Kỹ thuật sinh học phân tử và bệnh viêm não xốp ở bò (bovine spongiform encepholopathy)

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****** BÀI TIỂU LUẬN KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ BỆNH VIÊM NÃO XỐP Ở BÒ (BOVINE SPONGIFORM ENCEPHOLOPATHY) GVHD: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải. Sinh viên thực hiện: Trịnh Thị Huyền Trang 2 MỤC LỤC I/ ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 3 II, TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 4 2.1. Giới thiệu về bệnh viêm não xốp. .............................................................. 4 2.1.1. Nguồn gốc.............................................................................................. 4 2.1.2. Sự lưu hành........................................................................................... 6 2.1.3. Tác nhân gây bệnh. .............................................................................. 7 2.2. Các đặc điểm về dịch tễ. ........................................................................... 12 2.2.1. Ổ chứa mầm bệnh. ............................................................................. 12 2.2.2. Bệnh lý................................................................................................. 12 2.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định bệnh viêm não xốp ở bò........ 15 III/ KẾT LUẬN...................................................................................................... 20 IV/ TÀI LIỆU THAM KHẢO. ........................................................................... 21 3 I/ ĐẶT VẤN ĐỀ Thời gian gần đây bệnh bò điên gây ra những tổn thất rất lớn đối với nền nông nghiệp các nước cũng như gây nên những xáo trộn trong đời sống của con người. Những con bò bị điên, húc đầu vào tường, không tự chủ được các thao tác và hoạt động của bản thân nó và chết. Trên hình giải phẫu bệnh não có các lỗ thủng lỗ chỗ (nên được tả là não thể xốp).Vì thế người ta gọi là bệnh xốp não bò (Bovine Spongiform Encephalopathy - BSE) hay vẫn được gọi là bệnh bò điên (Mad Cow desease). Thể bệnh này rất giống với nhiều bệnh khác có cùng triệu chứng và cách truyền bệnh, bao gồm : bệnh gãi cừu, bệnh xốp não ở chồn, bệnh kuru ở người (xốp não được tìm thấy ở bộ tộc Papua ở New guine), bệnh CJD (Creutzfeldt- Jakob Disease) ở người. Những động vật bị bệnh có biểu hiện mất khả năng phối hợp động tác, không thể điều khiển nổi chân, run, sợ hãi và có thể ngứa với cường độ mạnh. Đôi khi bệnh thể hiện triệu chứng ngủ gà hoặc triệu chứng kích động. Thời gian ủ bệnh kể từ khi nhiễm đến khi phát bệnh thường lâu, nhiều năm. Nhưng khi bệnh đã phát thì con vật sẽ chết sau ít tháng. Có nhiều bằng chứng về khả năng bệnh bò điên lây sang người, gây một bệnh tiến triển chậm tác hại đến hệ thần kinh, làm xốp não và dẫn đến cái chết. Điều đó khiến dư luận thế giới lo ngại và nhiều nước đã cấm việc nhập khẩu bò sống và các sản phẩm của bò có xuất xứ từ nước Anh. Còn nhiều điểm về bệnh chưa được biết rõ, đang trong quá trình nghiên cứu. Nước Anh và nhiều nước khác đã áp dụng các biện pháp chống dịch nghiêm ngặt nên bệnh đã được khống chế. Hiện ở Việt Nam chưa phát hiện thấy bệnh này, nhưng chính phủ và Bộ NN &PTNT đã có nhiều văn bản quy định hạn chế việc nhập bò và các sản phẩm của bò từ các nước có bệnh. Tuy nhiên, trong sự vận động sôi động của nền kinh tế thị trường mọi người cần luôn cảnh giác để đề phòng bệnh bò điên không xảy ra ở Việt Nam. 4 II, TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về bệnh viêm não xốp. 2.1.1. Nguồn gốc. Năm 1732, các nhà khoa học thú y ở nước Anh đã quan sát thấy một dạng bệnh bí hiểm này xảy ra với cừu. Tên bệnh - Scrapie - tiếng Anh có nghĩa là ngứa, gãi, xuất phát từ đặc điểm con vật khi lâm bệnh luôn ngứa ngáy và dụi mõm xuống đất. Kết quả khám nghiệm tử thi cho thấy, toàn bộ não đã bị biến dạng đến mức không thể nhận ra – nhìn giống như một nắm bọt biển. Cừu đứng không vững, co rụt thân thể, sau đó gầy dần và chết sau vài tuần.Bệnh này chưa được quan tâm và ngăn ngừa cho nên mãi tận năm 1936, các nhà nghiên cứu Pháp cho thấy rằng bệnh có thể truyền từ con ốm sang con khoẻ bằng tiêm dịch nghiền não của cừu bệnh vào cừu khoẻ. Từ đó các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu về bệnh này. Sau 2 tháng tiêm , cừu mắc bệnh ở các trang trại cừu lớn hơn 4 năm tuổi mới biểu hiện bệnh. Con vật luôn ở trạng thái bị kích thích, hưng phấn không nghỉ, luôn luôn muốn gãi, đánh nhau, cọ sát làm rụng lông (do vậy có tên là bệnh gãi ở cừu); giảm thể trọng, ốm yếu, mất cân bằng về giác quan, và cuối cùng là chết. Chỉ có một số trong đàn có biểu hiện gãi và thường khoảng 10 con trong đàn cách lây lan bệnh tự nhiên đến nay vẫn chưa được rõ. Họ đã chứng minh được bệnh có thể truyền nhiễm qua mắc bệnh trực tiếp và gây ra do một tác nhân mà trước đó bệnh được xem do di truyền. Năm 1920: bệnh CJD (Creutzfeldt – Jakob) được mô tả lần đầu tiên ở Anh, có 2 bệnh nhân chết với triệu chứng tâm thần nên người ta gọi là dạng bệnh bò điên ở người. Bệnh này thường xảy ra ở người cao tuổi nên ít được chú ý. Tuổi biểu hiện trung bình là 56 tuổi và chỉ có 7 trường hợp người bệnh này nằm trong lứa tuổi 18- 29. Những biểu hiện bệnh đầu tiên là sự thay đổi về giấc ngủ và ăn. Sau 1 vài tuần xuất hiện những biểu hiện về thần kinh. Cơn bệnh về thần kinh xuất hiện trong số 20% trường hợp bệnh. Phần lớn người bị bệnh rung cơ và co cứng cơ, mất chức năng của não và các tập tính bình thường. Tiến triển của bệnh là sự phá hoại ở đại 5 não và chức năng đại não, giảm các hoạt động thần kinh, cảm giác và mất dần chức năng nhìn, bệnh nhân chết, 90% bệnh nhân chết sau 1 năm, 5% sau 2 năm và 5% có thể kéo dài đến 10 năm. Nhưng từ những năm 1990, bệnh này đã xảy ra cả ở những người trẻ tuổi và ngày càng nhiều. Đến cuối năm 2000 đã có tới 80 người ở Anh và 2 người ở Pháp chết do ăn phải thịt bò điên đều do hệ thống thần kinh trung ương bị thoái hóa kéo dài từ 6 tuần đến 8 tháng với triệu chứng là trạng thái mất cân bằng , mất trí nhớ, rồi dẫn đến liệt chân tay.CJD rất dễ nhầm với bệnh Alzheimer, một căn bệnh lú lẫn ở người cao tuổi. Trí nhớ của người bệnh cũng bị giảm sút nhanh chóng, khả năng nhận biết ngày một kém, tiến tới quên hết mọi chuyện và mất khả năng nhận biết. Bệnh Alzheimer chỉ xảy ra ở người cao tuổi, diễn biến kéo dài nhiều năm trong khi ở bệnh CJD thời gian bộc lộ triệu chứng chỉ kéo dài vài tháng. Thời gian ủ bệnh của CJD rất dài, có thể 15- 25 năm, nhưng khi bệnh phát, chỉ 4- 10 tháng sau bệnh nhân đã chết không có thuốc gì chữa được. Năm 1947, phát hiện ra bệnh xốp não ở chồn TME với cái chết không bình thường của chồn ở Wiscosin (Mỹ), Canada, Phần lan. Phần lớn chồn bị chết sau khi có dấu hiệu thần kinh rất ngắn. Thời gian nung bệnh thường là 6 tháng, bởi vì chúng sống tách biệt nhau và tách biệt các động vật khác nên con đường truyền bệnh chỉ có thể là thức ăn. Đánh nhau và ăn thịt nhau ở những con non cũng có thể là một trong những nguyên nhân truyền lây. Năm 1956. phát hiện bệnh Kuru ở người. Kuru là một bệnh xuất hiện ở bộ tộc Fore ở New Guinea. Ở đó tập tục ăn thịt người chết được tiến hành cho đến tận khoảng năm 1956. Bệnh này xảy ra ở phần lớn phụ nữ và trẻ em ở cả hai giới do ăn phải những mô bệnh óc của người chết trong bộ tộc. Đàn ông thì ít bị nhiễm bệnh hơn do họ chỉ ăn phần thịt. Căn bệnh gây mất khả năng điều vận của tiểu não dẫn tới không có khả năng phối hợp các động tác khi vận động, suy giảm trí nhớ, run rẩy chân tay, mất dần chức năng dẫn truyền vỏ não. Phần lớn bệnh nhân kuru chết không có dấu hiệu của điên 6 đó là dấu hiệu chính của 2 bệnh kuru và CJD. Bệnh nhân với thời gian ủ bệnh dài xuất hiện triệu chứng chậm nhưng thường chết vì tác động đột ngột bên trong não hoặc liên quan đến tuỷ sống sau đó được thay thế với triệu trứng bệnh lý trong vòng 12 tháng. Năm 1986, Jeffrey và Wells đã phát hiện một loại bệnh mới ở bò hoang ở Anh. Năm 1987, Wells và các cộng sự cũng phát hiện và mô tả một loại bệnh tương tự bò sữa, gọi là bệnh bò điên (Mad cow). Về sau do đặc điểm về tổ chức tế bào của bệnh, các tác giả đặt tên cho bệnh là “ Bệnh viêm não thể xốp ở bò ( Bovine Spongiform Encephalopathy - BSE). Cũng như các căn bệnh tương tự ở cừu gây bệnh ngứa gãi, ở chồn gây bệnh viêm não tủy truyền nhiễm TME, ở người gây bệnh Creutfeldf Jacob và Kuru người ta vẫn chưa được hiểu biết rõ ràng đầy đủ về các căn bệnh này. Tuy nhiên các bệnh kể trên, kể cả BSE, theo Frazen (1988) đã chứng minh nếu dùng mô não động vật bị bệnh tiêm truyền cho con vật khỏe mạnh thì vẫn gây được bệnh. 2.1.2. Sự lưu hành. Bệnh bò điên bắt nguồn từ nước Anh vào giữa những năm 80 của thế kỷ 20. Bệnh lần lượt được phát hiện ở nhiều nơi kéo dài sang những năm 90 với trên 160.000 7 ca mắc bệnh trong khoảng 30.000 đàn bò. Hầu hết trường hợp bệnh là ở giống bò sữa Holstein/ Friesian. Sau đó lần lượt một số nước cũng thông báo có bệnh: Thụy Sỹ 205 trường hợp, Ailen 12 con, Bồ Đào Nha 30 con. Các trường hợp có bệnh lẻ tẻ là Pháp, Đức, Italia, Đan Mạch, Canada, Oman và quần đảo Falkland. Trong số các nước có bệnh, nhiều trường hợp do nhập bò có bệnh từ nước Anh. 2.1.3. Tác nhân gây bệnh. Trong quá trình nhận diện tác nhân gây bệnh, các cách để làm biến đổi acid nucleic đều không ảnh hưởng đến mức độ nhiễm , ngược lại các quá trình làm biến tính protein đều làm giảm mức nhiễm. Điều này chứng tỏ tác nhân gây bệnh là thành phần protein. Giả thuyết “chỉ do protein” đã được đặt ra bởi Griffith (1967) và sau đó phát triển bởi Prusiner và cộng sự ( 1982, 1999) sau hơn 15 năm. Stomley Prusimerr dùng chất chiết xuất từ não của cừu bị bệnh, phá huỷ axit nucleic (đồng thời cả AND và ARN) mà vẫn không làm mất khả năng gây bệnh của chất chiết khi tiêm chất chiết này sang não động vật khác. Ngược lại nếu phá 8 huỷ Protein của chất chiết thì khả năng gây bệnh không còn. S.Prusiner cho rằng tác nhân gây bệnh có bản chất là Protein và ông đặt tên nó là Prion (proteinaceous infection particle) . Xác định chuỗi của protein gây bệnh này cho thấy nó giống hệt cấu trúc của protein PrPc, và được đặt tên là PrPsc. Normal and diseased prions PrPc là protein với cấu trúc khoảng 253 ạcid amin ở người và 250 acid amin ở các loài hữu nhũ khác . Nó được kiểm soát bởi một gene ở nhiễm sắc thể số 2 ở chuột và nhiễm sắc thể số 20 ở người. Gene này chứa 2 exon, trong đó exon thứ 2 mã hóa toàn bộ trình tự protein. Nó được bảo tồn ở các loài vật. Ở vật khoẻ phần glucide của prion protein gắn vào màng của tế bào bằng liên kết cộng hoá trị với chuỗi phospholipid. Ở bệnh gãi cừu protein prion nằm ở giữa màng tế bào và có hình dạng cáu trúc khác hẳn. Sự thay đổi này làm protein có thể chịu nhiệt, kháng với các loại enzim phân huỷ protein, tia tử ngoại, 135OC trong 18 phút, khi dùng proteinase K (1 loại enzyme phân huỷ protein cực mạnh) nó bị cắt làm 2 tiểu phần 27-30 KĐ (Kilodalton- đơn vị đo khối lượng protein =1 đơn vị oxy). Protein Prion ở người mắc bệnh GSS (Gerstmann - Strauxler Scheinker) thì axit amin proline được thay bằng Leucine tại vị trí 102. Nghiên cứu cấu trúc của prion, người ta chia ra 2 phần, phần 100 acid amin ở đầu carboxyl được gắp lại gồm 3 chuỗi xoắn anpha và 2 chuỗi đối song gấp nếp beta , 100 acid amin ở đầu amino có cấu trúc tổ chức ngẫu nhiên. Nghiên cứu bằng quang phổ cho thấy PrPc chủ yếu có cấu trúc 9 xoắn alpha trong khi PrPsc có chủ yếu cấu trúc xoắn beta và giảm cấu trúc alpha. Như thế có sự chuyển đổi từ cấu trúc alpha sang cấu trúc beta khi tạo PrPsc. Đầu kỵ nước của PrPc có lẽ tham gia vào việc chuyển đổi từ alpha sang beta. Gen cấu trúc của protein prion giống hệt nhau ở người, khỉ, chuột nhắt, chuột cống, chuột hang, chồn, bò và gà. Vùng khởi đầu, giải mã của gen này bao gồm 253 codon ở người và 257 codon ở chồn. Vai trò của PrPc vẫn chưa được hiểu rõ. Cắt bỏ gene mã hóa PrPc ở chuột (gen Prnp) vẫn không ảnh hưởng tăng trưởng của thú, ngoại trừ có trí nhớ kém và có vấn đề về giấc ngủ. Chuột thiếu PrP0/0 ( chuột thiếu PrPc) đề kháng với prion và không thấy dấu vết của nhiễm prion ở não của chúng . Điều này có thể do PrPc là 10 thụ thể tiếp nhận prion. Một prion bệnh được nhuộm màu (đỏ) được đưa vào qua đường tiêu hóa hoặc tự phát. Một prion nội sinh của cơ thể (màu xanh) đi vào tương tác với prion bệnh, chúng được ép sát vào nhau để thay đổi hình dạng của chúng thành prion bị bệnh. Cuối cùng prion bệnh càng ngày càng tăng do sự chuyển đổi từ prion bình thường sang prion bệnh, gây ra những thiệt hại cho mô. Về vị trí, PrPc thường có ở tế bào thần kinh. Protein này hiện diện trên bề mặt tế bào thần kinh trong khi PrPsc ở trong tế bào chất. Prion protein bệnh được tích luỹ ở trong tế bào tạo thành những túi gọi là Lysosome. Trong não khi tế bào đầy Lysosome có thể dẫn đến phá vỡ và làm chết tế bào. Khi tế bào chết nó tạo ra các hố ở trong não. Các prion bệnh được giải phóng và nó xâm nhập vào các tế bào khác. Như thế, PrPsc có thể đã biến thành PrPsc khi PrPc đi vào tế bào chất trong quá trình tạo PrPc. 11 Những tế bào liên quan đến bệnh của prion. Nhiều loại tế bào liên quan đến quá trình vận chuyển của prion (tế bào lympho B và T, tế bào thần kinh, tế bào M) trong quá trình sao mã của tác nhân lây lan (các neuron, các tế bào follocular dendritic) trong khoảng trống của prion (vi tế bào thần kinh, tế bào đơn nhân lớn) . Vì thế, để dẫn truyền tới não, tác nhân lây nhiễm này phải qua ít nhất 2 hàng rào không thấm, hàng rào của ruột và máu não. Chuỗi cấu trúc của prion là rào cản giữa các loài. PrPc của ký chủ càng gần cấu trúc với prion thì càng dễ nhiễm. Khi phân tích trình tự các gen Prnp ở các loài người ta thấy rằng khi prion protein của 2 loài càng giống nhau thì bệnh càng dễ lây truyền. Cừu và bò chỉ khác nhau 7 vị trí, người và bò khác nhau 30 vị trí và có lẽ như vậy khả năng truyền bệnh từ bò sang người sẽ lâu hơn nhưng không phải là không thể. Người ta đã quan sát thấy sự chuyển prion protein của người sang Prnp bệnh với sự có mặt của prion protein của bò trong phòng thí nghiệm. 12 2.2. Các đặc điểm về dịch tễ. 2.2.1. Ổ chứa mầm bệnh. Ổ chứa chính là các lòm mắc bệnh bò điên và bột thịt bột xương của các lò này. Ngoài ra còn ở thịt và óc cừu mắc bệnh gãi ngứa. 2.2.2. Bệnh lý. Các chứng cứ về dịch tễ cho thấy bệnh bò điên không phải do truyền từ bò này sang bò khác mà có nhiều khả năng do thức ăn đậm đặc chứa protein động vật có mầm bệnh. Trong một trại bò, được cùng ăn một lô thức ăn có bột thịt, bột xương của loài nhai lại nhưng chỉ có một số ít con mắc bệnh. Có giả thuyết cho rằng đó là do mầm bệnh phân phối không đều trong thức ăn, hoặc tính mẫn cảm khác nhau của từng cá thể bò. Sự nhân lên của mầm bệnh có thể xảy ra ở các tế bào lympho trong ruột và các tế bào của hệ lưới nội mô trước khi căn bệnh xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương. Về đường truyền bệnh, cho đến thời gian gần đây, người ta mới chứng minh được rằng bệnh chỉ truyền qua con đường tiêu hóa. Neen Singh và nhóm nghiên cứu tại ĐH Case Western Reserve đã mô phỏng quá trình ăn và tiêu hóa thịt bị nhiễm bệnh. Họ nghiền mô não chứa prion của bệnh nhân mắc một dạng bệnh bò điên. Sau đó, mô được tiếp xúc với một loạt enzym tiêu hoá mạnh ở miệng, dạ dày và ruột, có tác dụng phân huỷ protein thành các mẩu nhỏ hơn nữa. Kết quả cho thấy: Prion cũng như một loại protein thứ hai tên là ferritin vẫn nguyên vẹn. Ferritin chứa sắt và có rất nhiều trong thịt. Hai protein trên dường như bám vào nhau. Tiếp theo, nhóm nghiên cứu bổ sung một màng tế bào lót ở thành ruột vào mô hình ruột người. Bằng cách gắn nhãn phát sáng cho prion và ferritin, họ chỉ ra rằng 13 hai protein ''dắt tay nhau'' đi qua tế bào lót nói trên. Singh cho rằng một lượng lớn prion trong thịt bò nhiễm bệnh đã xâm nhập vào cơ thể bằng con đường này. Một cuộc nghiên cứu tiến hành năm 2001 cũng cho thấy prion có thể đi qua thành ruột. Nghiên cứu của Singh có thể giải thích cách prion vượt qua rào cản của các loài động vật. Nhiều loài động vật có protein ferritin gần như giống hệt nhau, cho phép ferritin bám vào và vận chuyển các prion lạ từ bò. Singh cho rằng ferritin có thể vận chuyển prion của những động vật hoang dã mắc bệnh xốp não, chẳng hạn như hươu, nai, vào cơ thể người. Theo Singh, chặn đứng quá trình vận chuyển ferritin có thể ngăn prion xâm nhập vào cơ thể người. Tuy nhiên, điều này rất khó có thể thực hiện do mọi người phải được điều trị vào thời điểm đang bị phơi nhiễm. Thời kì ủ bệnh: cũng như nhiều bệnh do virus chậm, bệnh bò điên có thời kì ủ bệnh khá dài, thường là trên 18 tháng.Trong gây bệnh thực nghiệm, thời gian ủ bệnh của cừu và dê ngắn nhất là 440 ngày và dài nhất là 1720 ngày. Thời gian ủ bệnh nhân tạo ở bò cũng tương tự như trên. Tính cảm nhiễm và sức đề kháng. Có sự khác nhau đáng kể về tuổi của bò đối với sự cảm nhiễm bệnh. Bê non và bò dưới 3 năm tuổi hình như ít bị cảm thụ với bệnh hơn là bò trưởng thành. Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là bò từ 4 năm tuổi trở lên. Tuy nhiên trong một đàn bò thì tỷ lệ mắc bệnh rất thấp. Đó là điều đặc biệt khác với các bệnh truyền nhiễm khác. Chính vì thế mà trong thời gian đầu, khi bệnh mới được phát hiện, người ta không cho đây là một bệnh truyền nhiễm. Chỉ đến khi gây được bệnh thực nghiệm cho bò thì tính truyền nhiễm của bệnh mới được khẳng định. Có một thực tế là đàn bò có số lượng lớn thì tỷ lệ mắc bệnh cao hơn là những đàn bò có số lượng ít. Bệnh xảy ra không phụ thuộc vào các tháng trong năm. Bò đực hay bò cái đều không có sự khác biệt với tỷ lệ mắc bệnh. Bò đang khai thác sữa hay đang có thai cũng không khác với bò không trong thời kỳ sản xuất về tỷ lệ bệnh. Riêng về 14 giống bò thì người ta thấy rằng hầu hết các ca bệnh là giống bò sữa Holstein F.Friesian. Đó là giống bò phổ biến được nuôi ở nước Anh. Bệnh tích Triệu chứng lâm sàng khác nhau nhưng thuộc 3 loại: - Thay đổi về hành vi. - Thay đổi về tư thế, dáng đi, và các vận động khác. - Tăng nhạy cảm. Khi bệnh mới bắt đầu, sự thay đổi về tính tình hành vi và sự vận động khó nhận thấy. Các triệu chứng ban đầu không rõ ràng bao gồm sự nhút nhát, sợ sệt, có vẻ lơ đễnh, nghễnh ngãng, run cơ nhẹ ở các vùng cổ, vai hoặc hông, nghiến răng thường xuyên, hoặc cử động không mục đích ở đầu và chân. Bò đi lắc lư chân sau, hay đá chân khi vắt sữa, đi hụt bước, mất nhịp nhàng khi vận động, không tuân theo sự điều khiển của chủ nuôi. Bò bệnh có vẻ cảnh giác khi có người đến gần và thường do dự không vào khoang vắt sữa, đôi khi có thể tấn công người khi bị bắt buộc phải vào. Khi đi, đầu nghiêng sang một phía, kêu rống. Bò hay tỳ móng vào thành chuồng, uể oải, cử động mất phối hợp, loạng choạng. Lúc nằm nghỉ bò bệnh rất thận trọng và thường chọn một chỗ riêng. Bò bệnh đôi khi đứng cúi đầu, cổ vươn thẳng, tai chĩa về phía sau, các cử chỉ bất thường, phần sau không phối hợp, đặc biệt dễ quan sát khi bò đang ăn cỏ bãi chăn. Triệu chứng tiến triển đôi khi làm bò ngã, nằm nghiêng. Một tiếng động bất ngờ có thể làm con vật co giật. Đa số bò bị bệnh bị giết chết trong giai đoạn này vì sản lượng sữa giảm thấp, giảm trọng lượng và tính tình trở nên không kiểm soát được. Diến biến của bệnh kéo dài khoảng 2- 3 tuần lễ hoặc hàng tháng, cuối cùng bò bị bại liệt dần. Thường nếu bệnh xuất hiện càng gần thời điểm cai sữa thì càng diễn biến nhanh hơn. Các triệu chứng cũng có thể tiến triển theo một chiều hướng khác như con vật trở nên hung dữ, chạy loạn lên, lao đầu vào tường, run rẫy, ngã, bại liệt rồi chết. Các biến đổi bệnh lý học chỉ thấy được dưới kính hiển vi và giới hạn ở não. Chúng bao gồm các thoái hóa đối xứng ở 2 bên não, có thoái hóa không bào ở tế bào chất ở phần chất xám. Khi quan sát dưới kính hiển vi một miếng cắt từ não, có cảm 15 giác như nhìn mặt cắt miếng bọt biển ( đệm mút), vì thế có tên gọi là bệnh viêm não dạng xốp. Vị trí bệnh tích thường gặp nhất là ở hành tủy, chiếm 99% trường hợp. Các bệnh tích của BSE cho thấy đó là một phản ứng viêm mô liên kết thần kinh. Một đặc điểm nổi bật của bệnh BSE là khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, chất chiết từ não có các sợi fibrin có kích thước từ 100 – 500nm chiều dài, được gọi là SAF ( scrapie associated fibrils). Các sợi này gồm 2 đến 4 sợi kết với nhau, có bề ngang 4-6 nm, sắp xếp theo hình xoắn ốc. 2.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định bệnh viêm não xốp ở bò Bệnh do prion xảy ra bởi sự thay đổi cấu hình của một protein không độc (PrPc) thành protein độc ( PrPsc). Điều này cho thấy sự không ổn định trong cấu trúc của PrPc.Người ta dùng các acid nucleic hiện diện (Circulating nucleic acids (CNA)) để phát hiện yếu tố SINEs (cell stress-related short interspersed nucleotide elements) một đoạn ngắn các nucleotide có tính mất ổn định hiện diện ở vùng trung tâm bảo toàn của PrPc trong huyết thanh gia súc liên quan đến bệnh BSE. Acid nucleic được ly trích, khuếch đại, tạo dòng, sắp xếp theo trình tự huyết thanh của protein prion kháng protease. Trình tự của 80bp từ vùng 3’ của Bov-tA SINE. Kỹ thuật PCR đã được sử dụng để phân tích huyết thanh từ 4 trường hợp liên quan của bệnh BSE, 137 động vật cùng họ biểu hiện bệnh BSE kết hợp với 8 trường hợp liên quan đến bệnh BSE, những con bò đối chứng âm của PrPres được kiểm tra. QUY TRÌNH THỰC HIỆN. Thu nhận huyết thanh : Máu từ tĩnh mạch đuôi hoặc động mạch đã thu được vào tube nhựa 18ml được giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để đảm bảo đông máu thích hợp. Những cái ống này được cất giữ tại 2 tới 8°C không quá 24h để thực hiện các thí nghiệm khác . Ly tâm được làm ở 2 tới 8°C với 1000g trong 15 phút. Huyết thanh nổi 16 trên mặt được chuyển vào trong những cái chén ly tâm nhỏ 1.5ml vào phân chia đều thành 0.5ml và bảo quản lạnh ngay lập tức ở 20°C hoặc 80°C cho đến khi sử dụng. Chuẩn bị những phần nhỏ huyết thanh Huyết thanh đông lạnh được xả ở 4°C trong nước đá và 250μL được chuyển thành những ống ly tâm nhỏ 1,5ml. Ống được ly tâm 4000 vòng trong 25 phút ở 4°C trong một mô hình đầu máy ly tâm 5.214 ghế (Eppendorf, Hamburg, Đức) để loại bỏ các mảnh vụn tế bào. Phần nổi trên mặt được chuyển vào một ống sạch và ly tâm 2000 vòng trong 35 phút. Phần nổi trên mặt đã được lấy ra cẩn thận và viên kết được sử dụng để phân tích xa hơn. Tách chiết Nucleic acid Sử dụng 20.000 × g bột viên với một silica chuẩn dựa trên chiết xuất axit nucleic theo hướng dẫn của nhà sản xuất . Các axit nucleic được sử dụng ngay lập tức hoặc đông lạnh ở -80 ° C cho đến khi tiếp tục sử dụng. Primers. Mồi được sử dụng trong nghiên cứu này đã được bắt nguồn từ trước khi điều tra Một thời gian ngắn, hai súc vật bị bệnh BSE và bốn đối chứng bình thường được sử dụng; dùng mồi CHX-1F và CHX-1R. 1F và CHX-CHX-1R. CHX-1F thì tương đồng với cDNA của bò tương tự như calmodulin trong khi CHX-1R thì tương đồng với các đơn vị monomer của Bov-tA. Giải trình tự. Mồi CHX-1F và CHX-1R đã được sử dụng trên chiết xuất axit nucleic trong 20μl PCR với 30-35 chu kỳ ở 48-55°C bắt cặp (60 seconds), 68°C kéo dài (2 min), and 94°C biến tính (1 min). Mẫu lấy từ các trường hợp bị bệnh BSE , bò khỏe mạnh làm đối chứng được phủ lên gel polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) và phân tích như mô tả. Band được cắt ra khỏi gel, tách rửa , và phải chịu sự reamplification. Các sản phẩm được kết thúc với polymerase T7 DNA và phosphoryl hóa với polynucleotide kinase và ATP. Hỗn hợp phản ứng này đã được sử dụng cho việc thắt đầu bằng vào một enzyme tiêu hóa SmaI, vector pGEM- 17 4Z khử gốc phospho .Ủ qua đêm ở 4 ° C bằng cách sử dụng 1 U T7 DNA ligase, 1 μg của vector, và các sản phẩm PCR. Sản phẩm này được chuyển vào Escherichia coli c và phủ trên TAXI LB-agar có chứa tetracyclin, ampicillin, 5-bromo-4- cloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside (X-Gal), và isopropylthiogalactopyranoside (IPTG). Sau khi ủ qua đêm ở 37°C, những dòng dương tính được chọn và nuôi cấy trong môi trường LB 1,5ml với ampicillin. Vi khuẩn được thu hoạch, và plasmid đã được phân lập theo quy trình chuẩn và hoàn nguyên trong 50μl Tris- borat-EDTA đệm. Các plasmid đã được trình tự sử dụng hoặc là một mô hình LICOR 4200 trình tự của DNA với IRD700-M13 có nhãn phía trước và mồi ngược M13 hay với một mô 3.100 trình tự mao quản nhỏ ABI sử dụng mồi không nhãn với vùng kết thúc Big-Dye . Trình tự này đã được xử lý bằng cách sử dụng Sequencher (Mac OSX). Sau một thời gian ngắn thiết kế các vector tạo dòng sử dụng , một contig tự động được thực hiện bằng cách sử dụng các thông số mặc định nghiêm ngặt. Từ contigs kết quả, chỉ các dòng từ ít nhất hai mẫu khác nhau đã được chọn. Homologs sau đó đã được định nghĩa như là phần của chuỗi contig đã được bao phủ bởi hơn 50% của các dòng cá thể. Các trình tự đã homologous cuối cùng được kiểm tra cho sự hiện diện của các mồi sử dụng. tất cả homologs có một trình tự mồi; 18 homologs có trình tự mồi hiện diện. BLAST phân tích. Phân tích di truyền đã được áp dụng cho các chuỗi bằng cách sử dụng chương trình BLAST Advance 3μl của dịch chiết nucleic acid từ huyết thanh đã được sử dụng mà không cần tiền xử lý Dnase trong tổng số 20μl. Mồi CHX-1F và CHX-1R đã được sử dụng 1μm sử dụng một hệ thống polymerase proofreading (Advantage-2 PCR kit, BD- Clontech, Heidelberg , Đức). Sau 30 chu kỳ / 95 °C trong 30 giây, 55oC trong 45 giây, và 68°C trong 1 phút, SybrGreen cđược ghi lại trong một MX4000 PCR hệ thống (cửa hàng số 401.260). Diện tích dưới đường cong (AUC) của các chức năng nóng chảy bắt nguồn-d (F) / dT giữa 87°C và 90°C đã được sử dụng để phân tích. sử dụng cách này vì nó không bị ảnh hưởng bởi các sản phẩm không đặc 18 hiệu: mồi-dimers, mà thường xuyên có thể có mặt do việc sử dụng các SybrGreen trong PCR. Các mẫu phản ứng của mỗi cá thể đã được tính toán trên cơ sở một AUC hơn giới hạn phát hiện, ( +5 độ lệch chuẩn). Tất cả các mẫu ban đầu phản ứng đã được lặp lại. Mẫu hiển thị phản ứng khi retesting được định nghĩa là nhiều lần. Phân tích thống kê. Tỷ lệ phản ứng lặp đi lặp lại trong các nhóm lân cận và nhóm đối chứng khỏe đã được tính toán và dùng thử nghiệm chi –square . Để so sánh tổng số nhóm thực hiện 9 bậc tự do , so sánh hai nhóm 2 nhóm với nhau mức độ tự do hạ xuống đến 1. Điện di. Tám μl của hỗn hợp PCR đã được trộn lẫn với đệm và cho vào một gel polyacrylamide đúc sẵn 12-20% trong đệm Tris-borat-EDTA (45mM Tris, 45mM acid boric, 1mM EDTA) (4 đến 20% Tris - borat-EDTA gel; Điện di ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong 45 phút tại 180V. Các gel được nhuộm màu cho 20 phút trong một giải pháp và chụp ảnh dưới tia UV. Trình tự của các sản phẩm PCR từ BSE và BSE-tiếp xúc với con bò dựa trên mồi CHX-1F và CHX-1R đã được gửi cho cơ sở dữ liệu EMBL (nhập số AJ780924 để AJ780929). 19 Hình phía trên cho thấy một băng điện di của các sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi trong các nhóm này. Tương tự như mô hình nhiều băng có thể được quan sát cho huyết thanh của BSE và 4 huyết thanh của cohort trong khi các phản ứng không được nhìn thấy ở động vật đối chứng bình thường. Hình bên dưới cho thấy các kết quả phân tích đường cong nóng chảy (28) của các mẫu. Kết quả. Một mồi bắt nguồn từ một vùng sine 3 '(CHX-1R) được đánh giá bởi PCR tách từ huyết thanh gia súc khỏe mạnh và bệnh. Mẫu của bò bị bệnh BSE, những động vật thân cận có nguy cơ mắc BSE, và động vật khỏe được sử dụng Một cặp mồi (CHX-1F/CHX-1R) cho thấy không có phản ứng với nhóm đối chứng là động vật khỏe mạnh, nhưng đã khuếch đại, phù hợp với BSE-tiếp xúc với gia súc. CHX- 1F/CHX-1R đã được sử dụng để khuyếch đại CNA từ hai mẫu có bệnh BSE, huyết thanh chứa đối chứng âm của PrPre , những con bò đối chứng khỏe mạnh. 20 Hiện nay người ta sử dụng phương pháp immuno-polymerase chain reaction (IPCR) để phát hiện sự hiện diện của PrPsc. IPCR là một kỹ thuật nhờ đó mà khả năng khuếch đại của PCR là đi đôi với phát hiện của các protein do kháng thể trong một định dạng ELISA. Khả năng phát hiện nhạy cảm gấp 1.000.000 lần so với mức phát hiện bởi western blot hoặc ELISA. Cách tiến hành. Sơ đồ của các kỹ thuật IPCR Bắt giữ kháng kháng thể của PrP , được hấp phụ lên tấm microwell, được sử dụng để nắm bắt các kháng nguyên PRP. Các cầu nối của Streptavidin-HRP giữa một máy dò -kháng thể kháng PRP và phóng 500bp biotinylated. Reporter DNA được khuếch đại bằng PCR sử dụng một probe huỳnh quang để phân tích thời gian thực. III/ KẾT LUẬN. Bệnh viêm não xốp ở bò là một bệnh truyền nhiễm khá đặc biệt mới được phát hiện ở Anh vào nửa cuối thập kỷ 80.Tác nhân gây bệnh còn nhỏ hơn cả virus gọi là prion là các tiểu phần protein có khả năng gây nhiễm. Bệnh đã được phát hiện ở nhiều trại nuôi bò của nước Anh. Sau đó có lẽ do việc xuất bò sống hoặc sản phẩm 21 của bò, bệnh đã được phát hiện ở nhiều nước Châu Âu và các lục địa khác tuy số lượng không nhiều. Người ta sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau để phát hiện ra bệnh viêm não xốp ở bò. Kỹ thuật PCR được dùng được dùng để phát hiện yếu tố SINEs (cell stress- related short interspersed nucleotide elements) một đoạn ngắn các nucleotide có tính mất ổn định hiện diện ở vùng trung tâm bảo toàn của PrPc trong huyết thanh gia súc liên quan đến bệnh BSE. Sử dụng một cặp mồi (CHX-1F/CHX-1R) cho thấy không có phản ứng với nhóm đối chứng là động vật khỏe mạnh nhưng có phản ứng với nhóm mang bệnh BSE. Ngoài ra người ta còn sử dụng kỹ thuật IPCR là một kỹ thuật nhờ đó mà khả năng khuếch đại của PCR là đi đôi với phát hiện của các protein bệnh cho kháng thể trong một định dạng ELISA. IV/ TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1. Trần Thị Dân, ,2005,công nghệ sinh học trong chăn nuôi gia súc, NXB Nông nghiệp. 2. 1. rezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_SingleItemSu pl.Pubmed_Discovery_RA&linkpos=3&log$=rela. 3. www.jbc.org/content/early/2009/08/19/jbc.M109.031559.abstrac 4. positiveconfirmati.cfm 5.