Luận án Nghiên cứu hệ gen ty thể, đơn vị mã hóa Ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và một số khu vực ở châu Á
Nghiên cứu hệ gen ty thể:
+ Toàn bộ hệ gen ty thể (mtDNA) hoàn chỉnh của sán lá phổi đã được thu
nhận của loài Paragonimus heterotremus (chủng LC, Việt Nam) có kích thước
15.722 bp (KY952166) và của loài Paragonimus ohirai (chủng Kino, Nhật Bản) có
kích thước 14.818 bp (KX765277). Hệ gen được xác định chứa 36 gen, gồm 12 gen
mã hóa protein (PCG), 2 gen ribosome ty thể (MRG), 22 gen vận chuyển amino
acid (tRNA) và một vùng không mã hóa (NCR) chứa cấu trúc lặp liền kề, sắp xếp
như sau: {5’-cox3-H-cob-nad4L-nad4-QFM-atp6-nad2-VAD-nad1-NPIK-nad3-
S1W-cox1-T-rrnL-C-rrnS-cox2-nad6-YL1S2L2R-nad5-GE-NCR[LRU#;SRU#]-3’}.
+ Đặc điểm gen và hệ gen đã được phân tích đầy đủ ở cả hai loài, trong đó
tổng thành phần nucleotide sử dụng A+T > G+C, với công thức sử dụng
T>G>A>C; giá trị độ lệch (skew/skewness) của AT thiên về lệch âm và GC là lệch
dương; “thiên vị” bộ mã nhiều nhất là Phe-TTT và Leu-TTG, ít nhất là Arg-CGA,
Arg-CGC. Khoảng cách di truyền giữa 9 chủng/4 loài P. heterotremus, P. ohirai, P.
westermani và P. kellicotti thuộc họ Paragonimidae cũng đã được xác định.
+ Phân tích phả hệ sán lá phổi dựa trên chuỗi amino acid cộng hợp của 12
PCG đều xác định vị trí “đồng vị” hay “chị em” (sister, monophyly) của họ
Paragonimidae/phân bộ Troglotremata với phân bộ Procephalata và “lệch vị"”
(paraphyly) với phân bộ Opisthorchiata.
187 trang |
Chia sẻ: huydang97 | Ngày: 27/12/2022 | Lượt xem: 364 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu hệ gen ty thể, đơn vị mã hóa Ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và một số khu vực ở châu Á, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
GGGGGCATTTGTATGGCGGTGTTAGAGGTGAAATTCTTGGATCGCCGCCAGACAAACTACAGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCTGGAGCGAA : 1080
* 1100 * 1120 * 1140 * 1160 * 1180 * 1200 * 1220 * 1240 * 1260
Pmiy-OkuST : AGTCAGAGGTTCGAAGACGATCAGATACCGTCCTAGTTCTGACCATAAACGATGCCAACTGACGATCCGCGGTGGTTCTTTTATTGTCCCCGCGGGCAGTCCCCGGGAAACCTTTAAGTCTTTGGGCTCCGGGGGAAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGC : 1260
* 1280 * 1300 * 1320 * 1340 * 1360 * 1380 * 1400 * 1420 * 1440
Pmiy-OkuST : ACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTCGACTCAACACGGGAAAACTCACCCGGCCCGGACACTGTGAGGATTGACAGATTGAAAGCTCTTTCTTGATTCGGTGGTTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACTTTG : 1440
* 1460 * 1480 * 1500 * 1520 * 1540 * 1560 * 1580 * 1600 * 1620
Pmiy-OkuST : GCCTGCTAAATAGTATGCCTGTCCTCTGTGCTCGTGCGGGTGGCGGTGCTCGCTGCCTCTTCGGGGGTGGTGGCGCCGTTCGCCGGCGGGTGCTGCGCAGGTGTTTACTTCTTAGAGGGACAAGCGGCGTGACAGTCGCACGAAAATGAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGT : 1620
* 1640 * 1660 * 1680 * 1700 * 1720 * 1740 * 1760 * 1780 * 1800
Pmiy-OkuST : CCGGGGCCGCACGTGCGCTACAATGACGGTTTCAGCGAGTCTGGGAACCTGGCCTGAAAGGGTTGGGCAAACTGAGTCATCACCGTCGTGACTGGGATCGGGGCTTGCAATTGTTCCCCGTGAACGAGGAATTCCTGGTAAGTGCAAGTCATAAGCTTGCGCTGATTACGTCCCTGCCCT : 1800
ITS1 (634) *
1820 * 1840 * 1860 * 1880 * 1900 * 1920 * 1940 * 1960 * 1980
Pmiy-OkuST : TTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTTTAGCAAGGTCCTCGGATTGGTGCCATTGTAGTTGTTTCGGCAGCTCGACCGGCGCTGAGAAGACGACCAAATTTGAACATTTAGAAGTGAAAGTCGTGACAAAGTTTCCGTAGGTGAACCTGGAGAAGGATCATTAGAGAA : 1980
* 2000 * 2020 * 2040 * 2060 * 2080 * 2100 * 2120 * 2140 * 2160
Pmiy-OkuST : TTGCCGAAATTCAAAATGCCTCGATGAGCAAATGGGCAAGTGTTCTCCACGGGTAGTCATACGCCTTAAATGCAGCTTCGGCTGCCTCAGGTAGAGCGTCTCTCCCCTGCCATTTGATTCAGCTGTGTCTGGCGAACTCCAGTGGCTGCATTCAGTTGAATCTTTTCCGACGAGCCTTCA : 2160
* 2180 * 2200 * 2220 * 2240 * 2260 * 2280 * 2300 * 2320 * 2340
Pmiy-OkuST : GTTTTGTTGGATGCAACCTCATCTGCATCAGGTGGAGCGTCTTTCCTATGCCATTTAATCCAGCTGTACCTGGCGCACATGCGTGCCAATGTACAGTTATCCTTGCAGCAAGGCACCTACCTATCCGATGCTCTTTGAGTTGCTTGCCATTTTCGGATAGCGAATGCATCTCGGGAGTGA : 2340
* 2360 * 2380 * 2400 * 2420 * 2440 * 2460 * 2480 * 2500 * 2520
Pmiy-OkuST : CGGGTTGTACTGTGCTCATAGACAGCGCCAGGCTTAATGGGTGGTGAGGCATATTGAGCTACAGATCGGCCACCGCCATGTTTTGTTCCAATCTATGCCATTTCACACTGTTCAAGTGGTCCAGGTCGGCCTGTCTGAATTGGTCCATTGCCCGACATGCATCCGGTTCCGTACTGGACT : 2520
5.8S (160)
* 2540 * 2560 * 2580 * 2600 * 2620 * 2640 * 2660 * 2680 * 2700
Pmiy-OkuST : GCATGTACAGTCGACTGGCGGTGCCTGATCCCGGGCTTGACTGGCTAACCATACGTCGTTCTTCTGGCTGACTGGATGTTCCATGTGAGTATAGCTCTGTATGGTGGGTCACTTGGCTCGTGTGTTGATGAAGAGCGCAGCCAACTGTGTGAATTAATGTGAAATGCATACTGCTTTGAA : 2700
ITS2 (283)
* 2720 * 2740 * 2760 * 2780 * 2800 * 2820 * 2840 * 2860 * 2880
Pmiy-OkuST : CATCGACATCTTGAACGCATATTGCGGCCACGGGTTAGCCTGTGGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCTTATAAACTATCGCGACGCCCAAAAAGTCGCGGCTTGGGTTTTGCCAGCTGGCGTGATTTCCCCAACCTGGCCTCGTGGCTGTGGGGTGCCAGATCTGTGGCGTTTCCCTAAC : 2880
28S (3881)
* 2900 * 2920 * 2940 * 2960 * 2980 * 3000 * 3020 * 3040 * 3060
Pmiy-OkuST : ATATCCGGGCGTACCCATGTTGTGGCTGAAAGCTTTGATGGGGATGTGGCAACGGAATCGTGGCTCAGTGATTGATTTGTGCGCGTTCCGCTATCCTATCATCGTCTATGGTTGATGTTGCGCGTGGTGTGTGCCCGATGCTGACCTATGTATGTGCCATGTGGCTCATTCTCCTGACCT : 3060
* 3080 * 3100 * 3120 * 3140 * 3160 * 3180 * 3200 * 3220 * 3240
Pmiy-OkuST : CGGATCAGACGTGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCTGAGTAACGGCGAGTGAACAGGGAAAAGCCCAGCACCGAAGCCTGTGGTCATTTGGTCACTAGGCAATGTGGTGTTCAGGTCGTTCCATAGAGGTGCTGCTCCACCC : 3240
* 3260 * 3280 * 3300 * 3320 * 3340 * 3360 * 3380 * 3400 * 3420
Pmiy-OkuST : TAAGTCCAGCAATGAGTACGGTGGTACGGACATGGCCCACAGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATCAGGCAGGCCAGTGCCTCTCTGGGTAGACCTTGGAGTCGGGTTGTTTGTGAATGCAGCCCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCCAAGGCTAAATACTTGCACGAGTCCGAT : 3420
* 3440 * 3460 * 3480 * 3500 * 3520 * 3540 * 3560 * 3580 * 3600
Pmiy-OkuST : AGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGCTCAGAGGTAAACGGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTTTGGGGATTCAGCTGGTGAGTGTGGTTTGAGCTTGGTCAAGTCGGTTGGACATTGGGGTCTGTGTAGCAGCAGGTCT : 3600
* 3620 * 3640 * 3660 * 3680 * 3700 * 3720 * 3740 * 3760 * 3780
Pmiy-OkuST : CTGCCCTTGGGCAGGGATGCGCGATGCACTTATCAGGTGTTGTGCGCCTCTTTGTTTATCGGGCCAATTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGGCACTGCTGTCTGACTACTGTGGTTAAACCGGACTTACAGAGCACTTGTGGTTTTGTATGGCCGGGAAGGCAGGT : 3780
* 3800 * 3820 * 3840 * 3860 * 3880 * 3900 * 3920 * 3940 * 3960
Pmiy-OkuST : AGCTCGTTGGCTAGCTTGTGGTTTACTGCAGGCGTTTGGTTTTCGAGTGTAATTAGCTGACCACGATTGTTCTGTGCAGTGTGTCGGAGACGGCGGCTTGTGGTACTTGCGTGCGTGCCGGTCCTGCTGGCGTGTTCGGGTTTGGTTGCCATGTTGCTTGTGAATGCAGGCCTGGTGATA : 3960
* 3980 * 4000 * 4020 * 4040 * 4060 * 4080 * 4100 * 4120 * 4140
Pmiy-OkuST : GCTCGGATTCGTTCGGTTGGCGGTTGCGTGCGTGGTGCCGTTAAGGGCCAACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTAACGAAACCCACAGGCGCAGTGAAAGTAAAGGCCCGGCTTG : 4140
* 4160 * 4180 * 4200 * 4220 * 4240 * 4260 * 4280 * 4300 * 4320
Pmiy-OkuST : TCCAGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTTCACGCATGGTACCACCAAGCAACGAGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGACGTAGACACATAATCTTCGGACCAGTGCACCGTCGGGGCGGAGCATGAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGT : 4320
* 4340 * 4360 * 4380 * 4400 * 4420 * 4440 * 4460 * 4480 * 4500
Pmiy-OkuST : TGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGACCGCAGCGATTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAACGTGAGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCCCTCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCTGGCGTTCGGAGAAATAAACAGTTTTATCCGGTAAAGCGAATGA : 4500
* 4520 * 4540 * 4560 * 4580 * 4600 * 4620 * 4640 * 4660 * 4680
Pmiy-OkuST : TTAGAGGCCTTGGGGGCGAAACGTCCTCAACCTATTCTCAAACTTTAAATGGGTGAGAAGCTGAACTCGCTTGAGCGGAGTTGGGCGTTGAATGTGAGTGCCAAGTGGGCCATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGCTGTGGGATGAACCAAACGTCCGGTTAAGGTGCCTAACGCGACGCT : 4680
* 4700 * 4720 * 4740 * 4760 * 4780 * 4800 * 4820 * 4840 * 4860
Pmiy-OkuST : CATCAGATACCACAAAAGGTGTTGGTTGGTCTAGACAGCAGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGAGTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATCAACCAGCCCTGAAAATGGATGGCGCTGGAGCGTCGGACCTATACCGGACCGTTACTGCAAGCTGAGTCGGTAATGTGTG : 4860
* 4880 * 4900 * 4920 * 4940 * 4960 * 4980 * 5000 * 5020 * 5040
Pmiy-OkuST : GTGTGAGGGCAAGCCGCACGACTCAGGCACGGAGTGGTGGTAACGAGTAGGAGGGTCGCCGTGGTGAGCGGGAAGCTTCGGGCGTGAGCTTGAGTGGAGCCGCCACGGGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAGTGAGAACCTTGAAGGCCGAGGTGGAGAAGGGTTCCATG : 5040
* 5060 * 5080 * 5100 * 5120 * 5140 * 5160 * 5180 * 5200 * 5220
Pmiy-OkuST : GGAACAGCAGTTGGCCATGGGTCAGGCGGTCCTAAGTGATCCGATAACTCGGTACAGAGACGGGGTGCCTGACATTGTCAGGATTGCTGCTCGTATTGTTGCAAGGCAGCCCCCTGTAGCGAAAGGGAATCGGGTTAATATTCCCGACCCTGCCCACGGAGATTGGTGTATTCCGGTCTT : 5220
* 5240 * 5260 * 5280 * 5300 * 5320 * 5340 * 5360 * 5380 * 5400
Pmiy-OkuST : GTGCTGGTTTGCATCTAGCGCGGTAACGCAACCGACCTCGGAGACGTCGGCAAGAGTTCTGGGAAGAGTTCTCTTTTCTTTATTAGGAGTGCATCCATCCCCTGGAATCGGGTTGTCCGGAGATAGGGGACTAGCCTCCGTAAAGCACCACCCCTCTTGTGGTGTCCGGAACGCTCTTGT : 5400
* 5420 * 5440 * 5460 * 5480 * 5500 * 5520 * 5540 * 5560 * 5580
Pmiy-OkuST : CGGCCCTTGAAAATCCGAGCAAGGCAATATAATTTTCGTGGCAGGCCGTACCCATATCCGCATCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCTCTGGCATTTGAACAATGTAGGTAAGGGAAGTCGGCAAATTGGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTGAGGGCCGAGTCAAATGGGCTG : 5580
* 5600 * 5620 * 5640 * 5660 * 5680 * 5700 * 5720 * 5740 * 5760
Pmiy-OkuST : GGATCAGATACGTGCCGGTCAAGTTGGGGGCTGGTTTTTCTGTCACTCTGTTCGCTTCGGTGGATGGGGTCGATGGGATTACTGGACTCTGACCAGGCCGGTCGTGGACGATCTCAGCTGTAGTGCTGCTTGGTTCGCATCGCGCGTGGGAAACTGTGTGCGTTTGTGGCCTTGCTTCCT : 5760
* 5780 * 5800 * 5820 * 5840 * 5860 * 5880 * 5900 * 5920 * 5940
Pmiy-OkuST : TCGTTTGGCGTTAAACGGCTAACTCAGAACTGGCACGGACCAGGGGAATCCGACTGTCTAATTAAAACAAAGCATTGCGATGTCCACTGACCGGTTTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAAGAAATTCAATCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACT : 5940
* 5960 * 5980 * 6000 * 6020 * 6040 * 6060 * 6080 * 6100 * 6120
Pmiy-OkuST : ATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGTCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATTAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTCCGACTTTGTGA : 6120
* 6140 * 6160 * 6180 * 6200 * 6220 * 6240 * 6260 * 6280 * 6300
Pmiy-OkuST : GGAGACATGACGGGTGTAGAATAAGTGGGAGCCAGGTCCTTCGGGGTTTGGCGTCAGTGAAATACCACCACCGTCATTGTTTCTTTGCTTATTCAGTAAAGCGGGGTGCCAATTTTGGTCCTAAGCACATGCTGGCATGCGTGGCTTTGCTGCGGGTGTCGGTATCCTGGTCATGTCAGA : 6300
* 6320 * 6340 * 6360 * 6380 * 6400 * 6420 * 6440 * 6460 * 6480
Pmiy-OkuST : TGAGCCGTGGCTTCGGCTGCGGTGTTTGAGTTTGAATGTGATGTGCGACCCGTTCTGAAGACAATGTCAGGCGGGGAGTTTGACTGGGGCGGTACATCTGTCAAATGGTAACGCAGGTGTCCCAAGGTAAGCTCAGCCAGGACGGAAACCTGGCGTAGAGTAAAAGGGCAAAAGCTTACT : 6480
* 6500 * 6520 * 6540 * 6560 * 6580 * 6600 * 6620 * 6640 * 6660
Pmiy-OkuST : TGATTTTGATTTTCAGTACGAATACAGACCGTGAAAGCGTGGCCTATCGATCCTTTTGATTTTGATATTCGGAGTTTGAAGCAAGAGGTGTCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCGCTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTCCCT : 6660
* 6680 * 6700 * 6720 * 6740 * 6760 * 6780 * 6800 * 6820 * 6840
Pmiy-OkuST : AGCGTTGTGACGCAGAATTCACCAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTAATGAGTACAATGAAACAGTGAAGTACAAACTGGCCGTTGCTATGGTAATCCTGTTTAGTACGAGAGGAACCGCAGG : 6840
* 6860 * 6880 * 6900 * 6920 *
Pmiy-OkuST : TTCAGACATTTGGTATATGTGCCTGGTCGAAAGGCCAATGGTGCGAAGCTACCATCTGAGGGATTAGGACTGAACGCCTCTAAGTCTGAATC : 6932 bp (0 TRU) ///-IGS-///
13
Hình PL3.8. Trình bày diễn giải gen và vùng giao gen của đơn vị mã hóa ribosome (rTU) loài
Paragonimus westermani (2n) của Ấn Độ (Pwes-Megha(2n)-IN), thiếu IGS (8.616 bp;
ITS1 chứa 15,7 TRU)
18S (1977)
* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * 120 * 140 * 160 * 180
Pwes(2n)-I : AACATGGGTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAGAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTACATACCTCAAAACGGTGAAACCGCGAATGGCTCATTAAATCAGCTATGGTTCCTTAGATCGTACATACTACATGGATAACTGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCCACTATGC : 180
* 200 * 220 * 240 * 260 * 280 * 300 * 320 * 340 * 360
Pwes(2n)-I : CCTGACCCGCGAGGGAACGGGTGGATTTATTAGAACAGAACCAACCGGTTGTGGCCTTGGCTGCATCCGTTGTACTCTGTGATGACTCTGGATAACTTCACTGATCGCGTCGGCCTTGTGTCGGCGACGGATCTTTCAAATGTCTGCCCTATCAATTTGCGATGGTAGGTGACCTGCCTA : 360
* 380 * 400 * 420 * 440 * 460 * 480 * 500 * 520 * 540
Pwes(2n)-I : CCATGGTGATAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACTTCCAAGGAAGGCAGCAGGCACGCAAATTACCCAATCCCGGCACGGGGAGGTAGTGACGAAAAATACGAATACGGGACTCAACAGAGGCTCCGTAATTCGAATGAGTACA : 540
* 560 * 580 * 600 * 620 * 640 * 660 * 680 * 700 * 720
Pwes(2n)-I : ATTTAAATCCTTTAACGAGGATCAACTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAACTCCAGCTCCAGAAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATCTGGGTCGCATGGCTACGTGCCGTCGCTCACTTTCTCGGTTGGCTGTTAAGGCCCTGGGTGTG : 720
* 740 * 760 * 780 * 800 * 820 * 840 * 860 * 880 * 900
Pwes(2n)-I : GTGGGTCGGTGTCGTGGTTGTGTGGTCTTTCTGCCGTGTCTGGTTCACAGGTGCTGACTAGGCCTTCGGGTTTGTCGGCATGCTCCCACATGCCTTTAAACGGGTGTCTgGGGCGGACTGCACgTTTACTTTGAACAAATTTGAGTGCTCAAAGCAgGCCCTTGTGCCTGAAAATTCTTG : 900
* 920 * 940 * 960 * 980 * 1000 * 1020 * 1040 * 1060 * 1080
Pwes(2n)-I : CATGGAATAATGGAATAGGACTTCgGTTCTATTTTGTTGGTTTTCGGATCCgAAGTAATGGTTAAGAGGGACAGACGGGGTCATTTGTATGGCGGTGTTAGAGGTGAAATTCTTGgATCGCCGcCAGACAAACTACAGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCTGGAGCGAA : 1080
* 1100 * 1120 * 1140 * 1160 * 1180 * 1200 * 1220 * 1240 * 1260
Pwes(2n)-I : AGTCAGAGGTTCGAAGACGATCAGATACCGTCCTAGTTCTGACCATAAACGATGCCAACTGACGATCCGCGGTGGTTCTTTTATTGTCCCCGCGGGCAGTCCCCGGGAAACCTTTAAGTCTTTGGGCTCCGGGGGAAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGC : 1260
* 1280 * 1300 * 1320 * 1340 * 1360 * 1380 * 1400 * 1420 * 1440
Pwes(2n)-I : ACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTCGACTCAACACGGGAAAACTCACCCGGCCCGGACACTGTGAGGATTGACAGATTGAAAGCTCTTTCTTGATTCGGTGGTTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACTTTG : 1440
* 1460 * 1480 * 1500 * 1520 * 1540 * 1560 * 1580 * 1600 * 1620
Pwes(2n)-I : GCCTGCTAAATAGTATGCCTGTCCTCTGTGCCCGTGCGGGTGGCGGTGCTCGCTGCCTCTTCGGGGGTAGTGGTGTCGTTCGCCGGCGGGTACTGCGCAGGTGTTTACTTCTTAGAGGGACAAGCGGCGTGACAGTCGCACGAAAATGAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGT : 1620
* 1640 * 1660 * 1680 * 1700 * 1720 * 1740 * 1760 * 1780 * 1800
Pwes(2n)-I : CCGGGGCCGCACGTGCGCTACAATGACGGTTTCAGCGAGTCTGGGAACCTGGCCCGAAAGGGTTGGGCAAACTGAGTCATCACCGTCGTGACTGGGATCGGGGCTTGCAATTGTTCCCCGTGAACGAGGAATTCCTGGTAAGTGCAAGTCATAAGCTTGCGCTGATTACGTCCCTGCCCT : 1800
ITS1 (2313)
* 1820 * 1840 * 1860 * 1880 * 1900 * 1920 * 1940 * 1960 * 1980
Pwes(2n)-I : TTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTTTAGCAAGGTCCTCGGATTGGTGCCATTGTAGTTGCTTCGGCAGCTCGACCGGCGCTGACAAGACGACCAAACTTGATCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACA : 1980
Int. seq 1 (77)
* 2000 * 2020 * 2040 * 2060 TRU1 * 2080 * 2100 * 2120 * 2140 * 2160
Pwes(2n)-I : GAATTCCCAAATCTAAAGGTGCCTAAATGAGCACAAGGGCAAGTGTTTTCTCAACGAGCAGTCATGCTCGTCAATTGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCC : 2160
* 2180TRU2 * 2200 * 2220 * 2240 * 2260 * 2280 * 2300TRU3 * 2320 * 2340
Pwes(2n)-I : TTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTG : 2340
* 2360 * 2380 * 2400 * 2420TRU4 * 2440 * 2460 * 2480 * 2500 * 2520
Pwes(2n)-I : ATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCC : 2520
* 2540TRU5 * 2560 * 2580 * 2600 * 2620 * 2640 * 2660TRU6 * 2680 * 2700
Pwes(2n)-I : TTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTG : 2700
* 2720 * 2740 * 2760 * 2780TRU7 * 2800 * 2820 * 2840 * 2860 * 2880
Pwes(2n)-I : ATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCC : 2880
* 2900TRU8 * 2920 * 2940 * 2960 * 2980 * 3000 * 3020TRU9 * 3040 * 3060
Pwes(2n)-I : TTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTG : 3060
* 3080 * 3100 * 3120 * 3140TRU10 * 3160 * 3180 * 3200 * 3220 * 3240
Pwes(2n)-I : ATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCC : 3240
* 3260TRU11 * 3280 * 3300 * 3320 * 3340 * 3360 * 3380TRU12 * 3400 * 3420
Pwes(2n)-I : TTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTG : 3420
* 3440 * 3460 * 3480 * 3500TRU13 * 3520 * 3540 * 3560 * 3580 * 3600
Pwes(2n)-I : ATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCC : 3600
* 3620TRU14 * 3640 * 3660 * 3680 * 3700 * 3720 * 3740TRU15 * 3760 * 3780
Pwes(2n)-I : TTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTG : 3780
Int. seq 2 (350)
* 3800 * 3820 * 3840 * 3860TRU15.7 * 3880 * 3900 * 3920 * 3940 * 3960
Pwes(2n)-I : ATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTTATGCTTGCAGCAGGGTGCC : 3960
* 3980 * 4000 * 4020 * 4040 * 4060 * 4080 * 4100 * 4120 * 4140
Pwes(2n)-I : TACCTGTCTGATGCCCTTCGTTTTGCTTGCCATCTTTTGATGGTCAGTCCATCTCGTGGGTGACGGGTTGTACTGTCTTCATGGACAGTGCTAGGCTTAATGAGTGGTACGGCATATTGAGCTACGGCTCGGCCACCGCCCTGTTTGTTATAATTTATGCCATTTTACACTGTTCAAGTG : 4140
5.8S (160)
* 4160 * 4180 * 4200 * 4220 * 4240 * 4260 * 4280 * 4300 * 4320
Pwes(2n)-I : GTTCAGGTCAGCTCGTCTGGGCTGTTCCATTGCCCGACATGCACCCGGTCTCGTACTGGACTGCATGTACAGTCGCCTGGCGGTGCCTTATCCCGGGCTAGACTGGTTAACCATACGTCGTTCGTCTGGGTGACTGGATGTTCGATGTGAGTACAACTCTGTGCGGTGGATCACTCGGCT : 4320
ITS2 (285)
* 4340 * 4360 * 4380 * 4400 * 4420 * 4440 * 4460 * 4480 * 4500
Pwes(2n)-I : CGTGTGTCGATGAAGAGCGCAGCCAACTGTGTGAATTAATGCGAACTGCATACTGCTTTGAACATCGACATCTTGAACGCATATTGCGGCCACGGGTTAGCCTGTGGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCTTATAAACTATCGCGACGCCCAAAAAGTCGCGGCTTGGGTTTTGCCAGCTG : 4500
* 4520 * 4540 * 4560 * 4580 * 4600 * 4620 * 4640 * 4660 * 4680
Pwes(2n)-I : GCGTGATCTCCCCAATCTGGTCTTGTGCCTGTGGGGTGCCAGATCTATGGCGTTTCCCTAACATACTCGGGCGCACCCACGTTGCGGCTGAAAGCCTTGACGGGGATGTGGCGACGGAATCGTGGCTCAGTAAATGATTTATGTGCGCGTTCCGCTGTCCTGTCTTCATCTGTGGTTCAT : 4680
28S (3881)
* 4700 * 4720 * 4740 * 4760 * 4780 * 4800 * 4820 * 4840 * 4860
Pwes(2n)-I : GTTGCGCGTGGTCTGCGTTTGATGCTGACCTATGTATGTGCCATGTGGCTCATTCTCCTGACCTCGGATCAGACGTGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTAAGCGGAGGAAGAGAAACTAACAAGGATTCCCTGAGTAACGGCGAGTGAACAGGGAAAAGCCCAGCACCGAAGCC : 4860
* 4880 * 4900 * 4920 * 4940 * 4960 * 4980 * 5000 * 5020 * 5040
Pwes(2n)-I : TGTGGTCATTTGGTCACTAGGCAATGTGGTGTTCAGGTCGTTCCATAGAGGTGCTGCTCCACCCTAAGTCCAGCAATGAGTACGGTGGTACGGACATGGCCCACAGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATCAGGCAGGCCAGTGCCTCTCTGGGTAGACCTTGGAGTCGGGTTGTT : 5040
* 5060 * 5080 * 5100 * 5120 * 5140 * 5160 * 5180 * 5200 * 5220
Pwes(2n)-I : TGTGAATGCAGCCCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCCAAGGCTAAATACTTGCACGAGTCCGATAGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGCTCAGAGGTAAACGGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGGGAATTCAGC : 5220
* 5240 * 5260 * 5280 * 5300 * 5320 * 5340 * 5360 * 5380 * 5400
Pwes(2n)-I : TGGTGAATGTGGTTTGGGCTTGGTCAAGTCGGTTGGACATTGAGGTCTGCGTACCGGCAGGTCTTTACCCTCGGGTAAGGATGCGCGATACACTTATCAAGTGTTGTGCGCCTCTTTGTTTATCGGGCCAATTCGCCAGTGCACTTTCTCGGAGTGTTCACCACGACCGGCACTGCTGTC : 5400
* 5420 * 5440 * 5460 * 5480 * 5500 * 5520 * 5540 * 5560 * 5580
Pwes(2n)-I : TGATTGCTGTGGTTAAACCGGACTTACAGGGCTCTTGTGGCGTTGTATGGCCGGGAAGGCAGGTAGCTCGTTGGCTAGCTTGCGGTTTACCGCTGGCGTTCGGTCTTCGAGTGTAAATAGCTGACCACGATATTTCTGTGCAGTGTGTCGGAGACGGCGGCTTTTGGTACGTGCGTGCGT : 5580
* 5600 * 5620 * 5640 * 5660 * 5680 * 5700 * 5720 * 5740 * 5760
Pwes(2n)-I : GCTGGTTCTGCTGGCGTGTCCGGGTTTGGTTGCCATGTTGCTTGTGAATGCAGGCCTGGCAATGGTTCGGATTCGTTTGGTGGGCGGTTGCGTATGTGGTGCCGTTAAGGGCCAACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAA : 5760
* 5780 * 5800 * 5820 * 5840 * 5860 * 5880 * 5900 * 5920 * 5940
Pwes(2n)-I : CATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTAACGAAACCCACAGGCGCAGTGAAAGTAAAGGCTTGACTTGTTCAGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTTCACGCATGGTGCCACCAAGCAACGAGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGACGTAGACACATAATCTTCGGACCAGTGCACC : 5940
* 5960 * 5980 * 6000 * 6020 * 6040 * 6060 * 6080 * 6100 * 6120
Pwes(2n)-I : GTCGGGGCGGAGCATGAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGACCGCAGCGATTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAACGTGAGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCCCTCC : 6120
* 6140 * 6160 * 6180 * 6200 * 6220 * 6240 * 6260 * 6280 * 6300
Pwes(2n)-I : GAAGTTTCCCTCAGGATAGCTGGCGTTCGGAGAAGTAAACAGTTTTATCCGGTAAAGCGAATGATTAGAGGCCTTGGGGGCGAAACGTCCTCAACCTATTCTCAAACTTTAAATGGGTGAGAAGCTGAACTCGCTTGAGCGGAGTTGGGCGTTGAATGTGAGTGCCAAGTGGGCCATTTT : 6300
* 6320 * 6340 * 6360 * 6380 * 6400 * 6420 * 6440 * 6460 * 6480
Pwes(2n)-I : TGGTAAGCAGAACTGGCGCTGTGGGATGAACCAAACGTCCGGTTAAGGTGCCTAACGCGACGCTCATCAGATACCACAAAAGGTGTTGGTTGGTCTAGACAGCAGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGAGTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATCAACCAGCCCTGAAAA : 6480
* 6500 * 6520 * 6540 * 6560 * 6580 * 6600 * 6620 * 6640 * 6660
Pwes(2n)-I : TGGATGGCGCTGGAGCGTCGGACCTATACCGGACCGTTACTGCAAGCTGGGTCGGTAATGTGTGGTGTGAGGGCAAGCCGCACGACTCAGGCACGGAGTGGTGGTAACGAGTAGGAGGGTCGCCGTGGTGAGCGGGAAGCTTCGGGCGTGAGCTTGAGTGGAGCCGCCACGGGTGCAGAT : 6660
* 6680 * 6700 * 6720 * 6740 * 6760 * 6780 * 6800 * 6820 * 6840
Pwes(2n)-I : CTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAGTGAGAACCTTGAAGGCCGAGGTGGAGAAGGGTTCCATGGGAACAGCAGTTGGCCATGGGTCAGGCGGTCCTAAGTGATCCGATAACTCGGTACAGAGACGGGGTGCCTGACATTGTCAGGATTGCTGCTCGTATTGTTGCAAGGCAGCCCCCTG : 6840
* 6860 * 6880 * 6900 * 6920 * 6940 * 6960 * 6980 * 7000 * 7020
Pwes(2n)-I : TAGCGAAAGGGAATCGGGTTAATATTCCCGACCCTGCCCACGGAGATTGGTGTATTCCGGTCTTGTGCTGGTTTGCATCTAGCGCGGTAACGCAACCGACCTCGGAGACGTCGGCAAGAGTTCTGGGAAGAGTTCTCTTTTCTTTATTAGGAGTGCATCCATCCCCTGGAATCGGGTTGT : 7020
* 7040 * 7060 * 7080 * 7100 * 7120 * 7140 * 7160 * 7180 * 7200
Pwes(2n)-I : CCGGAGATAGGGGACTAGCCTCCGTAAAGCACCACCCCTCTTGTGGTGTCCGGAACGCTCTTGTCGGCCCTTGAAAATCCGAGCAAGGCAATATAATTTTCGTGGCAGGCCGTACCCATATCCGCATCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCTCTGGCATTTGAACAATGTAGGTAAGGGAAG : 7200
* 7220 * 7240 * 7260 * 7280 * 7300 * 7320 * 7340 * 7360 * 7380
Pwes(2n)-I : TCGGCAAATTGGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTGAGGGCCGAGTCAAATGGGCTGGGATCAGATACGTGCCGGTCAAGTTGGGGGCTGGTTTTTCTGTCACTCTGTTCGCTTCGGTGGATGGGGTCGATGGGATTACTGGACTCTGACCAGGCCGGTCGTGGACGATCTCA : 7380
* 7400 * 7420 * 7440 * 7460 * 7480 * 7500 * 7520 * 7540 * 7560
Pwes(2n)-I : GCTGTAGTGCTGCTTGGTTCGCATCGCGCGTGGGAAACTGTGTGCGTTTGTGGCCTTGCTTCCTTCGTTTGGCGTTAAACGGCTAACTCAGAACTGGCACGGACCAGGGGAATCCGACTGTCTAATTAAAACAAAGCATTGCGATGTCCACTGACCGGTTTTGACGCAATGTGATTTCTG : 7560
* 7580 * 7600 * 7620 * 7640 * 7660 * 7680 * 7700 * 7720 * 7740
Pwes(2n)-I : CCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAAGAAATTCAATCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGTCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAAC : 7740
* 7760 * 7780 * 7800 * 7820 * 7840 * 7860 * 7880 * 7900 * 7920
Pwes(2n)-I : GGGCTTGGCAGAATTAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTCCGACTTTGTGAGGAGACATGACGGGTGTAGAATAAGTGGGAGCCAGGTCCTTCGGGGTTTGGCGTCAGTGAAATACCACCACCGTCATTGTTTCTTTGCTTATTCAGTAAAGCGGGGTGCCAATTTT : 7920
* 7940 * 7960 * 7980 * 8000 * 8020 * 8040 * 8060 * 8080 * 8100
Pwes(2n)-I : GGTCCTAAGCACATGCTGGCATGCGTGGCTTTGCTGCGGGTGTCGGTATCCTGGTCATGTCAGATGAGCCGTGGCTTCGGCTGCGGTGTTTGAGTTTGAATGTGATGTGCGACCCGTTCTGAAGACAATGTCAGGCGGGGAGTTTGACTGGGGCGGTACATCTGTCAAATGGTAACGCAG : 8100
* 8120 * 8140 * 8160 * 8180 * 8200 * 8220 * 8240 * 8260 * 8280
Pwes(2n)-I : GTGTCCCAAGGTAAGCTCAGCCAGGACGGAAACCTGGCGTAGAGTAAAAGGGCAAAAGCTTACTTGATTTTGATTTTCAGTACGAATACAGACCGTGAAAGCGTGGCCTATCGATCCTTTTGATTTTGATATTCGGAGTTTGAAGCAAGAGGTGTCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACT : 8280
* 8300 * 8320 * 8340 * 8360 * 8380 * 8400 * 8420 * 8440 * 8460
Pwes(2n)-I : GGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCGCTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTCCCTAGCGTTGTGACGCAGAATTCACCAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTAATGAGTACAATG : 8460
* 8480 * 8500 * 8520 * 8540 * 8560 * 8580 * 8600 *
Pwes(2n)-I : AAACAGTGAAGTACAAACTGGCCGTTGCTATGGTAATCCTGTTTAGTACGAGAGGAACCGCAGGTTCAGACATTTGGTATATGTGCCTGGTCGAAAGGCCAATGGTGCGAAGCTACCATCTGAGGGATTAGGACTGAACGCCTCTAAGTCTGAATC : 8616 bp
(15,7 TRU) ///-IGS-///
=======================================
Hình PL3.9. Trình bày diễn giải gen và vùng giao gen của đơn vị mã hóa ribosome (rTU) loài
Paragonimus westermani (3n) của Hàn Quốc (Pwes-Bogil(3n)-KR), thiếu IGS (7.292 bp;
ITS1 chứa 4,7 TRU)
18S (1977)
* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * 120 * 140 * 160 * 180
Pwes-KR(3n : AACCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAGAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTACATACCTCAAAACGGTGAAACCGCGAATGGCTCATTAAATCAGCTATGGTTCCTTAGATCGTACCTACTACATGGATAACTGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCCACTATGC : 180
* 200 * 220 * 240 * 260 * 280 * 300 * 320 * 340 * 360
Pwes-KR(3n : CCTGACCCGCGAGGGAACGGGTGGATTTATTAGAACAGAACCAACCGGTTGTGGCTCCGGCTGCATCCGTTGTACTCTGTGATGACTCTGGATAACTTCAATGATCGCGTCGGCCTTGTGTCGGCGACGGATCTTTCAAATGTCTGCCCTATCAATTTACGATGGTAGGTGACCTGCCTA : 360
* 380 * 400 * 420 * 440 * 460 * 480 * 500 * 520 * 540
Pwes-KR(3n : CCATGGTGATAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACTTCCAAGGAAGGCAGCAGGCACGCAAATTACCCAATCCCGGCACGGGGAGGTAGTGACGAAAAATACGAATACGGGACTCAACAGAGGCTCCGTAATTCGAATGAGTACA : 540
* 560 * 580 * 600 * 620 * 640 * 660 * 680 * 700 * 720
Pwes-KR(3n : ATTTAAATCCTTTAACGAGGATCAACTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAACTCCAGCTCCAGAAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATCTGGGTCGCATGGCTACGTGCCGTCGCTCACTTTCTCGGTTGGCTGTTAAGGCCCTGGGTGTG : 720
* 740 * 760 * 780 * 800 * 820 * 840 * 860 * 880 * 900
Pwes-KR(3n : GTGGGTCGGTGTCGTGGTTGTGTGGTCTTTCTGCCGTGTCTGGTTCACAGGTGCTGACTAGGCCTTCGGGTTTGTCGGCATGCTTCCAGATGCCTTTAAACGGGTGTCGGGGGCGGACGGCACGTTTACTTTGAACAAATTTGAGTGCTCAAAGCAGGCCCTTGTGCCTGAAAATTCTTG : 900
* 920 * 940 * 960 * 980 * 1000 * 1020 * 1040 * 1060 * 1080
Pwes-KR(3n : CATGGAATAATGGAATAGGACTTCGGTTCTATTTTGTTGGTTTTCGGATCCGAAGTAATGGTTAAGAGGGACAGACGGGGGCATTTGTATGGCGGTGTTAGAGGTGAAATTCTTGGATCGCCGCCAGACAAACTACAGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCTGGAGCGAA : 1080
* 1100 * 1120 * 1140 * 1160 * 1180 * 1200 * 1220 * 1240 * 1260
Pwes-KR(3n : AGTCAGAGGTTCGAAGACGATCAGATACCGTCCTAGTTCTGACCATAAACGATGCCAACTGACGATCCGCGGTGGTTCTTTTATTGTCCCCGCGGGCAGTCCCCGGGAAACCTTTAAGTCTTTGGGCTCCGGGGGAAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGC : 1260
* 1280 * 1300 * 1320 * 1340 * 1360 * 1380 * 1400 * 1420 * 1440
Pwes-KR(3n : ACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTCGACTCAACACGGGAAAACTCACCCGGCCCGGACACTGTGAGGATTGACAGATTGAAAGCTCTTTCTTGATTCGGTGGTTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACTTTG : 1440
* 1460 * 1480 * 1500 * 1520 * 1540 * 1560 * 1580 * 1600 * 1620
Pwes-KR(3n : GCCTGCTAAATAGTATGCCTGTCCTCTGTGCCCGTGCGGGTGGCGGTGCTCGCTGCCTCTTCGGGGGTAGTGGTGCCGTTCGCCGGCGGGTACTGCGCAGGTGTTTACTTCTTAGAGGGACAAGCGGCGTGACAGTCGCACGAAAATGAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGT : 1620
* 1640 * 1660 * 1680 * 1700 * 1720 * 1740 * 1760 * 1780 * 1800
Pwes-KR(3n : CCGGGGCCGCACGTGCGCTACAATGACGGTTTCAGCGAGTCTGGGAACCTGGCCCGAAAGGGTTGGGCAAACTGAGTCATCACCGTCGTGACTGGGATCGGGGCTTGCAATTGTTCCCCGTGAACGAGGAATTCCTGGTAAGTGCAAGTCATAAGCTTGCGCTGATTACGTCCCTGCCCT : 1800
ITS1 (989)
14
* 1820 * 1840 * 1860 * 1880 * 1900 * 1920 * 1940 * 1960 * 1980
Pwes-KR(3n : TTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTTTAGCAAGGTCCTCGGATTGGTGCCATTGTAGTTGCTCCGGCAGCTCGACCGGCGCTGAGAAGACGACCAAACTTGATCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACA : 1980
Int. seq. 1 (73)
* 2000 * 2020 * 2040 * TRU1 2060 * 2080 * 2100 * 2120 * 2140 * 2160
Pwes-KR(3n : GAATTCCCAATTCTGAAACTGCCTCAATGAGCACAAAGGCGTGTTCTAAACGAGCAGTCATGCTCGTCAAACGCAGACTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGTTTCGGCTGTGCCTGGCACACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGGATCTTCTCCGATGAGCCTTCG : 2160
* TRU2 2180 * 2200 * 2220 * 2240 * 2260 * 2280 * TRU3 2300 * 2320 * 2340
Pwes-KR(3n : GGTTTGTTGGATGCAGCCTTGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGTTTCGGCTGTGCCTGGCACACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGGATCTTCTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTTGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGTTTC : 2340
* 2360 * 2380 * 2400 * TRU4 2420 * 2440 * 2460 * 2480 * 2500 * 2520
Pwes-KR(3n : GGCTGTGCCTGGCACACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGGATCTTCTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTTGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGTTTCGGCTGTGCCTGGCACACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGGATCTTCTCCGATGAGCCTTCG : 2520
Int. seq. 2 (350)
*TRU4.72540 * 2560 * 2580 * 2600 * 2620 * 2640 * 2660 * 2680 * 2700
Pwes-KR(3n : GGTTTGTTGGATGCAGCCTTGTCTGCCTCAGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGTTTCGGCTGTGCCTGGCACACTCGTGTGCCTACGTACAGTTATACTTGCAGCAGGGTGCCTACCTGTCTGATGCTCTACGTTTTGCTTGCCATTTTCGGATGGTCAGTCCATCTCGTGGGTGAC : 2700
* 2720 * 2740 * 2760 * 2780 * 2800 * 2820 * 2840 * 2860 * 2880
Pwes-KR(3n : GGGTTGTGCTGTCTTCACCGACAGTGCTAGGCTTAATGAGTGGTATGGCATATTGAGCTACGGCTCGGCCACCGCCCTGTTTGTTTCAATTTATGCCATTTTACACTGTTCAAGTGGTTCAGGTCAGCTCGTCTGAGCTGTTCCACTGCCCGACATGCACCCGGTCTCGTGCTGGACTGC : 2880
5.8S (160)
* 2900 * 2920 * 2940 * 2960 * 2980 * 3000 * 3020 * 3040 * 3060
Pwes-KR(3n : ATGTACAGTCGCCTGGCGGTGCCTTATCCCGGGCTAGACTGGTTAACCATACATCGTTCGTCTGGGTGACTGGATGTTCGATGTGAGTACAACTCTGTGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGTGTCGATGAAGAGCGCAGCCAACTGTGTGAATTAATGCGAACTGCATACTGCTTTGAACA : 3060
ITS2 (285)
* 3080 * 3100 * 3120 * 3140 * 3160 * 3180 * 3200 * 3220 * 3240
Pwes-KR(3n : TCGACATCTTGAACGCATATTGCGGCCACGGGTTAGCCTGTGGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCTTATAAACTATCGCGACGCCCAAAAAGTCGCGGCTTGGGTTTTGCCAGCTGGCGTGATCTCCCCAATCTGGTCTTGTGCCTGTGGGGTGCCAGATCTGTGGCGTTTCCCTAACAT : 3240
28S (3881)
* 3260 * 3280 * 3300 * 3320 * 3340 * 3360 * 3380 * 3400 * 3420
Pwes-KR(3n : ACTCGGGCGCACCCACGTTGCGGCTGAAAGCCTTGACGGGGATGTGGCAACGGAATCGTGGCTCAGTGAATGATTTATGTGCGCGTTCCGCTGTCCTGTCTTCATCTGTGGTTTATGTTGCGCGTGGTCTGCTTTCGATGCTGACCTACGTATGTGCCATGTGGTTCATTCTCCTGACCT : 3420
* 3440 * 3460 * 3480 * 3500 * 3520 * 3540 * 3560 * 3580 * 3600
Pwes-KR(3n : CGGATCAGACGTGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTAAGCGGAGGAAGAGAAACTCACAAGGATTCCCTGAGTAACGGCGAGTGAACAGGGAAAAGCCCAGCACCGAAGCCTGTGGTCATTTGGTCACTAGGCAATGTGGTGTTCAGGTCGTTCCATAGAGGTGCTGCTCCACCC : 3600
* 3620 * 3640 * 3660 * 3680 * 3700 * 3720 * 3740 * 3760 * 3780
Pwes-KR(3n : TAAGTCCAGCAATGAGTACGGTGGTACGGACATGGCCCACAGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATCAGGCAGGCCAGTGCCTCTCTGGGTAGACCTTGGAGTCGGGTTGTTTGTGAATGCAGCCCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCCAAGGCTAAATACTTGCACGAGTCCGAT : 3780
* 3800 * 3820 * 3840 * 3860 * 3880 * 3900 * 3920 * 3940 * 3960
Pwes-KR(3n : AGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGCTCAGAGGTAAACGGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTTCGGGAATTCAGCTGGTGAGTGTGGTTTGGGCTTGGTCAAGTCGGTTGGACATTGAGGTCTGTGTAGCGGCAGGTCT : 3960
* 3980 * 4000 * 4020 * 4040 * 4060 * 4080 * 4100 * 4120 * 4140
Pwes-KR(3n : TTACTTTCGGGTAAGGATGCGCGATACACTTATCAAGTGTTGTGCGCCTCTTTGTTTATCGGGCCAATTTGCCAGTGCACTTTCTCGGAGTGTTCACCACGACCGGCACTGCTGTCTGATTGCTGTGGTTAAACCGGACTTACAGGGCTCTTGTGGCGTTGTATGGCCGGGAAGGCAGGT : 4140
* 4160 * 4180 * 4200 * 4220 * 4240 * 4260 * 4280 * 4300 * 4320
Pwes-KR(3n : AGCTCGTTGGCTAGCTTGCGGTTTACCGCTGGCGTTTGGTTTTCGAGTGTAAATAGCTGACCACGATATTTCTGTGCAGTGTGTCGGAGACGGCGGCTTGTGGTACGTGCGTGCGTGCCGGTTCTGCTGGCGTGTCCGGGTTTGGTTGTCATGTTGCTTGTGAATGCAGGCCTGGCAATG : 4320
* 4340 * 4360 * 4380 * 4400 * 4420 * 4440 * 4460 * 4480 * 4500
Pwes-KR(3n : GTTCGGATTCGTTTGGTGGGCGGTTGCGTATGTGGTGCCGTTGAGGGCCAACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGTGTAACGAAACCCACAGGCGCAGTGAAAGTAAAGGCTTGGCTTG : 4500
* 4520 * 4540 * 4560 * 4580 * 4600 * 4620 * 4640 * 4660 * 4680
Pwes-KR(3n : TCCAGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTTCACGCATGGTGCCACCAAGCAACGAGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGACGTAGACACATAATCTTCGGACCAGTGCACCGTCGGGGCGGAGCATGAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGT : 4680
* 4700 * 4720 * 4740 * 4760 * 4780 * 4800 * 4820 * 4840 * 4860
Pwes-KR(3n : TGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGACCGCAGCGATTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAACGTGAGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCCCTCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCTGGCGTTCGGAGAAGTAAACAGTTTTATCCGGTAAAGCGAATGA : 4860
* 4880 * 4900 * 4920 * 4940 * 4960 * 4980 * 5000 * 5020 * 5040
Pwes-KR(3n : TTAGAGGCCTTGGGGGCGAAACGTCCTCAACCTATTCTCAAACTTTAAATGGGTGAGAAGCTGAACTCGCTTGAGCGGAGTTGGGCGTTGAATGTGAGTGCCAAGTGGGCCATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGCTGTGGGATGAACCAAACGTCCGGTTAAGGTGCCTAACGCGACGCT : 5040
* 5060 * 5080 * 5100 * 5120 * 5140 * 5160 * 5180 * 5200 * 5220
Pwes-KR(3n : CATCAGATACCACAAAAGGTGTTGGTTGGTCTAGACAGCAGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGAGTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATCAACCAGCCCTGAAAATGGATGGCGCTGGAGCGTCGGACCTATACCGGACCGTTACTGCAAGCTGGGTCGGTAATGTGTG : 5220
* 5240 * 5260 * 5280 * 5300 * 5320 * 5340 * 5360 * 5380 * 5400
Pwes-KR(3n : GTGTGAGGGCAAGCCGCACGACTCAGGCACGGAGTGGTGGTAACGAGTAGGAGGGTCGCCGTGGTGAGCGGGAAGCTTCGGGCGTGAGCTTGAGTGGAGCCGCCACGGGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAGTGAGAACCTTGAAGGCCGAGGTGGAGAAGGGTTCCATG : 5400
* 5420 * 5440 * 5460 * 5480 * 5500 * 5520 * 5540 * 5560 * 5580
Pwes-KR(3n : GGAACAGCAGTTGGCCATGGGTCAGGCGGTCCTAAGTGATCCGATAACTCGGTACAGAGACGGGGTGCCTGACATTGTCAGGATTGCTGCTCGTATTGTTGCAAGGCAGCCCCCTGTAGCGAAAGGGAATCGGGTTAATATTCCCGACCCTGCCCACGGAGATTGGTGTATTCCGGTCTT : 5580
* 5600 * 5620 * 5640 * 5660 * 5680 * 5700 * 5720 * 5740 * 5760
Pwes-KR(3n : GTGCTGGTTTGCATCTAGCGCGGTAACGCAACCGACCTCGGAGACGTCGGCAAGAGTTCTGGGAAGAGTTCTCTTTTCTTTATTAGGAGTGCATCCATCCCCTGGAATCGGGTTGTCCGGAGATAGGGGACTAGCCTCCGTAAAGCACCACCCCTCTTGTGGTGTCCGGAACGCTCTTGT : 5760
* 5780 * 5800 * 5820 * 5840 * 5860 * 5880 * 5900 * 5920 * 5940
Pwes-KR(3n : CGGCCCTTGAAAATCCGAGCAAGGCAATATAATTTTCGTGGCAGGCCGTACCCATATCCGCATCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCTCTGGCATTTGAACAATGTAGGTAAGGGAAGTCGGCAAATTGGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTGAGGGCCGAGTCAAATGGGCTG : 5940
* 5960 * 5980 * 6000 * 6020 * 6040 * 6060 * 6080 * 6100 * 6120
Pwes-KR(3n : GAATCAGATACGTGCCGGTCAAGTTGGGGGCTGGTTTTTCTGTTACTCTGTTCGCTTCGGTGGATGGGGTCGATGGGATTACTGGACTCTGACCAGGCCGGTCGTGGACGATCTCAGCTGTAGTGCTGCTTGGTTCGCATCGCGCGTGGGAAACCGTGTGCGTTTGTGGCCTTGCTTCCT : 6120
* 6140 * 6160 * 6180 * 6200 * 6220 * 6240 * 6260 * 6280 * 6300
Pwes-KR(3n : TCGTTTGGCGTTAAACGGCTAACTCAGAACTGGCACGGACCAGGGGAATCCGACTGTCTAATTAAAACAAAGCATTGCGATGTCCACTGACCGGTTTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAAGAAATTCAATCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACT : 6300
* 6320 * 6340 * 6360 * 6380 * 6400 * 6420 * 6440 * 6460 * 6480
Pwes-KR(3n : ATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGTCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATTAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTCCGACTTTGTGA : 6480
* 6500 * 6520 * 6540 * 6560 * 6580 * 6600 * 6620 * 6640 * 6660
Pwes-KR(3n : GGAGACATGACGGGTGTAGAATAAGTGGGAGCCAGGTCCTTCGGGGTTTGGCGTCAGTGAAATACCACCACCGTCATTGTTTCTTTGCTTATTCAGTAAAGCGGGGTGCCAATTTTGGTCCTAAGCACATGCTGGCATGCGTGGCTTTGCTGCGGGTGTCGGTATCCTGGTCATGTCAGA : 6660
* 6680 * 6700 * 6720 * 6740 * 6760 * 6780 * 6800 * 6820 * 6840
Pwes-KR(3n : TGAGCCGTGGCTTCGGCTGCGGTGTTTGAGTTTGAATGTGATGTGCGACCCGTTCTGAAGACAATGTCAGGCGGGGAGTTTGACTGGGGCGGTACATCTGTCAAATGGTAACGCAGGTGTCCCAAGGTAAGCTCAGCCAGGACGGAAACCTGGCGTAGAGTAAAAGGGCAAAAGCTTACT : 6840
* 6860 * 6880 * 6900 * 6920 * 6940 * 6960 * 6980 * 7000 * 7020
Pwes-KR(3n : TGATTTTGATTTTCAGTACGAATACAGACCGTGAAAGCGTGGCCTATCGATCCTTTTGATTTTGATATTCGGAGTTTGAAGCTAGAGGTGTCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCGCTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTCCCT : 7020
* 7040 * 7060 * 7080 * 7100 * 7120 * 7140 * 7160 * 7180 * 7200
Pwes-KR(3n : AGCGTTGTGACGCAGAATTCACCAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTAATGAGTACAATGAAACAGTGAAGTACAAACTGGCCGTTGCTATGGTAATCCTGTTTAGTACGAGAGGAACCGCAGG : 7200
* 7220 * 7240 * 7260 * 7280 *
Pwes-KR(3n : TTCAGACATTTGGTATATGTGCCTGGTCGAAAGGCCAATGGTGCGAAGCTACCATCTGAGGGATTAGGACTGAACGCCTCTAAGTCTGAATC : 7292 bp (7,7 TRU) ///-IGS-///
=======================================
15
PHỤ LỤC II
PL2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu nghiên cứu
DNA tổng số từ SLP trưởng thành Paragonimus spp. nguyên con của từng
mẫu riêng biệt được tách chiết bằng bộ sinh phẩm DNeasy Blood and Tisue kit
(Qiagen Inc.. Mỹ) hoặc GeneJET™ Genomic DNA Purification Kit (Thermo
Scientific Inc., MA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA tổng số được thu
nhận với dung tích khoảng 100 L/mẫu, hàm lượng DNA là 50 ng/L.
Mô tả cụ thể tách chiết DNA tổng số bằng bộ sinh phẩm DNeasy Blood and
Tissue kit (Qiagen Inc.. Mỹ) :
- Mỗi mẫu sán lá ruột nhỏ (1 con) được nghiền trong 180 µL dung dịch
Tissue Lysis buffer (ATL) và bổ sung 20 µL Proteinase-K (100mg/ml) ủ ở 56oC/2
giờ cho đến khi mô được phân giải hoàn toàn.
- Tiếp tục bổ sung 200 µL dung dịch AL lắc đều ủ ở 56oC/30 phút.
- Thêm 200 µL Ethanol (100%), trộn đều, sau đó chuyển toàn bộ hỗn dịch
sang cột có màng lọc và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ phần dịch
phía dưới cột lọc.
- Thêm 500 µL dung dịch Washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc, ly tâm
13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới cột lọc.
- Tiếp tục thêm 500 µL dung dịch Washing buffer 2 (AW2) vào cột lọc để
rửa DNA, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới, rồi ly tâm lại
13.000 vòng/phút trong 2 phút để làm khô màng.
- Chuyển cột sang Eppendorf mới, thêm 60 µL dung dịch Elution buffer
(EL), để nhiệt độ phòng khoảng 2–3 phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2
phút. Bỏ cột, thu dịch bên dưới là DNA tổng số, ghi ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu
DNA ở –20oC cho đến khi sử dụng.
- Kiểm tra hàm lượng DNA tổng số bằng cách đo hấp phụ quang học (OD,
optical density) trên máy đo quang phổ kế NanoDrop®ND-1000 UV-Vis
Spectrophotometer (Thermo Scientific Inc.). DNA tổng số được pha thành nồng độ
50 ng/L, sử dụng 1–2 L cho mỗi phản ứng PCR có dung tích 50 L.
PL2.2. Phương pháp thiết kế mồi chung và mồi đặc hiệu mtDNA
Các mồi chung (hay còn gọi là mồi ty thể chung cho sán dẹt, universal-
16
platyhelminth primers) được sử dụng cho đề tài thu toàn bộ mtDNA SLP từ thiết kế
đã được liệt kê ở các công bố trước đây (Le et al., 2002; 2016; 2019) hoặc/và cải
tiến bổ sung thêm để thực hiện PCR dài (long-PCR/ L-PCR) với mục tiêu thu nhận
đoạn mtDNA có độ dài cao nhất có thể, 4–6 kb hoặc dài hơn (Bảng PL2.1). Một số
cặp mồi đặc hiệu mtDNA của từng loài Paragonimus spp. cũng được thiết kế để thu
nhận sản phẩm PCR ngắn (1,5–3 kb) từ khuôn DNA tổng số hoặc/và từ khuôn là
sản phẩm LPCR đã được thu nhận và các primer này cũng được sử dụng để giải
trình tự. Chuỗi mồi được thiết kế bằng chương trình Primer3Plus
(https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/).
Mồi chung sử dụng để thu nhận mtDNA của P. heterotremus và P. ohirai:
Sử dụng các cặp mồi chung: i) URNLF/URNSR thu vùng gen rrnL-rrnS
(~1000 bp); ii) TRECOBF/TRECOBR thu đoạn gen cob (~650 bp); iii)
PNAD1F/JNAD1R thu đoạn gen nad1 (~400 bp); iv) JB3F/JB4.5R thu đoạn gen
cox1 (444 bp) và giải trình tự. Các chuỗi này được sử dụng để thẩm định loài theo
danh pháp và tiếp tục thiết kế các mồi đặc hiệu khởi điểm cho các phản ứng
PCR/LPCR. Một số gen có mức độ bảo tồn cao như 16S (rrnL) hay 12S (rrnS) hay
chuỗi nucleotide của tRNAGly định vị ở sau gen nad5 được sử dụng thiết kế các mồi
lần lượt là UNI16F và UNI16R (trên rrnL), UNI12F và UNI12R (trên rrnS), GLYF
và GLYR (trên tRNAGly) cho các phản ứng L-PCR qua các vùng mã hóa và không
mã hóa của mtDNA (Bảng PL2.1).
Bảng PL2.1 liệt kê tất cả mồi chung và mồi đặc hiệu của từng loài đã được
thiết kế và sử dụng để thu sản phẩm PCR/LPCR có kích thước khác nhau của
mtDNA của P. heterotremus và P. ohirai. Trên cơ sở trình tự nucleotide của các
chuỗi đã thu nhận, tiếp tục thiết kế mồi và giải trình tự bằng phương pháp kế tiếp
lồng vào nhau, hay còn gọi là phương pháp “lao mồi” trực tiếp từ sản phẩm hoặc/và
sau khi tách dòng. Giải trình tự được thực hiện tại các cơ sở dịch vụ: Macrogen
(Hàn Quốc) tại (https://www.macrogen.com/en/main/); và Công ty Nam Khoa (Việt
Nam): (
PL2.3. Phương pháp thiết kế mồi giải trình tự đơn vị mã hóa ribosome
Bảng PL2.3 liệt kê tất cả mồi đã được sử dụng để thu sản phẩm PCR/LPCR
kích thước khác nhau của rTU của 6 chủng/5 loài là P. heterotremus, P. ohirai, P.
iloktsuenensis, P. miyazakii và loài P. westermani (2 chủng). Trên cơ sở trình tự
17
nucleotide của các chuỗi đã thu nhận, tiếp tục thiết kế mồi và giải trình tự bằng
phương pháp kế tiếp lồng vào nhau, hay còn gọi là phương pháp “lao mồi” trực tiếp
từ sản phẩm hoặc/và sau khi tách dòng. Giải trình tự được thực hiện tại các cơ sở
dịch vụ: Macrogen (Hàn Quốc) tại (https://www.macrogen.com/en/main/); và Công
ty Nam Khoa (Việt Nam): (
Mồi sử dụng để thu nhận rTU của 6 chủng/5 loài là P. heterotremus, P. ohirai,
P. iloktsuenensis, P. miyazakii và loài P. westermani (2 chủng) (Bảng PL2.3) được
kế thừa từ các nghiên cứu trước đây và thiết kế bổ sung dựa trên một số công bố về
rTU đã có trên Ngân hàng gen hoặc dữ liệu của chúng tôi công bố và hiện đang có
(Le et al., 2017; 2020b) hoặc được sưu tầm để kết hợp sử dụng (Olson et al., 2003;
Tkach et al., 2016). PCR/LPCR được áp dụng bằng cách phối hợp các cặp mồi khác
nhau và lệch nhau để thu các phần DNA (phân đoạn) dài ngắn khác nhau.
Toàn bộ mỗi đơn vị rTU (5’18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S-IGS 3’) của sán lá,
được biết cho đến nay có độ dài khoảng từ 7–8 cho đến 9–10 kb, tùy thuộc mỗi loài.
Phần mã hóa (coding region), tạm ký hiệu là rTU* được tính từ đầu 5’ của gen 18S
cho đến hết đầu 3’ của gen 28S, độ dài thường là khoảng 6–7 hoặc 8 kb, dài ngắn
khác nhau tùy loài Paragonimus. Các gen 18S, 5.8S, 28S rRNA cơ bản có độ dài cố
định ở các loài trong một chi, thậm chí trong một họ. Tuy nhiên, vùng ITS-1 (giữa
gen 18S và gen 5.8S) và ITS-2 (giữa gen 5.8S và gen 28S) và vùng bản lề IGS, ở
một số loài do có thể có nhiều cấu trúc lặp liền kề có số lượng khác nhau, nên tổng
kích thước sẽ khác nhau. Có một số mẫu chỉ thu được và giải trình tự được toàn bộ
phần mã hóa rTU*, không thu được vùng bản lề (IGS).
PL2.4. Thành phần phản ứng, thực hiện PCR và kiểm tra sản phẩm
Phản ứng PCR có thể điều chỉnh thành phần và chu trình nhiệt phù hợp để
thu sản phẩm PCR tốt nhất có thể thu nhận các phân đoạn của mtDNA và của rTU.
Chúng tôi giới thiệu phản ứng có hiệu suất tốt nhất đã được thực hiện.
Phản ứng có tổng thể tích 50 µL, gồm: 25 µL PCR mastermix (Thermo
Fisher Scientific, MA, USA), 2 µL mỗi loại mồi (10 pmol/µL), 2 µL khuôn DNA
(25–50 ng/µL), 2 µL DMSO (dimethyl sulfoxide) và 17 µL nước khử ion DEPC,
được thực hiện trên máy MJ PTC-100 (USA). Chu trình nhiệt gồm: 1 chu kỳ ở
95
oC/5 phút, 35 chu kỳ ở [94oC/1 phút, 52oC/1 phút; 72oC/2–6 phút], chu kỳ cuối ở
72
o
C/10 phút.
18
Phản ứng L-PCR được thực hiện với enzyme Phusion DNA polymerase
(Thermo Fisher Scientific Inc.), sản phẩm thu được có độ dài 4–6 kb với chất lượng
tốt. Sản phẩm PCR/LPCR thu được được điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%
nhuộm ethidium bromide, so sánh độ dài với chỉ thị DNA Lamda (HindIII). Sản
phẩm PCR đơn băng được tinh sạch trực tiếp bằng bộ sinh phẩm GeneJET PCR
Purification Kit (Thermo Scientific Inc.). Với sản phẩm đa băng, thì băng DNA
đúng với kích thước dự tính được phân lập từ thạch agarose bằng bộ sinh phẩm
GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific Inc.). Các sản phẩm PCR được tinh
sạch bằng bộ sinh phẩm GeneJET™ PCR Purification Kit và được gửi đi giải trình
tự tại các cơ sở dịch vụ đã giới thiệu.
PL2.5. Phương pháp thu nhận DNA ribosome các loài sán lá phổi
L-PCR được áp dụng thu nhận toàn bộ hoặc một phần ba (1/3) đến một nửa
(½) vùng sao chép rTU (độ dài khoảng 3 kb đến 4–5 kb, hoặc có thể đến 6 kb cho
mỗi sản phẩm) với enzyme của bộ sinh phẩm Phusion (Thermo Fisher Scientific).
Các sản phẩm có kích thước dự tính và có chất lượng tốt (rõ, đậm trên thạch
agarose) được tiếp tục sử dụng giải trình tự trực tiếp từ hai đầu biên hoặc/và làm
khuôn cho PCR/LPCR mới ở bên trong để có sản phẩm tiếp tục giải trình tự.
Phần lớn sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp sau khi tinh sạch sử dụng
bộ sinh phẩm GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific Inc., MA, USA)
theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chuỗi nucleotide của từng phân đoạn sau khi biên
tập (editing) bằng chương trình ChromasPro, được lồng nối liên tiếp với nhau để
thu nhận hoàn toàn trình tự rTU của mỗi loài. Sử dụng chuỗi nucleotide biên tập
cuối cùng để xác định gen, phân tích cấu trúc, sắp xếp gen, vùng biên, đặc điểm
chuỗi nucleotide nội gen và vùng giao gen. Các chương trình ChromasPro, BioEdit,
GENEDOC2.7 đã được sử dụng để thu nhận, xử lý, phân tích các chuỗi nucleotide,
đặc điểm các gen ribosome (18S, 5.8S, 28S) và vùng giao gen gồm ITS-1 và ITS-2
và vùng bản lề IGS.
PL2.6. Phương pháp tách dòng, thu DNA plasmid tái tổ hợp
Sản phẩm PCR hoặc được giải trình tự trực tiếp, nếu có chất lượng tốt và hàm
lượng đủ theo yêu cầu. Một số sản phẩm được tách dòng sử dụng vector TA cloning
thương mại là pCR2.1TOPO (Invitrogen) hoặc TOPO® XL PCR Cloning Kit
(Invitrogen Inc) (nếu sản phẩm PCR 2 kb, cho đến 4 kb), chọn lọc
19
plasmid tái tổ hợp để giải trình tự. DNA của plasmid tái tổ hợp được tách chiết với
bộ hoá chất GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.).
Nối sản phẩm PCR vào plasmid vector: Do sản phẩm PCR (sử dụng enzyme
Taq DNA polymerase) thông thường được gắn thêm Adenine (A) ở đầu 3’, nên khi
nối với vector có đầu lồi là Thymine (T) đã được các hãng sinh phẩm thiết kế từ
trước, thì hai nucleotide này sẽ gắn nối bổ sung cho nhau nhờ enzyme nối T4-DNA
ligase hoặc enzyme topoisomerase.
Vị trí để nối sản phẩm PCR vào được bố trí ở trong chuỗi gen lacZ, gen mã
hóa và sản xuất enzyme β-galactosidase, có tác dụng xúc tác thủy phân một loại hóa
chất có tên gọi là X-gal để tạo nên các dẫn chất có màu xanh. Vi khuẩn không mang
plasmid tái tổ hợp sẽ tạo nên khuẩn lạc màu xanh. Khi sản phẩm được nối vào vị trí
nối thành công, thì đoạn DNA ngoại lai làm bất hoạt gen lacZ không cho gen này
sản xuất ra enzyme β-galactosidase. Do vậy, vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp sẽ
không có enzyme β-galactosidase phân giải cơ chất X-gal tạo màu xanh, nên khuẩn
lạc sẽ mang màu trắng khi nuôi trên môi trường có chứa X-gal.
Chuyển nạp và nuôi cấy trên thạch: Tế bào sử dụng để chuyển nạp là tế bào
khả biến (competent cells) E. coli chủng DH5αT1 hoặc Top10 (Invitrogen). Lấy 2–
3 µL sản phẩm của phản ứng nối-ghép, chuyển vào ống chứa 50 µL hoặc 100 µL tế
bào khả biến DH5αT1; Ủ trên đá trong 45 phút, xử lý nhiệt (heat-shock) ở 42oC/45
giây và lập tức chuyển vào trong đá và để 2 phút. Thêm 150 µL dung dịch SOC
(dung dịch giàu dinh dưỡng), lắc 200 vòng/phút ở 37oC/1 giờ 30 phút; rồi tiếp tục
lấy toàn bộ hỗn hợp dàn trên mặt thạch (LB agar 1,5%) có chứa kháng sinh
Kanamycin (hay Ampicillin) và X-gal và ủ ở tủ ấm 37oC trong 18–20 giờ. Sau khi
ủ, nếu có khuẩn lạc phát triển trên mặt thạch (sau 18–20 giờ), thì đưa đĩa thạch vào
khoang lạnh (10oC) trong tủ lạnh để X-gal được phân giải hoàn toàn, giúp nhận biết
dễ dàng khuẩn lạc trắng và xanh trong quá trình chọn lọc khuẩn lạc.
Chọn lọc khuẩn lạc và nuôi cấy trong môi trường lỏng: Chọn lấy một số
khuẩn lạc màu trắng (4–6 khuẩn lạc) để nuôi cấy trong các ống chứa môi trường
LB lỏng có kháng sinh Kanamycin (10 µL Kanamycin (50mg/mL) cho 1 ống LB
nuôi cấy). Chọn khuẩn lạc màu trắng ngà là tốt nhất. Bổ sung thêm 7 µL X-gal
(40mg/ml) vào môi trường để phân biệt vi khuẩn tái tổ hợp phát triển (không có
màu xanh) và loại bỏ vi khuẩn không tái tổ hợp (ống có màu xanh). Sau khi cấy
20
khuẩn lạc, ống môi trường được lắc ở 220 vòng/phút trong 16–20 giờ ở 37oC cho vi
khuẩn nhân lên.
Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp: Sử dụng bộ kit QIAprep Spin Miniprep
của hãng QIAGEN theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Lấy 1,5 mL dung dịch tế bào vi khuẩn tái tổ hợp đã được nuôi cấy qua đêm,
ly tâm 10.000 vòng/phút trong 4–5 phút để thu cặn tế bào. Thêm 250 µL dung dịch
P1 để hòa tan cặn, hút nhẹ nhàng lên xuống vài lần rồi cho tiếp 250 µL dung dịch
P2; để ở nhiệt độ phòng trong 3–4 phút.
- Thêm 350 µL dung dịch N3, trộn nhẹ; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10
phút. Thu dịch trong bên trên (~ 800 µL) cho lên trên bề mặt màng của cột lọc đặt
trong 1 ống hứng (collection tube); ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch
bên dưới.
- Thêm 500 µL dung dịch PB lên trên màng lọc để rửa màng lọc có DNA của
plasmid; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch bên dưới.
- Thêm 750 µL dung dịch PE lên trên màng lọc để tiếp tục rửa màng lọc; ly
tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch bên dưới.
- Cuối cùng, ly tâm tiếp 13.000 vòng/phút trong 1 phút cho màng chứa DNA
của plasmid tái tổ hợp thật khô, bỏ phần dịch bên dưới. Chuyển cột lọc sang ống
Eppendorf mới và thêm 50 µL dung dịch EB lên trên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng
3–4 phút.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1–2 phút. DNA của plasmid tái tổ hợp được
“thôi” ra cùng với dung dịch EB (50 µL) và thu DNA của plasmid tái tổ hợp trong
ống, ký hiệu và bảo quản ở –20oC cho đến khi sử dụng.
Cắt kiểm tra DNA tái tổ hợp: Lấy 1 L DNA plasmid tái tổ hợp, dùng enzyme
giới hạn EcoRI cắt DNA plasmid, ủ ở 37oC trong 2 giờ; điện di trên thạch agarose 1%
và kiểm tra độ dài của các băng thu được để tính toán độ dài của sản phẩm PCR
ngoại lai có trong plasmid vector. Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp giải trình tự sử
dụng mồi chung M13F (5´- GTAAAACGACGGCCAG-3´) hoặc M13R (5´-
CAGGAAACAGCTATGAC-3´).
PL2.7. Phương pháp giải trình tự và xử lý chuỗi nucleotide
Sản phẩm PCR ngắn (<1,2–1,3 kb) được giải trình tự trực tiếp bằng mồi xuôi
và mồi ngược bám vào hai đầu biên (flanking primers) đó cũng chính là cặp primer
21
được sử dụng thực hiện phản ứng PCR tạo nên sản phẩm đó. Trong trường hợp giải
trình tự với sản phẩm PCR dài (>1,3 kb, đến vài kb), nếu sản phẩm có chất lượng
đơn nhất, rõ, tốt, ngoài cặp mồi hai đầu biên tham gia giải trình tự, chúng tôi thiết
kế các mồi kế tiếp cho chuỗi sau lồng bám vào chuỗi trước (gọi là “lao mồi”,
“primer-walking” strategy) (Le et al., 2017) để thu chuỗi hai chiều. Với đoạn DNA
đã chèn vào plasmid tái tổ hợp, sử dụng mồi chung M13F (5´-
GTAAAACGACGGCCAG-3´) và M13R (5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´),
hoặc các mồi được thiết kế thêm bên trong (internal primers) để giải trình tự. Chuỗi
nucleotide sơ cấp do cơ sở dịch vụ cung cấp được biên tập (editing) từ giản đồ trình
tự (chromatogram) để thu chuỗi thứ cấp bằng chương trình ChromasPro
( sau đó sắp xếp và thu chuỗi cuối
cùng bằng chương trình GENEDOC 2.7 (
Phân tích phả hệ bằng chương trình MEGA 7 hoặc MEGA X
(https://www.megasoftware.net/) sử dụng phương pháp ”kết nối liền kề” (Neighbor-
Joining, NJ) hoặc ”tiếp cận cực đại” (Maximum likelihood, ML) với hệ số tin cậy
(bootstrap) 1000 lần lặp lại (Kumar et al., 2016; 2018).
PL2.8. Phương pháp truy cập thu thập chuỗi so sánh và sắp xếp căn chỉnh
Sau khi có chuỗi cuối cùng, việc đầu tiên là xác định chuỗi đó có đúng chuỗi
của loài đang cần không. Việc giám định chuỗi được thực hiện bằng cách truy cập
vào Ngân hàng gen sử dụng chương trình BLAST
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) để xem xét thu nhận các chuỗi tương ứng
cùng và khác loài/chi/họ để so sánh đối chiếu. Nhiều trường hợp, chuỗi được giám
định bằng cách so sánh với các chuỗi trong kho dữ liệu của chúng tôi (Dữ liệu các
loài sán dẹt).
Một số lượng vài chục chuỗi (nếu có) của các chủng /loài gần gũi và của các
chủng /loài trong các chi/họ/liên họ/phân bộ tương ứng được thu nhận từ mọi nguồn
để sử dụng sắp xếp căn chỉnh (alignment). Sắp xếp căn chỉnh có thể thực hiện trực
tuyến (online) qua chương trình Gene Infinity ( hoặc
các chương trình so sánh chuỗi có tại trang Web Expasy (https://www.expasy.org/).
Tuy nhiên chúng tôi sử dụng chương trình GENEDOC 2.7 và MEGA 7 hoặc
MEGA X. Từng trường hợp sử dụng sẽ được giới thiệu chi tiết ở các mục tương
ứng.