Kỹ thuật thụ phấn và nuôi cấy phôi invitro

Kỹ thuật thụ phấn và nuôi cấy phôi invitro Giảng viên: Nguyễn Thị Lý Anh Sinh viên :Nguyễn Ngọc Hoà Hoàng Thị Lê Hoàng Khánh Hà Đinh Thị Phương Nguyễn Phương Thảo Phạm Thị Hân Nội dung I. Các khái niệm II. Kỹ thuật thụ phấn invitro III. Nuôi cấy phôi invitro (cứu phôi) IV. Ví dụ về thụ phấn invitro và cứu phôi I. Các khái niệm Thụ phấn Thụ tinh Phôi Thụ phấn invitro Nuôi cấy phôi (cứu phôi) Thụ phấn (pollination) là sự tiếp nhận các hạt phấn từ bao phấn tới núm nhụy để thực hiện thụ tinh ở hoa. Ở thực vật có hai phương thức thụ phấn là thụ phấn chéo và tự thụ phấn Thụ tinh (fertilization): Ở thực vật thụ tinh là sự kết hợp của hai giao tử đực và cái (tinh trùng và noãn) thành hợp tử (phôi, bào tử hoặc hạt) là đặc trưng cơ bản của sinh sản hữu tính, sinh sản lưỡng tính. Ở thực vật hạt kín có phương thức thụ tinh kép. Phôi là một nhóm tế bào có khả năng phát triển tạo thành cơ thể hoàn chỉnh là pha phát triển trung gian giữa hợp tử hay tế bào soma và bào tử thể. Có hai loại phôi: phôi hữu tính & phôi vô tính ( phôi soma) Phôi hữu tính : là phôi trong hạt được tạo ra do thụ tinh giữa tế bào trứng và giao tử đực (do lai hoặc tự thụ) còn gọi phôi hợp tử. Phôi soma: là phôi được phát sinh từ tế bào sinh dưỡng 2n chỉ của bố hoặc mẹ và tế bào ấy có cấu trúc như một phôi gọi là phôi vô tính ( phôi soma). Thụ phấn invitro là thực hiện quá trình thụ phấn trong ống nghiệm không phụ thuộc vào cơ thể mẹ. Nuôi cấy phôi (cứu phôi) là sự tách rời và nuôi cấy invitro phôi hợp tử đã thành thục hoặc chưa thành thục thành cây hoàn chỉnh. II. Kỹ thuật thụ phấn invitro Mục đích Điều kiện có thể thụ phấn in vitro Các bước tiến hành Các phương pháp thụ phấn in vitro II.1. Mục đích phải tiến hành kỹ thuật này Để khắc phục sự bất hợp trước khi thụ tinh. Thụ phấn, thụ tinh ở điều kiện in vitro tạo ra cơ hội sản xuất các phôi lai giữa các loài thực vật không thể lai bằng các phương pháp gây giống cây trồng truyền thống. II.2. Điều kiện có thể thụ phấn in vitro Điều kiện cơ bản là phải nuôi cấy thành công bầu quả hay noãn phân lập (noãn trần) của cây mẹ. Chủ động điều khiển quá trình nảy mầm của hạt phấn cây bố trong môi trường nuôi cấy vô trùng. Tiến hành thụ phấn để sự thụ tinh diễn ra và nuôi cấy hợp tử phát triển thành phôi lai trên môi trường dinh dưỡng vô trùng. II.3. Các bước tiến hành Lấy nụ của hoa mẹ ở thời điểm trước khi nở hoa 2 ngày, khử trùng, tách lấy bầu quả hay lá noãn nuôi cấy invitro. Lấy nụ hoa của cây bố vào ngày nở hoa, khử trùng, tách lấy bao phấn và để trong điều kiện vô trùng đến khi chúng tung phấn. Lấy hạt phấn rắc trực tiếp lên mặt cắt của bầu quả hay lá noãn để thụ phấn in vitro. Khi noãn thụ tinh, chúng hình thành hợp tử và tạo phôi. Các phôi lai in vitro thường bỏ qua giai đoạn ngủ, nghỉ và mọc thành cây in vitro II.4. Các phương pháp thụ phấn in vitro II.4.1. Thụ phấn bằng phương pháp cắt ngắn vòi nhụy Là phương pháp dễ và hiệu quả. Núm nhụy và 1 phần hoặc toàn bộ vòi nhụy của hoa được cắt ngắn, sau đó hạt phấn của cây bố được thụ trực tiếp lên vòi nhụy đã cắt ngắn và kết quả là có rất nhiều ống phấn đã kéo dài được tới bầu nhụy. Nhược điểm: số lượng hạt trong 1 quả ít. Có thể do ống phấn gặp khó khăn trong khi đâm xuyên qua vách bầu. II.4.2. Thụ phấn bằng phương pháp ghép vòi nhụy Hạt phấn cần thụ được “gửi” trên 1 núm nhụy thích hợp và nảy mầm, 1 ngày sau vòi nhụy và 1/3 bầu của hoa chứa hạt phấn được cắt và ghép lên 3/4 bầu nhụy của hoa cây mẹ cần thụ phấn. Theo Vantuyl và cộng sự(1991) thì một ngày sau khi “gửi” hạt phấn vòi nhụy được cắt ngắn cách trên bầu 1-2mm và được gắn lên bầu nhụy của hoa cây mẹ. Bầu và vòi nhụy ngoài đồng ruộng được kết hợp với nhau = ống nối còn trong invitro chỉ cần sử dụng agar để cố định là đủ. II.4.3. Thụ phấn cho giá noãn Bầu được cắt theo chiều dọc thành nhiều miếng vào ngày núm nhụy tiết ra dịch nhầy hoặc 1-2 ngày sau đó. Mỗi 1 miếng sẽ chứa 1 giá noãn và 1 hàng noãn, có thể để lại hoặc không để lại vách bầu. Một lượng lớn hạt phấn cần thụ được đặt theo giá noãn. Để kích thích hạt phấn nảy mầm và đâm xuyên vào noãn có thể đặt vào môi trường nuôi cấy 1 hay 2 vòi nhụy.  Có thể nuôi cấy ngoài sáng hay trong tối. Noãn nảy mầm sau 5-7 tuần thụ phấn và tiếp tục được thụ phấn Thụ phấn bên trong bầu (intraovarian pollionation): cả vòi nhụy hoặc 1 phần của nó có thể được tách ra và hạt phấn hoặc được đặt trên bề mặt vết cắt bầu quả hoặc chuyển qua lỗ trên thành vòi nhụy đến bầu quả III. Kỹ thuật cứu phôi Mục đích Nuôi cấy phôi hữu tính Các yếu tố ảnh hưởng Ứng dụng III.1. Mục đích Khắc phục sự bất hợp sau thụ tinh. Khắc phục sự bất hợp giữa nội nhũ và phôi khi lai xa. Tạo cây đơn bội (lúa mì x ngô, lúa mỳ x yến mạch dẫn đến sự loại bỏ một bộ nhiễm sắc thể). Ngăn ngừa sự thui chột phôi ở những loại quả hạch chín (đào, mận, mơ…). Phá ngủ nghỉ, rút ngắn chu kỳ tạo giống… III.2. Nuôi cấy phôi hữu tính Sự phát sinh phôi hữu tính: -Xảy ra quá trình thụ tinh giữa hạt phấn và noãn hình thành hợp tử -Hợp tử trải qua quá trình nguyên phân liên tiếp tạo thành phôi Nuôi cấy phôi hữu tính gồm -Tách phôi -Nuôi cấy phôi để tạo cây. III.2.1. Tách phôi Phôi hữu tính được hình thành trong môi trường vô trùng của noãn và mô bầu hoa. -Ở một số loài phôi có kích thước lớn, thuận tiện cho quá trình tách phôi (cây họ đậu), nhưng một số loài hoa khó tách phôi (hoa lan_hạt có kích thước nhỏ, vỏ hạt tiêu giảm và thiếu nội nhũ) -Ở thực vật hoa dạng chùm, mô non thường xếp ở đỉnh của chùm hoa Trong quá trình thu nhận phôi cần hạn chế sự tổn thương của dây treo phôi. Dây treo phôi có kích thước nhỏ và cấu trúc mỏng manh nên khó tách nó nguyên vẹn cùng với phôi để đưa vào nuôi cấy. Không có dây treo phôi làm giảm đáng kể tỉ lệ hình thành cây con từ nuôi cấy phôi non III.2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy Sau khi tách từ hạt phôi được nuôi cấy trong môi trường chứa: Muối khoáng Chất điều hoà sinh trưởng Nguồn carbon Aminoaxit và thành phần hữu cơ phức hợp Muối khoáng Môi trường với hàm lượng cao các ion K+, Ca2+ đảm bảo cho tỷ lệ sống cao của phôi và khả năng thúc đẩy sinh trưởng tốt đối với phôi của một số loài thực vật. Chất điều hoà sinh trưởng Auxin và cytokinin không được sử dụng nhiều trong nuôi cấy phôi do chúng cảm ứng tạo callus. Ở nông độ rất thấp (0.01 mg/ l) GA3 kích thích sự nảy mầm sớm của phôi. Nguồn carbon Đường: là thành phần không thể thiếu trong mọi môi trường nuôi cấy, vì nó là nguồn cung cấp Cacbon chủ yếu. Trong nhiều trường hợp đường sucrose cho kết quả tốt hơn các đường khác. Nồng độ sucrose có thể dùng từ 0.5% đến 18%. Glucose và sucrose ngoài vai trò dinh dưỡng, còn có khả năng duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường. Phôi trưởng thành sinh trưởng khá tốt ở nồng độ thấp nhưng phôi non đòi hỏi nồng độ sucarose cao hơn. Aminoaxit và thành phần hữu cơ phức hợp Glutamin là a.a hiệu quả nhất đối với nuôi cấy phôi nhiều loài thực vật. Cazein thuỷ phân(CH) (Ziebur & Brink, 1951) là hỗn hợp các a.a được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy phôi. Làm tăng kích thước và tỷ lệ phân hoá phôi. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa (Overbeek, 1942), nước chiết malt (Blackeslee & Satina, 1944), là những chất mà khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy sẽ đem lại hiệu quả cao hơn… vì trong các chất này có chứa nhiều vitamin, DNA, RNA, và một số chất điều tiết sinh trưởng khác III.3. Các yếu tố ảnh hưởng pH môi trường Nhiệt độ Ánh sáng III.3.1. pH môi trường Các phôi tách rời sinh trưởng tốt trên môi trường có pH 5.0-7.5 Đây là phạm vi pH của dịch noãn (6.0) III.3.2. Nhiệt độ 25±2°C thích hợp cho sinh trưởng và nảy mầm của phôi. Nhiệt độ tối ưu cho nuôi cấy phôi có thể khác nhau giữa các genotype trong cùng 1 loài VD: Loài Zamia, Phaseolus, bông: 27-30°C Loài lai Brassica, lúa, lúa mạch: 17-22°C III.3.3. Ánh sáng Khi nuôi cấy phôi chưa trưởng thành của lúa mạch, lanh, các cá thể loài lai Allium tiến hành trong tối trước khi chuyển sang điều kiện sáng để nảy mầm. III.4. Ứng dụng của nuôi cấy phôi hữu tính Thu nhận thể đơn bội Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt Nhân giống các cây hiếm Thụ phấn trong ống nghiệm III.4.1. Thu nhận thể đơn bội Nuôi cấy phôi hữu tính để thu nhận các thể đơn bội thông qua quá trình loại bỏ trực tiếp NST sau khi lai xa. Tổ hợp giữa hai loài càng khác xa nhau thì sự đào thải hoàn toàn NST đơn bội của một loài càng dễ xảy ra III.4.2. Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt Nuôi cấy phôi hữu tính được dùng để kiểm tra nhanh khả năng nảy mầm của hạt, đặc biệt là các hạt giống có sức sống kém và hạt sau thời gian bảo quản dài. Phương pháp này cho độ chính xác cao III.4.3. Nhân giống các cây hiếm Hạt của một số cây rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên, vì vậy làm giảm khả năng sinh sản hữu tính của chúng. Bằng cách nuôi cấy phôi tách rời đã thu được rất nhiều cây con. Áp dụng với loài mà hạt có sức sống kém, hạt không có nội nhũ hoặc ít nội nhũ. VD: đối với các loài phong lan hạt của chúng rất nhỏ và không có nội nhũ vì vậy khả năng này mần của hạt là rất thấp vì vậy bằng phương pháp nuôi cấy phôi ta sẽ làm tăng tỉ lệ nảy mầm của phong lan. III.4.4. Thụ phấn trong ống nghiệm Một số rào cản đối với quá trình thụ tinh: Hạt phấn không có khả năng nảy mầm trên núm nhụy loài khác Ống phấn không tiếp cận được noãn vào thời điểm thích hợp Vỡ ống phấn trong vòi nhụy Những rào cản đó có thể được vượt qua bằng kĩ thuật thụ phấn trong ống nghiệm IV.1. Ví dụ về thụ phấn invitro và cứu phôi Thụ phấn invitro cứu phôi trong lai tạo giống hoa Lily ở Việt Nam Lily là tên gọi chung của tất cả các cây thuộc chi Lilium, họ Liliaceae, bộ phụ của thực vật một lá mầm Càng ngày lily càng được ưa chuộng bởi kiểu dáng đẹp cùng với mùi thơm quí phái và màu sắc hấp dẫn, quanh năm có hoa… Hiện nay, ở Việt Nam lily được xếp vào loại hoa cao cấp, tiềm năng thị trường rất lớn. Tuy nhiên các giống hoa lily có mặt trên thị trường Việt Nam hiện nay chủ yếu là nhập nội từ Trung Quốc, Nhật Bản và Hà Lan với giá thành cực cao, thêm vào đó một số giống nhập nội từ Trung Quốc rất nhanh bị thoái hóa do chất lượng giống kém… Vấn đề đặt ra là chúng ta phải nhanh chóng chủ động về giống đối với loại hoa quý này. IV.1.1. Thí nghiệm thụ phấn invitro Chọn nụ hoa trước khi nở 1-2 ngày, khử trùng: rửa sạch bụi đất bằng nước thường trước khi đưa vào buồng cấy, khử trùng bằng cồn Ethanol trong 30giây, tráng lại = nước cất vô trùng, tiếp tục khử= HgCl2. 0.1% trong 10 phút, lắc đều mẫu, tráng lại bằng nước cất vô trùng 3 lần. Tách cánh hoa: -Hoa bố: tách lấy bao phấn giữ trong điều kiện vô trùng. -Hoa mẹ: giữ toàn bộ cơ quan sinh sản cái: bầu nhụy, vòi nhụy và núm nhụy. Chúng được đạt đứng thẳng trong ống nghiệm hoặc bình, trên nền môi trường thụ phấn Thụ phấn invitro: có thể sử dụng - Kỹ thuật thụ phấn cắt vòi nhụy: cắt hết vòi nhụy hạt phấn được thụ ngay tại điểm cắt. - Kỹ thuật ghép vòi nhụy: Hạt phấn bố được thụ trên đầu núm nhụy của hoa bố, 1 ngày sau vòi nhụy của bố đã thụ phấn được cắt phía trên bầu 2mm và gắn vào bầu nhụy nhờ 1 miếng agar. - Kỹ thuât thụ phấn giá noãn: Hạt phấn bố được thu trực tiếp vào hàng giá noãn được tách từ bầu hoa mẹ. IV.1.2. Thí nghiệm cứu phôi Sau khi thụ phấn invitro cho các tổ hợp, tiến hành cứu phôi vào các thời điểm khác nhau bằng kỹ thuật nuôi cấy lát cắt bầu nhụy. Quả được cắt thành những lát mỏng thành 2-3mm và nuôi cấy trên môi trường trên môi trường lát cắt bầu nhụy: MS bổ sung thêm 1mg/l -NAA và 90g/l sucrose. Hạt được hình thành với tỉ lệ phôi trong hạt cao. Sau đó phát triển thành cây hoàn chỉnh. IV.2. Thí nghiệm cứu phôi hữu tính khoai tây 1. Thu hái các quả khoai tây trưởng thành, khi quả còn màu xanh, khoảng 21 đến 28 ngày sau khi thụ phấn 2. Khử trùng bề mặt quả bằng etanol 90% trong 30s 3. Ngâm quả trong hỗn hợp dung dịch hypoclorit canxi 5% và nước cất vô trùng trong 15 phút 4. Trong tủ cấy vô trùng, tiến hành tách hạt từ quả và chuyển sang đĩa petri 5. Bóc vỏ hạt và tách rời phôi 6. Cấy phôi vào đĩa petri đã chứa sẵn môi trường dinh dưỡng và nuôi ở nhiệt độ từ 18-22ºC với ánh sáng yếu 7. Các phôi được tách tốt từ hạt sẽ phát triển dần thành cây khoai tây con sau đó có thể chuyển ra trồng trong vườn ươm Nhìn chung, nguồn gen khai thác từ các loài lily là vô cùng đa dạng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chọn tạo giống. Việc phát triển các phương pháp thụ phấn và cứu phôi thích hợp sẽ là công cụ hữu ích tạo ra nhiều giống mới với nhiều đặc tính quý. Tài liệu tham khảo Công nghệ sinh học, tập 4. TS. Trịnh Đình Đạt. Nhà xuất bản Giáo dục Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật. PGS-TSKH. Lê Văn Hoàng. Bộ giáo dục và đào tạo đại học Đà Nẵng Báo cáo tốt nhiệp của 1 số anh chị khóa48 và khóa 49 Xin chân thành cảm ơn cô và các bạn!