Kĩ thuật rapd và kĩ thuật ssr

PAGE  PAGE 4 Sinh viên: Đinh Thị Minh Nguyệt Lớp: K33C – Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 BÀI TIỂU LUẬN: KĨ THUẬT RAPD VÀ KĨ THUẬT SSR Kĩ thuật RAPD (Randomly Amplified Polymosphic DNA). Kĩ thuật này được gọi là kĩ thuật phát hiện tính đa hình của DNA nhân bản ngẫu nhiên. Đây là một trong các kĩ thuật phân tích đánh giá bộ genom thực vật đơn giản. Sự đa hình các sản phẩm của RAPD là kết quả của sự thay đổi điểm gắn của primer hoặc do sự thay đổi NST trong các vùng được nhân bản sẽ gây ra sự thay đổi của kiến trúc hay ngăn cản sự nhân bản của DNA mẫu. Kĩ thuật RAPD thực chất là quá trình nhân bản các đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR sử dụng các mồi thiết kế ngẫu nhiên. Các mồi này sẽ bắt cặp một cách ngẫu nhiên vào DNA khuôn ở vị trí bất kì nào đó, mà tại đó có trình tự bổ sung với nó. Nguyên lí: Sử dụng các mồi đơn có trình tự ngẫu nhiên, chiều dài khoảng 10 nucleotit để nhân bản các đoạn DNA nằm giữa hai mồi bắt cặp ngẫu nhiên được sắp xếp đúng chiều có khoảng cách phù hợp (150 – 3000 bp). Kết quả sẽ cho một bức tranh tổng thể về sự đa dạng DNA của các bộ gen cá thể nghiên cứu. Kĩ thuật RAPD gồm các bước cơ bản sau: Tách chất, tinh sạch, đánh giá độ tinh sạch DNA hệ gen. Thực hiện phản ứng PCR với mồi ngẫu nhiên. Điện di sản phẩm PCR. Xác định mức độ da hình DNA giữa các mẫu. Phân tích kết quả. Những khác biệt của RAPD với PCR: Do tính chất ghép cặp ngẫu nhiên nên primer vừa là primer xuôi vừa là primer ngược. RAPD không cho băng nhân bản nếu: + Không có trình tự nu giống trình tự primer trong genom của đối tượng nghiên cứu. + Có các trình tự này nhưng lại cũng nằm trên một sợi hay các trình tự nằm ở hai sợi quá xa nhau hay khi ghép cặp các primer không hướng vào nhau. Phải sử dụng nhiều primer khác nhau mới có thể phát hiện được những đa hình hay các khác biệt của genom của đối tượng nghiên cứu. Có thể dùng phối hợp vài primer cùng một phản ứng để tăng số băng nhân bản. Ưu điểm: Không cần biết trước trình tự DNA để thiết kế đoạn mồi. Đơn giản, dễ sử dụng, ít tốn kém. Bộ mồi được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền cho nhiều loài khác nhau. Nhược điểm: Khó lặp lại thí nghiệm vì độ lặp lại không cao. Cùng một băng DNA trên gel điện li có cùng trình tự hay không thì không thể phát hiện được. Ứng dụng: Được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau. Lập cây phát sinh chủng loại. Lập bản đồ di truyền. Được ứng dụng trong việc xác định các gen cần tìm, các đoạn DNA liên kết chặt chẽ với các gen cần tìm (chỉ thị phân tử DNA). SSR: Simple Sequence Repeats. Trong cấu trúc genom của SVNC có những đoạn DNA bao gồm những đoạn trình tự giống nhau và lặp đi lặp lại nhiều lần gọi là các đoạn trình tự lặp lại. Trình tự trong cấu trúc các đoạn lặp lại gọi là đơn vị lặp lại. Có hai loại trình tự lặp lại: + Trình tự lặp lại phân tán. + Trình tự lặp lại liền kề - tendem repeat. Số base trong một đơn vị lặp lại có thể từ hai đến hàng trăm base. Dựa vào số base trong một đơn vị lặp lại chia ra thành các đoạn chỉ thị sau: + Số base trong một đơn vị lặp lại nhỏ hơn 5 gọi là chỉ thị SSR (Simple Tendem Repeats). + Số base trong một đơn vị lặp lại từ 5 đến 25 gọi là chỉ thị STR (Short Tendem Repeats). + Số base trong một đơn vị lặp lại lớn hơn 25 gọi là chỉ thị VNTR (Variable Number Tendem Repeats). SSR marker: + Nguyên lí: Dựa vào hai đầu (vùng sườn) của các đoạn lặp lại có trình tự rất đặc biệt và thống nhất chung cho cùng một đoạn DNA trên gen không phân biệt cá thể trong cùng một loài, nhưng giữa các cá thể trong cùng một loài số lần lặp lại của đơn vị lặp lại là khác nhau. Từ đó, thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các cặp DNA trên gen chứa các trình tự lặp lại. Điện di sản phẩm PCR cho phép phân biệt được sự giống và khác nhau giữa các cá thể trong cùng loài. + Ưu điểm: Nhóm chỉ thị này rất đặc hiệu, có độ chính xác cao. Tương đối đơn giản, dễ thực hiện. Có độ lặp lại rất cao. + Nhược điểm: Nhóm kĩ thuật này cần nhiều bước tiến hành, cần thiết kế các cặp mồi chính xác tương ứng với hai đàu của đoạn DNA chứa trình tự lặp lại. + Ứng dụng: Sử dụng để xác định huyết thống, giám định cá thể (xác định tội phạm), các nhóm cá thể, dòng giống...... Sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, phân loại các giống vật nuôi với nhau trong cùng một loài động vật hay thực vật. Đây là chỉ thị đồng trội nên cho phép phát hiện được cá thể là đồng hợp tử hay dị hợp tử của gen phân tích – chẩn đoán cặp lai cho ưu thế lai. Xây dựng bản đồ liên kết, phân lập gen để xác định các dòng, giống cây trồng, vật nuôi.