ ẩm (g) At Ac Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat (%) Trung bình (%) 1 0,9987 0,5580 0,4800 0,9751 0,9667 0,5560 0,5480 2 0,9951 0,5250 0,4800 0,9333 0,5270 0,5330 3 1,002 0,5680 0,4800 0,9918 0,5640 0,5660 Bảng 12: Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat trong cao Xạ Can • Nhận xét: Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat trong cao Xạ Can chiếm khoảng 0,9667 %. Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN Qua quá trình thực nghiệm và làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, em đã thực hiện được các vấn đề sau: 1. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ bản của nguyên liệu Quế và Xạ Can theo chuyên luận “Dược Liệu” trong Dược Điển Việt Nam như:  Độ ẩm  Độ tro toàn phần  Độ tro không tan trong acid  Đánh giá được chất lượng của nguyên liệu về mặt đinh tính bằng cả hai phương pháp: − Phản ứng hóa học − Sắc ký lớp mỏng  Đánh giá được chất lượng của nguyên liệu về mặt định lượng − Hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu Quế bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước. − Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat trong Xạ Can bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến. 2. Xây dựng tiêu chuấn kiểm nghiệm cơ bản của cao Quế và Xạ Can theo trong Dược Điển Việt Nam như:  Độ ẩm  Độ tro toàn phần  Đánh giá được chất lượng của nguyên liệu về mặt đinh tính bằng cả hai phương pháp: − Phản ứng hóa học − Sắc ký lớp mỏng  Đánh giá được chất lượng của cao Quế và cao Xạ Can về mặt định lượng − Hàm lượng aldehyd cinamic trong cao Quế bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến − Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat trong cao Xạ Can bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến. 2. KIẾN NGHỊ Qua quá trình xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao Quế, Xạ Can em xin đề nghị các bảng tiêu chuẩn cơ sở để kiểm nghiệm như sau: 2.1. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu 2.1.1. Quế STT Các tiêu chí Yêu cầu Phương pháp thử 1 Độ ẩm Không được quá 14% DĐVN IV 2 Độ tro toàn phần Không được quá 5% DĐVN IV 3 Độ tro không tan trong acid Không được quá 2% DĐVN IV 4 Định tính Phản ứng hóa học Sắc ký lớp mỏng Nguyên liệu Quế có phản ứng của tinh dầu với acid nitric. Các vết thu được trên sắc kí đồ của mẫu thử phải có giá trị Rf và màu sắc tương đồng với các vết thu được của chất chuẩn aldehyd cinamic TCCS 5 Định lượng Hàm lượng tinh dầu thu được phải không được nhỏ hơn 1% trong nguyên liệu Quế DĐVN IV 2.1.2. Xạ Can STT Các tiêu chí Yêu cầu Phương pháp thử 1 Độ ẩm Không được quá 12% DĐVN IV 2 Độ tro toàn phần Không được quá 8,5% DĐVN IV 3 Độ tro không tan trong acid Không được quá 2% DĐVN IV 4 Định tính Phản ứng hóa học Sắc ký lớp mỏng Mẫu thử phải cho phản ứng với dung dịch natri hydroxyd Các vết thu được trên sắc kí đồ của mẫu thử phải có giá trị Rf và màu sắc tương đồng với các vết thu được của chất chuẩn 31 - norcycloartanyl tridecanoat TCCS 5 Định lượng Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat nằm trong khoảng 0,31%- 0,42%. TCCS 2.2. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao Quế và cao Xạ Can 2.2.1. Cao Quế STT Các tiêu chí Yêu cầu Phương pháp thử 1 Độ ẩm Không được quá 6% DĐVN IV 2 Độ tro toàn phần Không được quá 3% DĐVN IV 3 Định tính Sắc ký lớp mỏng Các vết thu được trên sắc kí đồ của mẫu thử phải có giá trị Rf và màu sắc tương đồng với các vết thu được của Nguyên liệu Quế. Chất chuẩn aldehyd cinamic TCCS 4 Định lượng Hàm lượng aldehyd cinamic trong cao nằm trong khoảng 5,2% - 7% TCCS 2.2.2. Cao Xạ Can STT Các tiêu chí Yêu cầu Phương pháp thử 1 Độ ẩm Không được quá 13% DĐVN IV 2 Độ tro toàn phần Không được quá 5% DĐVN IV 3 Định tính Phản ứng hóa học Sắc ký lớp mỏng Mẫu thử phải cho phản ứng với dung dịch natri hydroxyd Các vết thu được trên sắc kí đồ của mẫu thử phải có giá trị Rf và màu sắc tương đồng với các vết thu được của Nguyên liệu Xạ can. Chất chuẩn 31- norcycloartanyl tridecanoat TCCS 4 Định lượng Hàm lượng 31 - norcycloartanyl tridecanoat trong cao Xạ Can nằm trong khoảng 0,85% - 1,15% TCCS Với sự hiểu biết hạn chế của một sinh viên cùng với thời gian thực nghiệm không nhiều, nên kết quả thu được vẫn còn nhiều thiếu sót, em kính mong nhận được những ý kiến chỉ dẫn của thầy cô để khóa luận được hoàn chỉnh hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Dược điển Việt Nam IV (2004), Nhà xuất bản Y học 2. Vũ Thị Ngọc Anh (2011), Nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm của Tec-01 chiết xuất từ cây Xạ Can (Belamcanda chinensis (L.) DC. Họ Iridaceae) trên thực nghiệm. Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ. 3. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ (2000), Bài giảng chiết xuất dược liệu, Tài liệu giảng dạy sinh viên dược 5, Trường ĐH Y Dược TP.HCM, Bộ môn dược liệu. 4. Nguyễn Tinh Dung, Lê Thị Vinh, Trần Thị Yến, Đỗ Văn Huê (2006), Một số phương pháp Phân Tích Hóa Lý, Trường Đại Học Sư Phạm TP. Hồ Chí Minh. 5. Nguyễn Thị Ngọc Đan (2010), Xây dựng tiêu chuẩn Kiểm nghiệm viên nang cứng Mimosta được bào chế từ hỗn hợp các nguyên liệumướp đắng, mắc cỡ và râu mèo có tác dụng điều trị bệnh đái tháo đường. Khóa luận tốt nghiệp cử nhân hóa học. 6. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học. 7. Đặng Văn Giáp (1997), Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình MS – Excel, NXB Giáo Dục. 8. TS Lê Minh Hà (2010-2011).Xây dựng qui trình công nghệ chiết tách và tinh chế hợp chất tectorigenin từ cây Xạ can (Belamcanda chinensis) (L.) DC.) và nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của hợp chất tectorigenin tách được trên động vật thực nghiệm.Đào tạo thạc sĩ. 9. Từ Minh Koóng (2007). Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Tập 1, Kỹ thuật sản xuất thuốc bằng phương pháp tổng hợp hóa dược và chiết xuất dược liệu, Sách đào tạo dược sỹ Đại Học, NXB Y Học Hà Nội. 10. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam II, NXB Y Học. 11. Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học 12. Bộ môn nguyên liệu (2004), Giáo trình phương pháp nghiên cứu Dược liệu, trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. 13. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 545-553. 14. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 1095-1098. 15. Võ Phi, Trung Hoa Y Học Tạp Chí 1952, (38 (4): 315). 16. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 17. Trần tích (2007), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Giáo dục 18. Nguyễn Thị Huỳnh Trang (2013), Phân lập và xác định hợp chất chính trong cây Xạ Can (Belamcanda chinensis (L.). Báo cáo thực tập. 19. Huỳnh Văn Trung, Đỗ Quý Sơn (2005), Xử lý thống kê các số liệu thực nghiệm trong hóa học, NXB Khoa học và Kỹ Thuật, Hà Nội. Tiếng nước ngoài 20. Ching-Kuo Lee and Ming-Huey Chang (2000), The Chemical Constiuents from the Heartwood of Eucalyptus citriodora, Journal of the Chinese Chemical Society, 47, 555-560. 21. Fang H., Rao Y.K. and Tzeng Y.M (2004), Cytotoxic effect of trans- Cinnamaldehydefrom Cinnamoum osmophloeum Leaves on Human Cancer Cell Lines, Int. J. Appl. Sci. Eng, 2(2), 136-137. 22. Le Minh Ha, Phan Van Kiem, Natalya Khripach (2009), Chemical constituents of Belamcanda chinensis (L.) DC, Journal of Chemistry, 47 (5), 623 - 627. 23. Nandam Sree Satya, Surya Prakash D.V., Vangalapati Meena (2012), Purification of Cinnamaldehyde from Cinnamon Species by Column Chromatography, 1(7), 49-51. 24. Nenandis et al.,Radical scanvenging potential of phenolic compounds encountered in O. europea product as indicated by calculation of bond dissociation enthalpy and ionization potential values (2004), Joumal of Agricultural and Food Chemistry, 26, 295-299. 25. R.N. Mbouangouere, P. Tane, D.Ngamga, S.N. Khan, M.I. Choudhary anh B.T. Ngadjui (2007), A New Steroid andα-glucosidase Inhibitors from Anthocleistaschweinfurthii, Research Journal of Medicinal Plant, 1(3),106- 111. 26. Sharma C.K and Kanwar S.S. (2012), Synthesis of methyl cinnamate using immobilized lipase from B.licheniformis MTCC-1048. Research Jourmal of Recent Sciences, 1(3), 68-71. 27. Wu TS, Leu YL, Chan YY, Yu SM, Teng CM, Su JD (1994). Lignans and an aromatic acid from Cinnamomum philippinense. Phytochemistry, 36: 785-788. 28. Youn H.S., Lee J.K., Choi Y.J., Saitoh S.I. Miyake K. Hawanq D. H. and Lee J. Y (2008). Cinnamaldehyde suppresses toll-like receptor 4 activation mediated through the inhibition of receptor oligonmerization, Biochem Pharmacol, 75(2), 494-502.