Luận án Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano nhằm tăng sinh khả dụng của curcumin dùng theo đường uống (Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Dương Thị Hồng Ánh NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO NHẰM TĂNG SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN DÙNG THEO ĐƯỜNG UỐNG Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc Mã số: 62720402 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2017 Công trình được hoàn thành tại - Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội - Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội - Trung tâm Tương đương sinh học, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương - Khoa hóa học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội - Viện tiên tiến Khoa học và công nghệ, Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Trần Linh PGS.TS. Nguyễn Văn Long Phản biện 1:... ... Phản biện 2:... ... Phản biện 3:... ... Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại Vào hồi.. giờngày.tháng.năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ANOVA : Analysis of variance (Phân tích phương sai) AUC : The area under the curve (Diện tích dưới đường cong) BCS : Biopharmaceutics Classification System (Hệ thống phân loại Sinh dược học) Cmax : Maximum concentration (Nồng độ thuốc tối đa) CMC : Carboxy methylcellulose Cre : Cremophor RH40 CUR : Curcumin DC : Dược chất EMA : European Medicines Agency (Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu) FDA : Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thuốc thực phẩm) GBC : Glibenclamid GTTB : Giá trị trung bình HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HQC : High quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ cao) IS : Internal standard (Chất chuẩn nội) KTTP : Kích thước tiểu phân KTTPTB : Kích thước tiểu phân trung bình kl/kl : Khối lượng/khối lượng kl/tt : Khối lượng/thể tích LC-MS : Liquid chromatography-Mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ) LC-MS/MS : Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ/khối phổ) LLOQ : Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới) LQC : Low quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ thấp) LSD : Least Significant Difference Test (Kiểm định sự khác nhau có ý nghĩa thống kê tối thiểu) MF : Matrix factor (Hệ số ảnh hưởng của nền mẫu) MQC : Medium quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình) MRT : Mean residence time (Thời gian lưu thuốc trung bình) Na CMC : Natri carboxy methylcellulose PDI : Polydispersity index (Chỉ số đa phân tán) PEG : Polyethylen glycol P-gp : P-glycoprotein PLGA : Poly (acid lactic co-glycolic) Pol : Poloxame PVA : Alcol polyvinic PVP : Poly vinylpyrolidon RSD : Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) SD : Standard deviation (Độ lệch chuẩn) SE : Standard error (Sai số chuẩn) SEM : Scanning Electron Microscope (Kính hiển vi điện tử quét) SKD : Sinh khả dụng SQC : Supplement quality control (Mẫu kiểm tra bổ sung) TBME : Tert-butyl methylether THC : Tetrahydrocurcumin Tmax : Time of maximum plasma drug concentration (Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa) TPGS : D-alpha-tocopheryl poly (ethylen glycol) succinat 1000 tt/tt : Thể tích/thể tích t1/2 : Thời gian bán thải tR : Thời gian lưu Tw : Tween ULOQ : Upper Limit of Quantification (Giới hạn định lượng trên) US-FDA : The United States-Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc Mỹ) 1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án Curcumin là một thành phần hoạt tính có trong thân rễ một số loài nghệ, đặc biệt là Nghệ vàng (Curcuma longa L.). Hợp chất này có nhiều tác dụng dược lý nhưng ít tan và bị chuyển hóa, thải trừ nhanh khi dùng đường uống. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã đề cập đến một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng của curcumin dùng đường uống theo nhiều hướng: tăng độ tan và độ hòa tan của curcumin hoặc làm giảm chuyển hóa, thải trừ của curcumin. Để đạt được những mục tiêu trên, curcumin có thể được bào chế dưới dạng hệ phân tán rắn, hệ nano tinh thể, hệ tiểu phân nano polyme, hệ tiểu phân nano lipid rắn, hệ micel chất diện hoạt, hệ tự nhũ hóa, phức hợp phospholipid, liposome Trong số các biện pháp trên, bào chế dưới dạng hệ tiểu phân nano được coi là biện pháp làm tăng độ tan và độ hòa tan của curcumin, hướng tới cải thiện sinh khả dụng đường uống của curcumin một cách hiệu quả. Hệ tiểu phân nano có thể dễ dàng ứng dụng vào các dạng thuốc rắn dùng đường uống. Tại Việt Nam, một số chế phẩm chứa nano curcumin trên thị trường đang được quảng cáo quá mức cần thiết. Trong đó, các đặc tính của tiểu phân nano và khả năng hấp thu của curcumin vẫn còn nhiều vấn đề chưa rõ ràng. Do đó, việc tiến hành một nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano mang tính khoa học, trong đó đánh giá được khả năng hấp thu của curcumin dùng đường uống là vấn đề cấp thiết. Mục tiêu của luận án - Xây dựng được công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano chứa curcumin. 2 - Đánh giá được sinh khả dụng của hệ tiểu phân nano curcumin trên chuột thí nghiệm. Những đóng góp mới của luận án - Đã nghiên cứu xây dựng được công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcumin bằng phương pháp giảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn. Phương pháp bào chế đơn giản, dễ dàng áp dụng, có thể ứng dụng trong điều kiện thực tiễn ở Việt Nam. - Đã xây dựng được mô hình đánh giá SKD của bột phun sấy chứa hệ tiểu phân nano curcumin dùng đường uống trên chuột thí nghiệm. Mô hình đánh giá này khả thi và có thể áp dụng cho các nghiên cứu đánh giá SKD đường uống của hệ tiểu phân nano. Phương pháp đánh giá SKD dựa trên việc định lượng đồng thời chất gốc curcumin và chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột bằng kỹ thuật LC-MS/MS lần đầu tiên được xây dựng và thẩm định tại Việt Nam. Kết quả của phương pháp phân tích có thể ứng dụng trong các nghiên cứu dược động học của curcumin trên động vật thí nghiệm, tạo tiền đề cho các nghiên cứu dược động học của curcumin trên người. Dựa trên kết quả thực nghiệm của mô hình này, có thể kết luận hệ tiểu phân nano bào chế được đã cải thiện sinh khả dụng đường uống của curcumin do làm tăng độ tan, tốc độ hòa tan và tính thấm của curcumin. Đồng thời, nghiên cứu đã xác định được hằng số tốc độ chuyển hóa của chất gốc curcumin sang chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trên chuột thí nghiệm dựa trên mô hình dược động học quần thể một ngăn có chuyển hóa. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 150 trang không kể tài liệu tham khảo và phụ lục, 66 bảng, 36 hình, 115 tài liệu tham khảo. Bố cục gồm: Đặt vấn đề (1 3 trang); Tổng quan (29 trang); Nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu (25 trang); Kết quả nghiên cứu (66 trang); Bàn luận (28 trang); Kết luận và đề xuất (1 trang); Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (13 trang); Phụ lục (56 trang). Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. CURCUMIN 1.1.1. Nguồn gốc Curcumin có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp. 1.1.2. Công thức 1.1.3. Tính chất lý hóa  Đặc tính vật lý: bột kết tinh hoặc vô định hình màu vàng, ít tan trong nước, tan một phần trong methanol, tan tốt trong aceton, dimethylsulfoxid, ethanol.  Đặc tính hóa học: tính acid, pKa của curcumin lần lượt là 7,8, 8,5 và 9,0. 1.1.4. Độ ổn định Curcumin kém ổn định trong môi trường kiềm và không bền khi tiếp xúc với ánh sáng. 1.1.5. Định tính và định lượng Curcumin có thể được định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng dựa theo chuyên luận “Curcuminoids” của Dược điển Mỹ USP Công thức phân tử: C21H20O6 Khối lượng phân tử: 368,38 Tên khoa học: 1,7-bis (4– hydroxy– 3-methoxyphenyl) - 1,6– heptadien-3,5-dion Hình 1.1. Công thức cấu tạo của curcumin 4 39 hoặc HPLC. Hàm lượng curcumin trong các chế phẩm được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis hoặc HPLC. 1.1.6. Tác dụng dược lý Curcumin có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, chống ung bướu, hỗ trợ điều trị bệnh ung thư, thần kinh, tim mạch, bệnh phổi... 1.1.7. Sinh khả dụng Sinh khả dụng của curcumin thấp do ít tan, tốc độ hòa tan chậm, bị phân hủy trong môi trường sinh lý của hệ thống dạ dày ruột, tốc độ chuyển hóa và thải trừ nhanh. Sản phẩm của quá trình chuyển hóa có thể là tetrahydrocurcumin và một số dạng liên hợp glucuronid, sulfat của curcumin và tetrahydrocurrumin. 1.2. MỘT SỐ BIỆN PHÁP CẢI THIỆN SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN DÙNG ĐƯỜNG UỐNG 1.2.1. Biện pháp làm tăng độ tan và tốc độ hòa tan của curcumin Để cải thiện độ tan và tốc độ hòa tan của curcumin, các công trình nghiên cứu đã đề cập đến các biện pháp bào chế hệ nano tinh thể, hệ phân tán rắn, hệ micel, hệ vi nhũ tương, nhũ tương nano, hệ tự nhũ hóa hoặc dạng liên hợp. 1.2.2. Biện pháp làm giảm chuyển hóa và thải trừ của curcumin Với mục đích làm giảm chuyển hóa và thải trừ của curcumin có thể bào chế hệ nano chứa chất mang nhằm cải thiện độ ổn định, kéo dài thời gian lưu trong đường tiêu hóa và giảm sự thải trừ nhanh khỏi cơ thể. Một số hệ nano chứa chất mang được nghiên cứu để cải thiện SKD của curcumin như hệ nano polyme, hệ nano lipid, phức hợp phospholipid, liposome, hệ tiểu phân nano cubosome. Ngoài ra, việc phối hợp curcumin với các chất ức chế chuyển hóa như piperin, quercetin hoặc silibinin cũng là một giải pháp làm giảm chuyển hóa 5 curcumin. Nguyên nhân do các chất này ức chế không hoạt tính quá trình glucuronid ở gan và ruột. 1.3. MỘT SỐ MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN Để đánh giá SKD in vitro của curcumin, có thể sử dụng phương pháp đánh giá giải phóng trực tiếp trong môi trường, đánh giá giải phóng qua túi thẩm tích hoặc đánh giá tính thấm qua màng tế bào Caco-2. Một số nghiên cứu về SKD của curcumin sử dụng phương pháp nghiên cứu ex vivo để đánh giá hấp thu của curcumin trên ruột cô lập hoặc dùng mô hình in situ để nghiên cứu cơ thế thấm hoặc khuếch tán qua màng tế bào ruột. Ngoài ra, SKD đường uống của hệ tiểu phân nano được đánh giá sử dụng mô hình nghiên cứu in vivo bằng cách định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương chuột nhắt sau khi uống. Đây cũng là phương pháp được chọn để đánh giá SKD của hệ tiểu phân nano chứa curcumin. Chương 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên vật liệu Nguyên liệu, hóa chất, tá dược sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn DĐVN IV, BP, USP, tinh khiết phân tích hoặc dùng cho HPLC và LC-MS/MS. 2.1.2. Thiết bị Sử dụng các thiết bị bào chế và đánh giá thường quy như: máy nghiền bi Retsch MM200, thiết bị đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn Unidrive X1000, máy phun sấy Buchi mini spray dryer B-191, máy đo kích thước tiểu phân và xác định phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer Nano ZS90 Malvern, thiết bị quét nhiệt vi sai DSC 6 131, Setaram Instrumentation, thiết bị quét phổ nhiễu xạ tia X D8 Advance, Bruker axs, thiết bị thử độ hòa tan Erweka-DT, máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent HPLC 1260, máy sắc ký lỏng Acquity UPLC H-Class, kết hợp khối phổ Xevo TQD, Waters. 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: Thẩm định phương pháp định lượng; Nghiên cứu tiền công thức; Nghiên cứu bào chế và đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano curcumin; Nghiên cứu ảnh hưởng khi nâng quy mô bào chế đến đặc tính của hệ tiểu phân nano curcumin; Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở và theo dõi độ ổn định của hệ tiểu phân nano curcumin; Đánh giá SKD của hệ tiểu phân nano curcumin trên chuột thí nghiệm. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Thẩm định phương pháp định lượng 2.3.1.1. Thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis: Xác định bước sóng cực đại hấp thụ, xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ curcumin. 2.3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Phương pháp HPLC được lựa chọn với các điều kiện sắc ký: cột sắc ký AQ – C18 250 x 4,6 mm, hạt nhồi 5 µm. Pha động: acetonitril: dung dịch acid acetic 2% (kl/tt) (58:42), lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm. Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. Detector UV-Vis phát hiện ở bước sóng 430 nm. Thẩm định phương pháp định lượng curcumin dựa trên các chỉ tiêu: tính thích hợp, tính chọn lọc-độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng và độ chính xác. 7 2.3.1.3. Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời curcumin và chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột Xử lý mẫu: Thêm 10 l dung dịch chuẩn nội (glibenclamid) vào ống nghiệm chứa 100 l huyết tương. Chiết bằng dung môi tert-butyl methyl ether (TBME). Ly tâm, lấy lớp dịch trong phía trên. Cô bay hơi dung môi và hòa tan cắn trong 100 l pha động. Định lượng CUR và THC bằng phương pháp LC-MS/MS. Quy trình thẩm định phương pháp định lượng: tiến hành theo hướng dẫn của FDA và EMA dựa trên các tiêu chí: độ thích hợp, độ đặc hiệu-chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ lặp lại, tỷ lệ thu hồi, ảnh hưởng của nền mẫu, nhiễm chéo và độ ổn định. 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tiền công thức (Preformulation) 2.3.2.1. Nghiên cứu tính chất của dược chất a. Đánh giá hình thái và kích thước tiểu phân: sử dụng kính hiển vi điện tử quét b. Xác định kích thước tiểu phân trung bình và khoảng phân bố kích thước tiểu phân: sử dụng thiết bị Mastersizer 3000E c. Phương pháp xác định diện tích bề mặt và độ xốp: dựa trên sự hấp phụ khí nitrogen theo thuyết hấp phụ Brunauer-Emmet-Teller d. Phương pháp nhiễu xạ tia X e. Phương pháp giản đồ nhiệt vi sai f. Phương pháp đo phổ hồng ngoại g. Phương pháp định lượng Hàm lượng curcumin trong nguyên liệu được định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis hoặc HPLC. h. Phương pháp đánh giá độ tan của curcumin 8 Phân tán vào mỗi bình nón có nút mài khoảng 0,1 g curcumin trong 100 ml nước tinh khiết. Khuấy từ liên tục trong 24 giờ tại nhiệt độ 25 ± 2oC. Hút dung dịch thử, lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 5 µm, ly tâm 10 phút với tốc độ 12000 vòng/phút, lấy phần dịch trong, lọc 2 lần qua màng lọc cellulose acetat kích thước lỗ lọc 0,2 µm. Định lượng curcumin bằng phương pháp LC-MS/MS. i. Phương pháp đánh giá độ hòa tan của curcumin Sử dụng thiết bị cánh khuấy với tốc độ quay 100 vòng/phút, môi trường hòa tan 900 ml nước chứa 0,2% Tween 80, nhiệt độ 37 ± 0,5oC, khối lượng mẫu thử tương ứng với 5,0 mg curcumin. Sau các khoảng thời gian 10, 20, 30, 40, 50 và 60 phút, lấy khoảng 10 ml dung dịch thử, ly tâm 5 phút với tốc độ 12000 vòng/phút. Phần dịch trong được định lượng curcumin bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis ở bước sóng 427 nm. Sau khi đo quang, rót toàn bộ phần cắn và phần dịch ly tâm vào cốc thử độ hòa tan. 2.3.2.2. Nghiên cứu độ ổn định hóa học của curcumin ở trạng thái rắn Các mẫu nguyên liệu curcumin được đóng trong lọ thủy tinh ở trạng thái lọ mở hoặc đóng nắp và theo dõi ở các điều kiện khắc nhiệt: điều kiện ẩm và nhiệt trong 14 ngày (độ ẩm 75 ± 5%, nhiệt độ 40 ± 2oC); điều kiện độ ẩm cao 90%, nhiệt độ phòng trong 7 ngày; điều kiện nhiệt khô 60oC trong 7 ngày và tác động cơ học bằng cách nghiền bi inox 6 giờ. Đánh giá thay đổi hình thức bên ngoài bằng cảm quan và xác định lại hàm lượng curcumin bằng phương pháp HPLC. 9 2.3.2.3. Nghiên cứu tương tác dược chất-tá dược Phối hợp dược chất và một trong các tá dược Tween 80, Tween 60, Cremophor RH40, Poloxame 188, PVP, PVA, manitol, Trehalose, lactose, CMC, Na CMC và nước theo tỷ lệ nhất định để tạo bột nhão hoặc hỗn hợp vật lý và đóng vào các lọ thủy tinh. Bảo quản ở nhiệt độ 40 ± 2oC và độ ẩm 75 ± 5% trong 1 tháng, ở trạng thái lọ mở và đóng nắp (đậy nút cao su, chụp nắp nhôm). Sau thời gian theo dõi, đánh giá thay đổi về hình thức và hàm lượng curcumin bằng phương pháp HPLC. 2.3.3. Bào chế hệ tiểu phân nano 2.3.3.1. Phương pháp bào chế Bào chế hỗn dịch nano curcumin Quy trình A (áp dụng với mẻ 1 g) Ngâm trương nở hoặc hòa tan polyme trong 25 ml nước tạo dung dịch. Nghiền mịn curcumin bằng thiết bị nghiền bi inox, kích thước bi 20 mm, mỗi mẻ 1 g trong một buồng nghiền, thời gian nghiền 60 phút ở tần số 25 Hz. Phối hợp chất diện hoạt và nghiền ướt tạo hỗn dịch đặc bằng chày cối, thời gian nghiền 15 phút. Kéo từ từ hỗn dịch đặc bằng dung dịch polyme để tạo hỗn dịch curcumin. Đồng nhất hóa hỗn dịch nhờ lực phân cắt lớn với tốc độ 18000 vòng/phút trong thời gian 15 phút tạo hỗn dịch nano. Quy trình B (áp dụng với mẻ 5 g) Hòa tan polyme trong 10 ml nước nóng tạo dung dịch. Phối hợp với chất diện hoạt. Nghiền mịn curcumin bằng thiết bị nghiền bi inox, kích thước bi 20 mm, mỗi mẻ 5 g trong một buồng nghiền, thời gian nghiền 60 phút ở tần số 15 hoặc 30 Hz. Phối hợp chất diện hoạt và dung dịch polyme, nghiền ướt bằng buồng nghiền chứa 25 g bi zirconi oxyd, kích thước bi 0,65 hoặc 0,8 mm, mỗi buồng nghiền 10 chứa 5 g DC, tần số nghiền 30 Hz. Pha loãng hỗn dịch đặc bằng 100 ml nước tinh khiết. Lọc loại bi qua rây 300. Đồng nhất hóa hỗn dịch nhờ lực phân cắt lớn với tốc độ 18000 vòng/phút trong thời gian 60 phút tạo hỗn dịch nano. Bào chế hệ tiểu phân nano curcumin dạng bột phun sấy Đối với mẻ 1 g, tiến hành phun sấy hỗn dịch nano. Đối với mẻ 5 g, hòa tan chất mang thân nước vào 15 ml nước còn lại, phối hợp với hỗn dịch nano và tiến hành phun sấy với các thông số: nhiệt độ đầu vào 96oC, tốc độ cấp dịch 2 ml/phút và tỷ lệ thông gió 99%. 2.3.3.2. Kiểm soát các thông số trong quá trình bào chế Nghiên cứu được tiến hành với 3 mẻ liên tiếp ở quy mô 5 g/mẻ, khảo sát ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật trọng yếu như thời gian và tần số nghiền trong giai đoạn nghiền khô và nghiền ướt, tốc độ và thời gian khuấy trong giai đoạn đồng nhất hóa. 2.3.3.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano curcumin Hệ tiểu phân nano curcumin được đánh giá hình thái, diện tích bề mặt, độ xốp, phổ nhiễu xạ tia X, quét nhiệt vi sai, phổ hồng ngoại, hàm lượng curcumin, độ tan và độ hòa tan tương tự như đối với nguyên liệu curcumin. Kích thước tiểu phân trung bình, hệ số đa phân tán, thế Zeta được xác định bằng thiết bị Zetasizer ZS90 Malvern. Mất khối lượng do làm khô được xác định bằng cân xác định mất khối lượng do làm khô. Xác định khối lượng riêng biểu kiến và hiệu suất của quá trình bào chế. 2.3.3.4. Phương pháp thiết kế thí nghiệm, đánh giá ảnh hưởng của thành phần công thức, thông số quy trình và tối ưu hóa Sử dụng phần mềm MODDE 8.0, FormRules 2.0 và INForm 3.1. 11 2.3.3.5. Phương pháp phân tích thống kê Sử dụng phần mềm thống kê SPSS (IBM SPSS Statistics 20). 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu độ ổn định Việc khảo sát độ ổn định được thực hiện dựa theo quy định của ASEAN với một số điều chỉnh. Đối tượng thử là 3 mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin được đóng vào nang số 1 bằng cách cân thủ công, không dùng tá dược độn, ép vỉ nhôm-nhôm và đựng trong hộp giấy. Hàm lượng curcumin trong một nang là 40 mg. Mẫu được bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm (15-35oC, 60-90%) hoặc lão hóa cấp tốc (40 ± 2oC, 75 ± 5%). Sau mỗi 3, 6 và 9 tháng, lấy mẫu bột phun sấy từ các viên nang và đánh giá các chỉ tiêu: hình thái tiểu phân, KTTPTB, PDI, nhiễu xạ tia X, hàm lượng curcumin so với ban đầu, mất khối lượng do làm khô và độ hòa tan. 2.3.5. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo trên chuột thí nghiệm Chuẩn bị hai nhóm chuột, mỗi nhóm 78 chuột có khối lượng 20- 35 g, trong đó nhóm 1 uống hỗn dịch quy ước và nhóm 2 uống hỗn dịch nano. Chuột được cho uống thuốc bằng bơm tiêm có kim đầu tù với thể tích hỗn dịch được hiệu chỉnh theo khối lượng từng chuột. Mỗi chuột chỉ lấy máu một lần tại một thời điểm và mỗi thời điểm lấy máu trên 6 chuột. Máu được lấy từ vùng tĩnh mạch hốc mắt chuột và cho vào ống nghiệm chứa 10 l chất chống đông heparin. Ly tâm và tách lấy phần huyết tương. Xử lý mẫu và phân tích CUR và THC bằng phương pháp LC-MS/MS. Các thông số dược động học được tính toán theo phương pháp không dựa trên mô hình ngăn, lấy mẫu “rải rác” (sparse sampling), sử dụng phần mềm Phoenix WinNonLin 7.0 và dựa trên mô hình 12 dược động học quần thể một ngăn có chuyển hóa, sử dụng phần mềm Phoenix NLME 7.0. Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 3.1.1. Kết quả khảo sát phương pháp định lượng curcumin bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis Kết quả khảo sát cho thấy: có sự phụ thuộc tuyến tính giữa mật độ quang và nồng độ curcumin tại bước sóng 427 nm trong khoảng nồng độ đã khảo sát với hệ số tương quan r ≈ 1. Như vậy, trong trường hợp nhằm sơ bộ xác định độ hòa tan, có thể sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis để định lượng curcumin trong mẫu nghiên cứu. 3.1.2. Kết quả khảo sát thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Kết quả thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng HPLC cho thấy phương pháp có tính thích hợp và độ đặc hiệu đối với curcumin. Trong khoảng nồng độ khảo sát có tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ curcumin. Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp có độ đúng cao với phần trăm tìm lại nằm trong khoảng 98,0-102,0%, RSD nhỏ hơn 2%. Đồng thời, độ chính xác với RSD nhỏ hơn 2%. Như vậy, có thể sử dụng phương pháp HPLC trong phân tích hàm lượng curcumin và nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm chứa curcumin. 3.1.3. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng đồng thời curcumin và chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột Trong huyết tương chuột, phương pháp định lượng đồng thời curcumin và chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin bằng LC-MS/MS 13 có độ thích hợp, độ đặc hiệu-chọn lọc, khoảng tuyến tính (0,5-500 ng/ml), giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ lặp lại, tỷ lệ thu hồi, ảnh hưởng của nền mẫu, nhiễm chéo và độ ổn định đáp ứng các yêu cầu của một phương pháp phân tích dùng trong sinh học. 3.2. NGHIÊN CỨU TIỀN CÔNG THỨC 3.2.1. Kết quả nghiên cứu tính chất của dược chất Curcumin có KTTPTB ban đầu khá lớn (18,07 ± 1,34 m), khoảng phân bố KTTP rộng (Span 2,404 ± 0,453), tồn tại ở trạng thái kết tinh với mật độ và cường độ pic trên phổ nhiễu xạ tia X lớn, ít tan trong nước (0,17 ± 0,04 g/ml) và độ hòa tan kém. Do đó, để cải thiện SKD của curcumin, có thể sử dụng biện pháp cải thiện độ tan và độ hòa tan bằng kỹ thuật bào chế hệ tiểu phân nano. 3.2.2. Kết quả nghiên cứu độ ổn định hóa học của dược chất ở trạng thái rắn Trong các điều kiện khắc nghiệt về nhiệt khô và tác động cơ học bằng cách nghiền bi inox, hình thức và hàm lượng curcumin còn lại sau thời gian theo dõi 1 tháng không có sự thay đổi đáng kể. Tuy nhiên, trong điều kiện độ ẩm cao, curcumin dễ bị hút ẩm. 3.2.3. Kết quả nghiên cứu tương tác dược chất-tá dược Trong điều kiện tiến hành thực nghiệm, sau 1 tháng theo dõi, chưa có tương kỵ nào giữa DC và tá dược Tween 80, Tween 60, Cremophor RH40, Poloxame 188, PVP, PVA, manitol, Trehalose, lactose, CMC và Na CMC. 3.3. NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO 3.3.1. Xây dựng công thức bào chế hỗn dịch nano curcumin Hỗn dịch nano curcumin được bào chế với thành phần curcumin 1 g, sử dụng các chất diện hoạt khác nhau bao gồm Tween 80, Tween 60, Cremophor RH40 và Poloxame 188 với tỷ lệ khối lượng chất 14 diện hoạt/curcumin là 10%. Hỗn dịch nano sử dụng Tween 80 với tỷ lệ khối lượng Tween 80/curcumin là 10% được chọn vì có có KTTPTB nhỏ nhất (269,0 ± 34,57 nm), PDI 0,34 ± 0,09. Kết quả khảo sát các mẫu hỗn dịch nano bào chế với tỷ lệ Tween 80/curcumin khác nhau cho thấy, tỷ lệ Tween 80/curcumin được khảo sát trong khoảng từ 5-15%. Hỗn dịch nano curcumin được tiến hành bào chế phối hợp với các polyme thân nước khác nhau như PVP, Na CMC hoặc PVA. Kết quả đánh giá KTTPTB cho thấy: hỗn dịch nano sử dụng Na CMC có KTTPTB cao hơn so với hai mẫu sử dụng PVP và PVA. Nghiên cứu đã lựa chọn PVP trong thành phần hỗn dịch với tỷ lệ khối lượng PVP được khảo sát trong khoảng từ 10- 100% so với khối lượng curcumin. 3.3.2. Xác định một số thông số trong quy trình bào chế hỗn dịch nano Kết quả khảo sát đã lựa chọn tốc độ đồng nhất hóa 18000 vòng/phút trong thời gian 15 phút. 3.3.3. Xác định một số thông số trong quy trình bào chế bột phun sấy chứa nano Nhiệt độ khí vào được khảo sát trong khoảng 70-100oC và tốc độ phun dịch được khảo sát trong khoảng 1-5 ml/phút. 3.3.4. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức và thông số trong quy trình bào chế đến đặc tính của tiểu phân nano 3.3.4.1. Thiết kế thí nghiệm Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm theo thiết kế hợp tử tại tâm, với 4 biến đầu vào (tỷ lệ Tween 80/curcumin 5- 15%, tỷ lệ PVP/curcumin 10-100%, tốc độ phun dịch 1-5 ml/phút, nhiệt độ khí vào 70-100oC) và các biến đầu ra bao gồm: hiệu suất, 15 KTTPTB, PDI, phần trăm curcumin hòa tan tại các thời điểm 10, 20, 30, 40, 50 và 60 phút. Kết quả thiết kế thí nghiệm cho 23 thí nghiệm và 3 thí nghiệm bổ sung. 3.3.4.2. Phân tích các yếu tố thuộc về công thức và thông số trong quy trình bào chế ảnh hưởng đến đặc tính của hệ tiểu phân nano Mối quan hệ nhân quả giữa các biến độc lập (tỷ lệ Tween 80/curcumin, tỷ lệ PVP/curcumin, nhiệt độ khí vào và tốc độ phun dịch) và các biến phụ thuộc (hiệu suất, KTTPTB, PDI và độ hòa tan) được xử lý bằng phần mềm FormRules 2.0. Nếu nhiệt độ khí vào cao trên 88oC, tăng tỷ lệ Tween 80/curcumin trên 10%, KTTPTB của hệ tiểu phân nano curcumin có xu hướng giảm dần. Khi tăng đồng thời tỷ lệ khối lượng Tween 80 và PVP so với curcumin, hệ số đa phân tán giảm. Khi tỷ lệ Tween 80/curcumin trên 10%, nếu tỷ lệ PVP/curcumin trên 60%, phần trăm curcumin hòa tan sau 10 phút tăng mạnh. Khi nhiệt độ khí vào thấp (từ 70 đến 82oC), tốc độ phun dịch ảnh hưởng không đáng kể đến hiệu suất quá trình phun sấy. Nếu nhiệt độ khí vào cao (trên 82oC), nếu tốc độ phun dịch tăng từ 1,8 đến 3 ml/phút, hiệu suất quá trình phun sấy tăng. Do vậy, khi tiến hành phun sấy, cần lựa chọn nhiệt độ khí vào tương đối cao và tốc độ phun dịch vừa phải (2-3 ml/phút). 3.3.5. Tối ưu hóa công thức và một số thông số trong quy trình bào chế Qua kết quả xử lý của phần mềm INForm 3.1, công thức tối ưu được lựa chọn với các thành phần gồm curcumin 1,00 g, Tween 80 0,12 g, PVP K30 0,75 g và nước tinh khiết 25 ml. Các thông số được lựa chọn từ phần mềm tối ưu hóa bao gồm: nhiệt độ khí vào 96oC và tốc độ phun dịch 2 ml/phút. 16 Hệ tiểu phân nano curcumin bào chế theo công thức tối ưu có KTTPTB 223,1 ± 3,5 nm và PDI 0,326 ± 0,045. Hiệu suất 62,75%, mất khối lượng do làm khô 11,43%. Bột phun sấy chứa nano curcumin có độ hòa tan được cải thiện rõ rệt so với nguyên liệu ban đầu. 3.4. NGHIÊN CỨU NÂNG QUY MÔ BÀO CHẾ VÀ DỰ KIẾN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG 3.4.1. Xây dựng công thức bào chế tiểu phân nano curcumin ở quy mô 5 gam/mẻ Hỗn dịch nano được bào chế với tỷ lệ các thành phần tương tự mẻ 1 g nhưng bổ sung thêm chất mang manitol với tỷ lệ 50% về khối lượng so với curcumin. 3.4.2. Khảo sát các thông số trọng yếu, giai đoạn trọng yếu trong quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcumin quy mô 5 g/mẻ Bào chế hệ tiểu phân nano curcumin, khảo sát ảnh hưởng của các thông số trọng yếu. Kết quả nghiên cứu lựa chọn được tần số nghiền khô của thiết bị nghiền bi là 30Hz và thời gian nghiền 6 giờ (KTTPTB 8,79 ± 0,22 µm, Span 2,6 ± 0,2) trong buồng nghiền bi inox; quá trình nghiền ướt với bi zirconi oxyd kích thước 0,8 mm, thời gian 4 giờ ở tần số 30 Hz (KTTPTB 0,96 ± 0,11 µm, Span 2,67 ± 0,26) và giai đoạn đồng nhất hóa được tiến hành với tốc độ đồng nhất hóa 18000 vòng/phút trong 60 phút (KTTPTB 381,3 ± 22,4 nm, PDI 0,437 ± 0,033). 3.4.3. Đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano curcumin quy mô 5 g/mẻ 3.4.3.1. Hình thái học tiểu phân nano Các tinh thể curcumin phân tán vào trong cấu trúc hình cầu của PVP, tinh thể manitol tồn tại hỗn độn hoặc bám dính trên bề mặt tiểu 17 phân PVP (hình 3.19f). Sau khi rửa loại tá dược, KTTPTB của nano curcumin khoảng 300-500 nm và không có sự xuất hiện của tinh thể với các cạnh sắc và rõ như mẫu nguyên liệu ban đầu (hình 3.20). Hình 3.19f. Hình ảnh tiểu phân nano curcumin phun sấy Hình 3.20. Hình ảnh tiểu phân nano curcumin sau khi rửa loại tá dược 3.4.3.2. Kích thước tiểu phân và hệ số đa phân tán KTTPTB và PDI của 3 mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin lần lượt là: mẻ 1: KTTPTB 336,7 ± 18,6 nm, PDI 0,387 ± 0,032; mẻ 2: KTTPTB 359,5 ± 17,8 nm, PDI 0,416 ± 0,040; mẻ 3: KTTPTB 385,8 ± 22,4 nm, PDI 0,336 ± 0,027. 3.4.3.3. Diện tích bề mặt và độ xốp: Không xác định được 3.4.3.4. Phổ nhiễu xạ tia X và giản đồ quét nhiệt vi sai Y + 7 0 . 0 m m - F i le : N g u y e n l ie u C u rc u m i n . r a w - T y p e : 2 T h / T h lo c k e d - S t a r t : 1 . 0 0 0 ° - E n d : 6 4 . 9 3 0 ° - S t e p : 0 . 0 3 0 ° - S t e p t im e : 0 .3 s - T e m p .: 2 5 ° Y + 3 5 . 0 m m - F i le : H o n g A n h M a u t r a n g .r a w - T y p e : 2 T h / T h lo c k e d - S t a r t : 1 . 0 0 0 ° - E n d : 4 9 . 9 9 0 ° - S t e p : 0 . 0 3 0 ° - S t e p t im e : 0 . 3 s - T e m p . : 2 5 ° C ( F i l e : N a n o . r a w - T y p e : 2 T h /T h lo c k e d - S t a rt : 1 .0 1 3 ° - E n d : 4 9 . 8 6 5 ° - S t e p : 0 . 0 3 0 ° - S t e p t im e : 0 . 3 s - T e m p . : 2 5 ° C ( R o o m ) - T i m e S t a r t e d : 1 2 s - Li n ( C p s) 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 2 0 0 1 3 0 0 2 -T h e ta - S c a le 2 1 0 2 0 3 0 4 0 Nhiệt độ (oC) Hình 3.22. Giản đồ nhiệt vi sai của curcumin, một số tá dược và bột phun sấy chứa nano curcumin D òn g n h iệ t (m W ) CUR Mẫu trắng Bột PS chứa nano Góc nhiễu xạ 2- (o) Hình 3.21. Phổ nhiễu xạ tia X của mẫu curcumin, mẫu trắng phun sấy và bột phun sấy chứa nano curcumin 18 Mẫu nano curcumin có mật độ, cường độ pic đã giảm đi đáng kể so với mẫu nguyên liệu ban đầu (hình 3.21) và enthalpy nóng chảy của mẫu nano curcumin giảm xuống (hình 3.22), chứng tỏ mẫu nano curcumin đã chuyển một phần sang trạng thái vô định hình. 3.4.3.5. Phổ hồng ngoại của hệ tiểu phân nano Phổ hồng ngoại của hệ tiểu phân nano cho thấy có sự thay đổi về dao động hóa trị O-H tại số sóng 3502,73 cm-1, có thể do tương tác bởi liên kết hydro nội phân tử giữa curcumin và PVP. 3.4.3.6. Hiệu suất, mất khối lượng do làm khô và khối lượng riêng biểu kiến Ba mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin có hiệu suất đạt trên 60,0%; khối lượng riêng biểu kiến lần lượt là 0,329 ± 0,024, 0,350 ± 0,017 và 0,345 ± 0,009 g/ml; mất khối lượng do làm làm khô của 3 mẻ lần lượt là 9,35, 8,87 và 9,67%. 3.4.3.7. Hàm lượng curcumin Hàm lượng curcumin trong 3 mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis lần lượt là 42,29 ± 0,36, 41,49 ± 0,42, 41,62 ± 0,19%. Hàm lượng curcumin của 3 mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin được xác định bằng phương pháp HPLC lần lượt là 42,36 ± 0,24, 42,24 ± 0,13 và 41,82 ± 0,27%. 3.4.3.8. Độ tan Độ tan của curcumin từ 3 mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin lần lượt là 1,96 ± 0,08, 1,91 ± 0,12 và 1,98 ± 0,10 µg/ml. 3.4.3.9. Độ hòa tan Độ hòa tan của curcumin từ 3 mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin lần lượt: mẻ 1 (10 phút: 63,8 ± 2,4%, 20 phút: 78,8 ± 2,6%, 30 phút: 83,2 ± 1,7%, 40 phút: 93,5 ± 1,9%, 50 phút: 97,1 ± 0,8% và 19 60 phút: 100,7 ± 1,0%), mẻ 2 (10 phút: 66,4 ± 1,8%, 20 phút: 76,9 ± 1,5%, 30 phút: 82,4 ± 0,9%, 40 phút: 89,6 ± 1,5%, 50 phút: 98,1 ± 1,3% và 60 phút: 100,2 ± 2,2%), mẻ 3 (10 phút: 68,1 ± 1,7%, 20 phút: 75,8 ± 2,0%, 30 phút: 93,6 ± 0,9%, 40 phút: 97,3 ± 1,6%, 50 phút: 99,8 ± 2,1% và 60 phút: 102,7 ± 1,6%). 3.4.4. Dự kiến tiêu chuẩn chất lượng Bột phun sấy chứa nano curcumin ở dạng bột màu vàng, tơi xốp, KTTPTB nhỏ hơn 500 nm, PDI nhỏ hơn 0,55, mất khối lượng do làm khô không quá 12,0%, khối lượng riêng biểu kiến lớn hơn 0,250 g/ml, định tính (sắc ký đồ có pic của curcumin), hàm lượng curcumin trong bột phun sấy khoảng 40,00-43,50%, độ hòa tan lớn hơn 95,0% sau 60 phút. 3.5. THEO DÕI ĐỘ ỔN ĐỊNH Sau 9 tháng ở điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc, hệ tiểu phân nano chứa curcumin vẫn giữ nguyên cấu trúc trong đó curcumin phân tán bên trong polyme PVP. Đặc tính kết tinh, mất khối lượng do làm khô và độ hòa tan hầu như không thay đổi. KTTPTB, hàm lượng curcumin có thay đổi nhưng vẫn nằm trong giới hạn cho phép. 3.6. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG 3.6.1. So sánh sinh khả dụng của hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano curcumin Đồ thị biểu diễn nồng độ CUR trong huyết tương theo thời gian của hai nhóm chuột được trình bày ở hình 3.26. Sử dụng phần mềm Phoenix WinNonLin 7.0, tính toán các thông số dược động học không dựa trên mô hình ngăn, kết quả thu được trình bày ở bảng 3.52. 20 0 10 20 30 40 50 0 100 200 300 400 500 Hỗn dịch quy ước Hỗn dịch nano Hình 3.26. Đường cong nồng độ curcumin-thời gian của nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano Bảng 3.52. Một số thông số dược động học trên chuột uống hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano tính toán không dựa trên mô hình ngăn Thông số Hỗn dịch quy ước Hỗn dịch nano z (phút -1) 0,003 0,003 Tmax (phút) 25 20 Cmax (ng/ml) SE Cmax 2,6 0,4 37,6 2,3 AUC0240 phút (ng/ml.phút) SE AUC0240 phút 326,4 21,3 2874,4 118,2 MRT (phút) 107,2 101,7 Ghi chú: - Do việc lấy mẫu máu chuột là “rải rác” (sparse sampling) nên giá trị SE không được tính toán với một số thông số DĐH - Chỉ xác định AUC0240 phút do tại thời điểm 360 phút đối với hỗn dịch quy ước, nồng độ CUR trong huyết tương rất thấp Kết quả thu được ở bảng 3.52 cho thấy: dạng hỗn dịch nano có giá trị Cmax cao gấp 14,5 lần, AUC0240 phút cao gấp 8,8 lần so với hỗn dịch quy ước. Như vậy, hỗn dịch nano bào chế từ hệ tiểu phân nano cải thiện SKD của curcumin so với hỗn dịch quy ước. Thời gian (phút) N ồ n g đ ộ C U R t ro n g h u y ết t ư ơ n g (n g/ m l) 21 3.6.2. Xác định các thông số dược động học của chất gốc curcumin và chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trên chuột sau khi uống hỗn dịch nano curcumin Đối với nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước, nồng độ chất chuyển hóa THC rất thấp và hầu hết đều dưới nồng độ LLOQ (0,5 ng/ml). Vì vậy, nghiên cứu chỉ xác định các thông số dược động học của CUR và chất chuyển hóa THC trên nhóm chuột uống hỗn dịch nano. Các thông số dược động học được tính toán và xử lý thống kê dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa với hiệp biến khối lượng chuột ảnh hưởng đến thể tích phân bố, hằng số tốc độ hấp thu và hằng số tốc độ thải trừ. Kết quả đánh giá một số thông số dược động học cho thấy: hằng số tốc độ hấp thu của chất gốc (Ka) 65,2 phút -1, thể tích phân bố của chất gốc (V) 49885,4 ml, hằng số tốc độ chuyển hóa từ chất gốc sang chất chuyển hóa (Km) 0,00007 phút -1, hằng số tốc độ thải trừ của chất gốc (Ke) 0,003 phút -1, thể tích phân bố của chất chuyển hóa (Vm) 42,3 ml và hằng số tốc độ thải trừ của chất chuyển hóa (Kem) 36,3 phút-1. Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. VỀ HỆ TIỂU PHÂN NANO CHỨA CURCUMIN Curcumin là một DC ít tan thuộc nhóm IV trong hệ thống phân loại sinh dược học, có SKD thấp do ít tan và bị chuyển hóa, thải trừ nhanh. Trong nghiên cứu này, hệ tiểu phân nano bào chế được bằng phương pháp giảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn. Đây là phương pháp đơn giản, khả thi, có thể ứng dụng vào thực tế sản xuất. Hệ tiểu phân nano thu được có thể tồn tại một phần ở trạng thái kết tinh với KTTP giảm xuống dưới 500 nm. Với đặc điểm này, hệ tiểu phân nano có thể cải thiện độ tan và độ hòa tan của curcumin. 22 4.2. VỀ BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO CURCUMIN Trong quy trình bào chế hệ tiểu phân nano trình bày trong nghiên cứu, chất diện hoạt được nghiền ướt trực tiếp cùng với DC. Vì vậy, chất diện hoạt tập trung ở bề mặt phân cách pha cao. Kết quả thực nghiệm cho thấy sự có mặt của chất diện hoạt làm giảm đáng kể KTTP do làm giảm sức căng bề mặt phân cách pha rắn-lỏng. Ngoài ra, chất diện hoạt cũng có thể tạo micel làm tăng độ tan và tăng tính thấm qua đường tiêu hóa. Tuy nhiên, Tween 80 tạo ra lớp hấp phụ mỏng trên bề mặt tiểu phân. Vì vậy, trong nghiên cứu này, Tween 80 được phối hợp với một polyme thân nước PVP. Đồng thời, manitol được chọn là chất mang thêm vào công thức hỗn dịch trước phun sấy để tạo độ tơi xốp, thuận lợi cho việc đưa vào các dạng bào chế. Trong quá trình nghiền khô curcumin, các thông số cần kiểm soát là lượng DC đưa vào buồng nghiền, thời gian và tần số nghiền. Lượng DC đưa vào buồng nghiền chiếm khoảng 60% thể tích buồng nghiền. Lượng nguyên liệu quá lớn có thể tạo hiệu ứng “cái đệm” cản trở quá trình nghiền. Ngược lại, quá ít nguyên liệu, hiệu suất nghiền giảm và bề mặt buồng nghiền bị mài mòn. Về tần số nghiền, nếu tần số nghiền thấp, nguyên liệu chỉ chịu tác động của lực mài mòn của nguyên liệu vào buồng nghiền. Nếu tần số nghiền quá cao, các bi bị ép mạnh vào thành buồng nghiền nên không có lực mài mòn và va chạm. Trong giai đoạn nghiền ướt, việc sử dụng hai loại bi kích thước khác nhau trong nghiên cứu này (0,65 và 0,8 mm) không có sự khác biệt rõ rệt về KTTP DC. Điều này có thể do hai loại bi kích thước không khác nhau nhiều, hoặc do năng lượng động lực học tạo ra trong quá trình nghiền ở cùng tần số xác định của bi kích thước lớn (0,8 mm) cao hơn so với bi kích thước nhỏ (0,65 mm). 23 4.3. VỀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ TIỂU PHÂN NANO Hệ tiểu phân nano tạo thành với các đặc tính về hình thái cấu trúc, KTTPTB khoảng 300-500 nm, đặc tính kết tinh và độ hòa tan thích hợp đưa vào dạng thuốc dùng đường uống với mục đích cải thiện SKD của curcumin. 4.4. VỀ ĐỘ ỔN ĐỊNH Kết quả của nghiên cứu cho thấy bột phun sấy chứa tiểu phân nano curcumin đóng trong vỏ nang cứng, ép vỉ nhôm-nhôm, đựng trong hộp giấy ổn định về mặt hình thái, kích thước tiểu phân, đặc tính kết tinh, mất khối lượng do làm khô, hàm lượng và độ hòa tan curcumin trong thời gian theo dõi ở hai điều kiện. 4.5. VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA HỆ TIỂU PHÂN NANO CURCUMIN Kết quả xác định nồng độ CUR và THC trong huyết tương chuột đối với nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước cho thấy cả nồng độ CUR và THC đều thấp, chứng tỏ SKD của hỗn dịch quy ước thấp. Khi bào chế dưới dạng tiểu phân nano, hấp thu curcumin được cải thiện đáng kể do tăng độ tan, tốc độ hòa tan và tăng tính thấm. Đồng thời, hằng số tốc độ chuyển hóa Km đã được xác định dựa trên mô hình dược động học quần thể một ngăn có chuyển hóa, chứng tỏ có sự chuyển hóa thuận từ chất gốc curcumin sang THC. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN 1. Về xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcumin Đã bào chế được hệ tiểu phân nano curcumin 5 g/mẻ với công thức bào chế: curcumin 5,00 g, Tween 80 0,60 g, PVP K30 3,75 g, manitol 2,50 g và nước tinh khiết 125 ml. 24 Hỗn dịch nano được bào chế bằng phương pháp giảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn với các thông số: thời gian nghiền khô 6 giờ, tần số nghiền khô 30 Hz sử dụng buồng nghiền bi inox, thời gian nghiền ướt 4 giờ, tần số nghiền ướt 30 Hz sử dụng buồng nghiền bi zirconi oxyd 0,8 mm, đồng nhất hóa 18000 vòng/phút trong 60 phút. Hỗn dịch nano được phun sấy với các thông số: nhiệt độ khí vào 96oC và tốc độ phun dịch 2 ml/phút để tạo hệ tiểu phân nano. Hệ tiểu phân được duy trì ở dạng bột phun sấy với KTTPTB khoảng 336,7 ± 18,6 nm và PDI 0,387 ± 0,032, trong đó curcumin phân tán trong chất mang PVP. Tiểu phân nano tồn tại một phần ở dạng kết tinh với tốc độ hòa tan cải thiện đáng kể so với nguyên liệu ban đầu. Mất khối lượng do làm khô khoảng 9,35% và khối lượng riêng biểu kiến khoảng 0,329 ± 0,024 g/ml. Hệ tiểu phân nano nghiên cứu ổn định về hình thái, KTTP, đặc tính kết tinh, mất khối lượng do làm khô, hàm lượng curcumin và độ hòa tan curcumin trong 9 tháng ở điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc. 2. Về đánh giá sinh khả dụng của hệ tiểu phân nano Việc đánh giá SKD của thuốc nghiên cứu trên chuột thí nghiệm đã chứng tỏ hệ tiểu phân nano có khả năng cải thiện SKD của curcumin. Kết quả nghiên cứu bước đầu này cũng chứng minh được có sự chuyển hóa từ curcumin sang tetrahydrocurcumin trên chuột. ĐỀ XUẤT - Hoàn thiện quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcumin, nâng quy mô lô mẻ, hướng tới sản xuất nguyên liệu nano ứng dụng trong các dạng bào chế. - Đánh giá độ ổn định dài hạn của hệ tiểu phân nano curcumin. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Dương Thị Hồng Ánh, Nguyễn Đình Hà, Nguyễn Trần Linh (2015), “Tối ưu hóa công thức và một số thông số trong quy trình bào chế tiểu phân nano curcumin”, Tạp chí Nghiên cứu Dược và thông tin thuốc, tập 6, số 2, trang 2-5. 2. Dương Thị Hồng Ánh, Thái Thị Hồng Anh, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Trần Linh (2016), “Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano curcumin quy mô 5 gam/mẻ”, Tạp chí Nghiên cứu Dược và thông tin thuốc, tập 7, số 6, trang 28-33. 3. Dương Thị Hồng Ánh, Hoàng Văn Đức, Lê Thị Thu Huyền, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Trần Linh (2017), “Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời curcumin và chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột”, Tạp chí Dược học, tập 57, số 492, trang 50-52 và 73.