Luận án Nghiên cứu hệ gen ty thể, đơn vị mã hóa Ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và một số khu vực ở châu Á

Nghiên cứu hệ gen ty thể: + Toàn bộ hệ gen ty thể (mtDNA) hoàn chỉnh của sán lá phổi đã được thu nhận của loài Paragonimus heterotremus (chủng LC, Việt Nam) có kích thước 15.722 bp (KY952166) và của loài Paragonimus ohirai (chủng Kino, Nhật Bản) có kích thước 14.818 bp (KX765277). Hệ gen được xác định chứa 36 gen, gồm 12 gen mã hóa protein (PCG), 2 gen ribosome ty thể (MRG), 22 gen vận chuyển amino acid (tRNA) và một vùng không mã hóa (NCR) chứa cấu trúc lặp liền kề, sắp xếp như sau: {5’-cox3-H-cob-nad4L-nad4-QFM-atp6-nad2-VAD-nad1-NPIK-nad3- S1W-cox1-T-rrnL-C-rrnS-cox2-nad6-YL1S2L2R-nad5-GE-NCR[LRU#;SRU#]-3’}. + Đặc điểm gen và hệ gen đã được phân tích đầy đủ ở cả hai loài, trong đó tổng thành phần nucleotide sử dụng A+T > G+C, với công thức sử dụng T>G>A>C; giá trị độ lệch (skew/skewness) của AT thiên về lệch âm và GC là lệch dương; “thiên vị” bộ mã nhiều nhất là Phe-TTT và Leu-TTG, ít nhất là Arg-CGA, Arg-CGC. Khoảng cách di truyền giữa 9 chủng/4 loài P. heterotremus, P. ohirai, P. westermani và P. kellicotti thuộc họ Paragonimidae cũng đã được xác định. + Phân tích phả hệ sán lá phổi dựa trên chuỗi amino acid cộng hợp của 12 PCG đều xác định vị trí “đồng vị” hay “chị em” (sister, monophyly) của họ Paragonimidae/phân bộ Troglotremata với phân bộ Procephalata và “lệch vị"” (paraphyly) với phân bộ Opisthorchiata.

pdf187 trang | Chia sẻ: huydang97 | Ngày: 27/12/2022 | Lượt xem: 158 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu hệ gen ty thể, đơn vị mã hóa Ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và một số khu vực ở châu Á, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
GGGGGCATTTGTATGGCGGTGTTAGAGGTGAAATTCTTGGATCGCCGCCAGACAAACTACAGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCTGGAGCGAA : 1080 * 1100 * 1120 * 1140 * 1160 * 1180 * 1200 * 1220 * 1240 * 1260 Pmiy-OkuST : AGTCAGAGGTTCGAAGACGATCAGATACCGTCCTAGTTCTGACCATAAACGATGCCAACTGACGATCCGCGGTGGTTCTTTTATTGTCCCCGCGGGCAGTCCCCGGGAAACCTTTAAGTCTTTGGGCTCCGGGGGAAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGC : 1260 * 1280 * 1300 * 1320 * 1340 * 1360 * 1380 * 1400 * 1420 * 1440 Pmiy-OkuST : ACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTCGACTCAACACGGGAAAACTCACCCGGCCCGGACACTGTGAGGATTGACAGATTGAAAGCTCTTTCTTGATTCGGTGGTTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACTTTG : 1440 * 1460 * 1480 * 1500 * 1520 * 1540 * 1560 * 1580 * 1600 * 1620 Pmiy-OkuST : GCCTGCTAAATAGTATGCCTGTCCTCTGTGCTCGTGCGGGTGGCGGTGCTCGCTGCCTCTTCGGGGGTGGTGGCGCCGTTCGCCGGCGGGTGCTGCGCAGGTGTTTACTTCTTAGAGGGACAAGCGGCGTGACAGTCGCACGAAAATGAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGT : 1620 * 1640 * 1660 * 1680 * 1700 * 1720 * 1740 * 1760 * 1780 * 1800 Pmiy-OkuST : CCGGGGCCGCACGTGCGCTACAATGACGGTTTCAGCGAGTCTGGGAACCTGGCCTGAAAGGGTTGGGCAAACTGAGTCATCACCGTCGTGACTGGGATCGGGGCTTGCAATTGTTCCCCGTGAACGAGGAATTCCTGGTAAGTGCAAGTCATAAGCTTGCGCTGATTACGTCCCTGCCCT : 1800 ITS1 (634) * 1820 * 1840 * 1860 * 1880 * 1900 * 1920 * 1940 * 1960 * 1980 Pmiy-OkuST : TTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTTTAGCAAGGTCCTCGGATTGGTGCCATTGTAGTTGTTTCGGCAGCTCGACCGGCGCTGAGAAGACGACCAAATTTGAACATTTAGAAGTGAAAGTCGTGACAAAGTTTCCGTAGGTGAACCTGGAGAAGGATCATTAGAGAA : 1980 * 2000 * 2020 * 2040 * 2060 * 2080 * 2100 * 2120 * 2140 * 2160 Pmiy-OkuST : TTGCCGAAATTCAAAATGCCTCGATGAGCAAATGGGCAAGTGTTCTCCACGGGTAGTCATACGCCTTAAATGCAGCTTCGGCTGCCTCAGGTAGAGCGTCTCTCCCCTGCCATTTGATTCAGCTGTGTCTGGCGAACTCCAGTGGCTGCATTCAGTTGAATCTTTTCCGACGAGCCTTCA : 2160 * 2180 * 2200 * 2220 * 2240 * 2260 * 2280 * 2300 * 2320 * 2340 Pmiy-OkuST : GTTTTGTTGGATGCAACCTCATCTGCATCAGGTGGAGCGTCTTTCCTATGCCATTTAATCCAGCTGTACCTGGCGCACATGCGTGCCAATGTACAGTTATCCTTGCAGCAAGGCACCTACCTATCCGATGCTCTTTGAGTTGCTTGCCATTTTCGGATAGCGAATGCATCTCGGGAGTGA : 2340 * 2360 * 2380 * 2400 * 2420 * 2440 * 2460 * 2480 * 2500 * 2520 Pmiy-OkuST : CGGGTTGTACTGTGCTCATAGACAGCGCCAGGCTTAATGGGTGGTGAGGCATATTGAGCTACAGATCGGCCACCGCCATGTTTTGTTCCAATCTATGCCATTTCACACTGTTCAAGTGGTCCAGGTCGGCCTGTCTGAATTGGTCCATTGCCCGACATGCATCCGGTTCCGTACTGGACT : 2520 5.8S (160) * 2540 * 2560 * 2580 * 2600 * 2620 * 2640 * 2660 * 2680 * 2700 Pmiy-OkuST : GCATGTACAGTCGACTGGCGGTGCCTGATCCCGGGCTTGACTGGCTAACCATACGTCGTTCTTCTGGCTGACTGGATGTTCCATGTGAGTATAGCTCTGTATGGTGGGTCACTTGGCTCGTGTGTTGATGAAGAGCGCAGCCAACTGTGTGAATTAATGTGAAATGCATACTGCTTTGAA : 2700 ITS2 (283) * 2720 * 2740 * 2760 * 2780 * 2800 * 2820 * 2840 * 2860 * 2880 Pmiy-OkuST : CATCGACATCTTGAACGCATATTGCGGCCACGGGTTAGCCTGTGGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCTTATAAACTATCGCGACGCCCAAAAAGTCGCGGCTTGGGTTTTGCCAGCTGGCGTGATTTCCCCAACCTGGCCTCGTGGCTGTGGGGTGCCAGATCTGTGGCGTTTCCCTAAC : 2880 28S (3881) * 2900 * 2920 * 2940 * 2960 * 2980 * 3000 * 3020 * 3040 * 3060 Pmiy-OkuST : ATATCCGGGCGTACCCATGTTGTGGCTGAAAGCTTTGATGGGGATGTGGCAACGGAATCGTGGCTCAGTGATTGATTTGTGCGCGTTCCGCTATCCTATCATCGTCTATGGTTGATGTTGCGCGTGGTGTGTGCCCGATGCTGACCTATGTATGTGCCATGTGGCTCATTCTCCTGACCT : 3060 * 3080 * 3100 * 3120 * 3140 * 3160 * 3180 * 3200 * 3220 * 3240 Pmiy-OkuST : CGGATCAGACGTGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCTGAGTAACGGCGAGTGAACAGGGAAAAGCCCAGCACCGAAGCCTGTGGTCATTTGGTCACTAGGCAATGTGGTGTTCAGGTCGTTCCATAGAGGTGCTGCTCCACCC : 3240 * 3260 * 3280 * 3300 * 3320 * 3340 * 3360 * 3380 * 3400 * 3420 Pmiy-OkuST : TAAGTCCAGCAATGAGTACGGTGGTACGGACATGGCCCACAGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATCAGGCAGGCCAGTGCCTCTCTGGGTAGACCTTGGAGTCGGGTTGTTTGTGAATGCAGCCCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCCAAGGCTAAATACTTGCACGAGTCCGAT : 3420 * 3440 * 3460 * 3480 * 3500 * 3520 * 3540 * 3560 * 3580 * 3600 Pmiy-OkuST : AGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGCTCAGAGGTAAACGGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTTTGGGGATTCAGCTGGTGAGTGTGGTTTGAGCTTGGTCAAGTCGGTTGGACATTGGGGTCTGTGTAGCAGCAGGTCT : 3600 * 3620 * 3640 * 3660 * 3680 * 3700 * 3720 * 3740 * 3760 * 3780 Pmiy-OkuST : CTGCCCTTGGGCAGGGATGCGCGATGCACTTATCAGGTGTTGTGCGCCTCTTTGTTTATCGGGCCAATTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGGCACTGCTGTCTGACTACTGTGGTTAAACCGGACTTACAGAGCACTTGTGGTTTTGTATGGCCGGGAAGGCAGGT : 3780 * 3800 * 3820 * 3840 * 3860 * 3880 * 3900 * 3920 * 3940 * 3960 Pmiy-OkuST : AGCTCGTTGGCTAGCTTGTGGTTTACTGCAGGCGTTTGGTTTTCGAGTGTAATTAGCTGACCACGATTGTTCTGTGCAGTGTGTCGGAGACGGCGGCTTGTGGTACTTGCGTGCGTGCCGGTCCTGCTGGCGTGTTCGGGTTTGGTTGCCATGTTGCTTGTGAATGCAGGCCTGGTGATA : 3960 * 3980 * 4000 * 4020 * 4040 * 4060 * 4080 * 4100 * 4120 * 4140 Pmiy-OkuST : GCTCGGATTCGTTCGGTTGGCGGTTGCGTGCGTGGTGCCGTTAAGGGCCAACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTAACGAAACCCACAGGCGCAGTGAAAGTAAAGGCCCGGCTTG : 4140 * 4160 * 4180 * 4200 * 4220 * 4240 * 4260 * 4280 * 4300 * 4320 Pmiy-OkuST : TCCAGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTTCACGCATGGTACCACCAAGCAACGAGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGACGTAGACACATAATCTTCGGACCAGTGCACCGTCGGGGCGGAGCATGAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGT : 4320 * 4340 * 4360 * 4380 * 4400 * 4420 * 4440 * 4460 * 4480 * 4500 Pmiy-OkuST : TGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGACCGCAGCGATTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAACGTGAGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCCCTCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCTGGCGTTCGGAGAAATAAACAGTTTTATCCGGTAAAGCGAATGA : 4500 * 4520 * 4540 * 4560 * 4580 * 4600 * 4620 * 4640 * 4660 * 4680 Pmiy-OkuST : TTAGAGGCCTTGGGGGCGAAACGTCCTCAACCTATTCTCAAACTTTAAATGGGTGAGAAGCTGAACTCGCTTGAGCGGAGTTGGGCGTTGAATGTGAGTGCCAAGTGGGCCATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGCTGTGGGATGAACCAAACGTCCGGTTAAGGTGCCTAACGCGACGCT : 4680 * 4700 * 4720 * 4740 * 4760 * 4780 * 4800 * 4820 * 4840 * 4860 Pmiy-OkuST : CATCAGATACCACAAAAGGTGTTGGTTGGTCTAGACAGCAGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGAGTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATCAACCAGCCCTGAAAATGGATGGCGCTGGAGCGTCGGACCTATACCGGACCGTTACTGCAAGCTGAGTCGGTAATGTGTG : 4860 * 4880 * 4900 * 4920 * 4940 * 4960 * 4980 * 5000 * 5020 * 5040 Pmiy-OkuST : GTGTGAGGGCAAGCCGCACGACTCAGGCACGGAGTGGTGGTAACGAGTAGGAGGGTCGCCGTGGTGAGCGGGAAGCTTCGGGCGTGAGCTTGAGTGGAGCCGCCACGGGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAGTGAGAACCTTGAAGGCCGAGGTGGAGAAGGGTTCCATG : 5040 * 5060 * 5080 * 5100 * 5120 * 5140 * 5160 * 5180 * 5200 * 5220 Pmiy-OkuST : GGAACAGCAGTTGGCCATGGGTCAGGCGGTCCTAAGTGATCCGATAACTCGGTACAGAGACGGGGTGCCTGACATTGTCAGGATTGCTGCTCGTATTGTTGCAAGGCAGCCCCCTGTAGCGAAAGGGAATCGGGTTAATATTCCCGACCCTGCCCACGGAGATTGGTGTATTCCGGTCTT : 5220 * 5240 * 5260 * 5280 * 5300 * 5320 * 5340 * 5360 * 5380 * 5400 Pmiy-OkuST : GTGCTGGTTTGCATCTAGCGCGGTAACGCAACCGACCTCGGAGACGTCGGCAAGAGTTCTGGGAAGAGTTCTCTTTTCTTTATTAGGAGTGCATCCATCCCCTGGAATCGGGTTGTCCGGAGATAGGGGACTAGCCTCCGTAAAGCACCACCCCTCTTGTGGTGTCCGGAACGCTCTTGT : 5400 * 5420 * 5440 * 5460 * 5480 * 5500 * 5520 * 5540 * 5560 * 5580 Pmiy-OkuST : CGGCCCTTGAAAATCCGAGCAAGGCAATATAATTTTCGTGGCAGGCCGTACCCATATCCGCATCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCTCTGGCATTTGAACAATGTAGGTAAGGGAAGTCGGCAAATTGGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTGAGGGCCGAGTCAAATGGGCTG : 5580 * 5600 * 5620 * 5640 * 5660 * 5680 * 5700 * 5720 * 5740 * 5760 Pmiy-OkuST : GGATCAGATACGTGCCGGTCAAGTTGGGGGCTGGTTTTTCTGTCACTCTGTTCGCTTCGGTGGATGGGGTCGATGGGATTACTGGACTCTGACCAGGCCGGTCGTGGACGATCTCAGCTGTAGTGCTGCTTGGTTCGCATCGCGCGTGGGAAACTGTGTGCGTTTGTGGCCTTGCTTCCT : 5760 * 5780 * 5800 * 5820 * 5840 * 5860 * 5880 * 5900 * 5920 * 5940 Pmiy-OkuST : TCGTTTGGCGTTAAACGGCTAACTCAGAACTGGCACGGACCAGGGGAATCCGACTGTCTAATTAAAACAAAGCATTGCGATGTCCACTGACCGGTTTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAAGAAATTCAATCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACT : 5940 * 5960 * 5980 * 6000 * 6020 * 6040 * 6060 * 6080 * 6100 * 6120 Pmiy-OkuST : ATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGTCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATTAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTCCGACTTTGTGA : 6120 * 6140 * 6160 * 6180 * 6200 * 6220 * 6240 * 6260 * 6280 * 6300 Pmiy-OkuST : GGAGACATGACGGGTGTAGAATAAGTGGGAGCCAGGTCCTTCGGGGTTTGGCGTCAGTGAAATACCACCACCGTCATTGTTTCTTTGCTTATTCAGTAAAGCGGGGTGCCAATTTTGGTCCTAAGCACATGCTGGCATGCGTGGCTTTGCTGCGGGTGTCGGTATCCTGGTCATGTCAGA : 6300 * 6320 * 6340 * 6360 * 6380 * 6400 * 6420 * 6440 * 6460 * 6480 Pmiy-OkuST : TGAGCCGTGGCTTCGGCTGCGGTGTTTGAGTTTGAATGTGATGTGCGACCCGTTCTGAAGACAATGTCAGGCGGGGAGTTTGACTGGGGCGGTACATCTGTCAAATGGTAACGCAGGTGTCCCAAGGTAAGCTCAGCCAGGACGGAAACCTGGCGTAGAGTAAAAGGGCAAAAGCTTACT : 6480 * 6500 * 6520 * 6540 * 6560 * 6580 * 6600 * 6620 * 6640 * 6660 Pmiy-OkuST : TGATTTTGATTTTCAGTACGAATACAGACCGTGAAAGCGTGGCCTATCGATCCTTTTGATTTTGATATTCGGAGTTTGAAGCAAGAGGTGTCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCGCTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTCCCT : 6660 * 6680 * 6700 * 6720 * 6740 * 6760 * 6780 * 6800 * 6820 * 6840 Pmiy-OkuST : AGCGTTGTGACGCAGAATTCACCAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTAATGAGTACAATGAAACAGTGAAGTACAAACTGGCCGTTGCTATGGTAATCCTGTTTAGTACGAGAGGAACCGCAGG : 6840 * 6860 * 6880 * 6900 * 6920 * Pmiy-OkuST : TTCAGACATTTGGTATATGTGCCTGGTCGAAAGGCCAATGGTGCGAAGCTACCATCTGAGGGATTAGGACTGAACGCCTCTAAGTCTGAATC : 6932 bp (0 TRU) ///-IGS-/// 13 Hình PL3.8. Trình bày diễn giải gen và vùng giao gen của đơn vị mã hóa ribosome (rTU) loài Paragonimus westermani (2n) của Ấn Độ (Pwes-Megha(2n)-IN), thiếu IGS (8.616 bp; ITS1 chứa 15,7 TRU) 18S (1977) * 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * 120 * 140 * 160 * 180 Pwes(2n)-I : AACATGGGTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAGAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTACATACCTCAAAACGGTGAAACCGCGAATGGCTCATTAAATCAGCTATGGTTCCTTAGATCGTACATACTACATGGATAACTGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCCACTATGC : 180 * 200 * 220 * 240 * 260 * 280 * 300 * 320 * 340 * 360 Pwes(2n)-I : CCTGACCCGCGAGGGAACGGGTGGATTTATTAGAACAGAACCAACCGGTTGTGGCCTTGGCTGCATCCGTTGTACTCTGTGATGACTCTGGATAACTTCACTGATCGCGTCGGCCTTGTGTCGGCGACGGATCTTTCAAATGTCTGCCCTATCAATTTGCGATGGTAGGTGACCTGCCTA : 360 * 380 * 400 * 420 * 440 * 460 * 480 * 500 * 520 * 540 Pwes(2n)-I : CCATGGTGATAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACTTCCAAGGAAGGCAGCAGGCACGCAAATTACCCAATCCCGGCACGGGGAGGTAGTGACGAAAAATACGAATACGGGACTCAACAGAGGCTCCGTAATTCGAATGAGTACA : 540 * 560 * 580 * 600 * 620 * 640 * 660 * 680 * 700 * 720 Pwes(2n)-I : ATTTAAATCCTTTAACGAGGATCAACTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAACTCCAGCTCCAGAAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATCTGGGTCGCATGGCTACGTGCCGTCGCTCACTTTCTCGGTTGGCTGTTAAGGCCCTGGGTGTG : 720 * 740 * 760 * 780 * 800 * 820 * 840 * 860 * 880 * 900 Pwes(2n)-I : GTGGGTCGGTGTCGTGGTTGTGTGGTCTTTCTGCCGTGTCTGGTTCACAGGTGCTGACTAGGCCTTCGGGTTTGTCGGCATGCTCCCACATGCCTTTAAACGGGTGTCTgGGGCGGACTGCACgTTTACTTTGAACAAATTTGAGTGCTCAAAGCAgGCCCTTGTGCCTGAAAATTCTTG : 900 * 920 * 940 * 960 * 980 * 1000 * 1020 * 1040 * 1060 * 1080 Pwes(2n)-I : CATGGAATAATGGAATAGGACTTCgGTTCTATTTTGTTGGTTTTCGGATCCgAAGTAATGGTTAAGAGGGACAGACGGGGTCATTTGTATGGCGGTGTTAGAGGTGAAATTCTTGgATCGCCGcCAGACAAACTACAGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCTGGAGCGAA : 1080 * 1100 * 1120 * 1140 * 1160 * 1180 * 1200 * 1220 * 1240 * 1260 Pwes(2n)-I : AGTCAGAGGTTCGAAGACGATCAGATACCGTCCTAGTTCTGACCATAAACGATGCCAACTGACGATCCGCGGTGGTTCTTTTATTGTCCCCGCGGGCAGTCCCCGGGAAACCTTTAAGTCTTTGGGCTCCGGGGGAAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGC : 1260 * 1280 * 1300 * 1320 * 1340 * 1360 * 1380 * 1400 * 1420 * 1440 Pwes(2n)-I : ACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTCGACTCAACACGGGAAAACTCACCCGGCCCGGACACTGTGAGGATTGACAGATTGAAAGCTCTTTCTTGATTCGGTGGTTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACTTTG : 1440 * 1460 * 1480 * 1500 * 1520 * 1540 * 1560 * 1580 * 1600 * 1620 Pwes(2n)-I : GCCTGCTAAATAGTATGCCTGTCCTCTGTGCCCGTGCGGGTGGCGGTGCTCGCTGCCTCTTCGGGGGTAGTGGTGTCGTTCGCCGGCGGGTACTGCGCAGGTGTTTACTTCTTAGAGGGACAAGCGGCGTGACAGTCGCACGAAAATGAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGT : 1620 * 1640 * 1660 * 1680 * 1700 * 1720 * 1740 * 1760 * 1780 * 1800 Pwes(2n)-I : CCGGGGCCGCACGTGCGCTACAATGACGGTTTCAGCGAGTCTGGGAACCTGGCCCGAAAGGGTTGGGCAAACTGAGTCATCACCGTCGTGACTGGGATCGGGGCTTGCAATTGTTCCCCGTGAACGAGGAATTCCTGGTAAGTGCAAGTCATAAGCTTGCGCTGATTACGTCCCTGCCCT : 1800 ITS1 (2313) * 1820 * 1840 * 1860 * 1880 * 1900 * 1920 * 1940 * 1960 * 1980 Pwes(2n)-I : TTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTTTAGCAAGGTCCTCGGATTGGTGCCATTGTAGTTGCTTCGGCAGCTCGACCGGCGCTGACAAGACGACCAAACTTGATCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACA : 1980 Int. seq 1 (77) * 2000 * 2020 * 2040 * 2060 TRU1 * 2080 * 2100 * 2120 * 2140 * 2160 Pwes(2n)-I : GAATTCCCAAATCTAAAGGTGCCTAAATGAGCACAAGGGCAAGTGTTTTCTCAACGAGCAGTCATGCTCGTCAATTGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCC : 2160 * 2180TRU2 * 2200 * 2220 * 2240 * 2260 * 2280 * 2300TRU3 * 2320 * 2340 Pwes(2n)-I : TTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTG : 2340 * 2360 * 2380 * 2400 * 2420TRU4 * 2440 * 2460 * 2480 * 2500 * 2520 Pwes(2n)-I : ATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCC : 2520 * 2540TRU5 * 2560 * 2580 * 2600 * 2620 * 2640 * 2660TRU6 * 2680 * 2700 Pwes(2n)-I : TTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTG : 2700 * 2720 * 2740 * 2760 * 2780TRU7 * 2800 * 2820 * 2840 * 2860 * 2880 Pwes(2n)-I : ATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCC : 2880 * 2900TRU8 * 2920 * 2940 * 2960 * 2980 * 3000 * 3020TRU9 * 3040 * 3060 Pwes(2n)-I : TTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTG : 3060 * 3080 * 3100 * 3120 * 3140TRU10 * 3160 * 3180 * 3200 * 3220 * 3240 Pwes(2n)-I : ATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCC : 3240 * 3260TRU11 * 3280 * 3300 * 3320 * 3340 * 3360 * 3380TRU12 * 3400 * 3420 Pwes(2n)-I : TTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTG : 3420 * 3440 * 3460 * 3480 * 3500TRU13 * 3520 * 3540 * 3560 * 3580 * 3600 Pwes(2n)-I : ATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCC : 3600 * 3620TRU14 * 3640 * 3660 * 3680 * 3700 * 3720 * 3740TRU15 * 3760 * 3780 Pwes(2n)-I : TTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTG : 3780 Int. seq 2 (350) * 3800 * 3820 * 3840 * 3860TRU15.7 * 3880 * 3900 * 3920 * 3940 * 3960 Pwes(2n)-I : ATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGAATCTTTTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGATTCGGCTGTGCCTGGCGCACTCGTGTGCCTACGTACAGTTATGCTTGCAGCAGGGTGCC : 3960 * 3980 * 4000 * 4020 * 4040 * 4060 * 4080 * 4100 * 4120 * 4140 Pwes(2n)-I : TACCTGTCTGATGCCCTTCGTTTTGCTTGCCATCTTTTGATGGTCAGTCCATCTCGTGGGTGACGGGTTGTACTGTCTTCATGGACAGTGCTAGGCTTAATGAGTGGTACGGCATATTGAGCTACGGCTCGGCCACCGCCCTGTTTGTTATAATTTATGCCATTTTACACTGTTCAAGTG : 4140 5.8S (160) * 4160 * 4180 * 4200 * 4220 * 4240 * 4260 * 4280 * 4300 * 4320 Pwes(2n)-I : GTTCAGGTCAGCTCGTCTGGGCTGTTCCATTGCCCGACATGCACCCGGTCTCGTACTGGACTGCATGTACAGTCGCCTGGCGGTGCCTTATCCCGGGCTAGACTGGTTAACCATACGTCGTTCGTCTGGGTGACTGGATGTTCGATGTGAGTACAACTCTGTGCGGTGGATCACTCGGCT : 4320 ITS2 (285) * 4340 * 4360 * 4380 * 4400 * 4420 * 4440 * 4460 * 4480 * 4500 Pwes(2n)-I : CGTGTGTCGATGAAGAGCGCAGCCAACTGTGTGAATTAATGCGAACTGCATACTGCTTTGAACATCGACATCTTGAACGCATATTGCGGCCACGGGTTAGCCTGTGGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCTTATAAACTATCGCGACGCCCAAAAAGTCGCGGCTTGGGTTTTGCCAGCTG : 4500 * 4520 * 4540 * 4560 * 4580 * 4600 * 4620 * 4640 * 4660 * 4680 Pwes(2n)-I : GCGTGATCTCCCCAATCTGGTCTTGTGCCTGTGGGGTGCCAGATCTATGGCGTTTCCCTAACATACTCGGGCGCACCCACGTTGCGGCTGAAAGCCTTGACGGGGATGTGGCGACGGAATCGTGGCTCAGTAAATGATTTATGTGCGCGTTCCGCTGTCCTGTCTTCATCTGTGGTTCAT : 4680 28S (3881) * 4700 * 4720 * 4740 * 4760 * 4780 * 4800 * 4820 * 4840 * 4860 Pwes(2n)-I : GTTGCGCGTGGTCTGCGTTTGATGCTGACCTATGTATGTGCCATGTGGCTCATTCTCCTGACCTCGGATCAGACGTGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTAAGCGGAGGAAGAGAAACTAACAAGGATTCCCTGAGTAACGGCGAGTGAACAGGGAAAAGCCCAGCACCGAAGCC : 4860 * 4880 * 4900 * 4920 * 4940 * 4960 * 4980 * 5000 * 5020 * 5040 Pwes(2n)-I : TGTGGTCATTTGGTCACTAGGCAATGTGGTGTTCAGGTCGTTCCATAGAGGTGCTGCTCCACCCTAAGTCCAGCAATGAGTACGGTGGTACGGACATGGCCCACAGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATCAGGCAGGCCAGTGCCTCTCTGGGTAGACCTTGGAGTCGGGTTGTT : 5040 * 5060 * 5080 * 5100 * 5120 * 5140 * 5160 * 5180 * 5200 * 5220 Pwes(2n)-I : TGTGAATGCAGCCCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCCAAGGCTAAATACTTGCACGAGTCCGATAGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGCTCAGAGGTAAACGGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGGGAATTCAGC : 5220 * 5240 * 5260 * 5280 * 5300 * 5320 * 5340 * 5360 * 5380 * 5400 Pwes(2n)-I : TGGTGAATGTGGTTTGGGCTTGGTCAAGTCGGTTGGACATTGAGGTCTGCGTACCGGCAGGTCTTTACCCTCGGGTAAGGATGCGCGATACACTTATCAAGTGTTGTGCGCCTCTTTGTTTATCGGGCCAATTCGCCAGTGCACTTTCTCGGAGTGTTCACCACGACCGGCACTGCTGTC : 5400 * 5420 * 5440 * 5460 * 5480 * 5500 * 5520 * 5540 * 5560 * 5580 Pwes(2n)-I : TGATTGCTGTGGTTAAACCGGACTTACAGGGCTCTTGTGGCGTTGTATGGCCGGGAAGGCAGGTAGCTCGTTGGCTAGCTTGCGGTTTACCGCTGGCGTTCGGTCTTCGAGTGTAAATAGCTGACCACGATATTTCTGTGCAGTGTGTCGGAGACGGCGGCTTTTGGTACGTGCGTGCGT : 5580 * 5600 * 5620 * 5640 * 5660 * 5680 * 5700 * 5720 * 5740 * 5760 Pwes(2n)-I : GCTGGTTCTGCTGGCGTGTCCGGGTTTGGTTGCCATGTTGCTTGTGAATGCAGGCCTGGCAATGGTTCGGATTCGTTTGGTGGGCGGTTGCGTATGTGGTGCCGTTAAGGGCCAACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAA : 5760 * 5780 * 5800 * 5820 * 5840 * 5860 * 5880 * 5900 * 5920 * 5940 Pwes(2n)-I : CATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTAACGAAACCCACAGGCGCAGTGAAAGTAAAGGCTTGACTTGTTCAGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTTCACGCATGGTGCCACCAAGCAACGAGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGACGTAGACACATAATCTTCGGACCAGTGCACC : 5940 * 5960 * 5980 * 6000 * 6020 * 6040 * 6060 * 6080 * 6100 * 6120 Pwes(2n)-I : GTCGGGGCGGAGCATGAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGACCGCAGCGATTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAACGTGAGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCCCTCC : 6120 * 6140 * 6160 * 6180 * 6200 * 6220 * 6240 * 6260 * 6280 * 6300 Pwes(2n)-I : GAAGTTTCCCTCAGGATAGCTGGCGTTCGGAGAAGTAAACAGTTTTATCCGGTAAAGCGAATGATTAGAGGCCTTGGGGGCGAAACGTCCTCAACCTATTCTCAAACTTTAAATGGGTGAGAAGCTGAACTCGCTTGAGCGGAGTTGGGCGTTGAATGTGAGTGCCAAGTGGGCCATTTT : 6300 * 6320 * 6340 * 6360 * 6380 * 6400 * 6420 * 6440 * 6460 * 6480 Pwes(2n)-I : TGGTAAGCAGAACTGGCGCTGTGGGATGAACCAAACGTCCGGTTAAGGTGCCTAACGCGACGCTCATCAGATACCACAAAAGGTGTTGGTTGGTCTAGACAGCAGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGAGTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATCAACCAGCCCTGAAAA : 6480 * 6500 * 6520 * 6540 * 6560 * 6580 * 6600 * 6620 * 6640 * 6660 Pwes(2n)-I : TGGATGGCGCTGGAGCGTCGGACCTATACCGGACCGTTACTGCAAGCTGGGTCGGTAATGTGTGGTGTGAGGGCAAGCCGCACGACTCAGGCACGGAGTGGTGGTAACGAGTAGGAGGGTCGCCGTGGTGAGCGGGAAGCTTCGGGCGTGAGCTTGAGTGGAGCCGCCACGGGTGCAGAT : 6660 * 6680 * 6700 * 6720 * 6740 * 6760 * 6780 * 6800 * 6820 * 6840 Pwes(2n)-I : CTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAGTGAGAACCTTGAAGGCCGAGGTGGAGAAGGGTTCCATGGGAACAGCAGTTGGCCATGGGTCAGGCGGTCCTAAGTGATCCGATAACTCGGTACAGAGACGGGGTGCCTGACATTGTCAGGATTGCTGCTCGTATTGTTGCAAGGCAGCCCCCTG : 6840 * 6860 * 6880 * 6900 * 6920 * 6940 * 6960 * 6980 * 7000 * 7020 Pwes(2n)-I : TAGCGAAAGGGAATCGGGTTAATATTCCCGACCCTGCCCACGGAGATTGGTGTATTCCGGTCTTGTGCTGGTTTGCATCTAGCGCGGTAACGCAACCGACCTCGGAGACGTCGGCAAGAGTTCTGGGAAGAGTTCTCTTTTCTTTATTAGGAGTGCATCCATCCCCTGGAATCGGGTTGT : 7020 * 7040 * 7060 * 7080 * 7100 * 7120 * 7140 * 7160 * 7180 * 7200 Pwes(2n)-I : CCGGAGATAGGGGACTAGCCTCCGTAAAGCACCACCCCTCTTGTGGTGTCCGGAACGCTCTTGTCGGCCCTTGAAAATCCGAGCAAGGCAATATAATTTTCGTGGCAGGCCGTACCCATATCCGCATCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCTCTGGCATTTGAACAATGTAGGTAAGGGAAG : 7200 * 7220 * 7240 * 7260 * 7280 * 7300 * 7320 * 7340 * 7360 * 7380 Pwes(2n)-I : TCGGCAAATTGGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTGAGGGCCGAGTCAAATGGGCTGGGATCAGATACGTGCCGGTCAAGTTGGGGGCTGGTTTTTCTGTCACTCTGTTCGCTTCGGTGGATGGGGTCGATGGGATTACTGGACTCTGACCAGGCCGGTCGTGGACGATCTCA : 7380 * 7400 * 7420 * 7440 * 7460 * 7480 * 7500 * 7520 * 7540 * 7560 Pwes(2n)-I : GCTGTAGTGCTGCTTGGTTCGCATCGCGCGTGGGAAACTGTGTGCGTTTGTGGCCTTGCTTCCTTCGTTTGGCGTTAAACGGCTAACTCAGAACTGGCACGGACCAGGGGAATCCGACTGTCTAATTAAAACAAAGCATTGCGATGTCCACTGACCGGTTTTGACGCAATGTGATTTCTG : 7560 * 7580 * 7600 * 7620 * 7640 * 7660 * 7680 * 7700 * 7720 * 7740 Pwes(2n)-I : CCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAAGAAATTCAATCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGTCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAAC : 7740 * 7760 * 7780 * 7800 * 7820 * 7840 * 7860 * 7880 * 7900 * 7920 Pwes(2n)-I : GGGCTTGGCAGAATTAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTCCGACTTTGTGAGGAGACATGACGGGTGTAGAATAAGTGGGAGCCAGGTCCTTCGGGGTTTGGCGTCAGTGAAATACCACCACCGTCATTGTTTCTTTGCTTATTCAGTAAAGCGGGGTGCCAATTTT : 7920 * 7940 * 7960 * 7980 * 8000 * 8020 * 8040 * 8060 * 8080 * 8100 Pwes(2n)-I : GGTCCTAAGCACATGCTGGCATGCGTGGCTTTGCTGCGGGTGTCGGTATCCTGGTCATGTCAGATGAGCCGTGGCTTCGGCTGCGGTGTTTGAGTTTGAATGTGATGTGCGACCCGTTCTGAAGACAATGTCAGGCGGGGAGTTTGACTGGGGCGGTACATCTGTCAAATGGTAACGCAG : 8100 * 8120 * 8140 * 8160 * 8180 * 8200 * 8220 * 8240 * 8260 * 8280 Pwes(2n)-I : GTGTCCCAAGGTAAGCTCAGCCAGGACGGAAACCTGGCGTAGAGTAAAAGGGCAAAAGCTTACTTGATTTTGATTTTCAGTACGAATACAGACCGTGAAAGCGTGGCCTATCGATCCTTTTGATTTTGATATTCGGAGTTTGAAGCAAGAGGTGTCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACT : 8280 * 8300 * 8320 * 8340 * 8360 * 8380 * 8400 * 8420 * 8440 * 8460 Pwes(2n)-I : GGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCGCTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTCCCTAGCGTTGTGACGCAGAATTCACCAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTAATGAGTACAATG : 8460 * 8480 * 8500 * 8520 * 8540 * 8560 * 8580 * 8600 * Pwes(2n)-I : AAACAGTGAAGTACAAACTGGCCGTTGCTATGGTAATCCTGTTTAGTACGAGAGGAACCGCAGGTTCAGACATTTGGTATATGTGCCTGGTCGAAAGGCCAATGGTGCGAAGCTACCATCTGAGGGATTAGGACTGAACGCCTCTAAGTCTGAATC : 8616 bp (15,7 TRU) ///-IGS-/// ======================================= Hình PL3.9. Trình bày diễn giải gen và vùng giao gen của đơn vị mã hóa ribosome (rTU) loài Paragonimus westermani (3n) của Hàn Quốc (Pwes-Bogil(3n)-KR), thiếu IGS (7.292 bp; ITS1 chứa 4,7 TRU) 18S (1977) * 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * 120 * 140 * 160 * 180 Pwes-KR(3n : AACCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAGAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTACATACCTCAAAACGGTGAAACCGCGAATGGCTCATTAAATCAGCTATGGTTCCTTAGATCGTACCTACTACATGGATAACTGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCCACTATGC : 180 * 200 * 220 * 240 * 260 * 280 * 300 * 320 * 340 * 360 Pwes-KR(3n : CCTGACCCGCGAGGGAACGGGTGGATTTATTAGAACAGAACCAACCGGTTGTGGCTCCGGCTGCATCCGTTGTACTCTGTGATGACTCTGGATAACTTCAATGATCGCGTCGGCCTTGTGTCGGCGACGGATCTTTCAAATGTCTGCCCTATCAATTTACGATGGTAGGTGACCTGCCTA : 360 * 380 * 400 * 420 * 440 * 460 * 480 * 500 * 520 * 540 Pwes-KR(3n : CCATGGTGATAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACTTCCAAGGAAGGCAGCAGGCACGCAAATTACCCAATCCCGGCACGGGGAGGTAGTGACGAAAAATACGAATACGGGACTCAACAGAGGCTCCGTAATTCGAATGAGTACA : 540 * 560 * 580 * 600 * 620 * 640 * 660 * 680 * 700 * 720 Pwes-KR(3n : ATTTAAATCCTTTAACGAGGATCAACTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAACTCCAGCTCCAGAAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATCTGGGTCGCATGGCTACGTGCCGTCGCTCACTTTCTCGGTTGGCTGTTAAGGCCCTGGGTGTG : 720 * 740 * 760 * 780 * 800 * 820 * 840 * 860 * 880 * 900 Pwes-KR(3n : GTGGGTCGGTGTCGTGGTTGTGTGGTCTTTCTGCCGTGTCTGGTTCACAGGTGCTGACTAGGCCTTCGGGTTTGTCGGCATGCTTCCAGATGCCTTTAAACGGGTGTCGGGGGCGGACGGCACGTTTACTTTGAACAAATTTGAGTGCTCAAAGCAGGCCCTTGTGCCTGAAAATTCTTG : 900 * 920 * 940 * 960 * 980 * 1000 * 1020 * 1040 * 1060 * 1080 Pwes-KR(3n : CATGGAATAATGGAATAGGACTTCGGTTCTATTTTGTTGGTTTTCGGATCCGAAGTAATGGTTAAGAGGGACAGACGGGGGCATTTGTATGGCGGTGTTAGAGGTGAAATTCTTGGATCGCCGCCAGACAAACTACAGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCTGGAGCGAA : 1080 * 1100 * 1120 * 1140 * 1160 * 1180 * 1200 * 1220 * 1240 * 1260 Pwes-KR(3n : AGTCAGAGGTTCGAAGACGATCAGATACCGTCCTAGTTCTGACCATAAACGATGCCAACTGACGATCCGCGGTGGTTCTTTTATTGTCCCCGCGGGCAGTCCCCGGGAAACCTTTAAGTCTTTGGGCTCCGGGGGAAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGC : 1260 * 1280 * 1300 * 1320 * 1340 * 1360 * 1380 * 1400 * 1420 * 1440 Pwes-KR(3n : ACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTCGACTCAACACGGGAAAACTCACCCGGCCCGGACACTGTGAGGATTGACAGATTGAAAGCTCTTTCTTGATTCGGTGGTTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACTTTG : 1440 * 1460 * 1480 * 1500 * 1520 * 1540 * 1560 * 1580 * 1600 * 1620 Pwes-KR(3n : GCCTGCTAAATAGTATGCCTGTCCTCTGTGCCCGTGCGGGTGGCGGTGCTCGCTGCCTCTTCGGGGGTAGTGGTGCCGTTCGCCGGCGGGTACTGCGCAGGTGTTTACTTCTTAGAGGGACAAGCGGCGTGACAGTCGCACGAAAATGAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGT : 1620 * 1640 * 1660 * 1680 * 1700 * 1720 * 1740 * 1760 * 1780 * 1800 Pwes-KR(3n : CCGGGGCCGCACGTGCGCTACAATGACGGTTTCAGCGAGTCTGGGAACCTGGCCCGAAAGGGTTGGGCAAACTGAGTCATCACCGTCGTGACTGGGATCGGGGCTTGCAATTGTTCCCCGTGAACGAGGAATTCCTGGTAAGTGCAAGTCATAAGCTTGCGCTGATTACGTCCCTGCCCT : 1800 ITS1 (989) 14 * 1820 * 1840 * 1860 * 1880 * 1900 * 1920 * 1940 * 1960 * 1980 Pwes-KR(3n : TTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTTTAGCAAGGTCCTCGGATTGGTGCCATTGTAGTTGCTCCGGCAGCTCGACCGGCGCTGAGAAGACGACCAAACTTGATCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACA : 1980 Int. seq. 1 (73) * 2000 * 2020 * 2040 * TRU1 2060 * 2080 * 2100 * 2120 * 2140 * 2160 Pwes-KR(3n : GAATTCCCAATTCTGAAACTGCCTCAATGAGCACAAAGGCGTGTTCTAAACGAGCAGTCATGCTCGTCAAACGCAGACTCGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGTTTCGGCTGTGCCTGGCACACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGGATCTTCTCCGATGAGCCTTCG : 2160 * TRU2 2180 * 2200 * 2220 * 2240 * 2260 * 2280 * TRU3 2300 * 2320 * 2340 Pwes-KR(3n : GGTTTGTTGGATGCAGCCTTGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGTTTCGGCTGTGCCTGGCACACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGGATCTTCTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTTGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGTTTC : 2340 * 2360 * 2380 * 2400 * TRU4 2420 * 2440 * 2460 * 2480 * 2500 * 2520 Pwes-KR(3n : GGCTGTGCCTGGCACACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGGATCTTCTCCGATGAGCCTTCGGGTTTGTTGGATGCAGCCTTGTCTGCCTCGGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGTTTCGGCTGTGCCTGGCACACTCGTGTGCCTACGTACAGTCGGATCTTCTCCGATGAGCCTTCG : 2520 Int. seq. 2 (350) *TRU4.72540 * 2560 * 2580 * 2600 * 2620 * 2640 * 2660 * 2680 * 2700 Pwes-KR(3n : GGTTTGTTGGATGCAGCCTTGTCTGCCTCAGGTGGAGCGTTCTCCTCTGCCATGTGTTTCGGCTGTGCCTGGCACACTCGTGTGCCTACGTACAGTTATACTTGCAGCAGGGTGCCTACCTGTCTGATGCTCTACGTTTTGCTTGCCATTTTCGGATGGTCAGTCCATCTCGTGGGTGAC : 2700 * 2720 * 2740 * 2760 * 2780 * 2800 * 2820 * 2840 * 2860 * 2880 Pwes-KR(3n : GGGTTGTGCTGTCTTCACCGACAGTGCTAGGCTTAATGAGTGGTATGGCATATTGAGCTACGGCTCGGCCACCGCCCTGTTTGTTTCAATTTATGCCATTTTACACTGTTCAAGTGGTTCAGGTCAGCTCGTCTGAGCTGTTCCACTGCCCGACATGCACCCGGTCTCGTGCTGGACTGC : 2880 5.8S (160) * 2900 * 2920 * 2940 * 2960 * 2980 * 3000 * 3020 * 3040 * 3060 Pwes-KR(3n : ATGTACAGTCGCCTGGCGGTGCCTTATCCCGGGCTAGACTGGTTAACCATACATCGTTCGTCTGGGTGACTGGATGTTCGATGTGAGTACAACTCTGTGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGTGTCGATGAAGAGCGCAGCCAACTGTGTGAATTAATGCGAACTGCATACTGCTTTGAACA : 3060 ITS2 (285) * 3080 * 3100 * 3120 * 3140 * 3160 * 3180 * 3200 * 3220 * 3240 Pwes-KR(3n : TCGACATCTTGAACGCATATTGCGGCCACGGGTTAGCCTGTGGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCTTATAAACTATCGCGACGCCCAAAAAGTCGCGGCTTGGGTTTTGCCAGCTGGCGTGATCTCCCCAATCTGGTCTTGTGCCTGTGGGGTGCCAGATCTGTGGCGTTTCCCTAACAT : 3240 28S (3881) * 3260 * 3280 * 3300 * 3320 * 3340 * 3360 * 3380 * 3400 * 3420 Pwes-KR(3n : ACTCGGGCGCACCCACGTTGCGGCTGAAAGCCTTGACGGGGATGTGGCAACGGAATCGTGGCTCAGTGAATGATTTATGTGCGCGTTCCGCTGTCCTGTCTTCATCTGTGGTTTATGTTGCGCGTGGTCTGCTTTCGATGCTGACCTACGTATGTGCCATGTGGTTCATTCTCCTGACCT : 3420 * 3440 * 3460 * 3480 * 3500 * 3520 * 3540 * 3560 * 3580 * 3600 Pwes-KR(3n : CGGATCAGACGTGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTAAGCGGAGGAAGAGAAACTCACAAGGATTCCCTGAGTAACGGCGAGTGAACAGGGAAAAGCCCAGCACCGAAGCCTGTGGTCATTTGGTCACTAGGCAATGTGGTGTTCAGGTCGTTCCATAGAGGTGCTGCTCCACCC : 3600 * 3620 * 3640 * 3660 * 3680 * 3700 * 3720 * 3740 * 3760 * 3780 Pwes-KR(3n : TAAGTCCAGCAATGAGTACGGTGGTACGGACATGGCCCACAGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATCAGGCAGGCCAGTGCCTCTCTGGGTAGACCTTGGAGTCGGGTTGTTTGTGAATGCAGCCCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCCAAGGCTAAATACTTGCACGAGTCCGAT : 3780 * 3800 * 3820 * 3840 * 3860 * 3880 * 3900 * 3920 * 3940 * 3960 Pwes-KR(3n : AGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGCTCAGAGGTAAACGGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTTCGGGAATTCAGCTGGTGAGTGTGGTTTGGGCTTGGTCAAGTCGGTTGGACATTGAGGTCTGTGTAGCGGCAGGTCT : 3960 * 3980 * 4000 * 4020 * 4040 * 4060 * 4080 * 4100 * 4120 * 4140 Pwes-KR(3n : TTACTTTCGGGTAAGGATGCGCGATACACTTATCAAGTGTTGTGCGCCTCTTTGTTTATCGGGCCAATTTGCCAGTGCACTTTCTCGGAGTGTTCACCACGACCGGCACTGCTGTCTGATTGCTGTGGTTAAACCGGACTTACAGGGCTCTTGTGGCGTTGTATGGCCGGGAAGGCAGGT : 4140 * 4160 * 4180 * 4200 * 4220 * 4240 * 4260 * 4280 * 4300 * 4320 Pwes-KR(3n : AGCTCGTTGGCTAGCTTGCGGTTTACCGCTGGCGTTTGGTTTTCGAGTGTAAATAGCTGACCACGATATTTCTGTGCAGTGTGTCGGAGACGGCGGCTTGTGGTACGTGCGTGCGTGCCGGTTCTGCTGGCGTGTCCGGGTTTGGTTGTCATGTTGCTTGTGAATGCAGGCCTGGCAATG : 4320 * 4340 * 4360 * 4380 * 4400 * 4420 * 4440 * 4460 * 4480 * 4500 Pwes-KR(3n : GTTCGGATTCGTTTGGTGGGCGGTTGCGTATGTGGTGCCGTTGAGGGCCAACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGTGTAACGAAACCCACAGGCGCAGTGAAAGTAAAGGCTTGGCTTG : 4500 * 4520 * 4540 * 4560 * 4580 * 4600 * 4620 * 4640 * 4660 * 4680 Pwes-KR(3n : TCCAGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTTCACGCATGGTGCCACCAAGCAACGAGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGACGTAGACACATAATCTTCGGACCAGTGCACCGTCGGGGCGGAGCATGAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGT : 4680 * 4700 * 4720 * 4740 * 4760 * 4780 * 4800 * 4820 * 4840 * 4860 Pwes-KR(3n : TGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGACCGCAGCGATTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAACGTGAGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCCCTCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCTGGCGTTCGGAGAAGTAAACAGTTTTATCCGGTAAAGCGAATGA : 4860 * 4880 * 4900 * 4920 * 4940 * 4960 * 4980 * 5000 * 5020 * 5040 Pwes-KR(3n : TTAGAGGCCTTGGGGGCGAAACGTCCTCAACCTATTCTCAAACTTTAAATGGGTGAGAAGCTGAACTCGCTTGAGCGGAGTTGGGCGTTGAATGTGAGTGCCAAGTGGGCCATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGCTGTGGGATGAACCAAACGTCCGGTTAAGGTGCCTAACGCGACGCT : 5040 * 5060 * 5080 * 5100 * 5120 * 5140 * 5160 * 5180 * 5200 * 5220 Pwes-KR(3n : CATCAGATACCACAAAAGGTGTTGGTTGGTCTAGACAGCAGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGAGTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATCAACCAGCCCTGAAAATGGATGGCGCTGGAGCGTCGGACCTATACCGGACCGTTACTGCAAGCTGGGTCGGTAATGTGTG : 5220 * 5240 * 5260 * 5280 * 5300 * 5320 * 5340 * 5360 * 5380 * 5400 Pwes-KR(3n : GTGTGAGGGCAAGCCGCACGACTCAGGCACGGAGTGGTGGTAACGAGTAGGAGGGTCGCCGTGGTGAGCGGGAAGCTTCGGGCGTGAGCTTGAGTGGAGCCGCCACGGGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAGTGAGAACCTTGAAGGCCGAGGTGGAGAAGGGTTCCATG : 5400 * 5420 * 5440 * 5460 * 5480 * 5500 * 5520 * 5540 * 5560 * 5580 Pwes-KR(3n : GGAACAGCAGTTGGCCATGGGTCAGGCGGTCCTAAGTGATCCGATAACTCGGTACAGAGACGGGGTGCCTGACATTGTCAGGATTGCTGCTCGTATTGTTGCAAGGCAGCCCCCTGTAGCGAAAGGGAATCGGGTTAATATTCCCGACCCTGCCCACGGAGATTGGTGTATTCCGGTCTT : 5580 * 5600 * 5620 * 5640 * 5660 * 5680 * 5700 * 5720 * 5740 * 5760 Pwes-KR(3n : GTGCTGGTTTGCATCTAGCGCGGTAACGCAACCGACCTCGGAGACGTCGGCAAGAGTTCTGGGAAGAGTTCTCTTTTCTTTATTAGGAGTGCATCCATCCCCTGGAATCGGGTTGTCCGGAGATAGGGGACTAGCCTCCGTAAAGCACCACCCCTCTTGTGGTGTCCGGAACGCTCTTGT : 5760 * 5780 * 5800 * 5820 * 5840 * 5860 * 5880 * 5900 * 5920 * 5940 Pwes-KR(3n : CGGCCCTTGAAAATCCGAGCAAGGCAATATAATTTTCGTGGCAGGCCGTACCCATATCCGCATCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCTCTGGCATTTGAACAATGTAGGTAAGGGAAGTCGGCAAATTGGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTGAGGGCCGAGTCAAATGGGCTG : 5940 * 5960 * 5980 * 6000 * 6020 * 6040 * 6060 * 6080 * 6100 * 6120 Pwes-KR(3n : GAATCAGATACGTGCCGGTCAAGTTGGGGGCTGGTTTTTCTGTTACTCTGTTCGCTTCGGTGGATGGGGTCGATGGGATTACTGGACTCTGACCAGGCCGGTCGTGGACGATCTCAGCTGTAGTGCTGCTTGGTTCGCATCGCGCGTGGGAAACCGTGTGCGTTTGTGGCCTTGCTTCCT : 6120 * 6140 * 6160 * 6180 * 6200 * 6220 * 6240 * 6260 * 6280 * 6300 Pwes-KR(3n : TCGTTTGGCGTTAAACGGCTAACTCAGAACTGGCACGGACCAGGGGAATCCGACTGTCTAATTAAAACAAAGCATTGCGATGTCCACTGACCGGTTTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAAGAAATTCAATCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACT : 6300 * 6320 * 6340 * 6360 * 6380 * 6400 * 6420 * 6440 * 6460 * 6480 Pwes-KR(3n : ATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGTCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATTAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTCCGACTTTGTGA : 6480 * 6500 * 6520 * 6540 * 6560 * 6580 * 6600 * 6620 * 6640 * 6660 Pwes-KR(3n : GGAGACATGACGGGTGTAGAATAAGTGGGAGCCAGGTCCTTCGGGGTTTGGCGTCAGTGAAATACCACCACCGTCATTGTTTCTTTGCTTATTCAGTAAAGCGGGGTGCCAATTTTGGTCCTAAGCACATGCTGGCATGCGTGGCTTTGCTGCGGGTGTCGGTATCCTGGTCATGTCAGA : 6660 * 6680 * 6700 * 6720 * 6740 * 6760 * 6780 * 6800 * 6820 * 6840 Pwes-KR(3n : TGAGCCGTGGCTTCGGCTGCGGTGTTTGAGTTTGAATGTGATGTGCGACCCGTTCTGAAGACAATGTCAGGCGGGGAGTTTGACTGGGGCGGTACATCTGTCAAATGGTAACGCAGGTGTCCCAAGGTAAGCTCAGCCAGGACGGAAACCTGGCGTAGAGTAAAAGGGCAAAAGCTTACT : 6840 * 6860 * 6880 * 6900 * 6920 * 6940 * 6960 * 6980 * 7000 * 7020 Pwes-KR(3n : TGATTTTGATTTTCAGTACGAATACAGACCGTGAAAGCGTGGCCTATCGATCCTTTTGATTTTGATATTCGGAGTTTGAAGCTAGAGGTGTCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCGCTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTCCCT : 7020 * 7040 * 7060 * 7080 * 7100 * 7120 * 7140 * 7160 * 7180 * 7200 Pwes-KR(3n : AGCGTTGTGACGCAGAATTCACCAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTAATGAGTACAATGAAACAGTGAAGTACAAACTGGCCGTTGCTATGGTAATCCTGTTTAGTACGAGAGGAACCGCAGG : 7200 * 7220 * 7240 * 7260 * 7280 * Pwes-KR(3n : TTCAGACATTTGGTATATGTGCCTGGTCGAAAGGCCAATGGTGCGAAGCTACCATCTGAGGGATTAGGACTGAACGCCTCTAAGTCTGAATC : 7292 bp (7,7 TRU) ///-IGS-/// ======================================= 15 PHỤ LỤC II PL2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu nghiên cứu DNA tổng số từ SLP trưởng thành Paragonimus spp. nguyên con của từng mẫu riêng biệt được tách chiết bằng bộ sinh phẩm DNeasy Blood and Tisue kit (Qiagen Inc.. Mỹ) hoặc GeneJET™ Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific Inc., MA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA tổng số được thu nhận với dung tích khoảng 100 L/mẫu, hàm lượng DNA là 50 ng/L. Mô tả cụ thể tách chiết DNA tổng số bằng bộ sinh phẩm DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen Inc.. Mỹ) : - Mỗi mẫu sán lá ruột nhỏ (1 con) được nghiền trong 180 µL dung dịch Tissue Lysis buffer (ATL) và bổ sung 20 µL Proteinase-K (100mg/ml) ủ ở 56oC/2 giờ cho đến khi mô được phân giải hoàn toàn. - Tiếp tục bổ sung 200 µL dung dịch AL lắc đều ủ ở 56oC/30 phút. - Thêm 200 µL Ethanol (100%), trộn đều, sau đó chuyển toàn bộ hỗn dịch sang cột có màng lọc và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ phần dịch phía dưới cột lọc. - Thêm 500 µL dung dịch Washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới cột lọc. - Tiếp tục thêm 500 µL dung dịch Washing buffer 2 (AW2) vào cột lọc để rửa DNA, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới, rồi ly tâm lại 13.000 vòng/phút trong 2 phút để làm khô màng. - Chuyển cột sang Eppendorf mới, thêm 60 µL dung dịch Elution buffer (EL), để nhiệt độ phòng khoảng 2–3 phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút. Bỏ cột, thu dịch bên dưới là DNA tổng số, ghi ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu DNA ở –20oC cho đến khi sử dụng. - Kiểm tra hàm lượng DNA tổng số bằng cách đo hấp phụ quang học (OD, optical density) trên máy đo quang phổ kế NanoDrop®ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer (Thermo Scientific Inc.). DNA tổng số được pha thành nồng độ 50 ng/L, sử dụng 1–2 L cho mỗi phản ứng PCR có dung tích 50 L. PL2.2. Phương pháp thiết kế mồi chung và mồi đặc hiệu mtDNA Các mồi chung (hay còn gọi là mồi ty thể chung cho sán dẹt, universal- 16 platyhelminth primers) được sử dụng cho đề tài thu toàn bộ mtDNA SLP từ thiết kế đã được liệt kê ở các công bố trước đây (Le et al., 2002; 2016; 2019) hoặc/và cải tiến bổ sung thêm để thực hiện PCR dài (long-PCR/ L-PCR) với mục tiêu thu nhận đoạn mtDNA có độ dài cao nhất có thể, 4–6 kb hoặc dài hơn (Bảng PL2.1). Một số cặp mồi đặc hiệu mtDNA của từng loài Paragonimus spp. cũng được thiết kế để thu nhận sản phẩm PCR ngắn (1,5–3 kb) từ khuôn DNA tổng số hoặc/và từ khuôn là sản phẩm LPCR đã được thu nhận và các primer này cũng được sử dụng để giải trình tự. Chuỗi mồi được thiết kế bằng chương trình Primer3Plus (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/). Mồi chung sử dụng để thu nhận mtDNA của P. heterotremus và P. ohirai: Sử dụng các cặp mồi chung: i) URNLF/URNSR thu vùng gen rrnL-rrnS (~1000 bp); ii) TRECOBF/TRECOBR thu đoạn gen cob (~650 bp); iii) PNAD1F/JNAD1R thu đoạn gen nad1 (~400 bp); iv) JB3F/JB4.5R thu đoạn gen cox1 (444 bp) và giải trình tự. Các chuỗi này được sử dụng để thẩm định loài theo danh pháp và tiếp tục thiết kế các mồi đặc hiệu khởi điểm cho các phản ứng PCR/LPCR. Một số gen có mức độ bảo tồn cao như 16S (rrnL) hay 12S (rrnS) hay chuỗi nucleotide của tRNAGly định vị ở sau gen nad5 được sử dụng thiết kế các mồi lần lượt là UNI16F và UNI16R (trên rrnL), UNI12F và UNI12R (trên rrnS), GLYF và GLYR (trên tRNAGly) cho các phản ứng L-PCR qua các vùng mã hóa và không mã hóa của mtDNA (Bảng PL2.1). Bảng PL2.1 liệt kê tất cả mồi chung và mồi đặc hiệu của từng loài đã được thiết kế và sử dụng để thu sản phẩm PCR/LPCR có kích thước khác nhau của mtDNA của P. heterotremus và P. ohirai. Trên cơ sở trình tự nucleotide của các chuỗi đã thu nhận, tiếp tục thiết kế mồi và giải trình tự bằng phương pháp kế tiếp lồng vào nhau, hay còn gọi là phương pháp “lao mồi” trực tiếp từ sản phẩm hoặc/và sau khi tách dòng. Giải trình tự được thực hiện tại các cơ sở dịch vụ: Macrogen (Hàn Quốc) tại (https://www.macrogen.com/en/main/); và Công ty Nam Khoa (Việt Nam): ( PL2.3. Phương pháp thiết kế mồi giải trình tự đơn vị mã hóa ribosome Bảng PL2.3 liệt kê tất cả mồi đã được sử dụng để thu sản phẩm PCR/LPCR kích thước khác nhau của rTU của 6 chủng/5 loài là P. heterotremus, P. ohirai, P. iloktsuenensis, P. miyazakii và loài P. westermani (2 chủng). Trên cơ sở trình tự 17 nucleotide của các chuỗi đã thu nhận, tiếp tục thiết kế mồi và giải trình tự bằng phương pháp kế tiếp lồng vào nhau, hay còn gọi là phương pháp “lao mồi” trực tiếp từ sản phẩm hoặc/và sau khi tách dòng. Giải trình tự được thực hiện tại các cơ sở dịch vụ: Macrogen (Hàn Quốc) tại (https://www.macrogen.com/en/main/); và Công ty Nam Khoa (Việt Nam): ( Mồi sử dụng để thu nhận rTU của 6 chủng/5 loài là P. heterotremus, P. ohirai, P. iloktsuenensis, P. miyazakii và loài P. westermani (2 chủng) (Bảng PL2.3) được kế thừa từ các nghiên cứu trước đây và thiết kế bổ sung dựa trên một số công bố về rTU đã có trên Ngân hàng gen hoặc dữ liệu của chúng tôi công bố và hiện đang có (Le et al., 2017; 2020b) hoặc được sưu tầm để kết hợp sử dụng (Olson et al., 2003; Tkach et al., 2016). PCR/LPCR được áp dụng bằng cách phối hợp các cặp mồi khác nhau và lệch nhau để thu các phần DNA (phân đoạn) dài ngắn khác nhau. Toàn bộ mỗi đơn vị rTU (5’18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S-IGS 3’) của sán lá, được biết cho đến nay có độ dài khoảng từ 7–8 cho đến 9–10 kb, tùy thuộc mỗi loài. Phần mã hóa (coding region), tạm ký hiệu là rTU* được tính từ đầu 5’ của gen 18S cho đến hết đầu 3’ của gen 28S, độ dài thường là khoảng 6–7 hoặc 8 kb, dài ngắn khác nhau tùy loài Paragonimus. Các gen 18S, 5.8S, 28S rRNA cơ bản có độ dài cố định ở các loài trong một chi, thậm chí trong một họ. Tuy nhiên, vùng ITS-1 (giữa gen 18S và gen 5.8S) và ITS-2 (giữa gen 5.8S và gen 28S) và vùng bản lề IGS, ở một số loài do có thể có nhiều cấu trúc lặp liền kề có số lượng khác nhau, nên tổng kích thước sẽ khác nhau. Có một số mẫu chỉ thu được và giải trình tự được toàn bộ phần mã hóa rTU*, không thu được vùng bản lề (IGS). PL2.4. Thành phần phản ứng, thực hiện PCR và kiểm tra sản phẩm Phản ứng PCR có thể điều chỉnh thành phần và chu trình nhiệt phù hợp để thu sản phẩm PCR tốt nhất có thể thu nhận các phân đoạn của mtDNA và của rTU. Chúng tôi giới thiệu phản ứng có hiệu suất tốt nhất đã được thực hiện. Phản ứng có tổng thể tích 50 µL, gồm: 25 µL PCR mastermix (Thermo Fisher Scientific, MA, USA), 2 µL mỗi loại mồi (10 pmol/µL), 2 µL khuôn DNA (25–50 ng/µL), 2 µL DMSO (dimethyl sulfoxide) và 17 µL nước khử ion DEPC, được thực hiện trên máy MJ PTC-100 (USA). Chu trình nhiệt gồm: 1 chu kỳ ở 95 oC/5 phút, 35 chu kỳ ở [94oC/1 phút, 52oC/1 phút; 72oC/2–6 phút], chu kỳ cuối ở 72 o C/10 phút. 18 Phản ứng L-PCR được thực hiện với enzyme Phusion DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific Inc.), sản phẩm thu được có độ dài 4–6 kb với chất lượng tốt. Sản phẩm PCR/LPCR thu được được điện di kiểm tra trên thạch agarose 1% nhuộm ethidium bromide, so sánh độ dài với chỉ thị DNA Lamda (HindIII). Sản phẩm PCR đơn băng được tinh sạch trực tiếp bằng bộ sinh phẩm GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific Inc.). Với sản phẩm đa băng, thì băng DNA đúng với kích thước dự tính được phân lập từ thạch agarose bằng bộ sinh phẩm GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific Inc.). Các sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ sinh phẩm GeneJET™ PCR Purification Kit và được gửi đi giải trình tự tại các cơ sở dịch vụ đã giới thiệu. PL2.5. Phương pháp thu nhận DNA ribosome các loài sán lá phổi L-PCR được áp dụng thu nhận toàn bộ hoặc một phần ba (1/3) đến một nửa (½) vùng sao chép rTU (độ dài khoảng 3 kb đến 4–5 kb, hoặc có thể đến 6 kb cho mỗi sản phẩm) với enzyme của bộ sinh phẩm Phusion (Thermo Fisher Scientific). Các sản phẩm có kích thước dự tính và có chất lượng tốt (rõ, đậm trên thạch agarose) được tiếp tục sử dụng giải trình tự trực tiếp từ hai đầu biên hoặc/và làm khuôn cho PCR/LPCR mới ở bên trong để có sản phẩm tiếp tục giải trình tự. Phần lớn sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp sau khi tinh sạch sử dụng bộ sinh phẩm GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific Inc., MA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chuỗi nucleotide của từng phân đoạn sau khi biên tập (editing) bằng chương trình ChromasPro, được lồng nối liên tiếp với nhau để thu nhận hoàn toàn trình tự rTU của mỗi loài. Sử dụng chuỗi nucleotide biên tập cuối cùng để xác định gen, phân tích cấu trúc, sắp xếp gen, vùng biên, đặc điểm chuỗi nucleotide nội gen và vùng giao gen. Các chương trình ChromasPro, BioEdit, GENEDOC2.7 đã được sử dụng để thu nhận, xử lý, phân tích các chuỗi nucleotide, đặc điểm các gen ribosome (18S, 5.8S, 28S) và vùng giao gen gồm ITS-1 và ITS-2 và vùng bản lề IGS. PL2.6. Phương pháp tách dòng, thu DNA plasmid tái tổ hợp Sản phẩm PCR hoặc được giải trình tự trực tiếp, nếu có chất lượng tốt và hàm lượng đủ theo yêu cầu. Một số sản phẩm được tách dòng sử dụng vector TA cloning thương mại là pCR2.1TOPO (Invitrogen) hoặc TOPO® XL PCR Cloning Kit (Invitrogen Inc) (nếu sản phẩm PCR 2 kb, cho đến 4 kb), chọn lọc 19 plasmid tái tổ hợp để giải trình tự. DNA của plasmid tái tổ hợp được tách chiết với bộ hoá chất GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.). Nối sản phẩm PCR vào plasmid vector: Do sản phẩm PCR (sử dụng enzyme Taq DNA polymerase) thông thường được gắn thêm Adenine (A) ở đầu 3’, nên khi nối với vector có đầu lồi là Thymine (T) đã được các hãng sinh phẩm thiết kế từ trước, thì hai nucleotide này sẽ gắn nối bổ sung cho nhau nhờ enzyme nối T4-DNA ligase hoặc enzyme topoisomerase. Vị trí để nối sản phẩm PCR vào được bố trí ở trong chuỗi gen lacZ, gen mã hóa và sản xuất enzyme β-galactosidase, có tác dụng xúc tác thủy phân một loại hóa chất có tên gọi là X-gal để tạo nên các dẫn chất có màu xanh. Vi khuẩn không mang plasmid tái tổ hợp sẽ tạo nên khuẩn lạc màu xanh. Khi sản phẩm được nối vào vị trí nối thành công, thì đoạn DNA ngoại lai làm bất hoạt gen lacZ không cho gen này sản xuất ra enzyme β-galactosidase. Do vậy, vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp sẽ không có enzyme β-galactosidase phân giải cơ chất X-gal tạo màu xanh, nên khuẩn lạc sẽ mang màu trắng khi nuôi trên môi trường có chứa X-gal. Chuyển nạp và nuôi cấy trên thạch: Tế bào sử dụng để chuyển nạp là tế bào khả biến (competent cells) E. coli chủng DH5αT1 hoặc Top10 (Invitrogen). Lấy 2– 3 µL sản phẩm của phản ứng nối-ghép, chuyển vào ống chứa 50 µL hoặc 100 µL tế bào khả biến DH5αT1; Ủ trên đá trong 45 phút, xử lý nhiệt (heat-shock) ở 42oC/45 giây và lập tức chuyển vào trong đá và để 2 phút. Thêm 150 µL dung dịch SOC (dung dịch giàu dinh dưỡng), lắc 200 vòng/phút ở 37oC/1 giờ 30 phút; rồi tiếp tục lấy toàn bộ hỗn hợp dàn trên mặt thạch (LB agar 1,5%) có chứa kháng sinh Kanamycin (hay Ampicillin) và X-gal và ủ ở tủ ấm 37oC trong 18–20 giờ. Sau khi ủ, nếu có khuẩn lạc phát triển trên mặt thạch (sau 18–20 giờ), thì đưa đĩa thạch vào khoang lạnh (10oC) trong tủ lạnh để X-gal được phân giải hoàn toàn, giúp nhận biết dễ dàng khuẩn lạc trắng và xanh trong quá trình chọn lọc khuẩn lạc. Chọn lọc khuẩn lạc và nuôi cấy trong môi trường lỏng: Chọn lấy một số khuẩn lạc màu trắng (4–6 khuẩn lạc) để nuôi cấy trong các ống chứa môi trường LB lỏng có kháng sinh Kanamycin (10 µL Kanamycin (50mg/mL) cho 1 ống LB nuôi cấy). Chọn khuẩn lạc màu trắng ngà là tốt nhất. Bổ sung thêm 7 µL X-gal (40mg/ml) vào môi trường để phân biệt vi khuẩn tái tổ hợp phát triển (không có màu xanh) và loại bỏ vi khuẩn không tái tổ hợp (ống có màu xanh). Sau khi cấy 20 khuẩn lạc, ống môi trường được lắc ở 220 vòng/phút trong 16–20 giờ ở 37oC cho vi khuẩn nhân lên. Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp: Sử dụng bộ kit QIAprep Spin Miniprep của hãng QIAGEN theo hướng dẫn của nhà sản xuất. - Lấy 1,5 mL dung dịch tế bào vi khuẩn tái tổ hợp đã được nuôi cấy qua đêm, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 4–5 phút để thu cặn tế bào. Thêm 250 µL dung dịch P1 để hòa tan cặn, hút nhẹ nhàng lên xuống vài lần rồi cho tiếp 250 µL dung dịch P2; để ở nhiệt độ phòng trong 3–4 phút. - Thêm 350 µL dung dịch N3, trộn nhẹ; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Thu dịch trong bên trên (~ 800 µL) cho lên trên bề mặt màng của cột lọc đặt trong 1 ống hứng (collection tube); ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới. - Thêm 500 µL dung dịch PB lên trên màng lọc để rửa màng lọc có DNA của plasmid; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch bên dưới. - Thêm 750 µL dung dịch PE lên trên màng lọc để tiếp tục rửa màng lọc; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch bên dưới. - Cuối cùng, ly tâm tiếp 13.000 vòng/phút trong 1 phút cho màng chứa DNA của plasmid tái tổ hợp thật khô, bỏ phần dịch bên dưới. Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới và thêm 50 µL dung dịch EB lên trên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng 3–4 phút. - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1–2 phút. DNA của plasmid tái tổ hợp được “thôi” ra cùng với dung dịch EB (50 µL) và thu DNA của plasmid tái tổ hợp trong ống, ký hiệu và bảo quản ở –20oC cho đến khi sử dụng. Cắt kiểm tra DNA tái tổ hợp: Lấy 1 L DNA plasmid tái tổ hợp, dùng enzyme giới hạn EcoRI cắt DNA plasmid, ủ ở 37oC trong 2 giờ; điện di trên thạch agarose 1% và kiểm tra độ dài của các băng thu được để tính toán độ dài của sản phẩm PCR ngoại lai có trong plasmid vector. Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp giải trình tự sử dụng mồi chung M13F (5´- GTAAAACGACGGCCAG-3´) hoặc M13R (5´- CAGGAAACAGCTATGAC-3´). PL2.7. Phương pháp giải trình tự và xử lý chuỗi nucleotide Sản phẩm PCR ngắn (<1,2–1,3 kb) được giải trình tự trực tiếp bằng mồi xuôi và mồi ngược bám vào hai đầu biên (flanking primers) đó cũng chính là cặp primer 21 được sử dụng thực hiện phản ứng PCR tạo nên sản phẩm đó. Trong trường hợp giải trình tự với sản phẩm PCR dài (>1,3 kb, đến vài kb), nếu sản phẩm có chất lượng đơn nhất, rõ, tốt, ngoài cặp mồi hai đầu biên tham gia giải trình tự, chúng tôi thiết kế các mồi kế tiếp cho chuỗi sau lồng bám vào chuỗi trước (gọi là “lao mồi”, “primer-walking” strategy) (Le et al., 2017) để thu chuỗi hai chiều. Với đoạn DNA đã chèn vào plasmid tái tổ hợp, sử dụng mồi chung M13F (5´- GTAAAACGACGGCCAG-3´) và M13R (5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´), hoặc các mồi được thiết kế thêm bên trong (internal primers) để giải trình tự. Chuỗi nucleotide sơ cấp do cơ sở dịch vụ cung cấp được biên tập (editing) từ giản đồ trình tự (chromatogram) để thu chuỗi thứ cấp bằng chương trình ChromasPro ( sau đó sắp xếp và thu chuỗi cuối cùng bằng chương trình GENEDOC 2.7 ( Phân tích phả hệ bằng chương trình MEGA 7 hoặc MEGA X (https://www.megasoftware.net/) sử dụng phương pháp ”kết nối liền kề” (Neighbor- Joining, NJ) hoặc ”tiếp cận cực đại” (Maximum likelihood, ML) với hệ số tin cậy (bootstrap) 1000 lần lặp lại (Kumar et al., 2016; 2018). PL2.8. Phương pháp truy cập thu thập chuỗi so sánh và sắp xếp căn chỉnh Sau khi có chuỗi cuối cùng, việc đầu tiên là xác định chuỗi đó có đúng chuỗi của loài đang cần không. Việc giám định chuỗi được thực hiện bằng cách truy cập vào Ngân hàng gen sử dụng chương trình BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) để xem xét thu nhận các chuỗi tương ứng cùng và khác loài/chi/họ để so sánh đối chiếu. Nhiều trường hợp, chuỗi được giám định bằng cách so sánh với các chuỗi trong kho dữ liệu của chúng tôi (Dữ liệu các loài sán dẹt). Một số lượng vài chục chuỗi (nếu có) của các chủng /loài gần gũi và của các chủng /loài trong các chi/họ/liên họ/phân bộ tương ứng được thu nhận từ mọi nguồn để sử dụng sắp xếp căn chỉnh (alignment). Sắp xếp căn chỉnh có thể thực hiện trực tuyến (online) qua chương trình Gene Infinity ( hoặc các chương trình so sánh chuỗi có tại trang Web Expasy (https://www.expasy.org/). Tuy nhiên chúng tôi sử dụng chương trình GENEDOC 2.7 và MEGA 7 hoặc MEGA X. Từng trường hợp sử dụng sẽ được giới thiệu chi tiết ở các mục tương ứng.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_he_gen_ty_the_don_vi_ma_hoa_ribosome_cua.pdf
  • docĐóng góp mới TA, TV.doc
  • pdfĐóng góp mới.pdf
  • pdfQĐ HĐ.pdf
  • pdfTóm tắt tiếng anh.pdf
  • pdfTóm tắt tiếng việt.pdf
  • docTrích yếu luận án.doc
  • pdfTrích yếu.pdf