Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1

Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1 PAGE  PAGE 1 MỤC LỤC  TOC \o "1-3" \h \z \u  HYPERLINK \l "_Toc295209747" MỞ ĐẦU  PAGEREF _Toc295209747 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc295209748" NỘI DUNG  PAGEREF _Toc295209748 \h 5  HYPERLINK \l "_Toc295209749" I. Tổng quan về bệnh cúm A/H5N1  PAGEREF _Toc295209749 \h 5  HYPERLINK \l "_Toc295209750" I.1. Khái quát bệnh cúm gia cầm  PAGEREF _Toc295209750 \h 5  HYPERLINK \l "_Toc295209751" I.2. Dịch bệnh cúm A/H5N1  PAGEREF _Toc295209751 \h 5  HYPERLINK \l "_Toc295209752" I.3. Dịch tễ học  PAGEREF _Toc295209752 \h 8  HYPERLINK \l "_Toc295209753" I.4. Những hiểu biết cơ bản về virus cúm A/H5N1  PAGEREF _Toc295209753 \h 11  HYPERLINK \l "_Toc295209754" I.5. Phương pháp chẩn đoán bệnh cúm typ A và phòng chống bệnh  PAGEREF _Toc295209754 \h 16  HYPERLINK \l "_Toc295209755" II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu  PAGEREF _Toc295209755 \h 26  HYPERLINK \l "_Toc295209756" II.1. Đối tượng nghiên cứu  PAGEREF _Toc295209756 \h 26  HYPERLINK \l "_Toc295209757" II.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu  PAGEREF _Toc295209757 \h 26  HYPERLINK \l "_Toc295209758" KẾT LUẬN  PAGEREF _Toc295209758 \h 33  HYPERLINK \l "_Toc295209759" TÀI LIỆU THAM KHẢO  PAGEREF _Toc295209759 \h 36 MỞ ĐẦU Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm và thuỷ cầm, đặc biệt là ở gà. Dịch bệnh này do các phân typ khác nhau thuộc nhóm virus cúm typ A, họ Orthomyxoviridae gây nên (Dybing et al., 2000; Hatta et al., 2001). Khi dịch bệnh xuất hiện thì rất dễ bùng phát thành đại dịch nguy hiểm. Hàng năm trên thế giới có khoảng 10.000- 20.000 người tử vong vì bệnh cúm, đặc biệt là vụ dịch năm 1918-1919 có khoảng 21 triệu người chết (Couch, Kasel, 1995). Nhiều công trình đã chứng minh rằng virus cúm typ A là nguyên nhân gây ra những vụ đại dịch nguy hiểm và điều này được giải thích bằng khả năng thay đổi kháng nguyên HA- hemagglutinin (H1 đến H15) và kháng nguyên NA- neuramindaza (N1 đến N9), sự tổ hợp của những biến thể gen mã hoá cho kháng nguyên HA và kháng nguyên NA tạo nên những phân typ mới (subtype). Trong các phân typ thuộc cúm typ A cho đến nay thì phân typ H5N1 có độc lực cao nhất gây chết gia cầm hàng loạt. Trong những tháng cuối năm 2003 và đầu năm 2004, ở khu vực Đông Nam Á và Châu Á - Thái Bình Dương đã phải đối mặt với vụ dịch cúm gia cầm nguy hiểm với qui mô rộng lớn chưa từng có trong lịch sử. Ở nước ta dịch cúm gia cầm hoành hành đã gây những thiệt hại nghiêm trọng: về kinh tế, riêng vụ dịch từ cuối năm 2003 dến tháng 3/2004, cả nước ta đã phải tiêu hủy 43,8. Cúm còn lây sang người với những dấu hiệu trầm trọng và đã gây ra nhiều ca tử vong. Theo WHO, tính đến tháng 5 năm 2004 ở Việt Nam đã có 23 trường hợp tử vong do nhiễm virus cúm H5N1. Và đặc biệt là sau những cái chết gần đây tại Thái Lan, đã có dấu hiệu cho thấy virut cúm gia cầm có thể lây từ người sang người. Nếu điều này được khẳng định chính xác thì dịch cúm gia cầm thực sự đang diễn biến đến mức trầm trọng. Cuộc chiến chống lại dịch bệnh chết người này vì thế cần được đẩy mạnh hơn nữa. Để phòng chống căn bệnh nguy hiểm này đòi hỏi phải có các biện pháp tổng hợp như giám sát dịch tễ học, chẩn đoán nhanh, cách ly tiêu diệt mầm bệnh và tìm ra phác đồ điều trị hiệu quả. Kỹ thuật gen được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực của đời sống: trong y dược học, trong nông – lâm – ngư nghiệp, … Với những kiến thức đã được học môn Kỹ thuật gen do PGS.TS. Khuất Hữu Thanh giảng dạy em tìm hiểu đề tài: “Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1”. Do kiến thức hiểu biết còn hạn chế nên bài tiểu luận còn nhiều thiếu sót, rất mong thầy có sự chỉ bảo và góp ý giúp cho đề tài được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 6 tháng 6 năm 2011 Sinh viên thực hiện Phạm Khánh Dung NỘI DUNG I. Tổng quan về bệnh cúm A/H5N1 I.1. Khái quát bệnh cúm gia cầm Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh viêm đường hô hấp cấp tính rất nguy hiểm, với khả năng lây nhiễm cao, có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu hết với mọi loại vật chủ và có hệ gen luôn biến đổi. Đây là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus (de Wit, Fouchier, 2008). Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9), và sự tái tổ hợp (reassortment) giữa các phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA), hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ. Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện bao gồm 4 nhóm virus, đó là: nhóm virus cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus cúm C (Influenza C); và nhóm Thogotovirus. Các nhóm virus khác nhau bởi các kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA), ở virus cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở Thogotovirus là Glycoprotein (GP). I.2. Dịch bệnh cúm A/H5N1 I.2.1. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới Virus cúm typ A đã gây ra những vụ dịch kinh hoàng trong lịch sử: Đại dịch cúm Tây Ban Nha vào năm 1918 đã gây chết trên 20 triệu người, tiếp theo đó là những đại dịch nhưng ít nghiêm trọng hơn như: đại dịch cúm 1957 gọi là dịch cúm Châu Á do phân typ H2N2 gây nên, đại dịch cúm năm 1968 hay cúm Hồng Kông do phân typ H3N2 gây nên, đại dịch cúm 1977 gọi là dịch cúm Nga do phân typ H1N1 gây nên. Ba phân typ H1N1, H2N2, H3N2 đã lan truyền từ người sang người tạo nên những vụ đại dịch gây ra những tổn thất to lớn về mặt kinh tế và đặc biệt là gây tử vong rất cao. Tại Hồng Kông, năm 1997 phân typ cúm gia cầm H5N1đã gây nhiễm 18 trường hợp, trong đó 6 ca tử vong. Năm 2003, tại Trung Quốc/Hồng Kông hai trường hợp được xác nhận nhiễm cúm H5N1 và cả hai trường hợp này đều chết. Bản đồ các quốc gia xảy ra dịch cúm A/H5N1 (WHO, tính đến 15/09/2008). Phần bôi đậm là vùngdịch cúm xảy ra trên gia cầm. Phần bôi nhạt là vùng dịch cúm chỉ xảy ra trên chim hoang dã. Từ cuối 2005, cúm A/H5N1, chủ yếu là các chủng virus thuộc phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) bắt đầu lan sang một số nước vùng Trung Á, trong đó có Nga, rồi tràn ngập Đông Âu và xâm nhập vào các nước vùng Tiểu Á, bao gồm Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc- Trung Phi, đặc biệt Ai Cập và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất (Salzberg, 2007). Nhằm ngăn chặn dịch bệnh lây lan, trong hơn mười năm qua, trên thế giới đã có hàng trăm triệu gia cầm đã bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi và kinh tế. Đặc biệt, số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1, mỗi năm một cao hơn, theo thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 báo cáo với Tổ chức Y tế thế giới (WHO), từ năm 2003 đến tháng 6/2008, đã có tới 385 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó, 243 trường hợp đã tử vong chiếm tới 63,11%. Việt Nam và Indonesia là các 2 quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất do virus cúm A/H5N1 trên thế giới. Trong số 16 nước có người chết do cúm gia cầm, Inonesia và Việt Nam được WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” có thể cúm A/H5N1 có được các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành virus của người. I.2.2. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn. Đây là lần đầu tiên dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nền tới nền kinh tế quốc dân. Tính đến nay (tháng 10/2008), dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát hàng năm tại nhiều địa phương trong cả nước, có thể phân chia thành các đợt dịch lớn như sau: Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 và 30/03/2004, dịch cúm xảy ra ở các tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang. Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai tháng đã xuất hiện ở 57/64 thành trong cả nước. Tổng số gà và thủy cầm mắc bệnh, chết và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17% tổng đàn gia cầm. Trong đó, gà chiếm 30,4 triệu con, thuỷ cầm 13,5 triệu con. Ngoài ra, có ít nhất 14,8 triệu chim cút và các loại khác bị chết hoặc thiêu huỷ. Đặc biệt, có 3 người được xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt dịch này. Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: dịch bệnh tái phát tại 17 tỉnh, thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004 chỉ còn một điểm phát dịch. Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống kê trong vụ dịch này là 84.078 con. Trong đó, có gần 56.000 gà; 8.132 vịt; và 19.950 con chim cút. Và đã có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1, trong đó có 9 ca tử vong. Đợt 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: dịch cúm gà xảy ra trên 36 tỉnh thành trong cả nước. Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y thống kê là 1,846 triệu con (gồm 470.000 gà, 825.000 thủy cầm và 551.000 chim cút). Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gà xảy ra trong tháng 10/2005 lan nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng 12/2005. Sau một năm (2006), do áp dụng chương trình tiêm chủng rộng rãi cho các đàn gia cầm trong cả nước, cùng với các biện pháp phòng chống dịch quyết liệt, dịch cúm A/H5N1 không xảy ra ở Việt Nam. Mặc dù vậy, đến 06/12/2006 dịch cúm gia cầm A/H5N1 đã tái bùng phát ở Cà Mau, sau đó lan sang các tỉnh Bạc Liêu, Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ. Trong năm 2007, dịch bệnh tái phát tại Hải Dương vào ngày 17/02/2007 và được khống chế sau 1 tháng. Tuy nhiên, đến ngày 01/05/2007 dịch bệnh tiếp tục tái phát tại Nghệ An, sau đó lan sang nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước. Theo Báo cáo của Cục Thú y (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) đến ngày 10/06/2007 dịch đã xảy ra trên 16 tỉnh, thành phố (Nghệ An, Quảng Ninh, Cần Thơ, Sơn La, Nam Định, Đồng Tháp, Hải Phòng, Bắc Giang, Ninh Bình, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Quảng Nam, Hưng Yên, Thái Bình và Phú Thọ), và chỉ được khống chế hoàn toàn vào 8/2007. Gần đây, dịch bệnh lại tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc vào tháng 3/2008. Cho đến tháng 6/2008, dịch cúm gia cầm A/H5N1 về cơ bản đã được khống chế trên toàn quốc. I.3. Dịch tễ học Dịch cúm diễn ra hàng năm do virus cúm typ A và typ B gây ra thường diễn ta vào mùa đông. Cả virus typ A và virus typ B có thể đồng thời lưu hành, song chỉ có một typ hoặc một phân typ là chiếm ưu thế hơn trong một vụ dịch nhất định. Sự biến thể của virus xuất hiện với một số lượng vừa phải cuối một vụ dịch cú thể báo trước sự ưu thế của biến thể này vào vụ dịch tiếp theo. Đại dịch cúm diễn ra thường không theo một chu kỳ nhất định, mà xen kẽ vào là những vụ dịch nhỏ. Người ta nhận thấy chính virus cúm typ A là thủ phạm gây ra các vụ đại dịch, các virus cúm typ B thường gây ra các dịch khu vực. Nhiều công trình nghiên cứu đó chứng minh rằng virus cúm typ A cú khả năng biến đổi không ngừng, tạo ra những phân typ virus mới là nguyên nhân của các vụ đại dịch cúm. Nguyên nhân của sự biến đổi không ngừng có thể được giải thích như sau: Khi cơ thể bị nhiễm virus cúm sẽ sinh không thể chống lại virus ở mức độ khác nhau. Do vậy virus thay đổi không ngừng để tồn tại. Virus cúm typ A thích ứng tồn tại trên người và nhiều loài động vật như vịt, gà, lợn, ngựa, chim… nên các loài này luôn là nguồn tàng trữ virus. Chính vì vậy, sự lan truyền nội, ngoại loài tạo cơ hội cho các biến chủng trao đổi gen và tái tổ hợp tạo nên những biến chủng mới. Bệnh cúm lây trực tiếp từ người sang người bằng đường hô hấp, qua các hạt nước bọt nhỏ li ti mang rất nhiều virus. Ngày nay các phương tiện giao thông hiện đại làm cho dịch cúm không những lan tràn nhanh trong phạm vi địa phương mà còn cả trong phạm vi toàn cầu. Mọi người, mọi lứa tuổi đều nhạy cảm với cúm, đặc biệt là trẻ em, lứa tuổi thanh thiếu niên và phụ nữ mang thai. Người già, người có bệnh mạn tính đường hô hấp dễ bị nhiễm cúm nặng, có nhiều biến chứng và tỷ lệ tử vong cao. I.3.1. Sinh bệnh học và triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm A/H5N1 Sinh bệnh học Virus cúm xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô đường hô hấp thông qua cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể. Sau khi vào được trong tế bào biểu mô đường hô hấp, virus nhân lên và phát triển rất nhanh, phá vỡ tế bào để chui ra và xâm nhập vào các tế bào lành khác. Ở niêm mạc đường hô hấp trên, virus cúm bị các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể như dịch mũi họng, dịch phế nang và IgA tiết … chống lại. Khi virus cúm vượt qua được hàng rào này chúng sẽ xâm nhiễm vào máu, cuối cùng xâm nhập vào các cơ quan tổ chức. Triệu chứng lâm sàng Thời gian ủ bệnh là từ vài giờ đến 21 ngày, các triệu chứng bắt đầu xuất hiện một ngày sau khi virus phá vỡ tế bào chui ra. Bệnh nhân cúm A có hiện tượng sốt liên tục trên 380C, đau đầu, đau cơ, ho, đau họng, bệnh nhân khó thở (nhịp thở lúc chỉ còn 30-40 lần/phút), độ bão hoà oxi giảm, tụt huyết áp, bạch cầu giảm. Chụp X quang thấy phổi tổn thương nhanh hơn theo từng ngày, dẫn đến sốc rồi gây tử vong. Những trường hợp nhiễm cúm nặng được đặc trưng bởi sốt cao, đột ngột và tử vong nhanh với tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Tỷ lệ nhiễm bệnh nhiều nhất là ở trẻ em, nhưng tỷ lệ nhiễm cúm nặng và tỷ lệ tử vong cao nhất là ở người già trên 65 tuổi. I.3.2. Nguồn lây truyền bệnh cúm A/H5N1 Bằng chứng sinh thái học và nguồn gốc phả hệ virus cúm A cho thấy thuỷ cầm chính là nguồn tàng trữ virus cúm A, từ đó truyền sang các vật chủ khác như ngựa, lợn, gà, có thể lây sang cả cá voi và chim biển, người. Sau đó virut gây bệnh và gây dịch ở các loài này và dịch bệnh ở người. Gà bị nhiễm virus cúm sẽ thải virus cúm qua đường mỏ hoặc đường phân. Đây chính là nguy cơ lớn gây nhiễm nguồn nước và nguồn thức ăn, tạo điều kiện cho sự lan truyền virus trong quần thể người và động vật. Mối quan hệ lây nhiễm của virus cúm A I.4. Những hiểu biết cơ bản về virus cúm A/H5N1 I.4.1. Đặc điểm chung của virus cúm typ A thuộc họ Orthomyxoviridae Họ Orthomyxoviridae được chia làm 4 nhóm: Nhóm viruscúm typ A Nhóm virus cúm typ B Nhóm viruscúm typ C Nhóm Thogotovirus Hạt virion có dạng hình cầu, đôi khi ở dạng sợi, đường kính khoảng 80-120nm, trọng lượng phân tử của một hạt virion vào khoảng 250 triệu Dalton. Hệ gen là sợi ARN đơn âm, được ký hiệu là ss(-) ARN, kích thước hệ gen thường 10.000-15.000 nucleotide và có cấu trúc phân thành 8 phân đoạn, mỗi phân đoạn mã hoá cho một chuỗi polypeptide, từ đó tổng hợp nên các protein chức năng của virus. Lõi virus mang vật liệu di truyền và 3 polymerase, PB1, PB2, PB3 đều được gắn với nucleoprotein dạng xoắn helica, phức hệ này tạo thành nucleocapsid. Bao quanh nucleocapsid là lớp protein nền (matrix protein), ký hiệu là M1, tiếp đó là màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật chủ. Lớp vỏ virus có bản chất là lipoprotein, bao gồm những gai mấu có bản chất là protein trần hoặc đã được glycosyl hoá gắn chặt vào lớp kép lipid nhờ các tương tác kỵ nước, kích thước của những gai mấu có độ dài 10-14nm, đường kính 4-6nm. Có khoảng 500 gai mấu chia làm 2 loại: gai HA (hemagglutinin), gai NA (neuraminidase). Matrix protein RNA segment Nucleocapsid Ion chanel NA Inllustration of virus HA Lipid envelope a b a- Hình thái của virut cúm typ A; b- Cấu trúc hạt virion của cúm typ A I.4.2. Cấu trúc hệ gen và chức năng Virus cúm typ A có hệ gen là ss(-) ARN mang 8 phân đoạn, mỗi phân đoạn mã hoá cho một chuỗi polypeptide, từ đó tổng hợp nên các protein cấu trúc hoặc không cấu trúc của virus. Phân đoạn 1, 2, 3: mã hoá cho các protein PB1, PB2, PB3. Những protein này có chức năng là các ARN polymerase phụ thuộc vào ARN cần cho quá trình tổng hợp mARN và ARN hệ gen của virus. Phân đoạn 4: mã hoá cho protein HA. HA là các gai mấu có bản chất là glycoprotein, nằm rải rác trên bề mặt của virus cúm gây ngưng kết hồng cầu và tham gia vào một số chức năng sau: HA khởi đầu quá trình xâm nhiễm bằng cách gắn vào thụ thể sialic axit trên bề mặt tế bào vật chủ, sau khi chui vào tế bào sự dung hợp diễn ra để giải phóng ARN vào tế bào chất. Phân đoạn 5: mã hoá cho nucleoprotein (NP). Phân đoạn 6: mã hoá cho protein enzym neuraminidase (NA). NA là các gai mấu trên bề mặt của virus, có bản chất là glycoprotein, vừa đóng vai trò là kháng nguyên vừa có hoạt tính enzym. Enzym neuraminidaza phân cắt liên kết giữa thụ thể sialic axit và HA nhờ vậy đẩy nhanh quá trình lan truyền của virus trong hệ thống đường hô hấp. Phân đoạn 7: mã hóa cho chuỗi polypeptide, từ đó tổng hợp nên hai protein, protein nền (matrix protein)- ký hiệu là M1 và protein M2 đóng vai trò là kênh ion,nằm trên bề mặt của virus. Protein M1 là loại protein chiếm tỷ lệ cao nhất trong virion, với chức năng chính là làm ổn định hình thái của virion. Protein nền này cũng mang kháng nguyên đặc hiệu typ, qua đó được sử dụng để xác định virus cúm typ A, B, C. Phân đoạn 8: là gen mã hóa protein không cấu trúc (non structural protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của virus nếu thiếu chúng virus sinh ra sẽ bị thiểu năng (Murphy, Webster, 1996; Sekellick et al., 2000). Độc tính của virus có sự liên quan với gen không cấu trúc (non-structural gen) này được tìm thấy ở biến chủng A/H5N1/97 (Webster, 1998), trong tự nhiên, việc đột biến xóa đi một phần gen có liên quan đến giảm độc lực (Zhu et al., 2008). NS1 có khối lượng phân tử theo tính toán là 27.103 Da (trên thực tế là 25.103 Da), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm, và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ. NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen (30 bp và 336 bp) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 14.103 Da (trên thực tế là 12x103 Da), đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới (Sekellick et al., 2000; Zhu et al., 2008). Như vậy, virus cúm A/H5N1 có hệ gen được cấu trúc từ 8 phân đoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzym sửa chữa RNA, tạo điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn gen/hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng virus cúm A mới. I.4.3. Sự biến đổi tính kháng nguyên HA,NA và sự hình thành các phân typ mới Nguyên nhân gây các vụ dịch lớn hay đại dịch thường do những nguyên nhân chính sau : Nguyên nhân thứ nhất là do sự biến đổi kháng nguyên trên bề mặt của virus cúm, có hai hình thức biến đổi kháng nguyên. Biến đổi nhỏ (antigenic drift): là những thay đổi từ từ trong protein hemagglutin và neuraminidase khi virus mang những đột biến nhỏ và tiến hoá qua thời gian để trốn thoát khỏi kháng thể đặc hiệu của cơ thể vật chủ. Sự tích luỹ từ hai đến ba đột biến sẽ dẫn đến tạo thành một phân typ mới có thể gây đại dịch lớn. Biến đổi lớn (antigenic shift): là những biến đổi lớn và đột ngột trong cấu trúc của protein hemagglutin và neuraminidase dẫn đến sự tạo thành một phân typ virus mới. HA và NA là hai kháng nguyên bề mặt có mức độ biến đổi rẩt cao : có 15 biến thể gen HA (từ H1đến H15) và 9 biến thể gen NA (từ N1 đến N9). Sự tổ hợp lại của những biến thể gen thường kéo theo một phân typ cúm mới có khả năng gây nên đại dịch (ví dụ H2N2 năm 1957 và H3N2 năm 1968). Ngoài ra một nguyên nhân chính nữa đó là do hệ gen của virus cúm typ A phân đoạn tạo điều kiện cho sự trao đổi gen và sự tái tổ hợp trở lại, khi có hai phân typ cúm khác nhau xâm nhiễm vào một cơ thể vật chủ. Hơn nữa là do virus cúm thích ứng tồn tại trên rất nhiều loại vật chủ: người và các loài động vật như gà, vịt, lợn, ngựa, chim…, nên các loài này luôn là nguồn tàng trữ virus. Đồng thời tính thích ứng lan truyền nội, ngoại loài tạo cơ hội cho sự hình thành các tái tổ hợp gen mới, ví dụ: năm 1968, phân typ cúm H3N2 ở người là kết quả của sự tái tổ hợp gen H2N2 ở người và H3 của virus trong tự nhiên; H7N7 của hải cẩu có thể do sự tái tổ hợp gen của 2 hay 3 loại virus cúm ở chim; H1N1 và H3N2 phân lập năm 1978 và năm 1989 gây bệnh ở người có cấu trúc protein bề mặt được lấy từ nguồn gen tái tổ hợp từ H1N1 hoặc H1N2 và 4-6 gen có nguồn gốc từ H3N2. Các chủng virus cúm phân lập được, được qui định danh pháp theo trình tự như sau: typ huyết thanh/loài nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình phân typ theo kháng nguyên HA và NA. ví dụ: A/chicken/Vietnam/HD1/2004(H5N1) là chủng virut cúm typ A phân lập trên gà tại Việt Nam, ký hiệu chủng là HD1, năm phân lập là năm 2004, có kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1. I.4.4. Chu trình sinh sống của virus cúm typ A Virus xâm nhập vào tế bào vật chủ bằng cơ chế ẩm bào nhờ tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên HA và thụ thể là axit sialic trên màng tế bào vật chủ. Khi pH môi trường trong khoang ẩm bào thấp, sẽ diễn ra sự dung hợp giữa lớp vỏ lipoprotein của virus và lớp kép lipit của thể endosome, giải phóng RNP (ARN và các protein PB1, PB2, PB3 được bao bọc bởi nucleoprotein) vào tế bào chất của tế bào vật chủ, sau đó được chuyển vào trong nhân. Tại đây chúng sử dụng bộ máy của hệ thống vật chủ và enzym ARN polymerase phụ thuộc vào ARN do virus mang theo để tổng hợp nên mARN thông tin, mARN sau khi trải qua cải biến cắt bỏ intron, được adenyl hoá ở đầu 3’ sẽ được chuyển ra tế bào chất để tiến hành dịch mã tạo các protein cấu trúc hoặc không cấu trúc, hầu hết các protein được tổng hợp ở lại trong nguyên sinh chất, số khác lại được chuyển vào trong nhân để tiếp tục quá trình tổng hợp nguyên liệu di truyền và tham gia vào quá trình bao gói vật liệu di truyền. ARN đơn âm được chuyển thành ARN đơn dương theo cơ chế bổ sung, và sợi dương này lại làm khuôn để tổng hợp nhiều ARN đơn âm mới nhờ ARN polymerase phụ thuộc vào ARN vừa được tổng hợp. Các sợi ARN hệ gen được tạo thành là một sợi hoàn chỉnh về độ dài, không được mũ hoá ở đầu 5’ và không được adenyl hoá ở đầu 3’. Sau đó chúng được bao bọc lại để hình thành nên ribonucleocapsit sau đó được chuyển đến màng tế bào, nơi đã được gắn sẵn các gai HA, NA, M2 nhờ hệ thống Golgi chuyển ra và hạt virion mới được hình thành được giải phóng theo lối nảy chồi. Sự nhân lên của virut cúm typ A I.5. Phương pháp chẩn đoán bệnh cúm typ A và phòng chống bệnh I.5.1. Phương pháp chẩn đoán Phân lập virus cúm typ A từ dịch tiết của đường hô hấp (dịch mũi, họng) sau đó tiến hành chẩn đoán nhanh bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang, hoặc tiến hành nuôi cấy trong phôi gà. Chẩn đoán theo phương pháp huyết thanh học: dùng kháng thể kháng HA trong huyết thanh làm phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu. Chẩn đoán bằng các phương pháp sinh học phân tử: kỹ thuật RT-PCR kết hợp với ELISA để so sánh và tăng khả năng phát hiện tác nhân gây bệnh. Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật Real-time PCR để chẩn đoán nhanh và chính xác virus cúm typ A và phân typ H5N1. I.5.2. Phương pháp phòng và chống bệnh Một số loại hoá dược liệu được dùng trong điều trị các trường hợp nhiễm cúm bao gồm chất ức chê enzym neuraminidase, Amatadine và Rimantadine, cơ chế hoạt động của những loại nay như sau: Chất ức chế enzym neuraminidase: ngăn cản sự giải phóng của virus khỏi tế bào bị nhiễm, có hiệu quả đối với cả cúm typ A và cúm typ B. Amatadine: ngăn chặn quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào vật chủ bằng cách ức chế quá trình cởi bỏ vỏ của virus cúm typ A, thuốc được dùng cho cả phòng bệnh và điều trị đối với những trường hợp nhiễm cấp tính. Rimantadine: ức chế quá trình sao chép của các phân typ H1N1, H2N2, H3N2. Ngoài ra để phòng bệnh một cách hiệu quả, người ta đã triển khai các vắc xin chống cúm. Đã có hai loại vắc xin cúm là vắc xin sống giảm độc lực và vắc xin bất hoạt. Tuy nhiên vắc xin này chỉ có thể tạo ra sức đề kháng đối với một số chủng cúm nhất định, do virus cúm luôn biến đổi đặc tính kháng nguyên nên vắc xin sản xuất từ các chủng cũ không có khả năng phòng vệ đối với các chủng đã biến đổi. Chủng H5N1 được coi là loại biến chủng có độc lực cao nhất đối với người và động vật, nên gây chết phôi gà rất nhanh. Chính vì vậy không thể sử dụng nguồn phôi gà để nuôi cấy virus H5N1 nhằm tạo văc xin bất hoạt. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và mạng lưới các phòng thí nghiệm của WHO đang thực hiện tạo vắc xin H5N1 bằng phương pháp nhân tạo có tái tổ hợp gen của virus cúm H5N1 đương nhiễm, có khả năng gây đáp ứng miễn dịch nhưng không gây bệnh. Tuy nhiên H5N1 có khả năng biến đổi nội gen nhanh nên vấn đề vắc xin không thực sự dễ dàng. Vì vậy để phòng chống nhiễm bệnh cần thực hiện những biện pháp tổng hợp như giám sát dịch tễ học, chẩn đoán nhanh, chính xác các phân typ nhằm mục đích cách ly, tiêu diệt mầm bệnh hiệu quả. I.5.3. Kỹ thuật Real-time PCR Kỹ thuật Real- time PCR được cải tiến dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, là một phương pháp mới đang được một số phòng thí nghiệm trên thế giới khai thác có hiệu quả trong nhiều ứng dụng trong đó có việc phát hiện và định lượng DNA và RNA với độ chính xác và tính đặc hiệu rất cao, có thể phát hiện được sự có mặt của chỉ một bản sao của sợi khuôn ban đầu. I.5.3.1. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) Nguyên tắc: Lai đặc hiệu của ADN theo nguyên tắc bổ sung: A liên kết với T bằng hai liên kết hydro, G liên kết với C bằng ba liên kết hydro. Tổng hợp ADN invitro nhờ ADN polymerase. Điều kiện: Khuếch đại ADN đích cần phải biết trình tự nucleotit ở hai đầu để thiết kế cặp mồi đặc hiệu. Các bước cơ bản của phản ứng PCR, gồm 3 bước chính: Bước 1- bước biến tính: Tách ADN sợi đôi thành ADN sợi đơn ở nhiệt độ 94-95 0C trong khoảng thời gian từ 30”- 1’. Bước 2- bước gắn mồi: nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào nhiệt độ T0m của mồi, trong khoảng thời gian từ 30-60”. Bước 3- kéo dài chuỗi: nhiệt độ thích hợp cho enzym Tag ADN polymerase hoạt động là 72 0C, trong khoảng thời gian 30” đến vài phút, tuỳ thuộc vào kích thước đoạn ADN cần khuếch đại. Một số bước phụ trong phản ứng PCR: Hot start: ADN ban đầu phải được biến tính hoàn ở 94-95 0C trong khoảng 2-5 phút. Mục đích của bước này là làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng, do mồi có thể bám vào ngay ở nhiệt độ thường và kéo dài chuỗi. Kéo dài thời gian tổng hợp chuỗi: vân tốc tổng hợp chuỗi của Tag polymeraza là 60 nu/s, nhưng trong thực tế nếu nhân một đoạn có kích thước 1kb thì cần 1 phút. Làm lạnh ở 4 0C bảo vệ cấu trúc của AND. Nguyên tắc thiết kế mồi: Dựa trên trình tự nucleotit đã biết của đối tượng nghiên cứu hoặc đối tượng liên quan, mồi phải nằm trong vùng ít biến đổi của hệ gen. Dựa trên kích thước hệ gen: chiều dài mồi nên đủ lớn để sao cho 4n lớn gấp đôi hệ gen. Trình tự nên có 50-60% G + C, Tm của hai mồi phải gần như nhau, tránh lặp lại những trình tự giàu G-C (dễ tạo cấu trúc kẹp tóc bền). Mồi xuôi và mồi ngược phải tránh hiện tượng ghép cặp bổ sung tạo dạng dimer Khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược không được quá lớn, thích hợp nhất là dưới 1000 nucleotide. Dùng các phần mềm để thiết kế mồi. 1.5.3.2. Những hạn chế của kỹ thuật PCR truyền thống và những cải tiến của kỹ thuật Real-time PCR. Để hiểu rõ hơn những hạn chế của kỹ thuật PCR truyền thống và những ưu điểm của kỹ thuật Real-time PCR, ta cần xem một phản ứng PCR diễn ra qua các giai đoạn nào. Một phản ứng khuếch đại cơ bản trải qua 3 giai đoạn, giống như đồ thị sinh trưởng. Giai đoạn 1 (exponential): nhân lên theo cấp số mũ, số bản sao được tăng gấp đôi chính xác qua mỗi chu kỳ. Giai đoạn 2 (Linear): nguyên liệu trong phản ứng khuếch đại giảm dần, giai đoạn này có sự khác biệt rất lớn giữa các mẫu khác nhau (số lượng bản sao ban đầu, kích thước đoạn cần khuếch đại…). Giai đoạn 3 (end-point): không có sự khuếch đại diễn ra, sản phẩm PCR bắt đầu có sự phân huỷ (đối với kỹ thuật PCR truyền thống, sản phẩm ở giai đoạn này được đem điện di trên gel agaroza 1%). Kỹ thuật PCRKỹ thuật Real-time PCR-Sau khi phản ứng PCR kết thúc, sản phẩm phải đem điện di trên gel agarose để biết kết quả. -Phản ứng được giám sát từ khi bắt đầu phản ứng cho đến khi kết thúc, thông qua một hệ thống camera theo dõi sự phát huỳnh quang ở từng mẫu. - Số bản sao ở chu kỳ cuối của các mẫu có thể là khác nhau, song gel agarose có độ phân giải kém nên có thể không phát hiện ra sự khác nhau này. Agarose gel chỉ phân biệt được khi số lượng bản sao hơn kém nhau 10 lần.- Real-time PCR rất nhanh nhạy, khuếch đại đoạn ADN có kích thước dưới 400bp và có thể phân biệt khi có sự chênh lệch về số bản sao khoảng 2 lần.- Một số vấn đề gặp phải khi phát hiện sản phẩm tại pha cuối của phản ứng PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose: độ chính xác thấp, độ nhạy kém, độ phân giải thấp, không được tự động hoá, phân biệt các băng nhân bản chỉ dựa vào kích thước, kết quả không được hiển thị bằng dạng số, nhuộm bằng ethidium bromide hiệu quả thấp, và đặc biệt là trường hợp có sự phân huỷ sản phẩm PCR ở giai đoạn cuối. - Real-time PCR đã khắc phục được những nhược điểm này của kỹ thuật PCR truyền thống: số liệu được thu ở giai đoạn nhân lên theo cấp số mũ, tín hiệu phát huỳnh quang thu được tỉ lệ với số bản sao được nhân lên, không có sự phân huỷ sản phẩm PCR ở giai đoạn cuối…I.5.3.3. Hiểu biết cơ bản về kỹ thuật Real-time PCR Kỹ thuật Real- time PCR được cải tiến dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này cho phép giám sát phản ứng trùng hợp chuỗi ngay khi nó bắt đầu diễn ra và số liệu thu được trong suốt quá trình diễn ra phản ứng PCR, không phải sau khi phản ứng PCR đã kết thúc. Kỹ thuật này đã đưa lại một cuộc cách mạng trong định lượng ADN và ARN. Trong kỹ thuật này, phản ứng được đặc trưng là phát hiện ngay khi có sự khuếch đại ADN đích đầu tiên, chứ không cần sự tích luỹ số lượng bản sao ADN sau một số chu kỳ nhất định. Số lượng bản sao ban đầu càng lớn, thì tín hiệu huỳnh quang thay đổi càng nhanh. Ngược lại, trong phản ứng PCR chỉ có thể đánh giá lượng bản sao tích luỹ sau khi phản ứng kết thúc. Kỹ thuật Real-time PCR sử dụng hai loại chất hoá học để phát hiện sản phẩm PCR đó là: TaqMan và SYBR Green I dye. Sự khác biệt lớn nhất giữa hai loại hoá chất này là: SYBR Green I dye phát hiện ADN mạch đôi, bao gồm cả sản phẩm đặc hiệu và không đặc hiệu. TaqMan chỉ phát hiện sản phẩm đặc hiệu được nhân lên trong phản ứng PCR. Nguyên tắc hoạt động của TaqMan: sử dụng mẫu dò phát huỳnh quang để phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu, được diễn biến theo các bước sau: Một mẫu dò oligonucleotit được thiết kế với đầu 5’ mang một chất phát tín hiệu huỳnh quang (reporter) và đầu 3’ mang một chất kìm hãm sự phát tín hiệu huỳnh quang này (quencher) . Khi mẫu dò ở trạng thái nguyên vẹn thì có sự truyền năng lượng từ reporter sang quencher làm giảm khả năng phát sáng của reporter khi ở trong một khoảng cách nhất định. Sự truyền năng lượng từ reporter sang quencher được gọi là FRET (fluorescence resonant energy transfer) và được giải thích như sau:… Nếu trình tự nucleotit đích có mặt, mẫu dò sẽ bám vào theo nguyên tắc bổ sung và mẫu dò sẽ bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ nucleaza của Tag DNA polymeraza khi mồi được kéo dài. Sự phân cắt này sẽ tách reporter khỏi quencher làm tăng tín hiệu phát huỳnh quang và loại bỏ mẫu dò khỏi trình tự đích, cho phép mồi tiếp tục kéo dài mà không ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chuỗi. Hơn nữa reporter bị phân cắt khỏi mẫu dò ở mỗi chu kỳ có nghĩa là tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự nhân lên của trình tự đích. Hình vẽ minh hoạ nguyên tắc hoạt động của TaqMan Nguyên tắc hoạt động của SYBR Green I dye: khi liên kết với các ADN sợi đôi chất này sẽ phát tín hiệu huỳnh quang, diễn biến theo các bước sau: Khi SYBR Green I dye được bổ sung vào một mẫu, lập tức nó sẽ gắn với ADN sợi đôi. Phản ứng kéo dài chuỗi nhờ AmpliTag Gold sẽ tạo ra số bản sao nhiều gấp đôi sau mỗi chu kỳ. SYBR Green I dye sẽ gắn với các bản sao ADN mạch đôi này. Tín hiệu huỳnh quang tăng lên tỷ lệ với số lượng bản sao được tạo thành. Hình vẽ minh hoạ nguyên tắc hoạt động của SYBR Green I dye Những ưu điểm và hạn chế của hai phân tử chất hoá học này: TaqManSYBR Green I dyeƯu điểm-Tín hiệu huỳnh quang được phát ra chỉ khi có sự gắn của mẫu dò vào trình tự đích. -Mẫu dò có thể được đánh dấu bằng các loại reporter khác nhau cho phép phát hiện đồng thời hai trình tự đích khác nhau trong cùng một mẫu. -Quá trình phân hủy sản phẩm ở giai đoạn cân bằng được loại bỏ.-Được sử dụng để phát hiện bất cứ một trình tự đích ADN mạch đôi nào. -Không cần thiết kế mẫu dò vì vậy giảm chi phí và giảm bước chuẩn bị hoá chất. Hạn chế-Hạn chế lớn nhất của phân tử chất hoá học này là: phải tổng hợp các mẫu dò khác nhau để phát hiện các trình tự đích khác nhau.-Hạn chế cơ bản nhất của phân tử chất hóa học này là: vừa gắn vào sản phẩm đặc hiệu, lại vừa gắn vào sản phẩm không đặc hiệu. Vì vậy không được sử dụng trong trường hợp phát hiện đột biến.I.5.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật Real-time PCR Kỹ thuật Real-time PCR nhanh nhạy hơn kỹ thuật PCR truyền thống và hơn nữa với khả năng thu số liệu ở giai đoạn nhân lên theo cấp số mũ nên nó mở rộng hơn những ứng dụng ví dụ như: Định lượng virus. Đánh giá sự biểu hiện của gen. Đánh giá hiệu quả thuốc trong điều trị bệnh. Phát hiện đột biến. Chẩn đoán bệnh. Bệnh cúm là một bệnh đường hô hấp có nguy cơ lây nhiễm rất cao, dễ dàng trở thành dịch bệnh và bệnh này diễn ra hàng năm gây bệnh và tử vong đáng kể. Người già và trẻ em là đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao, thường gây chết hoặc biến chứng nghiêm trọng. Vì vậy, tầm quan trọng của việc chẩn đoán nhanh bệnh này không chỉ là đưa ra liệu pháp điều trị phù hợp, mà còn nhằm mục đích xác định nhanh sự bắt đầu khởi phát của một vụ dịch cúm. Gần đây, chất ức chế enzym neuraminidase là loại thuốc chống virut có hiệu quả cao với cả virus cúm A và cúm B khi mới xuất hiện triệu chứng. Với sự phát triển trong phương pháp điều trị mới này, việc chẩn đoán nhanh cúm càng có trở nên cấp thiết. Các phương pháp chẩn đoán thông thường vẫn được sử dụng: phân lập virus thông qua nuôi cấy, phát hiện kháng nguyên, và các phân tích huyết thanh học. Tuy nhiên mỗi phương pháp này đều có những hạn chế, ví dụ: Phân lập virus là phương pháp chẩn đoán rất nhạy, song thời gian tiến hành từ 1 đến 2 tuần, trong khi thời gian ủ bệnh là rất ngắn và bệnh tiến triển rất nhanh, nên khi thu được kết quả từ nuôi cấy sẽ là quá muộn để đưa ra những biện pháp can thiệp hiệu quả. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang cho kết quả nhanh nhưng độ chính xác không cao. Kỹ thuật Real-time PCR được cải tiến từ kỹ thuật PCR truyền thống nhằm giải quyết những hạn chế của các kỹ thuật trên, đó là chẩn đoán nhanh nhạy và độ chính xác cao. II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu II.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là chủng virut cúm gia cầm H5N1 đã được bất hoạt trong dung dịch trizol do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. II.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu II.2.1. Tách chiết ARN tổng số Các phân tử ARN không bền, dễ bị phân huỷ bởi enzym RNaza có mặt khắp mọi nơi, ngay cả trên ngón tay của người thao tác. Phân tử RNaza có hoạt tính rất cao và rất bền vững với các tác nhân làm mất hoạt tính của chúng. Vì vậy việc tách chiết ARN đòi hỏi phải thận trọng để tránh mọi sự tạp nhiễm RNaza từ môi trường. Thao tác phải trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hoá chất đều được xử lý DEPC trước khi đem khử trùng bằng áp lực hơi nước. Có rất nhiều phương pháp được sử dụng để tách chiết ARN của virut cúm H5N1, v trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp hoá học của Chomezynski và Sachi, Anal. Biochem. (1987), 156-159. Các bước tiến hành: Bổ sung 200 l dung dịch chloroform vào huyền dịch virut đã được bất hoạt trong trizol (400 l dịch virut trong 400 l trizol), đảo đều trong 15 giây. Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó đem ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C. Chuyển pha trên vào một ống Eppendorf mới. Bổ sung 0,5 ml isopropanol. Đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 12000v/p trong 10 phút ở 40C để thu tủa ARN. Rửa tủa lại bằng ethanol 70%, ly tâm 12000v/p trong 5 phút ở 40C. Làm khô ARN trong Box, hoà lại trong 20 l nước siêu sạch, đã được xử lý bằng DEPC để loại RNaza. II.2.2. Kiểm tra ARN tổng số bằng quang phổ kế Để có thể xác định tương đối nồng độ của ARN tổng số tách từ huyền dịch cúm H5N1, chúng tôi dùng phương pháp quang phổ kế. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin và pirimidin. Nồng độ ARN sợi đơn (g/ml) sẽ được tính theo công thức CARN = A260 x 40 x d, trong đó d là độ pha loãng mẫu cần đo. Cách tiến hành như sau: Dung dịch ARN thu được, được đem pha loãng 20 lần trong nước siêu sạch (5 l dung dịch ARN trong 95 l nước). Chuyển dung dịch ARN đã được pha loãng sang cóng thạch anh nhỏ của máy quang phổ Shimadzu và đo sự hấp thụ ở bước sóng 260 nm. Tuy nhiên cách tính trên chỉ chính xác nếu ARN thu được là sạch. Nếu dung dịch còn chứa protein thì protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm, do đó làm sai lệch nồng độ thật của ARN trong mẫu. Muốn biết việc xác định nồng độ ARN có chính xác hay không, cần đo thêm giá trị A280 (protein hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 280 nm). Nếu tỷ lệ A260/A280 nằm trong khoảng 1.8-2 thì mẫu tách chiết ARN được đánh giá là đạt yêu cầu về mức độ sạch để tiến hành tiếp những thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo. II.2.3. Phương pháp tạo cADN bằng phản ứng RT-PCR Để thực hiện phản ứng RT-PCR chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm SuperScipt one-step RT-PCR with Platium Tag của hãng Invitrogen. Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR: Tổng hợp cADN từ ARN của virut nhờ enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) và mồi ngẫu nhiên (random primer). Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị mẫu với thành phần như sau: ARN tổng số (tối ưu là 5 g) : 5 l Mồi ngẫu nhiên (50 ng/l) : 3 l dNTP (10 mM) : 1 l H2O đã xử lý DEPC : 1 l Tổng thể tích : 10 l Sau đó ủ ở 650C trong 5 phút và đặt trên đá ít nhất 1 phút. Đồng thời chuẩn bị một hỗn hợp khác với các thành phần như sau: 10X RT buffer : 2 l 25 mM MgCl2 : 4 l 0.1 M DTT : 2 l Chất ức chế RNaza : 1 l Tổng thể tích : 9 l Bổ sung 9 l hỗn hợp thành phần trên vào 10 l mẫu đã được xử lý ở trên. Sau đó đảo đều và ly tâm 3000 v/p trong 30 giây. Ủ hỗn hợp này ở 250C trong 2 phút. Bổ sung 1 l (50 units) SuperScriptTMII RT vào mỗi phản ứng, đảo đều sau đó đưa vào máy PCR với chu trình nhiệt như sau: 25oC trong 10 phút. 420C trong 50 phút. 700C trong 15 phút. 40C, thời gian = . Bổ sung 1 l RNaza H vào mỗi mẫu và ủ ở 370C trong 20 phút để loại bỏ ARN. Trong thành phần lúc này là các sợi đơn cADN có kích thước khác nhau và cADN sẽ được dùng làm khuôn để tổng hợp nên những đoạn ADN đích bằng cặp mồi đặc hiệu bằng phương pháp Real-time PCR. II.2.4. Chuẩn bị mồi đặc hiệu cho phản ứng khuếch đại Để chẩn đoán cúm A, chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho đoạn ADN có kích thước … thuộc gen mã hoá protein nền (kí hiệu M) của virus cúm, nằm trong vùng bảo thủ của gen M của virus cúm A. Khi đã được xác định là cúm typ A, để chẩn đoán phân typ cúm H5 chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho đoạn ADN thuộc gen mã hoá kháng nguyên HA, cặp mồi được thiết kế nằm trong vùng bảo thủ của gen H5 của virus cúm A. Thông tin về các cặp mồi được hiển thị trên bảng …. Cặp mồi số Tên mồi Tm Trình tự mồiKích thước sản phẩm PCR (bp)1MPMM2H5MH5PII.2.5. Chuẩn bị mẫu dương tính chuẩn cho chẩn đoán cúm H5N1 Chúng tôi đã thành công trong việc tách dòng gen mã hoá protein nền (gen M) của virut cúm A và gen mã hoá kháng nguyên HA (gen H) của phân typ H5N1, thông qua vectơ tách dòng pCR2.1 của hãng Invitrogen. Gen M và gen H đã được tách dòng ở trên , sẽ được làm mẫu dương tính chuẩn cho chẩn đoán phân typ H5N1 thuộc virus cúm typ A. Mẫu chuẩn dương tính này sẽ khẳng định chính xác hơn đối với các mẫu dương tính và hạn chế các trường hợp dương tính giả. II.2.6. Chẩn đoán cúm gia cầm H5N1 nhờ kỹ thuật Real-time PCR Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong tối (ánh sáng có thể làm mất hoạt tính phát huỳnh quang của SYBR Green I dye). Phản ứng khuếch đại là cực nhạy, nên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng, luôn đeo găng tay và thao tác cẩn thận để tránh tạp nhiễm từ môi trường ngoài. Chẩn đoán cúm gia cầm H5N1bằng SYBR Green I dye Real-time PCR: Đoạn gen có kích thước …bp thuộc gen M và một đoạn gen có kích thước …bp thuộc gen H được khuếch đại nhờ cặp mồi đặc hiệu tương ứng là MM, MP và HM, HP. Ta tiến hành phản ứng khuếch đại để chẩn đoán …mẫu được nghi ngờ là dương tính. Phản ứng Real-time PCR là cực nhạy, do vậy để tránh trường hợp dương tính giả, ta thiết lập một mẫu dương tính chuẩn và một mẫu âm tính (non-template control). Thành phần phản ứng Thành phầnThể tíchH2O vô trùngBufferdNTPcADNMồi xuôiMồi ngượcAmpliTaq Gold DNA Polymerase Tổng thể tíchSau khi mix mẫu, ta chia đều vào các ống mao quản và bổ sung ADN đích khác nhau vào từng ống, gắn ống mao quản lại, đặt vào rotor, ly tâm và cuối cùng đặt vào máy Real-time PCR. Chu kỳ nhiệt của phản ứng: Bước 1: 950C trong 6 phút. bước 2: 950C trong 10 giây. Bước 3: 580C trong 10 giây. Bước 4: 720C trong 10 giây. Bước 5: lặp lại 45 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4. Bước 6: xác định Tm nhờ đường cong phân ly bằng cách tăng nhiệt độ chậm từ 600C – 95oC trong 20 phút đồng thời đo sự thay đổi của mức độ phát huỳnh quang của SYBR Green. Phản ứng khuếch đại được giám sát từ khi phản ứng khuếch đại diễn ra cho đến khi kết thúc, thông qua một hệ thống camera theo dõi tín hiệu phát huỳnh quang từ mỗi ống. Với bước đầu sử dụng kỹ thuật Real-time PCR trong phòng thí nghiệm, để khẳng định hơn nữa kết quả của phản ứng khuếch đại ta có thể kiểm tra lại kết quả bằng phương pháp điện di trên gel agarose. II.2.7. Phương pháp điện di ADN trên gel agaroza 1% Nguyên tắc: axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, nên khi chịu tác động của điện trường thì các phân tử này sẽ chuyển động theo hướng từ cực âm sang cực dương. Khả năng dịch chuyển của các phân tử axit này phụ thuộc vào hai yếu tố chính:kích thước, trọng lượng phân tử và nồng độ chất cấu thành nên gel. Chuẩn bị gel agaroza: cân 1 g agaroza và bổ sung vào đó 100 ml dung dịch đệm TAE 1X. Đun trong lò vi sóng cho agaroza tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 500C rồi đổ dung dịch agaroza này vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau khoảng 1 giờ, khi gel đã đông, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đêm TAE 1X vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel 2 mm. Tra mẫu ADN: Lấy mẫu chứa khoảng 1-2 l ADN pha trong 16 l đêm TE rồi trộn với 4 l đệm màu 5X (chất này vừa có tác dụng tạo mầu quan sát, vừa có tác dụng lắng mẫu xuống đáy giếng trước khi chạy điện di) và sau đó tra mẫu vào các giếng nhỏ trong bản gel. Một lượng ADN  tương ứng đã được cắt phối hợp bằng Hind III và EcoR I cũng được tra vào gel để làm chỉ thị phân tử. Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 100 V, với thời gian 25-30 phút. Quan sát sự di chuyển của màu bromophenol blue để biết khi nào cần ngừng điện di. Nhuộm ADN bằng EtBr: gel agaroza sau khi chạy điện di được nhuộm bằng dung dịch EtBr (2g/ml) trong thời gian khoảng 10 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel (Gen Doc Pharmacia). KẾT LUẬN Kết quả tách chiết ARN tổng số Mẫu virus cúm gia cầm H5N1 không phải được tách từ dịch nuôi cấy, mà được tách từ dịch tỵ hầu của bệnh nhân và sau đó huyền dịch virut được bất hoạt bằng trizol (Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp), nên có thể lượng ARN tổng số thu được là thấp. Để đánh giá sơ bộ nồng độ ARN tổng số, chúng tôi dùng phương pháp quang phổ kế. Dung dịch ARN được pha loãng 20 lần trong nước siêu sạch đã được xử lý DEPC để loại bỏ RNaza và xác định độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm. Kết quả được nêu trong bảng sau: Bảng . Kết quả kiểm tra ARN bằng quang phổ kế A260A280A260/A280CARNTheo kết quả trên thì mẫu ARN tổng số được tách từ virut cúm H5N1 có tỷ số A260/A280 = , tức là đạt yêu cầu về độ sạch cho các nghiên cứu sinh học phân tử tiếp theo. Chất lượng của ARN tổng số thu được ảnh hưởng trực tiếp đến phản ứng RT-PCR để tạo cADN. Vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose 1% để đánh giá độ sạch, cũng như chất lượng của ARN tổng số thu được. Kết quả cho thấy ARN tổng số đã tách đạt tiêu chuẩn để thực hiện phản ứng RT-PCR. Kết quả chẩn đoán cúm gia cầm H5N1 bằng phương pháp Real-time PCR: Sử dụng phương pháp Real - Time RT-PCR ta có thể chẩn đoán nhanh và chính xác cúm gia cầm phân typ H5N1 thuộc virus cúm typ A. Qua tìm hiểu chúng tôi biết rằng bộ kit cho Real – Time RT- PCR rất đắt. Vì vậy,chúng tôi tận dụng bộ Kit Super One- Step RT-PCR để tiến hành phản ứng phiên mã ngược nhờ mồi ngẫu nhiên (random primer) để tạo cADN có kích thứơc khác nhau. Sau đó dùng cDNA này làm khuôn để nhân bản đoạn gen có kích thứơc …bp thuộc gen mã hoá protein nền M và nhân bản đoạn gen có kích thước ..bp thuộc gen mã hoá kháng nguyên bề mặt HA bằng Real - Time PCR. Gen M mã hoá cho protein nền (protein nền mang kháng nguyên đặc hiệu typ, do đó được sử dụng để chẩn đoán virut cúm typ A) đã được tách dòng và giải trình tự. So sánh với trình tự của gen M đã được đăng ký trong Ngân Hàng Gen Quốc tế, tìm ra vùng gen ít biến đổi thuộc gen M của virut cúm typ A, từ đó thiết kế cặp mồi đặc hiệu để câu đoạn gen này. Vùng gen ít biến đổi của gen M. Gen mã hoá kháng nguyên bề mặt HA (là kháng nguyên đặc hiệu phân typ, do đó được sử dụng để chẩn đoán cúm phân typ H5N1) đã được tách dòng và giải trình tự. Sau khi giải trình tự chúng tôi đã phân tích và so sánh với ngân hàng dữ liệu gen quốc tế và thấy đoạn gen mà chúng tôi giải mã được, chính là đoạn gen mã hóa cho HA của virus cúm H5N1 gây bệnh trên gia cầm. Đoạn gen H5 của virut cúm gây bệnh ở người Vịêt Nam đã được đăng ký trong ngân hàng gen quốc tế với số đăng ký AJ715872. Chúng tôi cũng đã so sánh trình tự nucleotide đoạn gen H5 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam với đoạn gen H5 phân lập từ gà tại Việt Nam (với số đăng ký AY574187) và nhận được sự tương đồng đạt 98,2%. Tìm ra vùng gen bảo thủ của gen H5 của virut cúm phân typ H5N1, từ đó thiết kế cặp mồi đặc hiệu để câu vùng gen này. Trong phản ứng này chúng tôi sử dụng chất hoá học SYBR Green I dye có đặc tính là không phát quang ở trạng thái tự do, chỉ khi gắn với DNA sợi kép nó mới phát huỳnh quang dưới ánh sáng kích thích. Nhờ hoạt tính này, chúng tôi sử dụng để phát hiện sản phẩm PCR được khuếch đại và tín hiệu phát huỳnh quang sẽ tăng dần sau mỗi chu kỳ khuếch đại do số lượng bản sao tăng lên. Kết quả trên cho thấy chỉ ở các mẫu dương tính giá trị Delta Rn (biểu thị giá trị huỳnh quang thu được sau khi trừ đi tín hiệu nền của mẫu âm tính không bổ sung DNA) nhìn chung tăng lên rất nhanh bắt đầu từ chu kỳ ? (giá trị này gọi là Ct) Ct là ngưỡng chu kỳ (cycle threshold) phản ánh số chu kỳ cần thiết để tất cả các đường cong vượt qua tín hiệu nền. Kỹ thuật Real -Time – PCR với SYBR Green còn cho phép phân tích được sự xuất hiện của sản phẩm đặc hiệu, không đặc hiệu cũng như ảnh hưởng nhiễu của hiện tượng mồi tự bắt cặp tạo dạng dimer. Hiện nay, Việt nam đã tạo được vắc xin, thuốc trong phòng chống bệnh cúm typ A/H5N1 và cũng có những phác đồ điều trị bệnh cho các bệnh nhân mắc cúm A/H5N1. Thuốc Arbidol (Fludon H1) do Việt Nam sản xuất là thuốc kháng virus có tác dụng điều trị cúm H1N1 và H5N1 tương tự như Tamiflu và Zanamivir hiện nay. Nhóm nghiên cứu do tiến sĩ Nguyễn Hải Nam, Trưởng Khoa Hóa Dược của Đại học Dược Hà Nội làm cố vấn khoa học vừa công bố hoàn tất nghiên cứu độ ổn định và xây dựng quy trình sản xuất Arbidol (Fludon H1). Các chuyên gia cho rằng, việc sử dụng Arbidol (Fludon H1) do Việt Nam tự sản xuất vào điều trị cúm A/H1N1 hiện nay sẽ góp phần chủ động nguồn thuốc điều trị, giảm được số ca mắc cúm A/H1N1 đang gia tăng, nhất là trong bối cảnh khan hiếm thuốc Tamiflu như hiện nay.  TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997), Sinh học phan tử, Nxb Giáo dục, Hà Nội. Lê Đình Lương (2001), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. Lê Đình Lương và Phan Cự Nhân (2001), Cơ sở Di truyền học, Nxb Giáo dục, Hà Nội. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, Khuất Hữu Thanh, Nxb KHKT, 9/2006 Kỹ thuật gen – Nguyên lý và ứng dụng, Khuất Hữu Thanh, nxb Khoa học kỹ thuật, 2006  HYPERLINK ""   HYPERLINK ""