Liệu pháp gen và ứng dụng liệu pháp gen trong chữa bệnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIỂU LUẬN SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ DI TRUYỀN HỌC ĐỀ TÀI : LIỆU PHÁP GEN VÀ ỨNG DỤNG LIỆU PHÁP GEN TRONG CHỮA BỆNH GVHD : PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Lớp : HC09SH Nhóm 1. Lê Hoàng Khoa 60901228 2. Cao Thị Mỹ Phương 60902029 3. Lê Kim Tài 60902310 4. Nguyễn Thị Thanh Tân 60902381 5. Nguyễn Đức Trung 60902979 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU NỘI DUNG A. LIỆU PHÁP GEN I. Khái niệm 1. Liệu pháp gen 2. Gen liệu pháp II. Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen III. Phân loại liệu pháp gen IV. Kỹ thuật cơ bản 1. Cơ sở của liệu pháp gen 2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen 3. Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp V. Nguyên lý của liệu pháp gen 1. Tách dòng gen liệu pháp 2. Các loại vecto thường được sử dụng trong liệu pháp gen B. Ứng dụng liệu pháp gen trong chữa bệnh I. Các lĩnh vực ứng dụng chủ yếu của liệu pháp gen II. Một số xu hướng chữa bệnh bằng liệu pháp gen III. Ứng dụng liệu pháp gen trong việc chữa bệnh HIV/AIDS IV. Vấn đề an toàn và triển vọng của liệu pháp gen C. Kết luận Tài liệu tham khảo. LỜI MỞ ĐẦU Nhiệm vụ hàng đầu của CNSH là giải quyết vấn đề mạng sống mà mỗi con người đều phải trải qua là sinh, lão, bệnh, tử. CNSH đang tập trung nỗ lực tìm ra các hướng đi để chữa khỏi các căn bệnh di truyền cũng như các căn bệnh hiểm nghèo. Trong đó liệu pháp gen là một kĩ thuật cao của CNSH có ý nghĩa quan trọng trong giải quyết nhiệm vụ này. NỘI DUNG A. LIỆU PHÁP GEN I. Khái niệm 1. Liệu pháp gen Liệu pháp gen (gene therapy) là kỹ thuật đưa gen lành vào cơ thể thay thế cho gen bệnh hay đưa gen cần thiết nào đó thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt được mục tiêu của liệu pháp. Biện pháp thứ nhất, đưa gen lành vào thay thế cho gen bệnh là cách giải quyết triệt để, vì gen lành sẽ được đưa vào đúng vị trí của nó trên bộ gen và chịu tác động bình thường của các trình tự biểu hiện gen đó. đưa vào tế bào bản sao của gene khỏe mạnh Biện pháp thứ hai, đưa gen cần thiết thay vào vị trí gen sai hỏng dễ thực hiện hơn nhưng khi đưa thêm một gen cần thiết vào bộ gen, người ta không làm chủ được vị trí gắn xen của đoạn mới đưa vào. Điều này dẫn đến một số kết quả không lường trước được: Gen mới đưa vào không nằm trong phức hợp điều hoà nên có thể được biểu hịên một cách tuỳ tiện, không đúng nơi (đúng với loại tế bào, mô đặc hiệu) và không đúng lúc (đúng với chu trình phát triển cá thể), hoặc thậm chí không được biểu hiện. Gen mới đưa vào gây những hiệu quả không mong muốn. Gen gắn vào một vị trí có khả năng hoạt hoá một gen tiền ung thư dẫn dến sự biểu hiện quá độ của gen này gây ra ung thư. 2. Gen liệu pháp Gen liệu pháp (Therapeutic gene) là các gen có chức năng sử dụng vào điều trị bệnh cho con người. Mỗi loại gen liệu pháp có những đặc điểm và chức năng khác nhau. Gen liệu pháp có thể là: Gen lành (các gen hoạt động bình thường) được đưa vào tế bào sống để thay thế các gen hỏng, gen mất chức năng Những gen có khả năng mã hóa 1 protein đặc hiệu, khi đưa vào tế bào sống có thể tạo nên các loại protein đặc hiệu. Các protein đặc hiệu có thể ức chế hoạt động của 1 gen khác trong tế bào, kìm hãm khả năng phân chia của tế bào hoặc gây chết các tế bào bị bệnh. Gen ức chế các gen gây bệnh, gen kìm hãm hoặc các gen phục hồi Các đoạn oligonucleotide có tác dụng kiềm hãm sự hoạt động các gen bị đột biến trong tế bào. II. Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen Theo dõi và hiểu biết cặn kẽ quá trình, cơ chế phát sinh bệnh, đặc tính di truyền của bệnh Nắm vững cấu trúc và chức năng của gen gây bệnh, gen hỏng, gen đột biến, … và cấu trúc, chức năng của gen liệu pháp. Dự đoán hiệu quả của liệu pháp. Nếu hiệu quả cao mới áp dụng Thử nghiệm nhiều lần với động vật, khi đạt hiệu quả cao mới áp dụng cho con người. III. Phân loại liệu pháp gen 2 nhóm phương pháp cơ bản: Liệu pháp gen soma (Somatic Gen Therapy - SGT): là phương pháp điều trị, thay thế hay sửa chữa các gen hỏng, gen bệnh của các tế bào soma trong cơ thể. SGT liên quan đến sự biểu hiện gen bên trong những tế bào sẽ được uốn nắn ở bệnh nhân nhưng không di truyền cho thế hệ sau. Tế bào dùng chữa trị có thể là tế bào lympho, tế bào gan, đặc biệt là dùng tế bào gốc. Đây là loại hình GT đang được nghiên cứu tại "Viện Liệu pháp Gen người" cũng như tại nhiều phòng thí nghiệm khác trên thế giới. Liệu pháp gen tế bào mầm (Germline Gen Therapy - GGT): điều trị, sửa chữa, thay thế gen hỏng cho các giao tử nhằm tạo ra thế hệ sau bình thường. GGT liên quan đến cải biến gen của những tế bào mầm mà những tế bào này truyền đạt những sự thay đổi đó cho thế hệ sau. Hãy còn ít công trình nghiên cứu về sự can thiệp vào dòng mầm vì lý do kỹ thuật và đạo đức. IV. Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen 1. Cơ sở của liệu pháp gen - Liệu pháp gen có thể được tiến hành thông qua một số cách sau: Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh. Strategies for Delivering Therapeutic Transgenes into Patients Tạo véctơ virus để chuyển gen một cách hiệu quả tới tế bào (in vivo). HIV based gene therapy vector Virus xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào bằng cách gắn với chúng và “bơm” thông tin di truyền của chúng vào tế bào. Vì các virus tự nhiên tự sinh sản bên trong tế bào chủ nên gây hại với vật chủ mang chúng. Tuy nhiên, có thể xoá hay làm mất các phần có hại của virus, ngăn không cho chúng tái bản trong tế bào chủ. Ngày nay các virus không có khả năng tái bản này được sử dụng chung cho các nghiên cứu liệu pháp gen trên người và động vật. Sử dụng các kỹ thuật khác nhau để chuyển gen vào tế bào bên ngoài người bệnh, sau đó chuyển các tế bào đã được biến đổi này vào người bệnh (ex vivo). Phương pháp này được sử dụng chung để phân phối các nhân tố phát triển và các phân tử khác tới các vùng đặc hiệu của cơ thể. Chúng cũng được sử dụng để tạo ra các dòng tế bào đã bị biến đổi hoàn toàn cho cấy ghép. Giống như trong liệu pháp gen in vivo, các tế bào được chuyển có thể gây biểu hiện các protein lạ gây sưng tấy hay đáp ứng miễn dịch. Các nhóm chuyên gia đã chia liệu pháp gen thành các mức khác nhau: Chuyển gen với sự hoà nhập (gen được kết hợp chặt chẽ với DNA của vật chủ) Chuyển gen không hoà nhập (gen không kết hợp chặt chẽ với DNA của vật chủ) Sử dụng các oligonucleotide tổng hợp nhân tạo gọi là các phân tử ribozyme/antisense không có các thành phần điều hoà (sự biểu hiện gen đã bị biến đổi). Để chuyển gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây: Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích hợp với những trình tự điều hoà thích hợp (trình tự khởi động), trình tự khởi động có thể là duy nhất đối với gen đặc hiệu, bằng cách này cho phép gen chỉ biều hiện trong các mô mà thông thường chúng được biểu hiện. Lần lượt, các gen có thể được kết nối với các trình tự khởi động, hoạt hoá trong tất cả các mô (phương pháp chung nhất được sử dụng ngày nay) hoặc có thể kết nối với các trình tự có thể hoạt hoá hay bất hoạt như một công tắc. Những thao tác như vậy có thể đạt được bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích. DNA cần kỹ thuật này để có thể tiếp cận với tế bào. Ba kỹ thuật cơ bản được sử dụng để làm điều này: DNA có thể được gắn trực tiếp với các tế bào hoặc cấy vào mô. Gọi là chuyển DNA trần (nacked DNA transfer) DNA có thể được sử dụng dể tạo nên con thoi dịch chuyển virus (viral transfer shuttle). Đây là phương pháp chuyển DNA hầu như chắc chắn nhất. DNA xâm nhập không hiệu quả vào tế bào vì nó khó có thể xuyên qua lớp màng lipit kép, nhưng vector virus dễ dàng làm việc này. DNA cũng có thể phối hợp với các phức hệ hoá học khác nhau để khuếch đại khả năng chuyển dịch qua màng tế bào của nó. Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen: liệu pháp gen có thể ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân hoặc trên các tế bào đã tách ra khỏi người bệnh (như tế bào tuỷ xương) sau đó cấy trở lại người bệnh. Trong tương lai, các thao tác liệu pháp gen của tế bào gốc phát triển trên môi trường mô tế bào và sau đó cấy lên người bệnh sẽ là tiến triển tột cùng. Mỗi kỹ thuật trên đều có những thuận lợi và khó khăn riêng. Khi chọn phương pháp phân phối gen, một số nhân tố cần được cân nhắc: Hiệu quả của liệu pháp phải được đặt lên hàng đầu. Sau đó, gen chuyển đổi phải được điều hoà đúng đắn. Nó phải được hoạt hoá đúng lúc, với độ dài thời gian chính xác và đúng số lượng. 2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen Trong thực nghiệm, người ta dùng các vector virus để chuyển các gen vào tế bào động vật theo 2 bước: Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển. Trước đó, các virus đã được biến đổi để không còn khả năng sao chép, đồng thời lại có khả năng biểu hiện mạnh gen cần đưa vào cơ thể. Các biến đổi này bao gồm việc loại bỏ các trình tự cần cho sự sao chép của virus và gắn vào trước gen các trình tự promotor mạnh. Sau đó, vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào nuôi cấy. Loại tế bào được sử dụng nhiều nhất là tế bào tuỷ xương vì dễ nuôi cấy lại bao gồm nhiều tế bào nguồn đa thế (pluri potential). Creating Recombinant Viral Vectors for Gene Therapy Bước 2: Vector virus mang gen lành được đưa vào cơ thể mà từ đó người ta đã tách các tế bào tuỷ xương. Như vậy, có thể xem đây là kỹ thuật ghép tự thân dù gen ghép vào là gen lạ đối với cơ thể. Trở ngại lớn là protein do gen lạ tạo ra có thể kích thích sản sinh kháng thể chống lại chính nó, hơn nữa, nếu việc chuyển gen vào tế bào nuôi cấy thường thành công thì việc đưa tế bào chuyển gen trở lại cơ thể lại ít khi có hiệu quả do nhiều nguyên nhân. Gần đây nhất, một quy trình liệu pháp gen vừa được thông qua nhằm làm chậm sự phát triển của bệnh AIDS. Người ta chuyển các oligonucleotit đối (antisens) bổ sung cho một số trình tự của virus HIV (trình tự TAR, REV) vào các tế bào của một người lành là anh em sinh đôi của người bệnh. Sau đó các tế bào này được tiêm vào bệnh nhân. Các Oligonicliotit đối TAR sẽ ức chế sự sao chép của virus khi bắt cặp và vô hiệu hóa trình tự TAR đóng vai trò trong sự sao chép. Còn các Oligonucleotit đối REV, khi bắt cặp với trình tự REV sẽ ngăn sự vận chuyển mRNA từ nhân ra tế bào chất. 3. Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp Hình thức chuyển gen có thể được thao tác thông qua một số cách sau: Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh (liệu pháp in vivo). Gồm: Lựa chọn vector liệu pháp thích hợp Tách và tạo vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp Đưa vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp vào bằng các kỹ thuật chuyển gen như vi tiêm, súng bắn gen,… Kiểm tra biểu hiện của gen liệu pháp Chuyển gen vào tế bào bên ngoài người bệnh (liệu pháp ex vivo): Lấy tế bào có gen hỏng ra ngoài cơ thể Chuyển gen lành vào thay thế gen hỏng để tạo tế bào lành Nhân tế bào lành thành số lượng lớn rồi đưa vào cơ thể Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp: Kỹ thuật vi tiêm (Microinjection) : dùng cho cả 2 hình thức in vivo và ex vivo Kỹ thuật xung điện (Electroporation) : thường dùng cho ex vivo Kỹ thuật dùng súng bắn gen (gene gun) : kỹ thuật này dùng để chuyển gen liệu pháp vào tế bào đích và thường đạt kết quả cao. Thực hiện theo hình thức ex vivo Kỹ thuật liposome (liposome technique) : thực hiện theo hình thức in vivo. Cần chú ý chọn tế bào đích để nâng cao hiệu quả V. Nguyên lý của liệu pháp gen : 1. Tách dòng gen liệu pháp : Tách dòng gen liệu pháp được thực hiện bằng các phương pháp tách dòng thực nghiệm thông thường, trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử và kỹ thuật gen. Gen liệu pháp có thể tách dòng từ các nguồn tế bào cho khác nhau như tế bào vi khuẩn, tế bào thực vật, động vật, tế bào người và một số loại virus. Tách dòng gen liệu pháp có hiệu quả cao đối với các gen đã biết rõ kích thước, vị trí của gen trong bộ gen. Hiệu quả tách dòng gen liệu pháp còn phụ thuộc vào cấu trúc, chức năng gen, sản phẩm của hoạt động gen cũng như mức độ hiện đại của các thiết bị thí nghiệm. Tùy theo đặc tính của gen liệu pháp và mục đích của liệu pháp gen, có thể tách dòng gen liệu pháp từ bộ gen (genome) hoặc từ mRNA. Trường hợp cần các gen nguyên vẹn (kể cả các vùng không mang mã di truyền) phải tách dòng từ bộ gen, thường chỉ thực hiện với các gen có kích thước nhỏ. Nếu các gen cần thiết có kích thước lớn, hoặc chỉ cần các phần DNA mang mã di truyền, phải thực hiện cách tách dòng từ mRNA. Trường hợp này cần tách chiết mRNA và thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược để tạo các cDNA tương ứng. Trường hợp gen liệu pháp là các đoạn oligo nucleotide đã biết trình tự (mạch kép hoặc mạch đơn), có thể tạo các đoạn oligo nucleotide bằng phương pháp tổng hợp nhân tạo. 2. Các loại vectơ thường sử dụng trong liệu pháp gen Để có thể nâng cao hiệu quả của liệu pháp gen trong chữa bệnh, một vấn đề quan trọng là chọn vectơ chuyển gen phù hợp với gen cần chuyển, phù hợp với loại tế bào đích và loại bệnh cần trị. Vectơ chuyển các gen liệu pháp trong liệu pháp gen gọi là các vectơ liệu pháp. Vectơ liệu pháp có một số đặc điểm riêng: Phải đảm bảo đưa các gen liệu pháp vào tế bào (cơ thể) dễ dàng, không gây tổn thương hoạt động của các gen khác trong bộ gen (không hoặc rất ít gây đáp ứng miễn dịch, không gây phá hủy chức năng các mô, không có tác động kích hoạt gen tiền ung thư…). Phải có khả năng mang một gen liệu pháp có kích thước càng lớn càng tốt. Có sự linh hoạt với các tế bào đích, mô đích để có thể gắn gen liệu pháp vào đúng những vị trí định trước Hiện nay, dựa vào nguồn gốc của vectơ liệu pháp gen, người ta chia các vectơ liệu pháp làm 2 nhóm: vectơ có bản chất virus (viral vector) và vectơ không có bản chất virus (nonviral vector). 2.1 Các vectơ liệu pháp gen có bản chất virus (viral vector) Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus Virus chứa vật chất di truyền được bao quanh bởi lớp màng protein. Đầu tiên, virus gắn với các tế bào chuyên biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các điểm thụ thể) trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lớp rào chắn màng tế bào. Khi xâm nhiễm tế bào, virus có khả năng chuyển bộ gen của virus vào trong các tế bào chủ. Một số nhóm virus có thể gắn được bộ gen virus hoặc một số gen của chúng vào bộ gen của tế bào chủ, tạo thành một thể thống nhất. Các gen virus gắn với tế bào chủ, có thể tồn tại lâu dài cùng với quá trình phân chia tế bào chủ, tạo nên các provirus. Hiện tượng tạo provirus được gọi là trạng thái tiềm sinh của virus. Đối với các virus gây bệnh, đó là thời gian ủ bệnh. Trong quá trình tồn tại và phân chia của tế bào chủ, bộ gen virus cũng được nhân lên tạo vô số tế bào mang gen virus, vẫn hoạt động bình thường. Khi có một tác nhân nào đó (thường là tia tử ngoại, các chất độc, tia phóng xạ hoặc nhiệt độ cao…) tác động vào provirus, làm cho bộ gen virus tách khỏi tế bào, thực hiện quá trình tái bản gen virus và tổng hợp các thành phần của virus trong tế bào chủ. Sự lắp ghép các thành phần của virus tạo nên các virion, các virion hoạt động tạo nên vô số virus mới phá vỡ tế bào chủ và tiếp tục xâm nhiễm tế bào khác. Đây là giai đoạn biểu hiện bệnh rõ nhất. Trên cơ sở hiểu biết về bộ gen virus, cơ chế xâm nhiễm tế bào, cơ chế gắn gen của virus vào bộ gen tế bào, con người đã tìm ra các biện pháp loại bỏ hoặc gây bất hoạt các gen có hại của virus, nhưng vẫn giữ lại các gen giúp cho sự xâm nhiễm và gắn gen virus vào bộ gen tế bào, tạo nên các vectơ liệu pháp gen. Các viral vector được chia thành nhiều nhóm tùy theo đặc điểm cấu trúc bộ gen, đặc điểm xâm nhiễm, đặc điểm gây bệnh của virus… . Viral vector gồm một số loại chủ yếu: vectơ adenovirus, vectơ retrovirus, vectơ adeno-associated virus (AAV), vectơ herpes simplex virus (HSV)… . 2.1.1 Vectơ adenovirus Đặc điểm và cấu tạo di truyền Adenovirus là một loại virus có caspid đa diện 20 mặt, phần lõi chứa DNA mạch kép. Vỏ caspid của virus chứa 3 protein: hexon, fiber và base penton. Hexon là thành phần cấu trúc quan trọng, tạo thành bề mặt 20 mặt, trong khi các penton tạo thành phức hệ với fiber cho kết quả là 12 chóp ngoài vỏ virus đóng vai trò quan trọng trong việc gắn với các phối tử. Adenovirus được phân lập đầu tiên từ amidan vòm họng của người, gây các bệnh về đường hô hấp. Bộ gen của adenovirus là một chuỗi DNA xoắn kép dài 36 kb, gồm hơn 50 gen. Trong bộ gen của adenovirus có 4 vùng gen quan trọng, ký hiệu là E1, E2, E3 và E4. Gen E1 có chức năng mã hóa cho các protein enzyme giúp cho quá trình phiên mã tổng hợp các protein sớm (protein enzyme của virus). Gen E2 và E4 điều hòa quá trình tái bản DNA virus, dịch mã tổng hợp protein muộn đồng thời có liên quan đến sự đáp ứng miễn dich của vật chủ trong quá trình tấn công của adenovirus. Nguyên lý thiết kế vectơ adenovirus Vectơ adenovirus được tạo nên từ các adenovirus tái tổ hợp. Đầu tiên cần tạo các adenovirus tái tổ hợp có khả năng xâm nhiễm tế bào chủ nhưng mất khả năng tái bản trong tế bào chủ. Để thiết kế vectơ adenovirus phải loại bỏ gen E1 của adenovirus, thay thế bằng phức hợp promoter-gen liệu pháp và các gen cần thiết điều khiển quá trình biểu hiện của gen liệu pháp trong tế bào chủ. Gen E3 cũng được gây bất hoạt hoặc loại bỏ. Bộ gen virus sau khi loại bỏ gen E1 và E3 được đưa vào tế bào đóng gói (packaging cell) cùng với gen liệu pháp. Tại đây, quá trình tái tổ hợp ở những điểm tương đồng tạo nên bộ gen adenovirus tái tổ hợp chứa gen liệu pháp. Cơ chế hoạt động Adenovirus có thể xâm nhiễm cả tế bào không phân chia và các tế bào đang phân chia. Vectơ adenovirus có thể mang các gen liệu pháp kích thước lớn từ 8 kb đến 30 kb, không gây đột biến gen của tế bào đích. Điểm bất lợi nhất khi sử dụng vectơ adenovirus là gây hiệu ứng giảm mạnh đáp ứng miễn dịch của tế bào. Vectơ adenovirus có khả năng xâm nhiễm nhiều loại tế bào do nhiều loại tế bào đích có các cơ quan thụ cảm phù hợp với adenovirus. Khi xâm nhiễm vào trong tế bào chủ, phần lõi mang bộ gen virus và gen liệu pháp chui qua lỗ màng nhân. Bộ gen của adenovirus không có khả năng gắn với bộ gen của tế bào chủ. Trong nhân của tế bào chủ, các gen của adenovirus thực hiện quá trình phiên mã, quá trình dịch mã trong tế bào chất của tế bào tạo các protein liệu pháp và các protein cần thiết cho virus. 2.1.2 Vectơ retrovirus ( retroviral vector) Đặc điểm cấu tạo và di truyền Retrovirus là loại virus RNA, có khả năng xâm nhiễm tế bào chủ cao, có khả năng gắn bộ gen virus với bộ gen tế bào chủ. Cấu trúc retrovirus gồm phần vỏ có ba lớp. Lớp vỏ ngoài cùng là glycoprotein, tiếp đến lớp vỏ kép lipid, trong cùng là vỏ caspid. Bên trong lớp vỏ caspid là RNA và các loại enzyme của virus. Enzyme phiên mã ngược giúp virus chuyển bộ gen RNA sang dạng cDNA mạch kép. Enzyme cài xen giúp cho quá trình cài xen bộ gen virus với bộ gen tế bào chủ ở những điểm tương đồng. Cấu tạo retrovirus Bộ gen retrovirus gồm 2 sợi đơn RNA đồng dạng, kích thước khoảng 7-11 kb. Mỗi sợi RNA chứa ba nhóm gen chủ yếu: gag, pol, env. Một số virus gây ung thư có thêm nhóm gen gây ung thư oncogen. Gen gag mã hóa các protein lõi trong thành phần cấu trúc hạt virion, gen pol mã hóa các enzyme phiên mã ngược và các enzyme cần thiết cho hoạt động của virus, gen env mã hóa protein trong cấu trúc các lớp vỏ của virus. Hai đầu mỗi sợi RNA có một trình tự lặp dài tận cùng – LTR (long terminal repeats). Đoạn lặp LTR mang một số trình tự cần thiết cho quá trình biểu hiện gen của virus và một trình tự đặc hiệu giúp gắn bộ gen virus với bộ gen tế bào chủ, gọi là trình tự gắn xen – att (attachment site). Trong bộ gen virus còn có một trình tự giúp quá trình đóng gói bộ gen của virus gọi là trình tự ᴪ. Bộ gen của virus gây bệnh ung thư MLV và DNA của virus (hình thái của bộ gen virus trong các tế bào bị nhiễm) Nguyên lý thiết kế vectơ Nguyên lý chung của quá trình thiết kế vectơ retrovirus là phải loại bỏ các gen độc của virus, chỉ giữ lại một số gen cần thiết cho quá trình xâm nhiễm, tái bản, gắn gen, đồng thời cài thêm các gen liệu pháp. Các giai đoạn thiết kế vectơ retrovirus: Loại bỏ các gen chủ yếu của virus gag, pol, env và oncogen, thay thế bằng gen liệu pháp tạo thành vectơ bộ gen Xử lý cắt riêng các gen gag, pol, env của retrovirus nhưng vẫn đảm bảo chức năng của các gen Đưa vectơ bộ gen cùng với các gen gag, pol,env đã xử lý của virus vào một tế bào đóng gói Trong tế bào đóng gói, các gen virus hoạt động tổng hợp các thành phần của vỏ virus, các thành phần của vỏ virus kết hợp với vectơ mang gen liệu pháp hình thành nên vectơ retrovirus Cơ chế hoạt động Mỗi loại retrovirus có đặc điểm cấu trúc gen, khả năng xâm nhiễm và tái bản riêng, do đó từ các loại retrovirus khác nhau ta có các loại vectơ retrovirus khác nhau. Hai nhóm vectơ retrovirus được sử dụng nhiều nhất trong liệu pháp gen là Mo-MuLV (Moloney murine luekemina) và Lentivirus ( HIV – human immune deficiency virus, SIV – Simian immune deficiency virus). Vectơ Mo-MuLV sử dụng cho những tế bào đang phân chia, vectơ HIV và SIV sử dụng cho những tế bào ở trạng thái không phân chia. Vectơ retrovirus được đưa đến tế bào đích bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Sau khi vào trong tế bào, các thành phần vỏ của virus bị phân hủy trong tế bào chất của tế bào đích, RNA được giải phóng. Enzyme phiên mã ngược của virus xúc tác quá trình chuyển RNA sợi đơn thành cDNA sợi kép. cDNA qua lỗ màng nhân vào trong nhân tế bào đích, nhờ enzyme intergase của virus làm cho cDNA mạch kép được gắn xen vào bộ gen ở những điểm tương đồng. Gen liệu pháp cũng đồng thời được gắn xen vào bộ gen của tế bào đích phiên mã và dịch mã tạo nên các protein liệu pháp trong tế bào đích. 2.1.3 Vectơ Adeno-Associated virus Đặc điểm cấu tạo và di truyền Adeno-Asociated Virus (AAV) là loại virus kích thước nhỏ thuộc nhóm parvovirus không gây bệnh cho người. khi không có mặt của một loại virus trợ giúp khác như adenovirus, virus helper…, AAV có thể xâm nhiễm các tế bào không phân chia, gắn bộ gen virus vào bộ gen người ở vị trí đặc hiệu trên nhiễm sắc thể số 19 tạo nên tiền virus (provirus). Bộ gen của AAV là DNA sợi đơn, được bao bọc trong lớp vỏ caspid. Kích thước bộ gen khoảng 4,5 – 4,7 kb, hai đầu là các trình tự lặp tận cùng đảo ngược ITR (Inverted Terminal Repeats) gồm 145 bp. Bộ gen AAV gồm 2 nhóm gen chính là gen rep và gen cap, các promoter p5, p19 và p40, phần cuối bộ gen là trình tự gắn đuôi poly Adenin – poly A (polyadeninlation). Gen cap mã hóa protein trong cấu trúc vỏ caspid của AAV. Gen rep mã hóa các enzyme giúp cho quá trình tái bản, phiên mã và quá trình gắn bộ gen AAV vào bộ gen tế bào chủ. Nguyên lý thiết kế Khi thiết kế các vectơ AAV phải loại bỏ các gen rep, cap của AAV đồng thời thay thế vào vị trí đó là gen liệu pháp cùng promoter thích hợp. Bộ gen của AAV chỉ thích hợp với các gen liệu pháp có kích thước dưới 4kb, khi kích thước gen liệu pháp lớn hơn 5kb, vectơ sẽ mất tác dụng. Quá trình thiết kế vectơ AAV cần sự có mặt của virus trợ giúp, thường sử dụng là các adenoviral helpers giúp quá trình tái tổ hợp đồng thời với gen liệu pháp, gọi là sự đồng chuyển nhiễm. Hiện nay, thiết kế vectơ AAV người ta sử dụng đồng thời vectơ plasmid mang gen liệu pháp và các đoạn ITR, virus AAV và virus trợ giúp là adenoviral helper. Quá trình chuyển nhiễm đồng thời tạo nên vectơ AAV mang gen liệu pháp và các dạng adenovirus lai. Các adenovirus lai bị gây bất hoạt bằng kỹ thuật xử lý nhiệt, sau đó dùng kỹ thuật siêu ly tâm phân đoạn để tách các vectơ AAV mang gen liệu pháp. Cơ chế hoạt động Khi vectơ AAV tiếp cận tế bào ở các thụ thể đặc trưng, toàn bộ các gen qua lỗ màng nhân vào trong nhân tế bào. Trong nhân tế bào chủ, một số gen mã hóa các protein enzyme được phiên mã và dịch mã, giúp cho quá trình tái bản DNA và gắn DNA vào vị trí đặc hiệu trên bộ gen tế bào chủ. Gen liệu pháp cũng được nhân lên, phiên mã và dich mã tạo nên các protein liệu pháp. 2.1.4 Vectơ liệu pháp từ Herpes Simplex Virus (HSV) Đặc điểm cấu tạo và di truyền của herpes virus Herpes virus là một nhóm virus lớn, gây bệnh ở người và động vật. Herpes virus có kích thước khoảng 150nm, cấu tạo gồm vỏ ngoài, vỏ trong, màng lipid, vỏ caspid và phần lõi chứa DNA. Vỏ caspid cấu tạo từ 162 đơn phân, tạo hình đa diện 20 mặt. Bộ gen là phân tử DNA mạch kép, kích thước 152 260 bp. Herpea virus tương đối đa dạng, gồm nhiều nhóm có sự phân biệt gọi là herpes typ 1, herpes typ 2.., do đó được gọi là virus đơn hình ( herpes simplex) ký hiệu là HSV-1, HSV-2. Bộ gen herpes virus gồm ba nhóm gen chủ yếu là: nhóm gen α hay gen rất sớm – IE (immediate early), nhóm gen β hay gen sớm – E (early) và nhóm gen γ hay gen muộn – L (late), hai đầu là các trình tự TR (terminal repeat)… . Trong bộ gen có khoảng một phần hai các gen không cần thiết cho sự tái bản của herpes virus trong tế bào chủ. Cấu tạo của herpes virus Nguyên lý thiết kế vectơ HSV-1 Thiết kế vectơ HSV-1 dựa trên cơ sở tái tổ hợp của virus HSV-1 với Amplicon plasmid. Amplicon plasmid là một plasmid tái tổ hợp mang gen Ori, gen kháng Ampicilin trong plasmid của E.coli đồng thời mang gen Ori và gen mã hóa khả năng đóng gói của HSV và gen liệu pháp có gắn đoạn promoter kiểm soát nhóm gen rất sớm. Amplicon plasmid và virus trợ giúp cùng được gây nhiễm vào tế bào khả biến. Quá trình tái tổ hợp trong nhân tế bào khả biến tạo nên các vectơ HSV mang gen liệu pháp có thể sư dụng trong liệu pháp gen. Cơ chế hoạt động của vectơ HSV-1 Vectơ HSV-1 có khả năng cho gắn và chuyển những gen liệu pháp kích thước từ 30 đến 50 kb. Vectơ HSV-1 xâm nhiễm tế bào chủ nhanh, thời gian tiềm ẩn dài, không hoặc ít gây đáp ứng miễn dịch không mong muốn ở tế bào chủ. Hiện nay, vectơ HSV-1 sử dụng trong liệu pháp gen còn hạn chế do vectơ HSV-1 có thể tạo một số hợp chất độc trong tế bào một cách gián tiếp. Mặt khác, vectơ HSV-1 chỉ biểu hiện đặc hiệu ở các tế bào thần kinh, do đó phạm vi ứng dụng của vectơ HSV-1 trong chữa bệnh rất hẹp, chủ yếu điều trị các bệnh lien quan đến hệ thần kinh. 2.2 Các vector không có bản chất virus 2.2.1 Liposomes - Liposome là vector không có bản chất virus, lợi dụng các tính chất tự nhiên của màng tế bào để xâm nhập vào tế bào. Tất cả các vật chất sinh học có cực và thành phần lipid cũng như tính hòa tan nước khác nhau. Thành phần và cấu trúc của nó xác định các tính chất này. - DNA tích điện âm. Tính “béo” cao và tích điện âm của màng tế bào người và màng nhân ngăn cản sự di chuyển tự do ra vào tế bào của DNA. Liposome mang điện tích dương, lớp vỏ ưa lipid. Do tích điện đối dấu, DNA và liposome dễ dàng gắn chặt với nhau, tạo nên phức hợp ưa lipid liposome-DNA. Tính hoà tan chất lipid này cho phép vận chuyển nó qua màng tế bào và màng nhân, dễ dàng đưa DNA vào nhân của tế bào. Hình 15. Sơ đồ quá trình sử dụng liposomes làm vector chuyển gen. - Liposome là các phân tử không độc, dễ dàng sản xuất với số lượng lớn, khiến chúng trở thành vector rất hiệu quả trong các ứng dụng thương mại. Sự xâm nhập của protein trong vector ngăn cản đáp ứng miễn dịch của vật chủ và chúng không bị nguy hiểm hay bị tiêu diệt bởi các enzym (endonucleases) nội bào. - So với tất cả các vector không có bản chất virus, chuyển gen liposome có tiềm năng ứng dụng lớn nhất tại thời điểm hiện tại. 2.2.2 Các polymer cation Các polymer cation là chuỗi các phức hợp tích điện dương. Khi trộn với DNA, chúng tạo thành phức hợp có tính chất của DNA kết tụ thành dạng mà có thể dễ dàng vào nhân. Lĩnh vực nghiên cứu này là cuộc cách mạng nhanh chóng các phân tử không độc có tính hiệu quả hơn và chuyển các gen tới các tế bào đúng đích hơn. Hình 16. Sự xâm nhập vào tế bào của các polymer cation. Hình 17. Các kỹ thuật được sử dụng để nghiên cứu sự tạo thành và tính ổn định của phức hệ polycation-DNA. 2.2.3 Cấy trực tiếp Sự cấy các DNA trần hay DNA tự do là một ví dụ khác của chuyển gen không có bản chất virus. Trong kỹ thuật này, DNA trần được cấy trực tiếp tới khối u hoặc mô. Phương pháp điều trị này có thể làm giảm trực tiếp sự sản xuất các protein quan trọng cho liệu pháp trị bệnh (ví dụ protein khối u) hoặc có thể gây ra đáp ứng miễn dịch giúp ngăn ngừa bệnh. Kỹ thuật này đã được ứng dụng cho cơ xương trong điều trị các bệnh thoái hoá cơ (như bệnh loạn dưỡng cơ), ngăn cản các bệnh gan do virus (như bệnh viêm gan), và các bệnh tim (như bệnh lỗi sung huyết tim). Ngoài ra, các nghiên cứu trên động vật đã thành công trong điều trị ung thư như u ác tính và u bướu. Trong khi giá thấp và tính dễ thiết kế làm nó được thu hút hơn, cũng có một số nhược điểm. Đầu tiên, sự quản lý hệ thống của vật chất di truyền là vấn đề và nguyên nhân gây ra sự phân huỷ bởi enzym nội bào và nhanh chóng bị dẹp bỏ (clearance) bởi gan và thận. Hiệu quả của biểu hiện di truyền cực kỳ khó nhận thấy. Hơn nữa, trong một số trường hợp không duy trì được biểu hiện của gen, các DNA lạ (foreign DNA) có thể gây đáp ứng miễn dịch mạnh. 2.2.4 Liệu pháp tế bào gốc - Chuyển tế bào gốc là kỹ thuật tạo ra tranh cãi lớn trong khoa học, chính trị và tôn giáo. Vì vậy, việc nghiên cứu chúng là hết sức hạn chế và chỉ diễn ra trên quy mô phòng thí nghiệm. - Các tế bào gốc là các tế bào đầu tiên trong cơ thể người. Chúng là các tế bào hoàn toàn giống nhau và hầu như có thể phát triển thành bất cứ tế bào nào ở người. - Các tế bào này có thể tách khỏi cơ thể, tinh chế trong phòng thí nghiệm, làm thành các dạng tế bào đặc hiệu khác nhau và sau đó các tế bào này được đưa trở lại vật chủ. 2.2.5. Biến đổi biểu hiện gen Sự biểu hiện gen ở người có thể bị biến đổi trực tiếp bằng cách sử dụng các công cụ phân tử có khả năng xuyên qua tế bào, gắn tới gen đích của chúng và điều hoà gen sản xuất protein. Có một số công cụ được dẫn ra dưới đây: 2.2.5.1 Liệu pháp antisense Antisense là một phương pháp để ngăn cản hoạt động của gen. Có 2 cơ chế antisense oligonucleotide là mã trình tự và kháng nguyên tại miện mRNA được đưa vào tế bào hoặc gen kháng nguyên. Gen được nhân bản và đưa vào tế bào. Cơ chế của liệu pháp antisense Trong kỹ thuật antisense người ta có thể cắt sử dụng một đoạn nucleotide nhỏ đối nghĩa với DNA tổng hợp nên protein và làm bất hoạt gen đó để giảm việc sản xuất ra 1 loại protein đó-nhằm gia tăng sự sinh tồn, sự ổn định nhiệt và hoạt tính của RNA nhân tạo. người ta thường dùng phương pháp sau đây : Biến đổi đầu 3’ và 5’ làm tăng sinh tồn của RNA nhân tạo : thông thường các enzyme cắt DNA/RNA từ đầu 3’ đến đầu 5’, nhưng cũng có enzyme cắt từ đầu 5’ đến đầu 3’. Dể bảo vệ RNA nhân tạo tránh khỏi phản ứng của enzyme người ta thường thay thế 2 gốc nối phosphap P=O ở 2 đầu thành phosphorothioate P=S hay phosphapamindate P-N, hay băng các amin-linker ngắn, hay các hóa chất thông thường như cholesterol, cyclodextrin. Các hóa chất này có thể làm giảm hiệu quả của khả năng phân giải enzyme và làm tăng tính sinh tồn của RNA nhân tạo trong quá trình sinh học. dùng các hóa chất có tính hydrophobic cao như cholesterol, pyrene và các đa amin đã giúp việc chuyển DNA/RNA chuyển qua màng của tế bào hữu hiệu hơn. Dùng các RNA nhân tạo với sự biến đổi các gốc 2’-Oxy để làm gia tính tính ổn định nhiệt của RNA nhân tạo :2’-omethyl, 2’-amino, 2’-O-ankyl, LNA. Dể tìm ra loại oligonucleotide DNA/RNA nhân tạo nào đó có nhiều gốc biến đổi hóa học mà vẫn có thể hòa tan trong dung dịch nước, có thể bền vững trong những phản ứng phân giải của enzyme, có thể có tính kết hợp base-pairring rất chặt chẽ với các oligonucleotide DNA/RNA thiên nhiên. Mới đây LNA(lock nucleic acid), với cấu trúc hóa học được biến đổi nhưng vẫn mang đủ điều kiện RNA nucleic acid. LNA oligonucleotide sẽ có đặc điểm là xương sống phosphat,LNA sẽ không dễ dàng bị phân giải hoàn toàn hay biến đổi từ 3’Oxy sang 2’Oxy ở trong các môi trường dung dịch có pH<7 các oligonucleotide sẽ rất bền vững trước phản ứng của enzyme và có tính ổn định nhiệt cao khi có base pairring kết hợp với các RNA thiên nhiên. 2.2.5.2. Oligonucleotide Oligonucleotide là các đoạn DNA ngắn có thể được sử dụng để kìm hãm quá trình dịch mã của gen. Mạch đối (antisense) của đoạn gen đã biết được tạo thành. Khi mang tới tế bào, các đoạn DNA này cuộn xoắn với RNA đặc hiệu và ngăn cản sự sản xuất protein từ RNA này. Hình 18. Quá trình hoạt động của Oligonucleotide. Công nghệ mạch đối đã rất hữu dụng trong nghiên cứu nhưng các ứng dụng thương mại của nó rất không thành công. Điều này là do thời gian sống ngắn của các oligomucleotide và sự khác nhau của phân phối đặc hiệu. Hiện tại, có một dược phẩm oligonucleotide đã được chấp nhận là FDA, dùng để điều trị nhiễm cytomegalovirus ở võng mạc. Dự án bộ gen người hoàn thành đã làm sống lại mối quan tâm trong lĩnh vực này với các kỹ thuật phân phối mới làm liệu pháp oligomucleotide có hiệu quả hơn. 2.2.5.3. Ribozyme Hình 19. Cấu tạo của Ribozyme. Ribozyme là các chuỗi RNA ngắn (30-50 nucleotide) được thiết kế đặc biệt, có hoạt tính xúc tác (chúng gây ra các phản ứng hoá học). Ribozyme gắn với các đoạn RNA đặc hiệu và tách chúng ra khỏi RNA, do đó ngăn cản quá trình sản xuất protein. Các ribozyme này dường như có hiệu quả trong 12 đến 24 tiếng. Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới nhất với ứng dụng trong các bệnh ung thư và các bệnh thoái hoá thần kinh (neuro-degenerative). Thông tin từ dự án bộ gen người có thể đem lại các ứng dụng có giá trị cho công nghệ này một cách nhanh chóng.  Hình 20. Quá trình hoạt động của Ribozyme. 2.2.5.4. Promoter Promoter là các đoạn DNA điều khiển biểu hiện gen không bị phiên mã. Tất cả các vector liệu pháp gen hiện nay sử dụng các promoter của virus để điều khiển sự biểu hiện của các gen được chuyển. Việc thiết kế và sử dụng đặc hiệu mô làm các promoter trở thành lĩnh vực nghiên cứu quan trọng, có thể cho phép hoạt hoá của gen được chuyển chỉ trong các mô dự kiến. Ví dụ, một vector sử dụng promoter cho kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến được sử dụng trong các thử nghiệm y học chống ung thư tiền liệt tuyến. Vector này sẽ là đích của một số lớn các tế bào, nhưng gen được chuyển chỉ được hoạt hoá trong các tế bào bình thường sản xuất kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến. B. ỨNG DỤNG LIỆU PHÁP GEN TRONG CHỮA BỆNH I. Các lĩnh vực ứng dụng chủ yếu của liệu pháp gen 1. Trong điều trị các bệnh do rối loạn di truyền Điều trị và chữa các bệnh do rối loạn di truyền các locus đơn gen Trong tế bào, một số gen đơn bị hỏng hay mất cấu trúc bình thường ( rối loạn chức năng gen), có thể gây nên các bệnh di truyền. Bệnh tật trong trường hợp này có thể gây tử vong ở giai đoạn sớm nếu không được chữa trị, hoặc để lại các di chứng và di truyền 100% cho các thế hệ sau. Một số loại bệnh điển hình: Bệnh thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng Bệnh thiếu máu hồng cầu liềm Bệnh máu khó đông Bệnh xơ nang và viêm phổi cấp Bệnh giảm trí nhớ Parkinson Bệnh run rẩy Gaucher Bệnh rối loạn cholesterol gia đình Bệnh rối loạn mãn tính các chức năng hạt Điều trị và chữa các bệnh do rối loạn di truyền các locus đa gen Một số loại bệnh do nhiều gen thuộc các locus khác nhau quy định, tùy theo mức độ hoặc mất chức năng của một hay nhiều gen (alelle) mà mức độ biểu hiện bệnh là khác nhau. Những bệnh ở trường hợp này di truyền 100% cho các thế hệ sau. Các bệnh điển hình như: Bệnh tim bẩm sinh Bệnh ung thư Bệnh tiểu đường Bệnh nghiện rượu Bệnh tâm thần phân liệt Hành vi tội phạm do gen 2. Trong chữa các bệnh do nhiễm trùng Là những bệnh do virus, vi khuẩn gây nên, trong đó có nhiều loại bệnh hiểm nghèo như bệnh ung thư, lao, HIV… gây thiệt hại to lớn về kinh tế, sức khỏe con người. liệu pháp gen là một trong những phương pháp chữa bệnh có hiệu quả cao, nhiều bệnh nhân mắc những bệnh nguy hiểm như ung thư gan, lao, viêm gan B… đã được chữa trị thành công bằng liệu pháp gen. trong tương lai, khả năng điều trị bệnh truyền nhiễm bằng liệu pháp gen ngày càng nhiều với hiệu quả và chất lượng càng cao. II. Một số xu hướng chữa bệnh bằng liệu pháp gen 1. Thay thế gen liệu pháp vào vị trí gen hỏng Nhiều bệnh gây nên do một gen đột biến, dẫn đến rối loạn chức năng gen gây thay đổi cấu trúc protein tạo nên các trạng thái bệnh lý. Chiến lược thay thế gen đã được áp dụng trong một số trường hợp điển hình như: Thay gen mã hóa “nhân tố VIII” trong điều trị bệnh máu khó đông Thay gen mã hóa Anpha-1-anti-trypsin khi chữa bệnh thiếu hụt Anpha-1-anti-trypsin Thay gen mã hóa enzyme glucocerebrosidase trong bệnh Gaucher Thay gen mã hóa enzyme ADA đã chữa khỏi bệnh thiếu hụt miễn dich trầm trọng 2. Tăng cường hoặc hỗ trợ hoạt động của gen Điều trị các loại bệnh theo xu hướng tăng cường hoặc hỗ tợ hoạt động của các gen được áp dụng trong các trường hợp sau: gen bị mất chức năng, dẫn đến tế bào hoạt động không bình thường tạo nên các protein bệnh lý Trong tế bào có quá nhiều bản sao của một gen bình thường, các hoạt dộng phiên mã và dịch mã làm dư thừa quá mức các sản phẩm bình thường của gen, gây nên các biểu hiện bệnh lý. Khôi phục trạng thái bình thường của kiểu gen, khi có một gen nào đó bị biến đổi, hoặc chuyển vị trí làm thay đổi kiểu gen Xu hướng này được dử dụng trong điều trị các bệnh do rối loạn chức năng của các gen đơn (monogenic). Một số bệnh điển hình được điều trị là bệnh xơ nang, bệnh máu khó đông, bệnh loạn dưỡng cơ… 3. Sửa chữa gen Khi phát hiện bệnh lý do gen bị đột biến ở một hoặc một số nucleotide, có thể áp dụng biện pháp sửa chữa gen (gene correction) nhằm khôi phục hoạt động của gen trở lại bình thường. Khó khăn lớn nhất của xu hướng điều trị sửa chữa gen là bằng phương pháp in vivo hoặc ex vivo rất khó đưa gen liệu pháp vào đúng vị trí đột biến, vị trí gen bị sai lệch. 4. Ức chế tế bào đích Hướng điều trị ức chế hoạt động của tế bào đích, có thể bằng cách cắt bỏ mRNA, ức chế hoạt động của gen hoặc mRNA. Có thể sử dụng một số biện pháp sau: Sử dụng ribozym để cắt bỏ hoặc sửa chữa các mRNA Dùng các chuỗi oligonucleotid để hình thành các xoắn ba DNA nhằm ức chế tái bản của gen và ức chế quá trình phiên mã của gen. Sử dụng vectơ oligonucleotid antisens tạo nên các mRNA xoắn đôi, làm ức chế quá trình dịch mã trên phân tử mRNA 5. Tiêu diệt tế bào đích Là biện pháp có hiệu quả cao đối với các tế bào ung thư, tế bào khối u. Trong chiến lược tiêu diệt tế bào đích bị bệnh, các viral vectơ mang các gen liệu pháp chủ yếu là những gen mã hóa cytokine hoặc độc tố (toxin), ví dụ như gen thymidin kinase,… thường được sử dụng. Tiêu diệt tế bào đích, cần phải lựa chọn loại vectơ liệu pháp và kỹ thuật chuyển gen liệu pháp vào tế bào đích thích hợp để các gen liệu pháp được đưa vào đúng tế bào đích, hoặc vào giữa khối u ung thư. Muốn hiệu quả tiêu diệt tế bào đích cao, các gen liệu pháp phải có khả năng biểu hiện mạnh, thời gian tồn tại và biểu hiện của gen liệu pháp cần đủ dài ở mức nhất định, đủ để tiêu diệt tế bào đích. III. Ứng dụng liệu pháp gen trong chữa bệnh HIV/AIDS : Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) do virus HIV (human immuno deficiency virus) gây nên và là bệnh đại dịch thế kỷ, gây tử vong lớn. Virus HIV gồm có 2 typ chính là HIV typ I chiếm 98% và HIV typ II chiếm khoảng 2%. Hình 22. Cấu tạo virus HIV Hình 23. Genome của virus HIV Hệ gen của HIV có kích thước khoảng 10kb bao gồm 9 gen chính: gag, pol, env, vif, tat, vpu, nef, vpr và rev. Sau khi xâm nhiễm vào tế bào người, hệ gen của HIV gắn và hoà nhập vào hệ gen của người tạo nên dạng tiền HIV (provirus) ở vô số tế bào lympho T và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác, gây suy giảm miễn dịch ở người mắc phải. Trong những điều kiện nhất định, dạng tiền virus HIV có thể tạo ra virus HIV mới, xâm nhiễm vào nhiều tế bào khác như tế bào lympho B, đại thực bào, bạch cầu, tế bào thần kinh v.v...gây suy giảm nhanh chóng hệ miễn dịch của người. Tứ đó biểu hiện các triệu chứng bệnh AIDS theo các nguồn bệnh nhiễm trùng khác nhau. Hình 24. Chu trình tái bản của virus HIV. Trong nhiều năm qua, các nhà khoa học đã nghiên cứu thí nghiệm nhiều biện pháp phòng chống và điều trị HIV/AIDS. Để hạn chế nhiễm HIV và đại dịch AIDS trên toàn thế giới, người ta đã nghiên cứu điều chế nhiều loại kháng sinh và biệt dược như: starudine, lamirudine, azathioprin (AZT) antiretrovir (ARV) v.v...nhất là RAN kháng virus để góp phần điều trị HIV/AIDS, kéo dài sự sống cho những người nhiễm HIV. Có nhiều loại thuốc điều trị HIV/AIDS nhưng hiệu quả kém do HIV đã có các đột biến thích ứng. Hướng mới trong điều trị AIDS là sử dụng liệu pháp gen. - Xu hướng chủ yếu của liệu pháp gen trong điều trị nhiễm HIV/AIDS là: + Chuyển các gen liệu pháp nhằm hạn chế khả năng xâm nhiễm và nhân bản của HIV. + Kích thích các gen của cơ thể để tăng cường miễn dịch chống sự phát triển của HIV. + Sử dụng các gen tự sát (Suicide gene) đã biến đổi làm cho các tế bào đã nhiễm HIV tự chết. + Tạo vacine phòng chống nhiễm HIV bằng công nghệ di truyền. - Một số liệu pháp gen trong điều trị HIV/AIDS là: + Phòng chống HIV/AIDS bằng cách ức chế hoạt động của gen của HIV, hoặc làm biến đổi gen của HIV: Theo hướng liệu pháp này là thiết kế vector mang gen liệu pháp đưa vào tế bào, cơ thể người bị nhiễm HIV nhằm phục hồi hệ thống miễn dịch nhưng lại không gây phản ứng phụ bất lợi cho người bệnh. Các vector liệu pháp sử dụng để phòng chống HIV/AIDS là andenovirus, AAV, oligonucletit, liposom v.v... Vector AAV đựơc gắn một gen liệu pháp nhằm hạn chế sự sao chép, nhân bản của HIV. Vector adenovirus có gắn 2 gen của HIV đã bị biến đổi như gen gag, tpa và một số gen của adenovirus đã bị biến đổi là gen Ad5 tạo ra vector Ad5Flag, hoặc vector Ad5tpagag. Khi đưa các vector này vào tế bào lây nhiễm HIV thì khả năng lây nhiễm HIV giảm đi. Hy vọng sẽ có ứng dụng trên người. Một số vector khác như pCMVA9 (gen virus HIV1 cắt bớt một một số gen, cài thêm promotor hCMV và tín hiệu đóng gói SD), hoặc vector HIV chuyển dịch (mang gen GA, RRE và promotor hCMV) đã góp phần ngăn cản sự sao chép, nhân bản của HIV. Bên cạnh đó còn một số vector liệu pháp khác như: các oligo-antisens, ribozym,... đang đựơc thử nghiệm nhằm hạn chế sự xâm nhiễm, hạn chế khả năng sao chéo, nhân bản của HIV. + Phòng chống HIV/AIDS bằng tăng cường miễn dịch tế bào: Theo hướng này, người ta sử dụng các gen đột biến Rev10, gen tăng cường hoạt động của gen cytokin, hoặc sử dụng các gen tự tử và gen độc tố (toxic gene).  Sử dụng vector oligonucleotit mang gen Rev10 chuyển vào tế bào lympho TCD4 đã kìm hãm được sự xâm nhiễm của HIV. Cũng có thể sử dụng liệu pháp gen tăng cường hoạt động của các gen cytokin tổng hợp các protein đáp ứng miễn dịch. Cytokin có nhiều loại khác nhau, trong đó các interferon (IFNα, IFNβ và IFNγ ) là quan trọng nhất. Interferon ngăn cản sự xâm nhiễm của các loại virus trong đó có HIV. Cytokin đựơc tổng hợp chủ yếu từ tế bào lympho T, trong đó có nhóm interleukin (IL1, IL2, ..., IL13) mà chủ yếu là interleukin IL2 có tác dụng kích thích tăng sinh của tế bào lympho TCD4 , đồng thời khống chế sự sao chép, nhân bản của HIV. Sử dụng các gen tự sát (Suicide gene) và gen độc tố đưa vào tế bào mới bị xâm nhiễm HIV cũng là liệu pháp gen để phòng chống HIV. Gen tự tử đưa vào tế bào bị HIV xâm nhiễm làm ức chế hoạt động của enzym sao chép ADN polymerase trong tế bào, làm cho sự sao chép DNA của tế bào bị gián đoạn, tế bào co lại và chết. Do vậy HIV không có khả năng lây nhiễm sang tế bào thường khác. Việc sử dụng gen độc tố mới chỉ có những thử nghiệm ban đầu chưa có kết quả đáng kể. Hình 25. Liệu pháp gen tự sát. (a) Vector adenovirus (AdV) phân phối gen Herpes simplex thymidine kinase (TK) tới tế bào đích của nó. (b) Sự biểu hiện của thuốc chống virus ganciclovir (GCV). (c) GCV-P có thể chuyển đến ngay sát các tế bào xuyên qua khe hở nơi (d) các enzim kinases của động vật có thể gắn thêm 2 phosphates tạo thành trinucleotide (GCV-P-P-P). (e) GCV-P-P-P có thể hợp nhất vào DNA; tuy nhiên, DNA polymerases không tái bản DNA chứa GCV-P-P-P. Sự phân bào bị gián đoạn và các tế bào chết. Vì GCV-P có thể chuyển tới các tế bào gần kề nên không cần chuyển gen tới tất cả các tế bào bởi vector virus và gọi là hiệu ứng ngoài. IV. VẤN ĐỀ AN TOÀN VÀ TRIỂN VỌNG CỦA LIỆU PHÁP GEN Vấn đế an toàn : Liệu pháp gen là trường hợp đặc biệt của chuyển gen liên quan trực tiếp đến tính mạng cong người , vì vậy cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy định của quốc tế , quốc gia để giảm thiểu rủi ro. Các rủi ro trong liệu pháp gen : - Gắn sai vị trí , gây đột biến gen - Gen mới đưa vào không nằm trong phức hợp điều hòa nên có thể được biểu hiện một cách tùy tiện , không đúng nơi ( đúng với loại tế bào , mộ đặc hiệu ) và không đúng lúc ( đúng với chu trình phát triển của cá thể ) , hoặc thậm chí không được biểu hiện. - Một số loại vectơ liệp pháp khi đưa vào cơ thể người như adenovirus, retrovirus . . . có thể biến đổi trở thành tác nhân gây bệnh , sự hiểu biết về cơ chế gây bệnh của một số gen đột biến vẫn chưa đầy đủ. Liệu pháp gen được giới hạn chặt chẽ trên tế bào sinh dưỡng. Việc tác động vào gen của tế bào sinh dục bị nghiêm cấm vì l‎í do đạo đức . Kỹ thuật sử dụng trong liệu pháp gen phức tạp, đòi hỏi chính xác mà chỉ một số phòng thí nghiệm tiên tiến mới thực hiện được . Vì vậy , liệu pháp gen trong điều trị , chữa bệnh còn phải nghiên cứu và cải tiến hơn nữa thì mới có hiệu quả. Triển vọng của liệu pháp gen ở Việt Nam : - Trên thế giới , liệu pháp gen đã được nhiều nước tiên tiến thực hiện và đã nghiên cứu , điều trị cho nhiều bệnh nhân mắc các bệnh hiểm nghèo như bệnh suy giảm miễn dịch tổ hợp trầm trọng , điều trị ung thư , thiếu máu hình liềm, bệnh xơ gang và hạn chế HIV/AIDS. - Ở Việt Nam hiện đã có một số nghiên cứu điều trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch như nghiên cứu và sản xuất interferon, interleukin để điều trị ung thư. Một số cơ sở nghiên cứu đã sản xuất được vaccine viêm gan tái tổ hợp để phòng chống bệnh viêm gan. C. KẾT LUẬN Từ các trình bày trên có thể thấy rằng, hiện nay có rất nhiều cách và phương thức để chuyển gen đích tới các tế bào nhằm thu được hiệu quả của liệu pháp. Tuy nhiên chúng ta cần nghiên cứu kỹ lưỡng các hiệu ứng phụ cũng như các tác động của nó tới thông tin di truyền cuả người và các khía cạnh đạo đức, xã hội khác. Song cũng cần phải nhắc lại rằng “Không hệ thống véctơ nào là tối ưu cho tất cả các kỹ thuật của liệu pháp gen”, do đó cần lựa chọn một cách chính xác nhất dự trên hiệu quả của vector đối với nhóm bệnh mà mình nghiên cứu. Mặt khác, liệu pháp gen đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong chữa bệnh, phục hồi cấu tạo và chức năng các bộ phận cơ thể, được dùng để tạo ra những cơ quan nhân tạo thay thế cho con người. Một lượng lớn các phác thảo liệu pháp gen điều trị các loại bệnh ngày nay đang được tiến hành. Kinh nghiệm thu được từ các thử nghiệm y học này sẽ có ích trong sự phát triển của liệu pháp gen điều trị các loại bệnh ở người như HIV, ung thư... Đây là lí do để hy vọng liệu pháp gen trong các năm tới sẽ giữ vai trò quyết định trong việc điều trị bệnh của con người. TÀI LIỆU THAM KHẢO ADDIN EN.REFLIST  1. TS. Khuất Hữu Thanh 1,TS. Khuất Hữu Thanh 2: Liệu pháp gen - Nguyên lý và ứng dụng. 2. Phạm Thành Hổ, 2005. Nhập môn Công nghệ sinh học. Nxb Giáo dục 3. J. T. Douglas: Cancer gene therapy. Technol Cancer Res Treat 2003, 2(1):51-64. 4. Trịnh Đình Đạt: Công nghệ sinh học - Tập 4: Công nghệ di truyền. 2008. 5. Jim Wilson - 29/4/2001 - Người dịch: Nguyễn Tấn Anh: Liệu pháp gen.